根癌农杆菌中锑氧化酶基因sboA的功能鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明属于细菌基因工程领域，涉及一种根癌农杆菌中锑氧化酶基因的功能鉴定。通过基因敲除、锑生长氧化实验以及异源表达等方法，分离、克隆了一种来源于根癌农杆菌GW4中的锑氧化酶基因sboA。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。该基因编码的酶能催化毒性强的三价锑[Sb(III)]氧化至毒性弱的五价锑[Sb(V)]，具有应用于环境锑污染净化的潜能。该基因包含在原核表达载体中，含有该质粒的大肠杆菌BL21/pET28a-sboA，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：2014437。CCTCC NO：M20144372014.09.22
【专利说明】根癌农杆菌中锑氧化酶基因sboA的功能鉴定
【技术领域】
[0001] 本发明属于细菌基因工程领域，涉及一种根癌农杆菌GW4中锑氧化酶基因的功 能鉴定。通过基因敲除、锑生长氧化实验以及异源表达等方法，分离、克隆了一个来源于 根癌农杆菌GW4中的新型锑氧化酶基因sboA。该基因编码的酶催化毒性较强的三价锑 [Sb(III)]氧化至毒性较弱的五价锑[Sb(V)],具有应用于环境锑污染净化的潜能。
【背景技术】
[0002] 锑（Antimony，Sb)是一种剧毒的重金属元素，位于元素周期表中第5周期VA 族，广泛分布于岩石、大气、土壤沉积物及水体中。其无机形态主要以单质锑[Sb(0)]、 三价锑[Sb(III)]和五价锑[Sb(V)]的形态存在，有机形态主要为三甲基锑化合物（何 孟常等，2004)。锑的毒理性质与砷相似但毒性远远大于砷，且无机锑的毒性强于有机 铺，Sb(III)的毒性强于 Sb(V) (Smichowski P. Antimony in the environment as a global pollutant:Areview on analytical methodologies for its determination in atmosphericaerosols. Talanta，2008, 75:2)。人类长期接触键可造成皮肤、上呼吸道、心、 肝、肺等组织明显损害，最终导致机体的癌变（Shotyk W，Krachler A. Contamination of bottled waters with antimony leaching from polyethylene terephthalate(PET) increases upon storage. Environ Sci Technol，2007, 41:1560-1563)。键的用途广泛， 包括生产陶瓷、玻璃、合金、电池、油漆、烟火材料及阻燃剂等，还可用来治疗各种寄生虫病。 但随着我国经济的迅猛发展，人民生活水平提高的同时，也对环境造成了极大的污染。工 业"三废"、机动车尾气的排放、污水灌溉和农药、除草剂、化肥等的使用以及矿业的发展， 使大量的锑及其化合物进入到大气、水和土壤，并最终进入动植物及人体中。据国际癌症 研究署（IARC)报道，充分的证据表明Sb(III)对环境中的动物有致癌作用（IARC. Some organic solvents,resin monomers and related compounds, pigments and occupational exposures in paint manufacture and painting. Lyon: IARC，1989. 291-305) 〇 由于键的 毒性和生物有效性，锑及其化合物被美国环保局及欧盟列为优先污染物，日本环境厅也将 其列为密切关注的污染物。在巴塞尔公约中关于危险废物的越境迀移限定中将锑列为危 险废物之列（Filella M，Belzile N，Chen Y W. Antimony in the environment:A review focused on natural waters I. Occurrence. EarthSci Rev，2002,57:125-176) 〇
[0003] 虽然锑污染严重威胁人类生命健康，但一些微生物却对环境中高浓度锑表现出极 强的适应性并在锑的环境地球循环中扮演着重要的角色。因此了解微生物的重金属抗性机 制，研究锑抗性相关的功能基因有助于我们从基因的水平上了解微生物对重金属的解毒机 制，并发现新的重金属污染修复方法。为环境中锑污染的修复提供理论基础和技术支持，并 更好的认识锑元素的环境地球循环。
