一种快速无掩模的细胞二维图形化制作方法与流程

本发明涉及一种快速制作细胞二维图形的技术，具体是一种基于数字微镜阵列的快速无掩模的细胞二维图形化制作方法。

背景技术：

生物学被认为是21世纪最有前景的学科，不仅仅是因为生物学目前有大量需要亟需解决的问题和挑战，更为重要的是，它与人类生活诸如人口、疾病、健康等问题息息相关。而细胞生物学是生物学重要的基础学科之一，是在显微、亚显微和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能和各种生命规律的一门学科。细胞在生物学中扮演着至关重要的角色，作为个体，细胞是独立的能够生长、增殖、凋亡，作为整体，细胞又能共同协作配合形成具有特定功能的组织和器官进而构成一个生命体。1665年英国学者胡克用自制的显微镜第一次开启了细胞的世界，至此拉开了对细胞探索的序幕。

通过对细胞差别生长、细胞迁移、粘附和细胞连接等细胞行为学的研究，不仅仅可以揭示生命活动的本质和细节，而且能够有效的解决当今重大疑难疾病治疗的世界性难题。特别是治疗癌症，系统免疫性疾病，一些常规药物无法达到治疗效果的病例，应用细胞治疗都可以得到较为理想的效果，现在在国内应用自身免疫细胞治疗疾病也有很大的发展。由于细胞生物学所研究的主要对象是细胞，如果直接在生物体内进行研究是非常困难的，这主要是因为细胞所在身体内环境是不断变化而且不可控的，而且使得细胞行为发生变化的原因会存在多种，无法实现可控的研究单一因素的影响。因此，需要我们在体外构建细胞的微环境，将对细胞行为的研究由复杂不可控的体内环境转移到体外可控便于操作的环境中，这对于研究细胞生物学具有重要的意义。

上世纪90年代发展起来的基于微纳加工的细胞图形化技术，使得研究人员能够精确的在二维平面控制多种细胞位置，甚至单细胞形状，不仅为细胞生物学的基础研究提供了强大的工具，而且使将来体外模拟组织器官的机构和功能 成为了可能。现有的图形化的方法多为自上而下的加工方法，如光刻法，但是这些方法的成本高，环境要求高。另外一些方法则是自下而上的图形化方法，主要有，软光刻，扫描探针加工以及纳米压印等方法，这些方法中，其准备过程和操作都非常复杂，耗时较多，有的还需要进行复杂的化学修饰。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种快速无掩模的细胞二维图形化制作方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种快速无掩模的细胞二维图形化制作方法，包括以下步骤：

将设计的二进制图形导入到数字微镜阵列中，并将聚乙二醇二丙烯酸甲酯pegda与光引发剂2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦tpo的混合溶液滴在盖玻片表面；

数字微镜阵列将紫外入射光投影到盖玻片表面；

调整紫外入射光的功率，激发混合溶液发生交联反应并固化粘附在盖玻片表面，使固化后的水凝胶形状与设计图形的形状和光斑形状一致；

将盖玻片经过酒精浸泡和磷酸盐缓冲液冲洗后，放入细胞培养皿中，并加入细胞培养基和细胞悬浮液，将细胞培养皿放入二氧化碳恒温细胞培养箱中进行培养。

所述混合溶液为使用75％的酒精配置的聚乙二醇二丙烯酸酯pegda和光引发剂tpo混合溶液，pegda的浓度为40％，tpo的浓度为0.5wt％。

所述混合溶液的制备方法包括以下步骤：

将pegda溶于酒精之中，待搅拌均匀后再加入光引发剂tpo，pegda的最终浓度为40％，tpo的浓度为0.5wt％。

所述将盖玻片经过酒精浸泡和磷酸盐缓冲液冲洗，包括以下步骤：

将带有固化后的pegda水凝胶微结构的盖玻片放入75％的酒精中，清洗掉未反应的水凝胶；

将酒精清洗后盖玻片放入磷酸盐缓冲液中，进行二次清洗，除去附着在表面的酒精。

所述盖玻片为玻璃。

所述细胞培养基为hyclonerpmi-1640，加入量为7-10ml。

所述细胞悬浮液为100μl乳腺癌细胞(mcf-7)浓度为3×106细胞悬浮液。

本发明可实现动态化，程序化的细胞图形化方法，并不需要任何物理模板以及表面化学修饰，并且基底为普通的玻璃，无需特殊材料。具体具有以下特点：

1.紫外光照射激发光引发产生自由基，自由基与pegda单体相结合，从而引发水凝胶的交联反应。自由基只在光斑照射的地方存在。

2.通过控制光斑的形状来控制pegda交联聚合后的形状，制作出各种水凝胶固化图案。利用这种微图形的制作方法，可以不需要物理模板，直接根据所需形状设计光斑，并且可以动态化的控制水凝胶形状的大小和位置。

