Hiv基因检测芯片和hiv核酸检测方法

专利名称：Hiv基因检测芯片和hiv核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒(HIV)基因检测芯片和HIV核酸检测方法。
HIV的实验室诊断包括病原学诊断和免疫学检测，目前最常用的检测方法(包括初筛和确诊)为抗体检测法。该方法具有特异性强、灵敏度高等优点，但由于检测的是人体内产生的针对HIV的特异性抗体，因此，必须要等到HIV病毒在体内繁殖一段时间，刺激机体产生一定滴度的抗体后，才能检测出。而在体内抗体产生之前的这段时期，尽管病人体内已经感染了HIV，但检测结果仍然为阴性，这段时期称之为窗口期，一般在6-1 2周内。因此，用抗体法确诊HIV感染的也一般在感染后的6-12周以后。除抗体法以外，其他如HIV抗原检测和病原学检测中的病毒培养也都有14-21天和11天的窗口期。如果病人在窗口期献血，用目前常用的抗体法筛检，将检测不出HIV病毒，该血样视为合格，但输给别人后，将会造成艾滋病病毒的传播。因此，艾滋病病毒感染的早期诊断不仅对疾病的早期发现有重要意义，而且对控制其流行，提高用血安全性也具有极为重要的意义。
目前HIV的早期诊断趋势是HIV的核酸检测。通过检测来自受试者的样本中是否存在HIV核酸来判断受试者体内是否感染HIV。这种方法只要体内存在HIV病毒就可以检测，理论上不存在窗口期。目前，用于HIV核酸检测的试剂和方法主要有罗氏公司的Amplicor(Saag S et al.HIV viral load markers inclinical practice.Nature Medicine 1996；2625-629.)、拜尔公司的bDNA、Organnon Teknika NucliSens等，这些方法的特点是用一条HIV保守基因片段作为参照探针，病人体内的核酸片段经扩增后与之杂交(Bayer bDNA方法只扩增杂交信号)，这样如果为了提高检测的灵敏度，就需要加大探针的上样量，而大的上样量则会增加检测的非特异信号，降低检测特异性。
由于HIV是RNA病毒，因此HIV核酸检测中存在的另一个困难是检测时需要将RNA先逆转录成互补DNA再进行后续检测步骤。欲检测标本中的RNA时，目前的检测步骤是，先用逆转录引物将RNA逆转录成cDNA，然后用多条引物分几次扩增，标记后再与靶DNA杂交。不仅操作烦琐，还增加了成本和交叉污染的机会。因此，这种方法很难在基层临床检测中得到推广和应用。在该领域迫切需要能够在一个试管中一次性完成逆转录、扩增和标记的方法。
另一方面，本发明提供了一种新的HIV核酸检测方法，该方法通过检测样本中HIV特异基因来判断样本中是否存在HIV核酸。该方法可用于HIV感染的窗口期，周岁内的新生婴儿期和临床用血安全方面的检测。具体而言，该方法包括以下步骤(A)从样本中分离RNA；(B)将得到的RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；(C)将标记好的探针与HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。
本发明采用六条或多条探针，很好地解决了灵敏度与特异性之间的制约关系，提高了产品的质量和实用性，同时多条探针同时应用也更好地解决HIV核酸半定量方面的问题，而HIV体内核酸半定量的测定对病人预后、药物疗效的评估，具有重要意义。
图2显示用本发明的方法检测HIV患者样本的结果。
阳性对照是具有SEQ ID NO7的序列的核酸片段。阴性对照是具有SEQ ID NO8的序列的核酸片段。阴性对照采用的是一段植物基因，与HIV片段同源性很低。阴性对照应该与HIV基因片段无非特异性杂交反应，如阴性对照出现杂交阳性信号，说明芯片受到HIV核酸片段的污染或RT-PCR反应体系受到其它核酸片段的污染。阳性对照采用小鼠GAPDH基因片段，与HIV基因片段同样没有非特异性杂交反应，并且该片段的质粒克隆扩增效率很高，在RT-PCR地高辛标记反应体系中加入微量的该克隆质粒即可产生高效的扩增。如果芯片杂交后没有该片段的杂交阳性信号，说明RT-PCR标记反应体系出现问题，如少加了某种RT-PCR反应成分或反应体系有逆转录酶或TaqDNA聚合酶的抑制剂。通过设置阴性对照和阳性对照，有效排除了假阳性和假阴性反应。
在本发明的一个具体实施方案中，HIV基因检测芯片为膜芯片，基因点样直径为0.15-0.2mm的斑点，膜芯片的大小为4cm×3.5cm，六个HIV基因片段以六个浓度梯度点样，点样数为36个，另加阳性对照样6个，阴性对照样6个。
本发明的HIV核酸检测方法包括以下步骤(A)从样本中分离RNA；
(B)将得到的RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；(C)将标记好的探针与HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。
其中所述样本可以是血液、血清、血浆、淋巴液、精液、尿液、唾液和脑脊液。从样本中分离RNA的方法是本领域技术人员熟知的。
在本发明的HIV核酸检测方法中，逆转录步骤中所使用的引物是具有SEQ ID NO9-13的序列的引物以及随机六核苷酸引物。核酸扩增采用Multiplex PCR方法，其中使用的引物是具有SEQ ID NO9-21的序列的引物。在实施本发明的方法时，一次加入上述所有引物和其他反应产物，反应就可以在一个试管中一次完成。
在本发明的方法中，完成杂交后，可以通过显色反应判断反应结果。显色步骤后，可以通过肉眼观察芯片上的杂交斑点，来判断反应结果，或者通过扫描仪扫描，从而进行定量测定。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。这些实施例仅为说明本发明，而非限定本发明。
其中上述针对HIV特异片段的寡核苷酸正向引物包括SEQID NO14-21。
其中上述针对HIV特异片段的寡核苷酸反向引物包括SEQ ID NO9-13。
其中随机六核苷酸引物是指能够与上述样品的HIV RNA接触，引发DNA的合成的长度为六个核苷酸的引物。随机六核苷酸引物的加入可以大大增强RT-PCR的效果。
(2)上述的正向引物、反向引物与六聚体寡核苷酸引物同时应用，引发DNA的合成(3)上述引物同时应用时，逆转录反应、PCR扩增同时在一个试管中一次完成。
所用方法为在一个200微升的PCR管中，混合以下成分


