外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途的制作方法

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途，更具体地，本发明涉及外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途、外泌体在制备用于促进造血干/祖细胞增殖的培养基中的用途、外泌体在制备用于促进造血干/祖细胞增殖的试剂盒中的用途以及促进造血干/祖细胞增殖的方法。

背景技术：

造血干/祖细胞是维持人体血液及免疫系统的基础，也是各类血细胞及免疫细胞的唯一来源。自上世纪五十年代首例造血干/祖细胞移植实施以来，造血干/祖细胞移植已成为目前临床上治疗多种恶性血液疾病、肿瘤及免疫疾病的有效治疗手段。与终末分化细胞相比，造血干/祖细胞具有很强的自我更新能力及向各谱系血细胞分化的潜能。因此移植治疗后，造血干/祖细胞能够迅速归巢并定植于患者骨髓微环境中。随后，伴随着造血干/祖细胞的快速增殖分化，逐步解除患者的骨髓抑制并重建其造血及免疫系统。

但是目前最主要的问题是造血干/祖细胞的数量问题。由于造血干/祖细胞在脐带血单个核细胞中比例仅为1％左右，能够采集到的造血干/祖细胞总数十分有限，不能满足临床应用需要。因而，目前的促进造血干/祖细胞增殖的方法仍有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种促进造血干/祖细胞增殖的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

以脐带组织来源的间充质干细胞作为基质细胞的共培养体系能够有效促进造血干/祖细胞的增殖。间充质干细胞能够分泌多种可溶性细胞因子，并产生大量微型囊泡，包括外泌体。那么，间充质干细胞所产生的何种物质能够影响造血干/祖细胞的增殖，发明人展开一系列实验证实间充质干细胞分泌的外泌体具备独特的生物学功能。发明人在含有重组人干细胞生长因子(SCF)、重组人血小板生成素(TPO)、重组FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的无血清培养基中添加由间充质干细胞生成的外泌体，结果发现，相对于对照，添加外泌体后造血干/祖细胞的增殖速度加快，经培养后造血干/祖细胞的总数量较未添加组显著增多。因而，发明人认为，外泌体能够显著增加造血干/祖细胞增殖的能力。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途。由此，在造血干/祖细胞增殖的体系中添加外泌体，能够有效提高造血干/祖细胞的增殖效率。

根据本发明的实施例，上述外泌体在促进造血干/祖细胞增殖中的用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述外泌体由间充质干细胞形成。发明人发现，间充质干细胞来源的外泌体中表达CD63、CD81、Hsp70等特异性蛋白，其内部包裹多种脂类物质、miRNA、mRNA及蛋白质，能作为信号分子参与介导细胞间通讯并调控细胞的功能。选用间充质干细胞分泌的外泌体促进造血干/祖细胞增殖效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述外泌体由脐带间充质干细胞形成。脐带间充质干细胞来源丰富，易于培养扩增且细胞免疫原性较低，采用脐带间充质干细胞分泌的外泌体，体内安全性更高。

根据本发明的实施例，所述造血干/祖细胞为脐带血造血干/祖细胞，优选CD34⁺细胞。发明人通过实验发现，外泌体在促进脐带造血干/祖细胞尤其是CD34⁺细胞的增殖方面具有更加显著的作用，尤其是脐带间充质干细胞来源的外泌体在促进脐带造血干/祖细胞的增殖方面，不仅具有显著的作用，而且安全性更高。

在本发明的第二方面，本发明提出了外泌体在制备培养基中的用途，所述培养基用于促进造血干/祖细胞增殖。由此，利用本发明的培养基能够高效地促进造血干/祖细胞的增殖，从而能够获得大量细胞活性好的造血干/祖细胞。

根据本发明的实施例，上述外泌体在制备培养基中的用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述外泌体由间充质干细胞形成，优选由脐带间充质干细胞形成。选用间充质干细胞分泌的外泌体制备培养基，所述培养基在促进造血干/祖细胞增殖的效率方面进一步提高。采用脐带来源的间充质干细胞分泌的外泌体，来源更加广泛，免疫原性更低。

