一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。
背景技术：
：五加皮来源为五加科植物细柱五加的干燥根皮。五加皮用药历史悠久，首载于《神农本草经》。祛风除湿，补益肝肾，强筋壮骨，利水消肿。以五加皮为主制成的五加皮酒，具有祛风祛湿，舒筋活血的功能，常用来治疗风湿性疾病。根据现代研究表明，五加皮具有抗炎、抗肿瘤、抗应激、免疫调节、保护肝脏等作用。由于其临床疗效，五加皮的应用越来越广泛，越来越受到研究者的关注。然而，各地药材市场中经常有伪品做五加皮出售，容易引起安全问题。我国有五加属18个种，分布在全国大部分地区，由于历史和地理因素，细柱五加的近缘种常被用作五加皮在地方中使用，可能会影响临床疗效，例如，红毛五加广泛分布于四川、甘肃、青海、宁夏等地，在四川、广东等地被作为五加皮应用已有很长的历史。无梗五加分布于黑龙江、吉林、辽宁等地，药材在产区做五加皮使用。更为严重的是市场中经常发现香加皮作为五加皮出售的现象。香加皮来源于萝摩科植物杠柳的干燥根皮。香加皮作五加皮混用的历史很长，在药材销售渠道还习惯将五加皮成为“南五加皮”，把香加皮叫做“北五加皮”，二者形态和名字相似，但功效和化学成分不同，香加皮没有补益肝肾的功效，且含有毒的杠柳毒苷等强心苷类化合物，误用后轻者不达疗效，重者导致毒性反应，甚至发生可能发生因心肌收缩性停跳而死亡的严重事件。临床上也曾有误服香加皮致死的报道，因此准确鉴定五加皮很有必要。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性鉴定中药材五加皮的方法，避免误服而产生身体伤害，保证五加皮临床安全用药，本发明提供了一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用。技术方案：一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。表1引物对及发卡结构序列名称序列(5，-3，)seqidno.p1-fggcatgcaatactagctagcagtcg1p1-rcatagtgactctgaatgctaactgtctac2p2-fcacgaccactgcacgacatcagtacg3p2-rctgcgtcgccaaacgagaggtagccac4p3-fcggacaactgcgagtatgctggcag5p3-rggcatggattcagcactagatgcacg6发卡结构cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：(1)提取五加皮样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述五加皮样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。有益效果：(1)本发明所述引物对能够特异性鉴定中药材五加皮，避免误服而产生身体伤害，保证五加皮临床安全用药；(2)所述引物对具有灵敏度高、稳定性强的优点。附图说明图1是实施例1～3pcr鉴定结果电泳图；其中m为分子量为2000的maker；1为实施例1pcr产物鉴定结果；2为实施例2pcr产物鉴定结果；3为实施例3pcr产物鉴定结果。具体实施方式实施例1一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：(1)提取五加皮样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述五加皮样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例2一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：(1)提取五加皮样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述五加皮样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例3一种用于鉴定中药材五加皮的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药材五加皮试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药材五加皮的步骤包括：(1)提取五加皮样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述五加皮样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。sequencelisting<110>苏州市李良济健康产业有限公司<120>一种用于鉴定中药材五加皮的引物对及其应用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1ggcatgcaatactagctagcagtcg25<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2catagtgactctgaatgctaactgtctac29<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3cacgaccactgcacgacatcagtacg26<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列<400>4ctgcgtcgccaaacgagaggtagccac27<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5cggacaactgcgagtatgctggcag25<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6ggcatggattcagcactagatgcacg26<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40当前第1页12