[0004]目前，对细菌中锑抗性分子机制的研究较少，特别是与锑氧化相关的分子机制研 究相当匮乏。细菌锑氧化可以将环境中的Sb(III)转化为毒性较低的Sb(V)，降低环境毒 性，对环境锑污染修复具有重要意义。迄今为止，科研工作者相继从多个种属中分离出50 多株铺氧化菌（Shi Z, Cao Z, Qin D et al. Correlation models between environmental factors and bacterial resistance to antimony and copper.PLoS One, 2013,8:e78533 ； Li J, Wang Q, Zhang S Z, Qin D, Wang G J. Phylogenetic and genome analyses of antimony-oxidizing bacteria isolated from antimony mined soil. Interna Biodeter &Biodegra，2013, 76:76-80)。但目前发现的锑氧化菌中，存在两种类型：第一类锑氧化菌既 可以氧化Sb (III)又可以氧化As (III)。2007年Lehr等人发现根癌农杆菌5A为这一类锑 氧化菌的代表。该菌在缺失了砷氧化酶大亚基基因aioA后，Sb (III)氧化仅受到十分微弱 的影响（Lehr CR, Kashyap DR, McDermott TR. New Insights into Microbial Oxidation of Antimony and Arsenic. Appl Environ Microbiol, 2007, 73:2386-2389)。第二类铺氧 化细菌中不含砷氧化酶，但也可以氧化Sb(III)。虽然砷和锑位于同一主族，但以上结果说 明细菌砷氧化和锑氧化是两个相对独立的过程，细菌内应该存在与砷氧化酶基因完全不同 的锑氧化酶基因。但目前，还没有研究发现特异性的锑氧化酶以及调控锑氧化过程的功能 基因。
[0005] 因此， 申请人:通过比较蛋白质组学等方法分析找出根癌农杆菌GW4(Wang Q, Qin D, Zhang S, et al. Fate of arsenate following arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens GW4. Environ Microbiol, 2014, doi:10. 1111/1462-2920. 12465)中的铺氧化 酶基因sboA，并采用基因敲除、生长氧化实验以及异源表达等方法鉴定该酶锑氧化的功能。 sboA基因的发现有利于我们研究锑氧化及抗性的分子机制，填补目前国内外对于锑氧化酶 基因研究领域的空白。其异源表达可以为构建基因工程菌修复环境中的锑污染提供理论依 据和技术支持。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于分离和克隆根癌农杆菌GW4中一个编码Sb(III)氧化酶的基 因sboA，并对其进行功能验证及应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID. NO: 1中第 1-855位喊基所不的序列；该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID N0:2所不。
[0007] 本发明通过以下技术方案实施：
[0008] 申请人:前期工作是以分离自山西省山阴市地下水沉积物中的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) GW4 (参见：Wang Q, Qin D, Zhang S, et al. . Environ M icrobiol, 2014, doi : 10. 1111/1462-2920. 12465)为研究对象，在加 50 μ M Sb (III)和 不加Sb(III)条件下进行比较蛋白质组学研究。经质谱测序后发现，由sboA编码的 氧化还原酶表达量上调。通过比对发现该基因编码的蛋白属于SDR家族，能够在类 固醇、辅酶因子、碳水化合物、脂类、多元醇、芳香族化合物和氨基酸等的代谢过程中 表现氧化还原表型（Odermatt A and Nashev LG. The glucocorticoid-activating enzyme IIbeta-433hydroxysteroid dehydrogenase type Ihas broad substrate specificity!physiological and toxicological considerations. J. Steroid Biochem. Mol. Biol, 2010, 119:1-13)。而铺（酒石酸铺钾）在水溶液中的水解形式类似于多元醇，因 此推测SboA可能为根癌农杆菌GW4中的锑氧化酶，并通过基因敲除、锑生长氧化实验以及 异源表达等方法鉴定其锑氧化的功能。