根据本发明的实施例，所述造血干/祖细胞为脐带血造血干/祖细胞，优选CD34⁺细胞。发明人通过实验发现，外泌体所制备的培养基在促进脐带造血干/祖细胞尤其是CD34⁺细胞的增殖方面具有更加显著的作用，尤其是脐带间充质干细胞来源的外泌体所制备的培养基，在促进脐带造血干/祖细胞的增殖方面，不仅具有显著的作用，而且安全性更高。

根据本发明的实施例，所述培养基中包含2～50微克/ml外泌体，由此，造血干/祖细胞的增殖效率高，获得的造血干/祖细胞的活性好。

根据本发明的实施例，所述培养基为添加了20～100ng/mL重组人干细胞生长因子、20～100ng/mL重组人血小板生成素和20～100ng/mL重组FMS样酪氨酸激酶3配体的Stemspan培养基。发明人通过实验发现，在上述培养基中培养人造血干/祖细胞，造血干/祖细胞的增殖效率高。

根据本发明的实施例，所述培养基中包含10微克/ml外泌体。发明人通过实验发现，在含有10微克/ml外泌体的培养基中培养造血干/祖细胞，造血干/祖细胞的增殖效率更高。

根据本发明的实施例，所述培养基为添加了50ng/mL重组人干细胞生长因子、50ng/mL重组人血小板生成素、50ng/mL重组FMS样酪氨酸激酶3配体的Stemspan培养基。发明人通过实验发现，在上述培养基中培养造血干/祖细胞，造血干/祖细胞的增殖效率进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了外泌体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进造血干/祖细胞增殖。由此，利用本发明的试剂盒能够高效地促进造血干/祖细胞的增殖，从而能够获得大量细胞活性好的造血干/祖细胞。

根据本发明的实施例，上述外泌体在制备试剂盒中的用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述外泌体由间充质干细胞形成，优选由脐带间充质干细胞形成。发明人发现选用间充质干细胞分泌的外泌体在促进造血干/祖细胞增殖的效率方面进一步提高。采用脐带来源的间充质干细胞分泌的外泌体，来源更加广泛，免疫原性更低。

根据本发明的实施例，所述造血干/祖细胞为脐带血造血干/祖细胞，优选CD34⁺细胞。发明人通过实验发现，外泌体在促进脐带血造血干/祖细胞尤其是CD34⁺细胞的增殖方面具有更加显著的作用，尤其是脐带间充质干细胞来源的外泌体在促进脐带造血干/祖细胞的增殖方面，不仅具有显著的作用，而且安全性更高。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括重组人干细胞生长因子、重组人血小板生成素和重组FMS样酪氨酸激酶3配体。发明人在实验中发现，外泌体和重组人干细胞生长因子、重组人血小板生成素和重组FMS样酪氨酸激酶3配体组合作用于造血干/祖细胞，促进造血干/祖细胞增殖的效率更高、更显著。

需要说明的是，本申请所述的试剂盒需要低温保存，以保持外泌体及任选的人干细胞生长因子、重组人血小板生成素和重组FMS样酪氨酸激酶3配体的活性，优选采用-70℃～-80℃保存。另外，外泌体适于采用生理盐水为保存基质。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种促进造血干/祖细胞增殖的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用添加外泌体的促进增殖培养基培养所述造血干/祖细胞。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地提高造血干/祖细胞的增殖效率和获得的造血干/祖细胞的细胞活性好。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述促进增殖培养基中添加有2～50微克/ml外泌体，优选10微克/ml外泌体。由此，利用本发明的方法促进造血干/祖细胞的增殖时，能够显著提高造血干/祖细胞的增殖效率，获得的造血干/祖细胞的活性更好。

根据本发明的实施例，所述添加外泌体的促进增殖培养基为前面所述的培养基。由此，能够显著提高造血干/祖细胞的增殖效率。进而，根据本发明的另一些实施例，于37摄氏度，5％CO₂条件下，利用添加外泌体的促进增殖培养基培养所述造血干/祖细胞3～14天。由此，造血干/祖细胞的增殖效率高，获得的造血干/祖细胞活性好。

