多工试片装置及其操作方法与流程

本发明涉及一种多工试片装置及其操作方法，以应用于分子生物检测，尤其涉及一种用于聚合酶链反应(pcr)、可以预先充填聚合酶链反应试剂的多工试片装置及其操作方法。

背景技术：

在分子生物检测领域中，经常需要针对一个样品进行多种项目标的的检验。例如，通过聚合酶链反应检测，来检验一个样品中数种单核苷酸多态性(snp)的基因型，或是检验一个样品中多个基因表现程度。此时，就会需要由几个dna或rna检验(assay)组成一个检验套组(panel)。pcr检验中每组检验试剂中至少包括两个特定的dna引子分子(某些pcr检验中还额外包括目标特定的报导探针(reporterprobes))，这对引子(引子对)必须正确地与从要进行测试样品(样品)中所萃取的dna模板混合，方能检验出样品中特定dna目标是否存在或存在的量是多少。

传统上，引子对和样品置放于相同的反应容器以进行pcr。一般的置放方式通常是通过吸量管将单瓶储存的引子对、酶和dntp混合物和缓冲液试剂以及样品一一以手动方式以吸量管移液到反应容器中。最常见的承载容器是96孔盘。利用前述置放方式，pcr检测至少需要两回合(两回)的吸量管移液操作，其中一回添加样品到反应容器中，而另一回添加引子对到反应容器中。例如，假设利用一个检验套组来检查在一个样品中的36个目标，则需要至少36回移液操作以添加各自引子对到36个不同的反应容器中，另外，需要36回移液操作以添加样品至上述各反应容器。此种操作方式不仅复杂容易出错，而且须耗用大量的人力。

若在个别反应容器预先填充引子对，则实验操作者只需要添加样品到已经预先填充好的容器内。以前述例子而言，测试一个样品的36个目标，将只需要36回移液操作添加样品至预先填充好的36个反应容器中。此外，可同 时降低反应容器体积至约纳升(nano-liter)的范围内，以节省检测试剂使用量。在此改良下，常见作为承载容器的96孔盘，其样式将改为类似试片的微滴定板。

然而，微滴定板的反应容器(也称为微井或纳米井孔)的尺寸和体积太小，难以手动填充所用的引子对或样品并同时避免造成相邻反应容器之间的交叉污染(即引子对从一井散逸至其他井)，因此，需要特殊的微流体配剂分装技术。更详细而言，预先提供引子对至各纳米井并且固定引子于该纳米井的表面。之后，使用者即可以单一移液操作或通过单一微流体通道来添加样品到各反应容器中，而无须担心引子从一井散逸到其他井，使井与井之间的交叉污染降至最低。

后续进行样品检测时，每个反应容器中必须填充预定量的样品。传统的方法是，用移液吸管或针状分注器将样品逐个添加到反应井中。然而，随着反应容器体积变小，井间的距离越接近，设计特殊的机械机构的分注器或路径，个别传送至每个反应容器是复杂且耗时的。若藉由特殊的试片装置设计来达到单一移液操作或通过单一微流体通道来添加样品到各反应容器中，将可以大大简化聚合酶链反应配制检测试剂所需的人为操作，并增加填充样品的便利性。

技术实现要素：

本发明提供了一种多工试片装置及其操作方法，适用于分子生物检测；特别是，用于聚合酶链反应；且更具体地，应用于实时聚合酶链反应。藉由本发明的多工试片装置及其操作方法，样品可以迅速且均匀地载入试片的每一反应容器中，以单一回移液操作在很短的时间内便能填充所有的反应容器。

本发明提供一种多工试片装置，其包括试片及牺牲层。试片具有多个反应容器、第一注入孔与第一排气孔。反应容器布置为阵列，每一反应容器具开口部和底部。牺牲层具有微流道，微流道具有相互连通的注入流道、主要流道及末端流道。牺牲层适于与试片组装，其中主要流道面对开口部而组装。从第一注入孔注入样品溶液至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道，其中样品溶液在流过主要流道时，载入每一反应容器中。

