专利名称：调控大豆抗逆性的转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的转录因子及其编码基因与应用。
大豆作为一种重要的油料和粮食作物，弄清其抗病抗逆机理，进而改善其抗病性及抗逆性，具有重要的理论及现实意义。
本发明所提供的抗逆转录因子名称为GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由174个氨基酸残基组成的蛋白质。所述序列2中自氮端到碳端第44-101个氨基酸残基保守结构域是转录因子GmDREB的AP2/EREBP功能保守域。
抗逆转录因子GmDREB的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由910个碱基组成，该基因的读码框为自3’端第155到第676位碱基，其表达主要受低温，高盐以及脱落酸诱导。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，如pBIN19以及由其衍生而来的pBI101，pBI121和pBI221系列载体(Bevan，1984核酸研究，128711-8721)，将本发明所提供的编码转录因子GmDREB的基因导入植物细胞，可获得对低温和高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。表达载体pBI121-GmDREB是利用常规分子生物学手段构建的带有本发明GmDREB cDNA的表达载体，它的基因图谱如
图1所示，该表达载体可用于转化大豆等双子叶植物。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)以及Ubiquitin启动子等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明GmDREB基因的表达载体可通过使用Ti(Tumor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
图2为GmDREB基因在大肠杆菌中的体外表达。
图3为Southern杂交分析结果。
图4为不同胁迫条件下Northern杂交检测的GmDREB基因表达特征。
取1μg总RNA通过12对(三条正向引物与四条反向引物组合)特异简并性引物进行各自独立的一步逆转录链式扩增反应(PCR)，3条对应于AP2/EREBP保守域N-端5’-GIRMRK-3’的正向引物(Forwardprimers)为GDF15’-GGIAT(A/C/T)CGIATGCGIAA(A/G)-3’；
GDF25’-GGIAT(A/C/T)CGIATGAG(A/G)AA(A/G)-3’；GDF35’-GGIAT(A/C/T)AG(A/G)ATGCGIAA(A/G)-3’。
4条对应于AP2/EREBP保守域C-端5’-ARLNFP-3’的反向引物(Reverse primers)为GDR15’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAGICGIGC-3’；GDR25’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAG(C/T)CTIGC-3’；GDR35’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AA(T/C)CTIGC-3’；GDR45’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AAICGIGC-3’。
上述引物中I为次黄苷(inosine)，PCR条件为4℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃1.5分-30循环；72℃10分；4℃保存。
PCR产物连接到pMD18-T载体上用于测序，再以阳性克隆为模板利用一对特异性引物GmDF1R5’-CTTCCGCATCCTTATTCC-3’和GmDR1F5’-GCGCGCCTTAACTTCCCC-3’，通过逆转录PCR反应扩增目的基因的5’端(PCR程序见kit D6122，Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)以及3’端(PCR程序见kit D6121，TakaraBiotech.(Dalian)Co.Ltd)。然后体外包装In vitro-GmDREB基因序列。再设计一对特异性引物GmDREBFd165，5’-AAAAGAATTCATGGAAGACAGGGATCACTG-3’，172；GmDREBRe676，5’-AAAACTCGAGATCTTGAAGCTCTTCGAGTT-3’657，94℃，3分；94℃1分，58℃1分，72℃1.5分-30循环；72℃10分；4℃保存，扩增mDREB-cDNA，PCR产物接于pMD18-T载体进行测序，得到了一个与体外包装序列完全一致的cDNA克隆，即序列1GmDREB的cDNA片段。该基因插入片段为910bp，含有522bp的开放阅读框架，编码174个氨基酸组成的多肽，其5’端为156bp，3’端为192bp。
实施例2、用于转化的融合表达载体的构建。
GmDREB cDNA表达载体的构建按常规分子生物学手段进行。将GmDREB编码区域利用GmDREB cDNA作模板进行PCR扩增并通过正向引物端的BamHI和反向引物端的SacI位点将其插入到pBI121双元表达载体中的一个CaMV35S启动子后面，得到一个融合表达载体pBI121-GmDREB，其图谱如图1所示，经酶切鉴定插入片段无误后，转化于农杆菌，再提取质粒经酶切确认成功转化于农杆菌中，该表达载体可直接用于植物，特别是大豆的转化。
实施例3、大豆GmDREB基因在大场杆菌中的体外表达鉴定将GmDREB cDNA编码区域连接于一个表达载体pGEX-4T-1上，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。而未经诱导的菌株却没有蛋白表达带出现。聚丙烯凝胶电泳谱带如图2所示，图中，M是Marker；1、3是经诱导的菌株；2是未经诱导的菌株。从图中可以看出，经诱导的菌株有蛋白条带出现，未经诱导的菌株没有蛋白条带出现。
实施例4、GmDREB基因在大豆基因组中的分析。
以地高辛(DIG)标记的GmDREB cDNA为探针，与经不同限制性内切酶(EcoRI，EcoRV，P-PstI以及XhoI)消化后的棉花基因组DNA在65℃条件下进行Southern杂交分析，并在高严谨度下洗膜(高严谨度的条件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，结果如图3所示，有多条杂交带出现，表明大豆基因组中存在着多拷贝的GmDREB基因，或者存在着低拷贝的GmDREB同源体。
实施例5、大豆GmDREB基因在逆境胁迫条件下的表达特征。