[0009] 本发明采用敲除载体PJQ200SK(其构建见图1，美国蒙大拿州立大学，蒂莫 西?麦克德莫特（Timothy R. McDermott)教授惠赠）对sboA基因进行无痕敲除（Link AJ,Phillips D, Church GE Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli:application to open reading frame characterization. J Bacteriol, 1997, 179:6228-6237)。敲除载体 pJQ-sboA 构建过程 如下：根据菌株GW4中sboA基因序列及其上下游序列，分别设计上下游同源片段引物 PsboA-lF，如下所示：（5 ' AAATCTAGAGCGGAACATCGGGAATACG3 '）/PsboA-IR (5 ' CATTATC TTCCTTGAATGCGGGGTGGATGGTCGTCATAGGTT3，）和 PsboA-2F (5，CCGCATTCAAGGAAGATAATGC CTATGACATCGTCCAGAACC3，）/PsboA-2R(5，AAAGGATCCTGAATAGCGAGCCAGACCA3，）。通过 cross-over PCR将sboA基因的上下游同源片段连接到一起，再将其与pJQ200SK敲除载体 同时利用BamHI和XbaI进行双酶切，并连接转化至大肠杆菌（Escherichia coli) S17-1中， 最终成功获得敲除载体E. coli S17-l/pJQ-sboA。将构建好的载体利用双亲本杂交方法转 入野生型根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)GW4中，通过同源重组使载体单交换插 入到GW4基因组中，最后通过蔗糖致死得到突变株GW4-Λ sboA。通过引物PMsboA-IF ^ A ACAACAGCAGGCGGAGAC3' )/PMsboA-IR(5，CGATGGCGGCAACAAT3')和引物 PMsboA-2F(5， CGCTTTCCGCCTTCTTT3 '）/PMsboA-2R (5 ' CGTACATCGCCGACAAGG3 '）同时扩增 sboA 上下游 同源片段以及基因内部片段来验证敲除成功（见图3)。
[0010] 敲除成功后，构建互补载体pCPP30-sb〇A并验证互补株表型能否回复。利用引物C sboA-F (Si AAACTGCAGCGAAACGACGCGAAGGAGAA3; )/CsboA-R(Si AMGGATCCCTGGAGGTTGCCG TGCTTAA3')扩增完整的sboA基因片段，与互补载体pCPP30(见图2)同时进行PstI-BamHI 双酶切，再通过T 4连接酶连接后转化至E. coli S17-1中最终获得互补载体。将互补载体 通过双亲本杂交转化至突变株GW4-Λ sboA中得到互补株GW4-Λ sboA-C，同时将互补载体 通过双亲本杂交转化至野生型GW4中的到超表达株GW4: : sboA (见图3)。
[0011]分别将菌株 GW4、GW4- Λ sboA、GW4- Λ SboA-C 和 GW4: : SboA 接种至含有 10 μ M 和 50yMSb(III)的CDM(配方见附录）培养基中，每隔8h取样，检测其生长及氧化情况。利用 紫外分光光度计测定〇D_ (Beckman，DU800)，利用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光 谱仪（HPLC-HG-AFS, Beijing Titan Instruments Co. ,Ltd.)测定培养基中的铺含量。结 果显示敲除sboA基因的突变株氧化速率降低了 27%，互补株的表型回复到野生型水平，而 超标达菌株的氧化速率提高了 34%，说明sboA基因确实影响了菌株的Sb(III)氧化表型 (见图4)。
[0012] 为了进一步研究sboA的Sb(III)氧化功能，我们通过将互补载体pCPP30_sboA 转入不含该基因的E. coli S17-1中进行异源表达并检测其Sb(III)氧化表型。以野生 型E. coli S17-1和转入pCPP30空载体的E. coli S17-l(pCPP30)作为对照。结果显示， 虽然E. coli S17-1和转入空载的E. coli S17-l(pCPP30)可以氧化少量Sb(III)，但转入 pCPP30-sboA载体的E.coliS17-l(pCPP30-sboA)的Sb(III)氧化表型明显加快，说明SboA 确实加快了E.COliS17-l(pCPP30-SbOA)中的锑氧化反应，具有催化细菌Sb(III)氧化的 能力（见图5)。
[0013] 为深入证实SboA的锑氧化能力，我们通过原核表达系统表达并纯化SboA蛋白， 并在体外检测其对Sb(III)的氧化能力。利用带有EcoRI和HindIII酶切位点的引物Es boA-F (5，AAAGAATTCATGACGACCATCCACCCC3，）/EsboA-R(5，AAAAAGCTTCGGCACCCGTAAAAT CTG3)扩增完整的sboA基因片段，并将其与pET-28a(+)表达载体连接构建成重组载体后 (见图6)，转入表达菌株即大肠杆菌BL21中。 申请人:将构建好的重组的大肠杆菌BL21/ pET28a-sboA，Escherichia coli BL21/pET28a-sboA，于 2014 年 9 月 22 日送至中国.武 汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（英文简称CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO: M2014437。