在本发明的一实施例中，多工试片装置还包括用以容置试片及牺牲层的 壳体，壳体具有第二注入孔与第二排气孔，其中依序从第二注入孔及第一注入孔注入样品溶液至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道，其中样品溶液在流过主要流道时，载入每一反应容器中。

在本发明的一实施例中，壳体的材料包括导热材料。

在本发明的一实施例中，壳体包括上盖及底板，上盖适于与底板组装，且上盖具有用以容置试片及牺牲层的凹槽，第二注入孔及第二排气孔位于上盖中。

在本发明的一实施例中，试片的材料包括透光性材料。

在本发明的一实施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本发明的一实施例中，牺牲层的材料包括蜡。

本发明提供一种多工试片装置，其包括试片及牺牲层。试片具有多个反应容器，且反应容器布置为阵列，每一反应容器具有开口部和底部。牺牲层具有微流道，微流道具有相互连通的注入流道、主要流道及末端流道。牺牲层适于与试片组装，其中主要流道面对开口部而组装。将样品溶液注入至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道，其中样品溶液在流过主要流道时，载入每一反应容器中。

在本发明的一实施例中，还包括用以容置试片及牺牲层的壳体，壳体具有注入孔与排气孔，其中从注入孔注入样品溶液至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道，其中样品溶液在流过主要流道时，载入每一反应容器中。

在本发明的一实施例中，壳体的材料包括导热材料。

在本发明的一实施例中，壳体包括上盖及底板，上盖适于与底板组装，且上盖具有用以容置试片及牺牲层的凹槽，注入孔及排气孔位于上盖中。

在本发明的一实施例中，试片的材料包括透光性材料。

在本发明的一实施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本发明的一实施例中，牺牲层的材料包括蜡。

本发明提供一种多工试片装置的操作方法，包括组装包含试片、牺牲层及用以容置试片及牺牲层的壳体的多工试片装置。试片具有布置为阵列的多个反应容器，每一反应容器具开口部和底部，牺牲层具有微流道，微流道具有相互连通的注入流道、主要流道及末端流道，其中主要流道面对开口部而 组装。接着，将样品溶液经由壳体的注入孔注入至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道，其中样品溶液在流过主要流道时，载入每一反应容器中。之后，将油经由壳体的注入孔注入至注入流道，以使油从注入流道流过主要流道至末端流道，其中油在流过主要流道时，排除未装载于反应容器中的样品溶液。接下来，加热以使牺牲层熔化，熔化后的牺牲层与油混合。

在本发明的一实施例中，油包括矿物油或硅油。

在本发明的一实施例中，壳体的材料包括导热材料。

在本发明的一实施例中，试片的材料包括透光性材料。

在本发明的一实施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本发明的一实施例中，牺牲层的材料包括蜡。

基于上述，本发明提供了一种多工试片装置及其操作方法，使样品在流过牺牲层的主要流道时，迅速且均匀地载入试片的每一反应容器中，再藉由油排除未装载于反应容器中的样品溶液。如此一来，以单一回移液操作在很短的时间内便能填充所有的反应容器，因此，能够简化实验操作并节省时间。

另一方面，试片与牺牲层之间间隔至少约10μm的距离，而牺牲层具有一定厚度。在聚合酶链反应的实验过程中，加热以使牺牲层熔化，熔化后的牺牲层与油混合，进而使试片与底板之间具有约600μm的距离，以使反应顺利进行。由于不需添加过量样品，即可使试片与底板之间维持特定距离，因此，具有节省样品添加量的作用。

