一种与仔猪腹泻相关的分子标记及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种与仔猪腹泻相关的分子标记及其检测方法和应用，它涉及动物分子遗传标记制备【技术领域】，本发明要解决目前鉴定的候选基因无法满足抗病育种的需要的问题。本发明的分子遗传标记，其核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示，检测仔猪腹泻易感/抗性的方法为：从待检测猪血液中提取基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物采用TaqI-PCR-RFLP基因型分型，即完成。它用于猪标记辅助选择育种中。本发明选择CISH作为仔猪腹泻候选基因，开展了CISH启动子区域遗传变异的筛选及影响仔猪腹泻性状的研究，以期建立新的标记辅助选择技术，并用于仔猪抗腹泻新品系(种)的育种中。
【专利说明】一种与仔猪腹泻相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物分子遗传标记制备【技术领域】，具体涉及一种用CISH基因预示和 鉴定仔猪腹泻的分子标记的检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 仔猪腹泻是养猪生产中的常见疾病，是困扰世界养猪业的主要疾病之一。患有腹 泻病的仔猪饲料报酬率低，生长效率下降，生长发育停滞，给养猪业造成巨大的经济损失。 虽然通过采取加强饲养管理、改善环境卫生条件、应用药物和疫苗进行治疗和预防等措施 使仔猪腹泻得到了一定的控制，但从长远来看，利用分子遗传学方法和技术，选育出具有抗 腹泻能力的抗病新品系（种）将是解决该问题的最佳方法。
[0003] 虽然猪分子抗病育种研究已取得一定的成果，但目前鉴定的候选基因无法满足抗 病育种的需要。由于构建用于抗病性状QTL定位的资源家系成本高、难度大，因此，利用候 选基因法挖掘抗病性状的遗传标记仍将是猪分子抗病育种研究的重要内容。
[0004] CISH是细胞因子信号转导抑制因子（Suppressors of cytokine signaling，S0CS)基因家族的第一个成员，是IL-2等细胞因子诱导的极早期基因产物。研 究发现，CISH包含一个SH2和SOCS-box结构域。其中，SH2结构域可以与磷酸化的酪氨酸 残基结合，介导CISH与其它信号转导分子间的结合和相互作用。因此，CISH可作为一种负 调控因子，抑制IL-2诱导的STAT5的活化，进而对IL-2信号转导系统进行负调控。此外， CISH可增强NF- κ B活性，进而在T细胞的发育和分化中起重要作用的调节作用。
[0005] CISH在免疫系统中的重要作用，引起了人类医学研究的关注。Tsao等利用 RT-PCR技术分析了 CIS, S0CS1, S0SC2和S0CS3基因在系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus, SLE)病人外周血淋巴细胞中的表达量，指出CISH可作为SLE疾病诊断的候 选基因。2010年5月发表在《新英格兰医学杂志》上的一篇文章指出CISH基因对人体免疫 系统有着重要影响。研究人员耗时5年，在分析了马拉维、肯尼亚、越南、香港等地的8000 多人的基因之后确认CISH基因与很多传染性疾病有着密切关系。该基因发生变异后，会导 致携带者更易感染结核病、疟疾以及菌血病等传染性疾病。基因功能研究发现CISH蛋白会 抑制免疫系统细胞间的信号传递，CISH表达水平的降低会导致多种传染性疾病的易感性增 强。这表明，CISH对人体免疫反应有着很大的遗传影响。此后，Tong等（2012)分析了 889 个越南人的CISH，发现该基因的-292A>T位点与越南人乙型肝炎（Vietnamese hepatitis Bvirus，HBV)易感性显著相关。
[0006] SOCS基因家族在免疫系统中的重要作用，也引起了猪抗病育种研究的关注。 Delgado-Ortega等分析了猪CISH和S0CS1-7等基因在肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、肠系膜 淋巴结、气管和胸腺等组织的mRNA表达谱，发现CISH在小肠、大肠、脾脏和胸腺等组织显著 表达。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种与仔猪腹泻相关的分子标记及其检测方法和应用，将 该分子标记作为猪抗腹泻遗传改良的应用，以解决目前鉴定的分子标记无法满足抗病育种 的需要的问题。
[0008] 本发明的一种与仔猪腹泻相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表Seq ID No :1 所示。
[0009] 本发明的一种采用分子标记检测仔猪腹泻的方法，它是按照以下步骤进行的：从 待检测猪血液中提取基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对PCR产物采用TaqI-PCR-RFLP 基因型分型，即完成所述的检测。
