专利名称：人类str基因型检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术产品，特别是涉及一种人类STR基因型检测试剂盒。
背景技术：
人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7mer组成的叫微卫星，又称它为短串联重复序列(Short Tandem Repeat.STR)。不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近年来建立了一种崭新的STR基因分型技术，该技术可将不同个体进行鉴别，并可进行个体间的遗传学分析，从而给法医学、考古学、遗传学以及肿瘤学等领域的发展带耒了新的变革。到目前为止，只有美国的PE和Promega两家公司先后推出了一种STR基因型检测试剂盒，但该类STR基因型检测试剂盒重点是针对白种人群的STR位点设计的，其对黄种人的STR基因型检测的适用性比较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确并且更适合黄种人的人类STR基因型检测试剂盒。
本发明为解决上述问题的技术方案是该试剂盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder、对照模板组成。
所述的DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder组分为DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上样缓冲液 900μl×1支5×反应混合物1.64ml×1支10×引物混合物A组D3S1358+TH01+D13S317 210μl×1支B组.TPOX+vWA+D7S820210μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 210μl×1支D组.D5S818+CSF1PO+D16S539 210μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048210μl×1支LadderA组.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支
B组.TPOX+vWA+D7S820110μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D组.D5S818+CSF1PO+D1 6S539 110μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048110μl×1支所述的试剂盒还包括内标，所述的DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder组分为DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 50μl×1支11×上样缓冲液 220μl×1支5×反应混合物410μl×1支10×引物混合物 210μl×1支LadderA组.标记的荧光素为TAMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B组.标记的荧光素为HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772 110μl×1支C组.标记的荧光素为FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048 110μl×1支内标由100～400bp组成，每两个片段之间相差20bp，标记的荧光素为ROX 110μl×1支本发明对人类STR基因型的检测，特别是对黄种人的人类STR基因型的检测具有以下积极效果(1)所选用的STR位点大部分可在国际罪犯基因库中通用，同时增加三个更适合中国人群的位点(D6S1043，D2S1772，D7S3048)，从而更具有适用性；(2)DNA提取方法，简单、快速、价格便宜，而且对人体和环境无污染；(3)检测中国汉族的结果为PM＜10-18；RCP＞99.9999％。超过了国内外规定的标准(国际标准为PM＜10-11；RCP＞99.73％)。
具体实施例方式
实施例一在本实施例中，本发明是采用银染技术检测人类STR基因型的。
本试剂盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder、对照模板组成，其组分为DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上样缓冲液 900μl×1支5×反应混合物1.64ml×1支10×引物混合物A组.D3S1358+TH01+D13S317 210μl×1支