为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合附图作详细说明如下。

附图说明

图1是根据本发明第一实施例的多工试片装置的结构示意图；

图2是根据本发明第一实施例的试片的结构示意图；

图3是根据本发明第一实施例的试片的反应容器的剖面示意图；

图4是根据本发明第一实施例的多工试片装置应用于样品溶液装载的示意图；

图5是根据本发明第二实施例的多工试片装置应用于样品溶液装载的示 意图；

图6a至图6c是根据本发明多工试片装置的操作方法的示意图。

附图标记：

10：试片

12、42：注入孔

14、44：排气孔

16：双阶结构

20：牺牲层

22：注入流道

24：主要流道

26：末端流道

28：微流道

30：壳体

40：上盖

50：底板

60：空间

70a、70b：样品溶液

80：油

100：检测区域

102、160a、160b、160c、160d、160e、160f：反应容器

102a：开口部

102b：底部

x：第一阶

y：第二阶

具体实施方式

本发明提供一种多工试片装置及其操作方法，可以广泛地应用于不同类型的反应检验。下文中，先针对说明书内文所使用的名词加以定义说明。

“试剂”可指用于一个特定测试/检验的数种成分的配方或制剂。例如，在采用聚合酶链反应的试验中，检测试剂包括一对引子、酶、dntps、荧光 报导物与盐类等。在应用程序中，不同的引子对和荧光报导物可能先被添加到反应容器中，再其次是样品与酶、dntp和其它添加剂混合再加到反应容器中。

“样品”是指被测试的核酸样品。例如，样品可以是从血液、组织、唾液等来源中提取的核酸片段(包括dna或rna等)。

“分析”或”试验”可指对同一样品进行的一或多个实验或测试项目。例如，使用pcr来针对核酸样品检测300单核苷酸多态性(300snp)基因型，该检测包括数种pcr检测项目，通过检查每个单核苷酸多态性(snp)的每个基因型(a、t、c、g)。例如，使用实时荧光定量pcr确定一个特定序列的核酸量。

“样品溶液”指的是上述“样品”与混合试剂(mastermix)的混合物或混合溶液。

“反应容器”可指管盘的各个管、各反应管、微滴定板的孔或井，或测试试片或阵列板的凹坑/孔。如本文所述，“试片”、“试片板”、“检测阵列板”或“检测板”均可指容纳前述反应容器的同一基底或基板。

当在容器中的液体体积减小到一定程度时，在容器中的液体流动主要是由表面的附着力而非重力所控制。如果容器中的液体体积只有几纳升，该液体具有较高的表面黏附性会黏着到容器(纳井)上，也就是说，此时液体可以被视为黏接剂般稳定附着至容器底部或容器壁上。

较佳的，反应容器可以是试验试片或检测阵列板的单个反应孔或井。正如前面所讨论的，优选乃是使用更小的体积的反应容器，其尺寸例如从几纳升到几百纳升不等。

图1是根据本发明第一实施例的多工试片装置的结构示意图。

请参照图1，多工试片装置包括试片10、牺牲层20以及壳体30，其中壳体30可用以容置试片10及牺牲层20。在下文中，将先参照图2及图3，针对试片10的结构进行详细说明。

图2是根据本发明第一实施例的试片的结构示意图。

请参照图2，试片10具有检测区域100，且检测区域100的面积例如是22.5毫米×22.5毫米。检测区域100中包含多个反应容器102，且反应容器102布置为n×n阵列。此外，试片10更具有注入孔12与排气孔14。在本实施例 中，试片10的尺寸例如是42毫米×36毫米×2毫米。更详细而言，试片10的材料可包括透光性材料，且透光性材料例如是聚碳酸酯(pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)。

请再参照图2，从试片10的剖视图(图2的右侧部分)来看，每一反应容器102具有较宽的开口部102a和较窄的底部102b。在本实施例中，每个反应容器102的深度d1例如是100微米，其开口部102a的尺寸例如是200微米(l1)×185微米(w1)，底部102b的尺寸例如是106.74微米(l2)×91.74微米(w2)。反应容器102之间的间距p1范围例如是25微米至40微米。反应容器102的倾斜侧壁的角度θ例如是90度至140度，优选在100度至135度之间，更优选在110度至120度之间。每一反应容器102可以容纳例如2.1纳升的样品溶液。

图3是根据本发明第一实施例的试片的反应容器的剖面示意图。

请参照图3，试片10的反应容器可以设计成具有不同的形状或配置方式。举例而言，反应容器160a及160b乃是在试片10内形成的凹槽但没有贯通试片10。反应容器160b、反应容器160d及反应容器160f具有倾斜侧壁。反应容器160c、反应容器160d、反应容器160e及反应容器160f贯穿试片10而在试片10的顶面和底面上有两个开口端。由于毛细作用，样品液体能稳滞于反应容器160c、反应容器160d、反应容器160e及反应容器160f中。反应容器160d穿透试片10且在试片10的顶面和底面上具有两个开口端，并有倾斜的侧壁连接的两个开口端。