[0010] 所述的引物为 F :5'AAGAGGAGGCGATATGTAGT3' ；
[0011] R:5'TAGGGAGGTGCTAATGCT3' ；
[0012] 本发明的一种与仔猪腹泻相关的分子标记的应用，它用于猪标记辅助选择育种 中。
[0013] 本发明包含以下有益效果：
[0014] 本发明通过分子技术检测仔猪基因型，结合标记辅助选择技术选择有益基因型个 体留种，可以显著提高仔猪群体的抗腹泻病能力，增加猪场经济效益。
[0015] 本发明提供了长白猪和民猪包括猪CISH基因启动子区域1554bp的基因组核 苷酸序列，通过序列比对提供了位于该扩增片段内部的一处单核苷酸多态性（SNP)。制 备该基因片段的步骤如下：（1)从NCBI下载猪CISH基因 mRNA序列（GeneBank登录号： KM507873)。以该序列为查询序列，利用ENSEMBL数据库（SscrofalO)进行猪CISH基因染 色体定位，进一步将序列向5'侧翼区步移3000bp后下载序列。根据下载序列设计引物（F: 5' AAGAGGAGGCGATATGTAGT3'，R :5' TAGGGAGGTGCTAATGCT 3'）；（2)PCR 扩增、测序和序列比 对分析。
[0016] 本发明进一步提供了利用TaqI-RFLP方法确定的不同基因型个体与仔猪腹泻指 数间的相关关系。
[0017] 根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这 些方法来选择携带有利等位基因的个体，进而达到较好的选择效果。
[0018] 本发明选择CISH作为仔猪腹泻候选基因，开展了 CISH启动子区域遗传变异的筛 选及影响仔猪腹泻性状的研究，以期建立新的标记辅助选择技术，并应用于仔猪抗腹泻新 品系（种）的育种工作。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明二个猪种CISH基因序列比对结果和SNP位点；
[0020] 图2为实施例1包括猪CISH基因启动子区域的基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱；其 中，M泳道：DNAMarkerDL2, 000 ;泳道1为引物扩增片段；
[0021] 图3为实施例1的CISH基因 TaqI-RFLP检测结果；其中，M泳道：DNA Marker DL2, 000 ;1泳道为GG基因型；3-6泳道为AA基因型；7-10泳道为AG基因型。 具体实施方案
[0022]
【具体实施方式】一：本实施方式的一种与仔猪腹泻相关的分子标记，所述的分子标 记的核苷酸序列如序列表SeqIDNo :1所示。
【具体实施方式】 [0023] 二：本实施方式与一不同的是：分子标记的核苷酸序 列的514bp处有一个碱基突变，所述碱基突变为由A突变为G。其它与一相 同。
【具体实施方式】 [0024] 三：本实施方式的一种采用分子标记检测仔猪腹泻的方法，它是按 照以下步骤进行的：从待检测猪血液中提取基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对PCR产 物采用TaqI-PCR-RFLP基因型分型。
[0025] 本实施方式在采用TaqI-PCR-RFLP基因型分型后，分出AA型，即个体腹泻率低的 基因型，并在育种中留种。
【具体实施方式】 [0026] 四：本实施方式与三不同的是：所述的引物序列如序 列表Seq ID No :2和Seq ID No :3所示。其它与三相同。
【具体实施方式】 [0027] 五：本实施方式与三或四不同的是：
[0028] 所述的PCR反应体系为：
【权利要求】
1. 一种与仔猪腹泻相关的分子标记，其特征在于所述的分子遗传标记的核苷酸序列如 序列表Seq ID No :1所示。
2. 根据权利要求1所述的一种与仔猪腹泻相关的分子遗传标记，其特征在于分子遗传 标记的核苷酸序列的514bp处有一个碱基突变，所述碱基突变是由A碱基突变为G碱基。
3. -种采用如权利要求1所述的分子遗传标记检测仔猪腹泻的方法，其特征在于它是 按照以下步骤进行的：从待检测猪血液中提取基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对PCR 产物采用TaqI-PCR-RFLP基因型分型，即完成所述的检测。
4. 根据权利要求3所述的一种采用分子遗传标记检测仔猪腹泻的方法，其特征在于所 述的引物序列如序列表Seq ID No :2和Seq ID No :3所不。
5. 根据权利要求3所述的一种采用分子遗传标记检测仔猪腹泻的方法，其特征在于所 述的PCR反应体系为：
?〇?程序如下：941：预变性41^11;然后941：变性458、561：退火458、721：延伸908，共 35个循环，最后72°C延伸IOmin。
6. -种与仔猪腹泻相关的分子遗传标记的应用，其特征在于它用于猪标记辅助选择育 种中。
【文档编号】C12N15/11GK104263727SQ201410538300
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】牛步月, 王希彪, 刘志然, 韩小飞, 杨秀芹 申请人:东北农业大学