根据本发明的实施例，所述外泌体由间充质干细胞形成，优选由脐带间充质干细胞形成，任选地，所述造血干/祖细胞为脐带血造血干/祖细胞，优选CD34⁺细胞。如前所述，选用间充质干细胞分泌的外泌体提高造血干/祖细胞增殖的效率进一步提高，优选细胞免疫原性较低的脐带间充质干细胞，体内安全性更高，来源更加广泛。另外，外泌体在促进脐带造血干/祖细胞尤其是CD34⁺细胞的增殖方面具有更加显著的作用，尤其是脐带间充质干细胞来源的外泌体在促进脐带造血干/祖细胞的增殖方面，不仅具有显著的作用，而且安全性更高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的间充质干细胞的形态图；

图2是根据本发明实施例的外泌体形态图；

图3是根据本发明实施例的培养细胞数量随时间的变化图；

图4是根据本发明实施例的培养后的细胞流式检测结果；

图5是根据本发明实施例的培养后的细胞的集落形成数；以及

图6是根据本发明实施例的造血干/祖细胞在不同培养基中增殖的情况。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1人脐带间充质干细胞培养及其外泌体分离富集

在本实施例中，发明人详细介绍了外泌体分离富集的过程：

1)间充质干细胞培养于含无血清培养基(三有利公司，中国)的10cm细胞培养皿中。待细胞生长并达到90％以上汇合度时，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗细胞一次，加入TrypLe Express酶(Gibco)消化细胞1～2分钟，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化作用，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm/min离心5分钟。吸弃上清后用新鲜无血清培养基重悬细胞，并按照1:5的传代比例将细胞接种至新的平皿中继续培养。其中，间充质干细胞的形态如图1所示。

2)待间充质干细胞生长达到90％以上的汇合度时，吸弃培养基，更换为外泌体收集培养基，添加量为6ml/皿。外泌体收集培养基的配方为αMEM培养基(Gibco)+1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(Gibco)+1％非必需氨基酸(Gibco)+1％谷氨酰胺(Gibco)。继续培养48小时后收集培养基，并按下述步骤进行离心操作：

300g，10分钟，4℃，收集上清；

2000g，10分钟，4℃，收集上清；

10000g，30分钟，4℃，收集上清；

110000g，2小时，4℃，收集沉淀物并用35ml PBS缓冲液重悬沉淀；

110000g，2小时，4℃，收集沉淀物并用100-200μl生理盐水重悬沉淀。其中，间充质干细胞来源的外泌体的形态如图2所示。

3)所获得的外泌体在完成蛋白定量后置于-70℃长期保存。

实施例2脐带血CD34⁺细胞分离及培养

在本实施例中，发明人详细介绍了脐带血CD34⁺细胞分离及培养的实验过程：

1)取肝素抗凝的新鲜脐带血一份,转移至无菌玻璃瓶内，与PBS缓冲液等体积比轻摇混合均匀；

2)按4:1的体积比将脐血稀释液与0.5％的甲基纤维素轻摇混匀，于室温下静置沉降约30分钟，待红细胞自然沉降至液面界限分明后，将上清转移至50mL离心管内，室温离心，1800rpm/min离心5分钟；

3)弃上清，加入10mLPBS重悬细胞，室温离心，1800rpm/min离心5分钟，结束后吸弃上清并用5ml PBS重悬细胞；

4)在离心管中加入预热至室温的人淋巴细胞分离液[Ficoll-Hypaque液，(1.077±0.0002)g/L]5mL，将细胞悬液沿着管壁缓慢加至分离液液面上，室温离心,2000rpm/min离心25分钟；

5)吸取单个核细胞层并转移至新离心管中，室温离心，2000rpm/min离心5分钟后弃上清；用PBS缓冲液洗涤细胞一次；随后吸弃上清，用1ml PBS缓冲液重悬细胞并进行细胞计数。调整细胞密度至每300μl PBS中含有10⁸细胞；