然而，图2及图3中所示的结构图仅用于例示说明本实施例，本发明反应容器的形状、大小或数量并不以此为限，且反应容器的横截面形状亦可以是例如圆形，方形或多边形。

一般情况下，引子是溶于水性溶剂或溶液，本发明的试片可设计为反应容器的内壁和底表面是亲水性的，而各反应容器之间是疏水性的。试剂或探针将只附着至亲水性区域，也就是说，只附着到反应容器的内壁和底部表面。每个反应容器的尺寸可以是小于1毫米。以此尺寸大小规模，少量的样品液体可以在10秒内溢流填充大量的反应容器，显著提高了样品装载效率。

图4是根据本发明第一实施例的多工试片装置应用于样品溶液装载的示意图。接着，在下文中，将同时参照图1、图2及图4对本发明第一实施例 的多工试片装置的结构及其于样品溶液装载的应用进行说明。

请参照图1，牺牲层20具有微流道28，且微流道28具有相互连通的注入流道22、主要流道24及末端流道26。在本实施例中，牺牲层20的材料可包括蜡，因此，在聚合酶链反应中加热至约60℃时可熔化。然而，本发明并不以此为限，亦可使用任何可熔温度范围在高于室温至60℃的材料，且较佳使用可熔温度为约60℃的材料。更详细而言，牺牲层20的尺寸例如是37.6毫米×39.6毫米×1.3毫米，微流道28的深度例如是0.12毫米，主要流道24的尺寸例如是22.5毫米×22.5毫米。

请同时参照图1及图2，牺牲层20适于与试片10组装，其中主要流道24面对试片10中反应容器102的开口部102a而组装。请同时参照图1、图2及图4，可从试片10的注入孔12注入样品溶液至注入流道22，以使样品溶液从注入流道22流过主要流道24至末端流道26，其中样品溶液在流过主要流道24时，载入试片10的每一反应容器102中(样品溶液的流动方向如图4中的虚线箭头所示)。

在图2中，试片10的注入孔12与排气孔14以对角线形式配置，但本发明并不以此为限，注入孔12与排气孔14的配置方式亦可依牺牲层20的注入流道22及末端流道26的配置方式而加以调整，只要能够使样品溶液在流动过程中充分延展即可。

如图1所示，壳体30可包括上盖40及底板50，其中上盖40适于与底板50组装。更详细而言，上盖40的尺寸例如是45mm×43mm×5mm，底板50的尺寸例如是42mm×40mm×2mm。在本实施例中，上盖40可具有用以容置试片10及牺牲层20的凹槽，且注入孔42及排气孔44可位于上盖40中。然而，本发明中壳体30的结构并不以此为限，亦可使用任何其他能够容置试片10及牺牲层20的结构。举例而言，壳体30也可以是一体成型结构，其中具有卡榫而能够开合以置入试片10及牺牲层20。此外，亦可以使用导槽推进结构使试片10及牺牲层20容置于壳体30中。

更详细而言，壳体30在聚合酶链反应中具有导热的作用，其材料可包括导热材料，导热材料例如是铝或铜等金属、石墨或晶圆，但本发明并不以此为限。此外，壳体30更具有使试片10及牺牲层20与外界隔绝，以避免反应受到影响的作用。

在本实施例中，壳体30可包括标示标签(未显示)，当本发明的多工试片装置应用于设置有标签读取装置的仪器(例如：热循环仪)时，标签读取装置可以读取壳体30上的标示标签，其中标示标签例如是手写标记、条形码或其他标记，但本发明并不以此为限，亦可依需求及所搭配使用的标签读取装置选择适用的标示标签。