B组.TPOX+vWA+D7S820 210μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 210μl×1支D组.D5S818+CSF1PO+D16S539210μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048 210μl×1支LadderA组.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支B组.TPOX+vWA+D7S820 110μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D组.D5S818+CSF1PO+D16S539110μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048 110μl×1支HS-Taq的制备本专利中使用的DNA聚合酶(HS-Taq)是热启动酶，该酶是在制备普通Taq酶的基础上，用抗酶抗体将酶的活性基团封闭起来，使其在常规或稍高温度下不具有酶的活性，只有经过90多度的高温处理，抗体蛋白质变性后，酶的活性才得以恢复。
11X上样缓冲液的配制55％溴酚兰、55％二甲苯兰、10mM NaOH、95％甲酰腰胺。
5×反应混合物的配制反应混合物中各组份之间的塔配和PH值将直接影晌到扩增产物量的高低以及非特异扩增带的多少。特别是在复合扩增体系中，镁离子浓度最为最要。其调整程序如下1、调整复合体系中各引物对之间的最佳浓度。
2、将调整好的引物混合物和镁离子浓度(一般设在1～5mM之间)进行棋盘滴定。
3、根据滴定结果，在无非特异带出现的前提下，选择扩增产量最高的镁离子浓度和引物浓度为最后选定的浓度。
各引物之间浓度的塔配为了确保在同一扩增体系中各位点的扩增产物量大致相等，而且无非特异带被扩增，所以各引物之间浓度的塔配至关重要。各引物间浓度的塔配程序如下1、先用超纯水或TE将合成的引物溶解成100～200PM。
2、成对的引物等体积混合后，分别稀释成0.2；0.1；0.05；0.025PM/100μl反应体积，在相同体系中进行扩增。
3、选择无非特异带、而且特异带较清楚的引物浓度为初筛浓度。
4、在同一复合扩增体系中，用各位点引物的初筛浓度进行复合扩增。
5、根据各位点之间扩增的产物量，以及非特异带出现的情况，在对相应位点的引物浓度进行增减。
6、一直调到每组中所有位点的扩增产物量基本相等，而且无明显非特异带，方为合格。
制备对照模板用基因克隆技术将某一个人在本发明中十五个位点的所有等位基因片段克隆出来，然后将各等位基因片段的重组质粒等量合并后分装，作为对照模板。
循环参数的筛选1、本扩增体系中所用的DNA聚合酶为热启动酶(HS-Taq)，因此必须经过较高温度和较长时间之后，才能恢复酶的活性，所以本专利中选定的预变性条件为96℃，5分钟。这也是人类巨大而复杂的染色体彻底变性所需要的条件。
2、根据本专利中所选择的各引物的TM值，确定60℃为退火温度。
3、根据上述原则和常规程序，设定本专利的循环参数为96℃预变性5分钟，然后95℃变性44秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分钟，循环5次。紧接着92℃变性30秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分钟，再循环25次。最后72℃保温10分钟。
Ladder的制备1、提取DNA。
2、从汉族中收集无任何血缘关系的检材200份以上，分别用单位点的引物进行扩增，从中筛选出每个位点的所有基因片段和内标中所需长度的扩增片断。
3、按《PCR技术实验指南》中第八章的程序，对PCR产物进行克隆。
4、按《分子克隆》中文版第二版第19页上的程序提取质粒DNA，并进行纯度和定量测定。
5、按基因扩增技术制备各等位基因片段，然后对各种片进行纯化和定量测定。
6、将各等位基因片段分外进行核酸序列分析，以测定各片段的大小和串联单位的重复次数。在此基础上，对各等位基因片段按国际通用的法则进行命名。
7、将各位点的等位基片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量进行分装。
本实施的检测步骤以下一、DNA的提取不同检材有不同的提取方法，其提取方法如下1、从全血中提取DNA取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的超纯水，混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，(若沉淀中仍有红细胞，需重复此操作1-2次)加入DNA提取液20μl，混匀，100℃煮5分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟，取2μl上清到20μl反应体积中进行扩增。
2、从其它有核细胞中提取DNA可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精斑、血痕和组织碎片等有核细胞的管中，100℃煮5分钟(可在扩增仪上进行)后，12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。