*引物组为SEQ ID NO.14+12，SEQ ID NO.20+10，SEQ ID NO.20+11，SEQ IDNO.11+9，SEQ ID NO.18+12，SEQ ID NO.15+12，SEQ ID NO.20+9，SEQ ID NO.16+9，sEQ ID NO.17+10，sEQ ID NO.119+11组合中的任一种。
按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和聚合条件如下

(4)将以上得到的片段克隆，所用方法为[1].感受态细胞的制备挑取JM109受体菌单菌落(2-3mm)于有2YT培养基的200ml锥形瓶中。
37度振荡(250rp)培养2.5小时(活细胞数不超过108个/ml)超净工作台上，倒入经消毒的50ml离心管中，盖严。
在冰浴中放置10分钟，使菌落冷却至0度。4度，4000rp离心10分钟收集菌体。弃上清夜，倒置在卫生纸上1分钟。加10ml预冷的0.1mol/L CaCL2，悬浮菌体。冰浴25分钟。离心(4度4,000rpm 10分钟)加入1.5ml预冷的0.1mol/L CaCL2小心悬浮。4度冰箱保存过夜。[2].连接在微型离心管中制备下列连接反应液，总量为10μl。
PMD 18-T Vector1μlControl Insert DNA 1μldH2O. 3μlSolutionI5μl16度反应过夜。[3].转化用微量移液器吸取已培养的感受态细胞100μl，加入小PCR管中，用微量移液器尖端混合均匀。
冰浴30分钟。
42度静置90秒。
冰浴2-3分钟。
加入800μl 37度预热的2YT培养基中置于摇床37度(200rpm)45分钟。
备取100-200μl涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。
倒置培养皿，37度培养过夜。挑取阳性克隆，测序证实后，-20度保存。(4)将上述序列的引物组合在不同病人血液中经RT-PCR证实后，选出特异性高，灵敏度高的引物组合探针，保存。(5)将保存的探针扩增后，用点膜仪固定于膜上，经后续处理固定，制成HIV基因检测芯片。[1].PCR扩增所用方法为

