猪链球菌2型lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪链球菌2型快速检测试剂盒及其检测方法。所述技术可用于猪链球菌2型的检测。其特征是：该技术将环介导等温扩增技术与横向流胶体金试纸条检测技术相结合，检测过程不需要昂贵的专业仪器设备，省略了琼脂糖凝胶电泳步奏，能够肉眼直观的判定检测结果。该技术具有准确、快速、高效、灵敏、方便等特点，适用于动物链球菌病诊断、进出口检疫、食品卫生检验等的检测，对于促进我国畜牧业发展、保障人畜健康和动物性食品安全均具有重要意义。
【专利说明】猪链球菌2型LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测猪链球菌2型菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法，属 于动物卫生和食品检验【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌病（Streptococcussuis，SS)是由猪链球菌引起的人兽共患传染性疾 病，根据菌体荚膜多糖的多样性，猪链球菌分为1~34型和1/2型，共35个血清型，其中猪链 球菌2型（Streptococcussuisserotype2，SS2)致病力最强，人感染后会出现发烧、脑炎、 败血症等症状，严重者可发生中毒性休克导致多器官衰竭甚至死亡。1951年，Jansen和Van Dorssen在世界范围内首次报道猪链球菌病，之后英国、美国等许多国家先后报道了人感染 猪链球菌病例。1998年我国首次报道人感染猪链球菌病例，国内四川省、湖南省、浙江省等 地均发生了人感染猪链球菌病疫情。猪肉是人类重要的食品，其安全性越来越引起人们的 关注。猪链球菌2型作为重要的动物源性人畜共患病原给人们的健康和生活造成了重大威 胁。因此，建立准确而快速的猪链球菌2型检测方法是当前猪链球菌防控的关键，也是食品 检疫急需的手段。
[0003] 荚膜多糖（CPS)为公认的猪链球菌毒力因子，它能保护细菌在非免疫动物体内不 被吞噬。猪链球菌2型cps共有cps2Z、2J等14个开放阅读框，其中cps2J基因除与1/2 型有较高同源性外，与其他血清型的序列同源性都很低，是目前国内外利用分子生物学技 术鉴别猪链球菌2型种型的靶基因。
[0004] 本发明针对猪链球菌CPS2J基因设计了型特异性引物，建立了一种能检测猪链 球菌2型血清型的LAMP-LFD检测体系，其中的2条促环引物分别标记了异硫氰酸荧光素 (Fluoresceinisothiocyanate,FITC)和地高辛（Digixon，Dig)。当LAMP扩增后，阳性扩 增产物具有异硫氰酸荧光素和地高辛的双重标记，而阴性产物不具有双重标记。将横向流 检测试纸条插入检测缓冲液后，LAMP扩增产物与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结 合形成三元复合物，通过层析作用，结合到试纸条的生物素抗体标记的检测线上，呈现红褐 色；LAMP阴性扩增样品不具有双重标记，不能与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结 合形成三元复合物，也不能与检测线结合，检测线不显色。
[0005] 本发明具有快速、特异、敏感等特点，不需特殊仪器设备和实验条件，操作更为简 便安全，非常适用于临床和基层使用，对SS2突发公共卫生事件应急处置的早期筛查和食 品卫生检验具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供了一种用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物组，其 特征在于它是由下述引物组成： CPS-F3TGGTGTTTCAAACGCAAGSEQIDNO： 1CPS-B3TGCAGCTCAGATTCTTGASEQIDNO：2 CPS-FIPGCCGTCAACAATATCATCAGAATCTTTTGAATTACGGTATCAAAAATAGCAC SEQIDNO：3 CPS-BIPACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTTCCATCAAAAGTAGCAAGT SEQIDNO：4 CPS-LFTCGTTTAATATAATACAAACATSEQIDNO：5CPS-LBGAGAATGATAGTGATTTGTCSEQIDNO:6。
[0007] 其中CPS-LF和CPS-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