6)向细胞悬液中加入100μl的封闭试剂及100μl的抗人CD34磁珠抗体(美天旎公司，德国)，混合均匀后置于4℃避光旋转孵育细胞45分钟；

7)向细胞悬液中加入10ml的PBS缓冲液，4℃离心,2000rpm/min离心5分钟，弃上清后用2ml PBS缓冲液重悬细胞；

8)将细胞悬液加入预先放入磁场的分离柱当中，使细胞悬液自然通过磁场，随后用1ml PBS缓冲液将吸附于分离柱内的CD34⁺细胞冲出，室温离心,2000rpm/min离心5分钟；

9)吸弃离心后上清，用CD34⁺细胞培养基重悬细胞后置于低吸附孔板中进行长期培养。

其中，CD34⁺细胞培养基配方为：

用CD34⁺细胞培养基培养CD34⁺细胞后细胞数随时间变化的曲线图如图3所示。结果表明，对照组(未添加外泌体，添加了重组人干细胞生长因子、重组人血小板生成素、重组FMS样酪氨酸激酶3配体)的细胞数明显少于外泌体添加组的细胞数。

实施例3检测造血干/祖细胞的比例

在本实施例中，发明人通过流式细胞检测方法检测了经过上述CD34⁺细胞培养基培养后的细胞培养物中造血干/祖细胞的比例。

1)吸取培养细胞并置于1.5ml的EP管中，室温离心2000rpm，5分钟；

2)吸弃上清，用1ml PBS缓冲液重悬细胞，室温离心2000rpm，5分钟；

3)吸弃上清，用100μl的PBS重悬细胞，加入0.2μl/管FVS510抗体(BD公司，美国)，室温避光孵育30分钟；

4)向每管加入1ml PBS缓冲液，室温离心2000rpm，5分钟；

5)吸弃上清，用100μl的PBS重悬细胞，加入CD34、CD38、CD45RA、CD90、CD49f抗体(均来自eBioscience公司)，室温避光孵育20分钟；

6)向每管加入1ml PBS缓冲液，室温离心2000rpm，5分钟；吸弃上清后重复该步骤；

7)将细胞用300μl PBS缓冲液重悬，进行流式检测。

结果如图4所示，结果表明，经过含外泌体的培养基处理CD34⁺细胞12天后，CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺为代表的较为原始的造血干/祖细胞的数量及比例同未处理组相比显著升高，表明外泌体能够促进造血干/祖细胞的扩增及自我更新能力的维持。

实施例4造血集落形成实验

在本实施例中，发明人通过集落形成实验检测了经过上述CD34⁺细胞培养基培养后的细胞的造血集落形成能力。

1)吸取2ml H4434半固体集落培养基(Stemcell公司，加拿大)放入离心管中，吸取8X10⁴个培养细胞注入半固体培养基中，反复吹吸混匀；

2)按0.5ml/孔体积吸取混有细胞的半固体培养基，小心接种于低吸附24孔板中，每组三个重复孔；

3)在孔板空白和间隙处加入适量无菌PBS；将孔板置于培养箱中培养14天，随后进行集落数的统计。

结果如图5所示，结果表明外泌体添加组的集落形成能力强于对照组(未添加外泌体，只添加了重组人干细胞生长因子、重组人血小板生成素、重组FMS样酪氨酸激酶3配体)，进一步表明经外泌体处理的细胞培养物中造血干/祖细胞的比例较对照组显著升高。

实施例5

在本实施例中，发明人通过实验考察了造血干/祖细胞在不同培养环境中的增殖情况，具体如下所述：

对分离的CD34+细胞分别培养于四组培养基中，分别为StemSpan培养基组，StemSpan培养基+细胞因子组，StemSpan培养基+外泌体组以及StemSpan培养基+细胞因子+外泌体组。经过12天的培养发现，造血干/祖细胞的数量由图6所示。图6结果显示，在培养基中含有细胞因子的前提下，外泌体能够更加显著地提高造血干/祖细胞增殖效率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。