PCR循环如下

PCR产物纯化1.取40μl PCR产物，加200μl体积的(GENECLEAN Turbo盐溶液(BIO 101，GENECLEAN TURBO FOR PCR KIT，Cat No1103-200)，混匀。
2.将上述溶液转移至Turbo Cartridge，10,000rpm离心5秒。
3.加54ml无水乙醇到Wash Solution中，混匀后，取500μl到Turbo Cartridge。
4.离心5秒中，去下层洗液5.重复洗涤一次6.将空的Turbo Cartridge管离心4分钟，10,000rpm。
7.将Turbo Cartridge管移到一新管中，去掉TurboCartridge的盖子。
8.加30μl洗脱液室温放置5分钟。
9.离心30秒，10,000转/分，收集回收液(含PCR产物)10.-20度保存备用。
点膜
将纯化后的PCR产物转移到384孔微型板中，将浓度调整为0.5μg/μl，加入20XSSC，终浓度为6XSSC，然后调整为6个浓度梯度，用384.5a点膜仪(V&P Scientifics Corp.)点膜。
固定将点膜后的滤膜在80度真空环境下，烘烤30分钟，然后在紫外交联仪内65毫焦/cm2进行交联固定。
HIV基因检测芯片为多斑点的膜芯片，点样直径为0.15-0.2mm的斑点，膜芯片的大小如下4cm长×3.5cm宽，HIV基因点样为36个，六个片段以六个浓度梯度点样，阳性对照点样6个，阴性对照点样6个。基因点样为6个，基中5个检测基因，1个内参照基因将溶解了Carrier RNA的Solution I溶液分装成小份，4℃冰箱可保存6个月。如有沉淀，用之前37度加热，同一试剂加热勿超过5次。
加等体积的无水乙醇到SKVR洗涤液A中。
在SKVR洗涤液B中加无水乙醇至乙醇终浓度为35％。操作取一1.5ml的离心管，加入300μl SKVR结合溶液后，再加入200μl血浆，用微量移液器轻轻抽吸4次后，室温放置10分钟。取200μl DEPC处理的水放在一小离心管中，65℃水浴，预热备用。
向管中加250μl无水乙醇，上下颠倒试管3分钟。
将提纯树脂溶液(Solution II)摇匀至无肉眼可见的沉淀为止。加50微升提纯树脂溶液后，将全部液体上柱，12,000转/分，离心1分钟。
将柱子取出，移到一个2ml的新管中，小心打开盖子，加入600μl SKVR洗液A(Solution III)，12,000转/分，离心1分钟。第二次将柱子取出，移到一个2ml的新管中，小心打开盖子，加入600μl SKVR洗液B(Solution IV)，12,000rpm，离心1分钟。
第三次将柱子取出，移到一个2ml的管中，小心打开盖子，加入500μl 75％的乙醇，12,000rpm，离心1分钟。
最后将柱子转移到一个1.5ml的收集管中，小心打开盖子，加50μl预热的DEPC处理的水，65℃水浴5分钟，然后12,000rpm，离心2分钟保存离心后的液体(在1.5ml的收集管中)，备用。(B)将得到的病毒RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记，方法为

*混合引物为所有引物(SEQ ID NO.9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21)各取1μl充分混匀后的混合引物。按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和聚合条件如下


(C)将标记好的探针与膜上的探针杂交，洗涤后肉眼观察结果，扫描仪进行病毒半定量检测。具体方法为试剂配制a)经变性并被打断的鲑鱼精DNAb)把鲑鱼精DNA(Sigma，III型，钠盐)溶解于水配制成10mg/ml浓度(必要时于室温磁力搅拌2-4小时助溶)c)把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚氯仿各抽提一次，回收水相。
d)使DNA溶液快速通过17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。
e)加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。
f)离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度。
g)测定溶液的OD260值并计算出DNA浓度。
h)煮沸10分钟，分装成小份保存于一20度。
i)临用前置沸水浴中加热5分钟然后迅速在冰浴中骤冷。
预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑精DNA。Denhardt试剂Denhardt试剂(Denhardt，1996)通常配置成50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液(常为含有0.5％SDS和100μl/ml经变性并被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖(Ficoll，400型，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组分V；Sigma)，加水至终体积为500ml。预杂交和杂交杂交液的配制杂交液6XSSC5XDenhardr试剂0.5％SDS100μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA50％甲酰胺操作1、预杂交1)每一张杂交膜用杂交液2ml。
2)将杂交膜装入杂交袋中，加入2ml杂交液。尽可能将袋内空气挤压出来，加热封口，将其浸入42℃的水浴中温育1小时。
3)100℃加热5分钟使探针变性，迅速在冰水浴中骤冷。
4)将杂交袋剪开一角，加入探针，尽可能将袋内所有空气挤压出去，加热封口。
5)将杂交袋浸入42℃的水浴，杂交过夜。
6)取出杂交膜并将其置入一个盛有2XSSC和0.1％SDS的托盘内，于室温洗涤4次，每次5分钟。
7)将杂交膜转移至一个盛有0.2XSSC，0.1％SDS的平底塑料盒中，洗涤2次，每次30分钟。
8)将滤膜置于一叠纸巾上，以除去大部分液体。
2、显色1)将HIV膜放入封闭液中封闭30分钟2)加入2ml抗地高辛抗体稀释液(稀释度为1∶3000)3)用10m洗涤液洗涤2次，每次15分钟4)加入2ml检测缓冲液5分钟5)加入1ml NBT/BCIP底物溶液，平铺于膜上用塑料纸盖好，避光(勿晃动)，反应时间至阳性参照有清晰的斑点出现为止。
6)用水冲洗终止反应。
3、检测结果申请人采用本发明的HIV核酸检测方法检测了经过确认的HIV患者标本，具体情况如下。共检测了20例HIV感染者和5例阴性血清，均与原先的诊断结果相符。阳性标本来源于深圳市疾病控制中心艾滋病确认实验室。所有阳性标本均经该室用WB方法确认。病人血清中的病毒载量在＜50拷贝/ml到5万拷贝/ml范围内(经该室用Roche公司的HIV-1 MONITORTM TEST试剂盒测定)。阴性标本来源于深圳市疾病控制中心艾滋病确认实验室，经该室用硒标法确认为阴性。