3.pegda是一种生物兼容性的材料，并且对蛋白质具有防止粘附的作用从而能够阻止细胞粘附，而玻璃可以进行细胞的粘附培养。通过上述这种方法，可以控制细胞的生长位置，生长图形，并且可以通过改变pegda的形状和尺寸来调节细胞的生长形状，研究外部物理微环境对细胞行为的影响。

附图说明

图1为本发明的pegda水凝胶交联反应的原理图；

图2为光斑经过聚焦物镜投射到玻璃基底上的示意图；

图3为光学显微图片；

其中，图3(a)为固化后pegda水凝胶的结果图，图3(b)为乳腺癌细胞图形化后的结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明是基于数字微镜阵列紫外光固化水凝胶的细胞二维图形化方法：通 过数字微镜阵列将图案反射到玻璃基底上，水凝胶混合溶液中的光引发剂吸收紫外光产生自由基，从而引起水凝胶发生交联反应，形成固化的水凝胶微结构，并且pegda水凝胶的形状与照射的光斑的大小和形状一致，因此，通过控制光斑的位置、形状和尺寸，就能在玻璃表面的任意位置生长出任意形状的水凝胶微结构。此外，利用细胞不在水凝胶表面粘附而在玻璃表面粘附的特性，可以通过控制pegda水凝胶的微结构的位置、形状和尺寸来控制细胞生长的位置、形状和大小。

利用紫外光照射使得水凝胶固化的原理具有以下特点(如图1所示)：

1：光引发剂tpo在紫外光的照射下会产生自由基，单个tpo分子会分裂产生两个自由基。

2：自由基于pegda的分子反应，打开pegda分子中的碳碳双键使得pegda分子变成活性分子，pegda活性分子相结合，交联成聚合物链，使得溶液变为固体状。

3：光斑经过聚焦物镜投射到玻璃基底上(如图2所示)

实施例一

1、将一片盖玻片用无水乙醇清洗两次，利用氮气将盖玻片吹干待用。

2、使用75％的酒精配置聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)和光引发剂(tpo)的混合溶液，pegda的浓度为40％，tpo的浓度为0.5wt％。

3、取0.5ml配置好的溶液，滴在盖玻片上，使得溶液均匀平铺在盖玻片表面。

4、将盖玻片放置在架子上，在电脑中绘制需要的图片形状(三角形图形如图3左下角的光斑)，将绘制好的图片导入到数字微镜阵列中，数字微镜阵列将紫外光反射到玻璃基底上，投射到玻璃基底上的图形会诱导聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂的混合溶液发生交联反应并固化粘附在玻璃表面，而水凝胶的形状与设计图片形状和投射光斑形状一致。如图3(a)所示，在图3(a)中，灰色区域为pegda水凝胶，黑色区域为裸露的玻璃基底。

5、将带有固化后的pegda水凝胶微结构的盖玻片放入75％的酒精中，清洗掉未反应的水凝胶。

6、将酒精清洗后盖玻片放入磷酸盐缓冲液中，进行二次清洗除去附着在表面的酒精。

7、将磷酸盐缓冲液清洗后的盖玻片放入细胞培养皿中，加入hyclonerpmi-1640培养基10ml，并且放入100μl乳腺癌细胞(mcf-7)浓度为3×106细胞悬浮液。将细胞培养皿放入细胞培养箱(37℃，co2为5％)，并且每天更换培养基，观察并记录细胞的状态。因为水凝胶表面会阻止细胞粘附，细胞则会生长在玻璃基底上，所以细胞就是生长成为特定的形状，如图3(b)所示，mcf-7细胞生长在玻璃基底上，形成一个三角形图形。