3、从附材上提取DNA用剪刀或其它锐器将带有人类有核细胞的布料、纸屑、泥沙等检材分割成小米大小后，放入0.5ml塑料离心管中，再加入本试剂中提供的DNA提取液使其全部淹没，再置100℃煮5分钟，然后取一小片(或小粒)煮过的附材直接放入PCR管中进行扩增二、按以下方法配制扩增混合物，并进行扩增取一支离心管，加(反应管数+1)×[(HS-Taq 0.4μl(用前必须用手指弹匀)+5×反应混合物4μl+10×引物混合物2μl+超纯水11.6μl)]，混匀后，每个反应管分装18μl，然后每个反应管分别加提取的DNA 2μl和一滴石蜡油(若模板DNA浓度太低，可适当增加其体积，但同时要减少超纯水体积，以保持总反应体积为20μl)，稍离心后进行扩增。
三、加2μl上样缓冲液到扩增产物中，混匀后准备电泳。
四、用95％乙醇-0.5％乙酸溶液将粘胶剂稀释100倍，然后用脱脂棉将其涂在干净的玻璃板上，室温下风于后便可用于制胶。
五、将两个边条分别放在两块玻璃之间的两边，玻璃和边条均在下缘对齐，各用两个长尾夹将边条固定在玻璃板之间，夹子的着力点正好在边条之上.以防玻璃变形，然后将长玻璃朝下，并水平放在一个支架上，准备灌胶。
六、加3滴TEMED及6滴10％AP到装有15ml 6％PAG的小烧杯中，边加边摇(不能太用力，以免产生气泡)，混匀后灌入夹层玻璃中(边灌边用手指敲击玻璃，以防产生气泡)，并尽快放好梳子。梳子插入胶中0.5cm左右即可。
七、待胶凝固一小时后，先松开四个长尾夹，并在短玻璃上缘两边各放一条塑料泡沫以填充短玻璃板比长玻璃板短的那一部分，然后用四个长尾夹将它们固定在电泳槽上(短玻璃朝内，长玻璃朝外)。然后用300V预电泳20分钟。
八、上样前慢慢取下梳子，并用电泳液冲洗电泳道。取2μl 11×上样缓冲液到20μl扩增产物中，充分混匀后，每道上样3μl，每种Ladder也各上3μl。
九、上样后600V电泳1小时左右，即蓝色指示剂跑到距离胶的下缘3cm左右时，即可银染色。
十、取下带胶的玻璃板到固定液中摇10分钟，倒掉固定液，用ddH2O漂洗两遍，再加染色液(用前将2克AgNO3溶于1000ml ddH2O中，放室温避光保存备用)摇15分钟后，在10秒内用ddH2O漂洗一遍，再用0.75M的NaOH漂洗一遍，然后立即加显色液(在100ml0.75M的NaOH中加入甲醛800μl，现配现用)摇至核酸带清楚为止(约15分钟左右)。倒掉显色液，用自来水充分漂洗后晾干，并观察结果。
十一、从等位基因频率统计表中(见中国汉族等位基因频率统计表)查找相应的基因频率，并按实施例三的方法计算相应的PM值和实施例四的方法计算相应的RCP值。
实施例二在本实施例中，本发明是采用荧光法检测人类STR基因型的。
本试剂盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder、内标、对照模板组成，其组分为DNA提取液 1.20ml×2支HS-Taq50μl×1支11×上样缓冲液220μl×1支5×反应混合物 410μl×1支10×引物混合物210μl×1支LadderA组.标记的荧光素为TAMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B组.标记的荧光素为HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772 110μl×1支
C组.标记的荧光素为FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048110μl×1支内标由100～400bp组成，每两个片段之间相差20bp，标记的荧光素为ROX 110μl×1支HS-Taq的制备、11X上样缓冲液的配制、5×反应混合物的配制、各引物之间浓度的塔配、Ladder的制备与实施例一相同，内标的制备与Ladder的制备相同。
本实施的检测步骤以下一、DNA的提取不同检材有不同的提取方法，其提取方法如下1、从全血中提取DNA取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的超纯水，混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，(若沉淀中仍有红细胞，需重复此操作1-2次)加入DNA提取液20μl，混匀，100℃煮5分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟，取2μl上清到20μl反应体积中进行扩增。
2、从其它有核细胞中提取DNA可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精斑、血痕和组织碎片等有核细胞的管中，100℃煮5分钟(可在扩增仪上进行)后，12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。
