专利名称：来源于番茄的抗逆性转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是来源于陆地番茄的转录因子及其编码基因与应用。
番茄作为一种重要的食用蔬菜植物，弄清其抗病抗逆机理，进而改善其抗病性及耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
本发明所提供的抗逆转录因子名称为LeDREB2，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由299个氨基酸残基组成的蛋白质。所述序列2中自氮端到碳端第86-143个氨基酸残基保守结构域是转录因子LeDREB2的AP2/EREBP功能保守域。
抗逆转录因子LeDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1238个碱基组成，该基因的读码框为自3’端第218到第1114位碱基，其表达主要受干旱、低温、高盐以及外来脱落酸、乙烯的诱导。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，如pBIN19以及由其衍生而来的pBI101，pBI121和pBI221系列载体(Bevan，1984核酸研究，128711-8721)，将本发明所提供的编码转录因子LeDREB2的基因导入植物细胞，可获得对干旱、低温和高盐胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。表达载体pBI121-LeDREB2是利用常规分子生物学手段构建的带有本发明LeDREB2 cDNA的表达载体，它的基因图谱如
图1所示。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)以及Ubiquitin启动子等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明LeDREB2基因的表达载体可通过使用Ti(Tumor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
图2为LeDREB2基因在大肠杆菌中的体外表达。
图3为Southern杂交分析结果。
图4为不同胁迫条件下Northern杂交检测的LeDREB2基因表达特征。
实施例2、用于转化的融合表达载体的构建。
LeDREB2 cDNA表达载体的构建按常规分子生物学手段进行。将LeDREB2编码区域插入在一个35S启动子后面，包装于含有TMV翻译增强子的pBI121双元表达载体上，得到一个融合表达载体pBI121-LeDREB2(其图谱如图1所示)，经酶切鉴定插入片段无误后，转化于农杆菌，再提取质粒经酶切确认成功转化于农杆菌中，该复合体可直接通过转基因技术用于植物，特别是番茄的转化。
实施例3、番茄LeDREB2基因在大场杆菌中的体外表达鉴定利用一对特异性引物LeDREB2F-317 5’-AAAAGAATTCCTTCTTCAGCCACTT-3’331，LeDREB2R-945 5’-AAAACTCGAGCGTAACTCGATCCCA-3’931通过PCR扩增得到一个包含AP2/EREBP结构域的cDNA片段(Size-624bp)，并将该cDNA片段插入到蛋白表达载体pGEX-4T-1中相对应的EcoRI和XhoI位点上，然后转化于大肠杆菌中，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。而未经诱导的菌株却没有蛋白表达带出现。聚丙烯凝胶电泳谱带如图2所示，图中，M是Marker；1、3是经诱导的菌株；2是未经诱导的菌株。从图中可以看出，经诱导的菌株有蛋白条带出现，未经诱导的菌株没有蛋白条带出现。
实施例4、LeDREB2基因在番茄基因组中的分析。
利用LeDREB2 cDNA作为探针，与经不同限制性内切酶(E-EcoRI，V-EcorV，P-PstI以及X-XhoI)消化后的番茄基因组DNA在65℃条件下进行杂交，并在高严谨度下洗膜，(高严谨度的条件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，结果如图3所示，除EcoRI消化基因组DNA呈现微弱两条杂交带外，其它均有多条杂交带出现，表明LeDREB2基因在番茄基因组中是一个多拷贝基因，或者在其基因组中存在着低拷贝的LeDREB2同源体。
实施例5、番茄LeDREB2基因在逆境胁迫条件下的表达特征。
将生长2个星期的番茄幼苗分别置于4℃水，250mM NaCl水溶液以及100μM脱落酸(ABA)溶液中进行光照培养，干旱处理是将生长2个星期的番茄幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水，并分别在1小时、3小时、5小时、7小时、9小时、12小时以及24小时取样，提取总RNA并利用实施例3中所示的引物进行定量(1μgRNA)RT-PCR扩增目的片段，然后转移到尼龙膜与LeDREB2 cDNA探针进行Northern杂交分析，并在高严谨度下洗膜。完全相同的步骤用于LeUbi3(LeUbi3一种番茄中存在的泛蛋白基因)分析。所用引物为LeUbi.3Fd-1463 5’-GTGAAAGCCAAGATCCAGGAC-3’1484；LeUbi.3Re-1857 5’-CAATCGCCAGCCTCCTTGTTG-3’1878(394bp)(Hoffman et al，1991，Ubi3accession number-X58253)，LeUbi3用做外部对照。结果如图4所示，其中A是干旱处理的结果，B是4℃低温处理的结果，C是250mM NaCl处理的结果，D是脱落酸处理的结果，从图中可以看出，LeDREB2的转录主要受低温，盐以及干旱诱导表达，而且外来的脱落酸以及乙稀也可诱导该基因的表达。
序列表<160>2<210>1<211>1238<212>DNA<213>番茄属陆地番茄(Lycopersicon esculentum L.)<400>1tctctctcat caaccctcct ctcctctccc ctctctctct atattctatt ttcacacact60aaaacagagc agctcgtcat ttcttcaaca tctctgtgta tacactgcgt tcagtttatt 120gagagtttcg caaatttaca gacatagttt tttcgcgaaa aaagagagag aagaaaacag 180agcaaacgta acaaaaacag agcaacacaa ttcatacatg ataataatgt ctacagagca 240accaaattgt tcagaaagta ctgaatctag ctgcaactct tcttcttctt cgtcgccctc 300atcgccatct tccgttcttc ttcagccact tccacaaatc aattcaaaaa atcgactcaa 360aagatgcaga ggtgaagagg aagtagaaga agaagaagac gtggtcgtta ataatccaaa 420tccgaagaag atgaataaaa acaacaacaa tggcagcagt actagtgttg tttcttatgt 480aggtgtacga atgagagcat ggggaaaatg ggtatccgaa