图1为显示实验中使用的HIV检测芯片结构图。其中阴性对照为辣椒色素基因，与HIV基因无同源性，因此，在所有检测中，均不应出现杂交信号。HIV基因探针为保守的HIV基因，在与HIV感染者阳性病人血清杂交后，出现杂交信号，而正常人的血清不应出现杂交信号。阳性对照为GAPDH基因，只要操作和检测试剂无误，应出现杂交信号。1-6为不同的上样浓度。
图2为显示采用上述检测芯片检测以上经过确认的HIV阳性样本的结果。由该结果可见，本发明的HIV基因检测芯片和HIV核酸检测方法可以准确地检出样本中的HIV核酸。
权利要求
1.一种HIV基因检测芯片，其中在固相载体上固定有HIV特异性基因片段和阳性及阴性对照。
2.权利要求1的芯片，其中HIV特异性基因片段以不同的浓度梯度固定在固相载体上。
3.权利要求2的芯片，其中HIV特异性基因片段包括SEQ ID NO1-6的序列，阴性对照为SEQ ID NO7，阴性对照为SEQ IDNO8。
4.一种HIV核酸检测方法，包括以下步骤(A)从样本中分离RNA；(B)将得到的RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；(C)将标记好的探针与HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。
5.权利要求4的方法，其中所述样本可以是血液、血清、血浆、淋巴液、精液、尿液、唾液或脑脊液。
6.权利要求5的方法，其中逆转录步骤中所使用的引物是具有SEQ ID NO9-13的序列的引物以及随机六核苷酸引物。
7.权利要求5的方法，其中核酸扩增中使用的引物是具有SEQ IDNO9-21的序列的引物。
8.权利要求5的方法，其中在实施本发明的方法时，一次加入所有引物和其他反应产物，反应就可以在一个试管中一次完成。
9.权利要求5的方法，其中还包括在完成杂交后通过显色反应判断反应结果的步骤。
10.权利要求9的方法，其中在显色步骤后，通过扫描仪扫描进行定量测定。
全文摘要
本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒(HIV)基因检测芯片和HIV核酸检测方法，这种人类免疫缺陷病毒(HIV)基因检测芯片在固相载体上固定有HIV特异性基因片段和阳性及阴性对照；这种HIV核酸检测方法，包括以下步骤(A)从样本中分离RNA；(B)将得到的RNA转移到一个试管中一次完成逆转录、扩增和地高辛标记；(C)将标记好的探针与HIV基因检测芯片杂交，根据杂交结果判断样本中是否存在HIV。本发明可用于HIV感染的窗口期，周岁内的新生婴儿期和临床用血安全方面的检测。
文档编号C12Q1/68GK1478904SQ0212898
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月26日 优先权日2002年8月26日
发明者梁培华, 冯铁建, 吴炳义, 王晓辉, 赵广录, 陈琳, 丁野青, 张向阳 申请人:深圳市君轩生物技术有限公司, 深圳市疾病预防控制中心