3、从附材上提取DNA用剪刀或其它锐器将带有人类有核细胞的布料、纸屑、泥沙等检材分割成小米大小后，放入0.5ml塑料离心管中，再加入本试剂中提供的DNA提取液使其全部淹没，再置100℃煮5分钟，然后取一小片(或小粒)煮过的附材直接放入PCR管中进行扩增二、以下方法配制扩增混合物，并进行扩增取一支离心管，加(反应管数+1)×[(HS-Taq 0.4μl(用前必须用手指弹匀)+5×反应混合物4μl+10×引物混合物2μl+超纯水11.6μl)]，混匀后，每个反应管分装18μl，然后每个反应管分别加提取的DNA 2μl和一滴石蜡油(若模板DNA浓度太低，可适当增加其体积，但同时要减少超纯水体积，以保持总反应体积为20μl)，稍离心后按下列条件进行扩增96℃预变性5分钟，然后95℃变性45秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分钟，循环5次。紧接着92℃变性30秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分钟，再循环25次。最后72℃保温10分钟。
三、分别用本发明中使用的四种荧光素(TAMRA，HEX，FAM，ROX)标记物在PE 310、377或其型号的全自动荧光核骏序列分析上作矩阵分析，以调整仪器的参数。
四、将内标分别三种荧光素标记的Ladder按适当比例混合后进行电泳，然后将电泳后的用激光扫描的荧光数据记录在电脑中。
五、将内标分别与每份检材的扩增产物按一定比例混合后，在相同条件下进行电泳，然后在电脑中通过内标，将扩增产物的电泳结果与Ladder进行比对，以得到每份检材所属的等位基因。
六、从等位基因频率统计表中(见中国汉族等位基因频率统计表)查找相应的基因频率，并按实施例三的方法计算相应的PM值和实施例四的方法计算相应的RCP值。
实施例三(人员个体识别)在STR-PCR基因分型的电泳图谱上，纯合子表现为一条特征带，杂合子表现为两条特征带。根据H-W定律，在处于遗传平衡的群体，纯合子基因型频率等于基因频率的平方，杂合子基因型频率等于两基因频率乘积的2倍。在个人识别鉴定中，当二份物证材料的STR基因型不同时，可排除二份材料来源于同一个体。如果二份材料的STR基因型相同，则按上述方法计算偶合概率。联合扩增多个STR位点，二检材的型别均相同，偶合概率PM为多个STR基因型频率的乘积。下表为一实际案例的计算结果(表中的“n”代表串联序列重复次数)。
通过下表的计算说明，用于比较的这两份检材不相同的可能性(即偶合概率PM)为7.5689×10-18。这个结果说明在全世界总人口(60亿人)中不可能有第二个重复的可能性，从而可以认定这两份检材来自同一个体。
实施例四(亲子鉴定)1、原理判定亲生关系的理论依据是孟德尔遗传的分离律。按照这`一规律，在配子细胞形成时，成对的等位基因彼此分离，分别进入各自的配子细胞。精、卵细胞受精形成子代，孩子的两个基因组一个来自母亲，一个来自父亲；因此同对的等位基因也就是一个来自母亲，一个来自父亲。鉴定的结果如果符合该规律，则不排除亲生关系，若不符合，则排除亲生关系(变异情况除外)。
在大多数情况下，母、子关系是已知的，要求鉴定假设父和孩子是否亲生关系。此时首先从母、子基因型的对比中，可以确定孩子基因中可能来自父亲的基因(生父基因，OG)。然后观察假设父亲的基因型，如果不具有生父基因，则可排除假设父与孩子的亲生关系。若假设父也具有生父基因，结果就不能排除假设父的亲生关系，假设某案例中母亲是vWA-16/17型，孩子为16/18型，从比较中可确定生父基因是vWA-18。此案中假设父1为vWA-14/20型；假设父2为vWA-14/18型。其中假设父1不具备生父基因vWA-18，故可排除他与孩子的亲生关系；相比之下，假设父2因具有vWA-18，不排除与孩子有亲生关系。
2、亲权指数的计算上例中假设父2不能排除父子亲生关系，但他不一定是孩子的生父，因为人群中vWA-18基因频率为0.1908。虽然生父必须有生父基因，但有vWA-18基因的男人不一定就是孩子的生父。按照概率理论，具有生父基因的假设父和具有生父基因的随机男人都有成为孩子生父的可能性。假设父提供生父基因成为孩子生父的可能性和随机男人提供生父基因成为孩子生父的机会的比值叫作亲权指数(paternity index，PI)。前一种可能性假设为X；后一种可能性假设为Y。上例中的假设父2基因型为vWA-14/18杂合子，他提供生父基因vWA-18的可能性为1/2，即X＝1/2。随机男人提供生父基因vWA-18的机会为该基因的频率，即Y＝0.1908。因此，此例的PI值为0.5/0.1908＝2.6208。如果假设父2的确是孩子的生父，则不论检测多少位点，均不会排除他与孩子的亲生关系，在所有检测的位点，每一个位点都可以计算出一个PI值，多个位点的累计PI值等于各个位点PI值的乘积，但前提条件是所检测的各位点之间没有遗传连锁关系。