atccgtgaac ctaaaaaaaa 540atcacggatt tggttaggta cctttgctac cccggaaatg gcggcgcgtg ctcacgacgt 600cgccgccatg tccattaaag gtacctcagc tatactcaat tttccccaat tttcacattt 660actgccccga cccgtcacgt gctccccacg tgacatccaa aacgccgccg taaaagccgc 720tcacatggat cacctaaatc caaaattctc aatattaccc gaaacctctg cggcgacgat 780gacctcatcg tcatcgtcgc tgtcgttagt ttcgggcgtt acatcctcct cgtcgtcgtt 840tcaagacgac gaggagtcaa gaccgtcgcc tccggagctg attccggagg cgacggggca 900gttgagtgag atagtggagc tgccaaaatt gggatcgagt tacgaattgg ttgaatcaac 960tcagagttta tttgaatcag atgaatggtg ggataataat tatggaaatt gtgaatattt 1020ttttggacaa gataattata ttagtagtaa tatggaattt acaggattag aaaatgtggt 1080ttcaaccagt tttgagagtt ttttatggca acattagaat aaaaaaaata atgttttttc 1140ttttgataat taattttaca ctttattttt ttttatgtaa tttaggtgga aattattgat 1200gaactttata cgtttcttgc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1238<210>2<211>299<212>PRT<213>番茄属陆地番茄(Lycopersicon esculentum L.)<400>2Met Ile Ile Met Ser Thr Glu Gln Pro Asn Cvs Ser Glu Ser Thr5 10 15Glu Ser Ser Cys Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Pro20 25 30Ser Ser Val Leu Leu Gln Pro Leu Pro Gln Ile Asn Ser Lvs Asn35 40 45Arg Leu Lys Arg Cys Arg Gly Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Glu50 55 60Asp Val Val Val Asn Asn Pro Asn Pro Lys Lys Met Asn Lys Asn65 70 75Asn Asn Asn Gly Ser Ser Thr Ser Val Val Ser Tyr Val Gly Val80 85 90Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro95100 105Lys Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Pro Glul10 115 120Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Met Ser Ile Lys Gly125 130 135Thr Ser Ala Ile Leu Asn Phe Pro Gln Phe Ser His Leu Leu Pro140 145 150Arg Pro Val Thr Cys Ser Pro Arg Asp Ile Gln Asn Ala Ala Val155 160 165Lys Ala Ala His Met Asp His Leu Asn Pro Lys Phe Ser Ile Leu170 175 180Pro Glu Thr Ser Ala Ala Thr Met Thr Ser Ser Ser Ser Ser Leu185 190 195Ser Leu Val Ser Gly Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Phe Gln Asp200 205 210Asp Glu Glu Ser Arg Pro Ser Pro Pro Glu Leu Ile Pro Glu Ala215 220 225Thr Gly Gln Leu Ser Glu Ile Val Glu Leu Pro Lys Leu Gly Ser
230 235 240Ser Tyr Glu Leu Val Glu Ser Thr Gln Ser Leu Phe Glu Ser Asp245 250 255Glu Trp Trp Asp Asn Asn Tyr Gly Asn Cys Glu Tyr Phe Phe Gly260 265 270Gln Asp Asn Tyr Ile Ser Ser Asn Met Glu Phe Thr Gly Leu Glu275 280 285Asn Val Val Ser Thr Ser Phe Glu Ser Phe Leu Trp Gln His290 295 299
权利要求
1.抗逆转录因子LeDREB2，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的转录因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第86-143个氨基酸残基保守结构域是转录因子LeDREB2的AP2/EREBP功能保守域。
4.抗逆转录因子LeDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述抗逆转录因子LeDREB2的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第218到第1114位碱基。
7.含有权利要求4所述基因的表达载体。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述表达载体为pBI121-LeDREB2。
9.含有权利要求4所述基因的细胞系。
10.权利要求4所述基因在培育抗旱、抗寒、抗盐植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了来源于番茄的抗逆性转录因子及其编码基因与应用，目的是提供具有较强抗逆特性的来源于番茄的转录因子及其编码基因。本发明所提供的抗逆转录因子名称为LeDREB2，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。抗逆转录因子LeDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK1477110SQ02128889
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月19日 优先权日2002年8月19日
发明者程宪国, 刘强, 侯玉霞 申请人:清华大学