请同时参照图1、图2及图4，可依序从壳体30的注入孔42及试片10的注入孔12注入样品溶液至注入流道22，以使样品溶液从注入流道22流过主要流道24至末端流道26，其中样品溶液在流过主要流道24时，载入试片10的每一反应容器102中(样品溶液的流动方向如图4中的虚线箭头所示)。另外，如图4所示，试片10可更具有位于其边缘处的双阶结构16，双阶结构16与牺牲层20、上盖40及底板50之间可形成空间60，空间60具有防止气泡产生的作用。在本实施例中，双阶结构16可具有第一阶x以及第二阶y，其中第一阶x与第二阶y的厚度比例例如是1:1，且第一阶x与第二阶y的厚度例如分别是1mm，总厚度例如是2mm。

在图1中，上盖40的注入孔42及排气孔44以对角线形式配置，但本发明并不以此为限。注入孔42及排气孔44的配置方式是依据试片10的注入孔12与排气孔14的配置方式而定。即，如上文所述，可依牺牲层20的注入流道22及末端流道26的配置方式而加以调整，只要能够使样品溶液在流动过程中充分延展即可。

图5是根据本发明第二实施例的多工试片装置应用于样品溶液装载的示意图。图5所示的第二实施例相似于图1、图2、图3及图4所示的第一实施例，故相同组件以相同标号表示且在此不予赘述。

本实施例与上述第一实施例不同之处在于，试片10不具有注入孔12及排气孔14，且试片10不具有位于其边缘处的双阶结构16。此外，牺牲层20的尺寸大于试片10的尺寸。举例而言，试片10的尺寸可与上述第一实施例相同，而牺牲层20中主要流道24的尺寸例如是大于22.5毫米×22.5毫米。

请参照图5，可从壳体30的注入孔42注入样品溶液至注入流道22，以使样品溶液从注入流道22流过主要流道24至末端流道26，其中样品溶液在流过主要流道24时，载入试片10的每一反应容器102中(样品溶液的流动方向如图5中的虚线箭头所示)。

本发明更提供一种上述第一实施例及第二实施例中所述多工试片装置的操作方法。图6a至图6c是根据本发明的多工试片装置的操作方法的示意图。接着，在下文中，将参照图6a至图6c对本发明的多工试片装置的操作方法进行说明。必须说明的是，有关多工试片装置的结构及样品溶液装载的细节已于上文中详细地描述，故在此不予赘述。

首先，组装多工试片装置，经组装完成的多工试片装置经例如点胶方式固定密封以维持气密状态，避免样品溶液向外流动。

接着，藉由移液操作(pipetting)或其他适用的液体分装器，将样品溶液经由壳体的注入孔注入至注入流道，以使样品溶液从注入流道流过主要流道至末端流道。如图6a所示，样品溶液70a及样品溶液70b在流过主要流道24时，载入每一反应容器102中。更详细而言，样品溶液的添加总量例如是60μl。

之后，将油经由壳体的注入孔注入至注入流道，以使油从注入流道流过主要流道至末端流道。如图6b至图6c所示，油80在流过主要流道24时，排除未装载于反应容器102中的样品溶液70b。更详细而言，油例如是矿物油或硅油。

接下来，在聚合酶链反应的实验过程中，加热以使牺牲层熔化，熔化后的牺牲层与油混合，其中牺牲层经加热以融化的温度例如是约60℃。必须说明的是，本发明的试片与牺牲层之间间隔至少约10μm(例如是10μm至50μm)的距离，而牺牲层具有一定厚度(例如是550μm至590μm的厚度)。因此，当熔化后的牺牲层与油混合时，能够使试片与底板之间具有约600μm的距离，以使反应顺利进行。由于不需添加过量样品，即可使试片与底板之间维持特定距离，因此，具有节省样品添加量的作用。

综上所述，本发明提供了一种适用于分子生物检测的多工试片装置及其操作方法，使样品溶液在流过牺牲层的主要流道时，迅速且均匀地载入试片的每一反应容器中，再藉由油排除未装载于反应容器中的样品溶液。如此一来，以单一回移液操作在很短的时间内便能填充所有的反应容器，因此，能够简化实验操作并节省时间。此外，由于不需添加过量样品，即可使试片与底板之间维持特定距离，因此，本发明更具有节省样品添加量的作用。

虽然本发明已以实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何所属 技术领域中普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的改动与润饰，故本发明的保护范围当视所附权利要求界定范围为准。