[0008] 本发明进一步公开了用于检测猪链球菌2型LAMP-LFD的检测试剂盒，其组成如 下： (1)LAMP反应液： LAMP反应液中含有：2XBuffer(含Mg2+) 2. 5μL;CPS-F3 0. 5μL；CPS-B3 0· 5μL;CPS-FIP4μL;CPS-BIP4μL;CPS-LF0·5μL;CPS-LB0· 5μL;dNTPs3· 5μL (2) 超纯水 (3) Bst酶（8υ/μL) (4) 横向流动试纸条：购自MileniaBiotecGmbH公司 (5) 用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物；其中的引物指的是： CPS-F3TGGTGTTTCAAACGCAAGSEQIDNO： 1 CPS-B3TGCAGCTCAGATTCTTGASEQIDNO：2 CPS-FIPGCCGTCAACAATATCATCAGAATCTTTTGAATTACGGTATCAAAAATAGCAC SEQIDNO：3 CPS-BIPACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTTCCATCAAAAGTAGCAAGT SEQIDNO：4 CPS-LFTCGTTTAATATAATACAAACATSEQIDNO：5CPS-LBGAGAATGATAGTGATTTGTCSEQIDNO：6 ； 所述的CPS-LF和CPS-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
[0009] 本发明更进一步公开了采用此试剂盒用于检测猪链球菌2型的LAMP-LFD方法，其 特征在于，按如下的步骤进行： (1)LAMP扩增反应体系为：2XBuffer(含Mg2+)2.5yL;0157-F3 0. 5μL；0157-Β3 0· 5μL;0157-FIP4μL;0157-ΒΙΡ4μL;0157-LF0· 5μL; 0157-LB 0. 5μL；dNTPs 3. 5μL;8U/μLBst酶1μL;加入样品DNA模板1至5μL;用超纯水补充至终体积25μL (2) 扩增反应过程：在恒温水浴锅内95 °C条件下变性5min，在63 °C进行60min，并且 在80°C持续2min，4°C，保存； (3) 扩增反应结束，取扩增产物IOyL加入到IOOyL缓冲液中，混合均匀，将横向流动 试纸条插入均勻后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果。
[0010] (4)结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则 说明样品中含有猪链球菌2型；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测 线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
[0011] 本发明同时也公开了用于猪链球菌2型的LAMP特异性引物组在制备用于检测猪 链球菌2型LAMP-LFD试剂盒中的应用。
[0012] 实验结果表明： 采用本发明所公开的用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物组制备的试剂盒在检 测猪链球菌2型LAMP-LFD检测试剂盒方面具有良好的积极效果。
[0013] 本发明公开的用于检测猪链球菌2型的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效 果在于： (1)猪链球菌目前发现的有35个血清型，其中猪链球菌2型具有较高的致病力。本发 明采用的LAMP技术针对cps2J基因设计引物，能过从食品和动物组织中快速的检测出猪链 球菌2型。该方法具有操作简便、特异性强等特点，检测过程不需要PCR仪等昂贵的设备， 只需恒温水浴锅即可；其敏感性可达到1至l〇pg，比常规PCR高10倍以上。此外，该方法 不需要进行琼脂糖凝胶电泳，既避免了EB或荧光染料染色等有毒试剂对环境的污染，又降 低了非特异性扩增条带对结果判定的干扰，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。
[0014] (2)本发明将LAMP技术与横向流动试纸条技术相结合，可以通过肉眼直接观察结 果，使检测更为便捷，适用于现场的实时快速检测和出入境检疫，对于及时监控该病的发生 发展，制定行之有效的防制措施，提高我国基层检验检疫机的猪链球菌2型的疫情监控和 快速检测水平具有重要意义。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为猪链球菌2型LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1 :空白对照；2 :猪链球 菌2型； 图2为食品样品的猪链球菌2型LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1-6 :1 :0. 76cfu/mL；2 ：7. 6cfu/mL；3 ：76cfu/mL；4 ：7. 6X102cfu/mL；5 ：7. 6X103cfu/mL；6 ：7. 6XIO4Cfu/ mL;N，空白对照； 图3为LAMP-LFD特异性试验图；自左向右，依次为1 :大肠杆菌（0157 :H7) ;2 :大肠杆 菌（08 :K88) ;3 :大肠杆菌（0141 :K99) ;4 :无乳链球菌；5 :停乳链球菌；6 :巴氏杆菌；7 :金 黄色葡萄球菌；8 :沙门氏菌；9 :表皮葡萄球菌；10 :志贺氏菌；11 :猪链球菌2型；12 :蜡样 芽苞杆菌；13 :副猪嗜血杆菌；14 :空白对照。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪链球菌2型的LAMP-LFD 引物组的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的试 剂原料均有市售。本发明所述的猪链球菌2型引物组序列见表1。