生长2个星期的大豆幼苗分别置于4℃水、250mM NaCl的水溶液，以及100μM脱落酸(ABA)溶液中进行光照培养，干旱处理是将生长2个星期的大豆幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水，并分别在1小时、3小时、5小时、7小时、12小时以及24小时取样，提取总RNA与GmDREB cDNA探针杂交分析。结果如图4所示，其中A是干旱处理的结果，B是4℃低温处理的结果，C是250mM NaCl处理的结果，D是脱落酸处理的结果，从图中可以看出，GmDREB的转录主要受低温与盐诱导，并不同程度受干旱以及ABA诱导。
序列表<160>2<210>1<211>910<212>DNA<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>1gcacctctat atatacatag acacatgtaa atggttgcaa agaaagataa gataggtacc 60agctttcaca tagtttattt aatccgttat atgccacctg atatataggc atattagcta 120gttaggtagg tatagtagtt aagttaattc aaccatggaa gacagggatc actgttgttc 180caacaattca acgatgatca caacaacaaa gaaaagaacg ggtagaagaa gtccaacatc 240ggataagctc aagaatcaac accgcgagaa gcagtcgatg aaaccttacc gtggaataag 300gatgcggaag tgggggaagt gggtggcgga gatcagagaa cccaacaaaa ggtcgaggat 360atggttgggt tcttacacga cacccgtggc cgccgcacgt gcctacgaca ccgctgtctt 420ttacctccgg ggtcccaccg cgcgccttaa cttccccgaa ctcttgttcc aggacgacga 480ccaggagggc agtgattcgg tgcagcacgg cgcagcaggg aacatgtccg ctgattccat 540tcgccgaaaa gccacgcaag tcggcgccag agtcgacgct ctccaaaccg cgcttcacca 600ccacgcgcca agtaccaact ctctcaatct caagcccgac ttgaacgagt ttccaaaact 660cgaagagctt caagattgat ataaatcaaa tatcaatatc aatcaatata tttaatttcc 720taagttcttt attaatatat agttttatgt gtgtatatat agatgatgat gcctcggagt 780tggggcttga aactaattaa ccccttccct tccccttaat ttagatatat cccttttctt 840gtttttccgt atcttcaatc ataatatcaa atcaaagaag tattattatt ttctaaaaaa 900aaaaaaaaaa 910<210>2<211>174<212>PRT<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>2Met Glu Asp Arg Asp His Cys Cys Ser Asn Asn Ser Thr Met Ile5 10 15Thr Thr Thr Lys Lys Arg Thr Gly Arg Arg Ser Pro Thr Ser Asp20 25 30ys Leu Lys Asn Gln His Arg Glu Lys Gln Ser Met Lys Pro Tyr35 40 45Arg Gly Ile Arg Met Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile50 55 60Arg Glu Pro Asn Lys Arg Ser Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Thr65 70 75Thr Pro Val Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Val Phe Tyr80 85 90Leu Arg Gly Pro Thr Ala Arg Leu Asn Phe Pro Glu Leu Leu Phe95 100 105Gln Asp Asp Asp Gln Glu Gly Ser Asp Ser Val Gln His Gly Ala110 115 120Ala Gly Asn Met Ser Ala Asp Ser Ile Arg Arg Lys Ala Thr Gln125 130 135Val Gly Ala Arg Val Asp Ala Leu Gln Thr Ala Leu His His His140 145 150Ala Pro Ser Thr Asn Ser Leu Asn Leu Lys Pro Asp Leu Asn Glu155 160 165Phe Pro Lys Leu Glu Glu Leu Gln Asp170 17权利要求
1.抗逆转录因子GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的转录因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第44-101个氨基酸残基保守结构域是转录因子GmDREB的AP2/EREBP功能保守域。
4.抗逆转录因子GmDREB的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述抗逆转录因子GmDREB的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第155到第676位碱基。
7.含有权利要求4所述基因的表达载体。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述表达载体为pBI121-GmDREB。
9.含有权利要求4所述基因的细胞系。
10.权利要求4所述基因在培育抗寒、抗盐植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了调控大豆抗逆性的转录因子及其编码基因与应用，本发明所提供的抗逆转录因子名称为GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。抗逆转录因子GmDREB的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK1477109SQ0212888
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月19日 优先权日2002年8月19日
发明者程宪国, 侯玉霞, 刘强, 陈受宜 申请人:清华大学, 中国科学院遗传与发育生物学研究所