三联体基因型组合的可归纳为三条原则(1)当假设父为纯合子时，X＝1；假设父为杂合子时，X＝1/2，但杂合子假设父的2个基因均可能是生父基因时，X＝1。(2)只涉及1个生父基因时，Y值等于生父基因的频率。(3)若涉及2个生父基因时，Y值为2个生父基因频率之和。
亲子鉴定的PI值简易计算法可参照《亲子鉴定DNA分型PI值简化计算法》。
例如某亲子鉴定案检测结果如下
经过14个基因座检测，均不排除孩子与AF有亲生关系，可计算出这14个基因座的PI值。然后各值相乘得到此案的累计PI值为9657145.0995。
2、父子关系相对机会(relative chance of paternity，RCP)上述计算出的PI值是一个绝对值，为使鉴定结果能够以概率形式表达父子关系的相对机会，PI值须转换成一种相对值RCP。计算出PI值后，RCP＝[PI/PI+1]×100％。按照国内外亲子鉴定的惯例，当RCP值大于99.73％时，则可以认为假设父与孩子具有亲生关系。如果RCP值达不到99.73％，应该增加检测位点数直至RCP大于99.73％为止。本试剂盒提供的九个基因座均是高多态性的，上例中检测这9个STR基因座都不能排除父子关系，RCP值为99.9999％，该值已大大超过99.73％。可以认定AF-C是亲生关系。亲子鉴定DNA分型PI值简化计算法表1.AF-C-M三联体PI值
表2.二联体AF-G的PI值 原则1.三联体AF-C-M鉴定例(1)当AF为纯合子时，X＝1；AF为杂合子时，X＝1/2；但杂合子AF的2个基因均可能是生父基因时，X＝1。
(2)只涉及一个生父基因时，Y＝生父基因频率。
(3)涉及2个生父基因时，Y＝2个生父基因频率之和。
2.二联体AF-C鉴定例将母亲传递必需基因机会按随机个体处理，即Xm＝(AF提供p机会)×q+(AF提供q机会)×pYm＝2pq
中国汉族等位基因频率统计表
权利要求
1.一种人类STR基因型检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder、对照模板组成。
2.根据权利要求1所述的人类STR基因型检测试剂盒，其特征在于所述的DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder组分为DNA提取液 1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上样缓冲液 900μl×1支5×反应混合物 1.64ml×1支10×引物混合物A组.D3S1358+TH01+D13S317 210μ1×1支B组.TPOX+vWA+D7S820 210μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 210μ1×1支D组.D5S818+CSF1PO+D16S539210μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048 210μl×1支LadderA组.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支B组.TPOX+vWA+D7S820 110μl×1支C组.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D组.D5S818+CSF1PO+D16S539110μl×1支E组.D6S1043+D2S1772+D7S3048 110μl×1支
3.根据权利要求1所述的人类STR基因型检测试剂盒，其特征在于它还包括内标，所述的DNA提取液、HS-Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder组分为DNA提取液 1.20m1×2支HS-Taq 50μl×1支11×上样缓冲液 220μl×1支5×反应混合物 410μl×1支10×引物混合物 210μl×1支LadderA组.标记的荧光素为TAMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B组.标记的荧光素为HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772110μl×1支C组.标记的荧光素为FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048 110μl×1支内标由100～400bp组成，每两个片段之间相差20bp，标记的荧光素为ROX110μl×1支
全文摘要
本发明涉及一种生物技术产品，为一种人类STR基因型检测试剂盒。本测试剂盒主要由DNA提取液、HS－Taq、上样缓冲液、反应混合物、引物混合物、Ladder、对照模板等组成。本发明与国外产品相比，更适合中国人群。检测中国汉族的结果为PM＜10
文档编号C12Q1/68GK1506470SQ0215216
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月9日 优先权日2002年12月9日
发明者张兹钧 申请人:张兹钧