[0019] 表1 |：I'
【权利要求】
1. 一种用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组 成： CPS-F3 TGGTGTTTCAAACGCAAG SEQ ID NO ： 1 CPS-B3 TGCAGCTCAGATTCTTGA SEQ ID NO ：2 CPS-FIP GCCGTCAACAATATCATCAGAATCTTTTGAATTACGGTATCAAAAATAGCAC SEQ ID NO ：3 CPS-BIP ACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTTCCATCAAAAGTAGCAAGT SEQ ID NO ：4 CPS-LF TCGTTTAATATAATACAAACAT SEQ ID NO ：5 CPS-LB GAGAATGATAGTGATTTGTC SEQ ID NO ：6 ； 其中CPS-LF和CPS-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
2. -种含有权利要求1所述用于检测猪链球菌2型LAMP-LFD的检测试剂盒，其组成 如下： (1) LAMP反应液： LAMP 反应液中含有：2XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L ;CPS-F3 0. 5 μ L ； CPS-B3 0· 5 μ L ;CPS-FIP 4 μ L ;CPS-BIP 4 μ L ;CPS-LF 0·5 μ L ; CPS-LB 0· 5 μ L ;dNTPs 3· 5 μ L 超纯水Bst酶（8U/yL) (4) 横向流动试纸条 (5) 用于检测猪链球菌2型的LAMP特异性引物；其中的引物指的是： CPS-F3 TGGTGTTTCAAACGCAAG SEQ ID NO ： 1 CPS-B3 TGCAGCTCAGATTCTTGA SEQ ID NO ：2 CPS-FIP GCCGTCAACAATATCATCAGAATCTTTTGAATTACGGTATCAAAAATAGCAC SEQ ID NO ：3 CPS-BIP ACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTTCCATCAAAAGTAGCAAGT SEQ ID NO ：4 CPS-LF TCGTTTAATATAATACAAACAT SEQ ID NO ：5 CPS-LB GAGAATGATAGTGATTTGTC SEQ ID NO ：6 ； 所述的CPS-LF和CPS-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
3. -种采用权利要求2所述试剂盒用于检测猪链球菌2型的LAMP-LFD方法，其特征在 于，按如下的步骤进行： (1) LAMP 扩增反应体系为：2XBuffer (含Mg2+) 2· 5μ L ;0157-F3 0. 5 μ L ； 0157-Β3 0· 5μ L ;0157-FIP 4μ L ;0157-ΒΙΡ 4μ L ;0157-LF 0· 5μ L ; 0157-LB 0. 5 μ L ；dNTPs 3. 5 μ L ;8U/ μ L Bst酶1 μ L ;加入样品DNA模板1至5 μ L ;用超纯水补充至终体积25 μ L (2) 扩增反应过程：在恒温水浴锅内95 °C条件下变性5min，在63 °C进行60min，并且 在80°C持续2min，4°C，保存； (3) 扩增反应结束，取扩增产物10yL加入到lOOyL缓冲液中，混合均匀，将横向流动 试纸条插入均勻后的液体中3min ;取出后在5至7min内读取检测结果； (4) 结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明 样品中含有猪链球菌2型；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出 现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
4.权利要求1所述用于猪链球菌2型的LAMP特异性引物组在制备用于检测猪链球菌 2型LAMP-LFD试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104278099SQ201410538068
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】张莉, 王利丽, 李秀丽, 鄢明华, 任卫科, 池晶晶, 杨春蕾, 孙英峰, 田向学, 李富强 申请人:天津市畜牧兽医研究所