[0014] 大肠杆菌pET28a_sboA的菌学特征
[0015] 本发明构建的重组大肠杆菌（或称之为表达菌株）E.coli BL21/pET28a-sb〇A最 适生长温度37°C ;为革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢；具有卡那霉素（Kan)抗 性。
[0016]将重组的表达菌株 E. coli BL21 (pET28a-sboA)在 37°C培养至 OD6tltl 约为 0· 3-0. 4 时加入0. 2mM IPTG，28°C诱导2h后收集菌体压力破碎，利用镍柱结合带有His标签的目的 蛋白，再通过不同浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来，最终成功获得SboA蛋白。由于SboA在 体外氧化Sb(III)需要一个电子受体，而目前的研究还并未发现Sb(III)氧化的电子受体， 因此我们将缺失了 sboA基因的突变菌株GW4-AsboA在加IOyM Sb(III)的条件下培养 24h后取细胞破碎的上清液作为电子受体，加入1 μ M Sb (III)，200 μ M辅酶NADP+和不同 浓度纯化后的SboA蛋白，以50mM Tris-HCUpH = 8. 0)作为缓冲体系，28°C孵育0. 5h后通 过高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪检测SboA体外氧化Sb (III)的能力。结 果表明相比于不加SboA蛋白，加入不同浓度SboA蛋白后Sb(III)氧化能力逐渐增强,证明 SboA在体外具有氧化Sb (III)的能力（见图7)。
[0017] 本发明的优点如下：
[0018]1.自然界中很多细菌可以氧化Sb(III)，但迄今为止还未有研究发现细菌中的锑 氧化酶基因，本发明创新点在于首次揭示细菌中锑氧化酶基因，填补国内外关于细菌锑氧 化酶研究领域的空白。
[0019] 2.目前我国重金属污染严重，研究细菌锑抗性相关的功能基因有助于我们从基因 的水平上了解微生物对锑的解毒机制，也能使我们更好的认识地球上锑元素的物质循环。
[0020] 3.异源表达SboA可以使E. coli S17-1的Sb(III)氧化速率加快，有利于我们开 发新的重金属污染修复方法，为环境中锑污染的原位微生物修复以及基因工程菌的构建提 供理论基础和技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 序列表SEQ ID NO :1是本发明锑氧化酶基因Sb0A的核苷酸序列，序列长度为 855bp (该基因编码区为l-855bp，显示对应的氨基酸序列）。
[0022] 序列表SEQ ID NO :2是本发明锑氧化酶基因sboA编码的蛋白质序列，编码284个 氨基酸。
[0023] 图1 :本发明所使用的敲除载体pJQ200SK-sb〇A示意图。
[0024] 图2 :本发明所使用的互补载体pCPP30_sboA示意图。
[0025] 图3 :sboA基因及其周围基因的不意图及检验PCR结果。
[0026] 其中：图3中的A为铺氧化酶基因sboA及其周围基因的不意图。在图3中的A : B'为sboA基因及其上下游同源片段，C'为sboA基因内部片段。图3中的B为利用引物 PMsboA-lF/PMsboA-lR 扩增的 B' 段长度，图 3 中的 C 为利用引物 PMsboA-2F/PMsboA-2R 扩增的C'片段长度。泳道说明：1-为野生型GW4,2-为突变株GW4-Asb〇A，3-为互补株 GW4-AsboA_C，M为DL2000plus Marker。由图3可知，突变株及互补株构建成功。
[0027] 图4 :是野生型菌株GW4,突变株GW4- Λ sboA，互补株GW4- Λ sboA-C和超表达菌株 GW4: : sboA在加不同浓度Sb(III)条件下的生长及氧化曲线。
[0028] 其中：图4中的A和C为大肠杆菌（E. coli)S17-l菌株在加ΙΟμΜ Sb(III)条件 下的生长氧化曲线，图4中的B和D为大肠杆菌（E. coli) S17-1菌株在加50 μ M Sb (III) 条件下的生长氧化曲线。
[0029]图 5 :大肠杆菌（E. coli)S17-l 中 Sb(III)的氧化。
[0030] 其中：图5中的A为0· 5h，lh，I. 5h和2h分别取样检测转入质粒（即互补载体） pCPP30-sboA 的 E. coli S17-1 (pCPP30-sboA)和对照菌株 E. coli S17-1 (pCPP30)，E. coli S17-1的生长曲线。图5中的B为各菌株的Sb(III)氧化曲线。
[0031] 图6 :本发明所使用的重组表达载体pET-28a_sboA示意图。
[0032] 图7 :SboA对Sb (III)的体外氧化实验。
【具体实施方式】
[0033] 实施例I :sboA基因敲除，互补及超标达实验
[0034] 1、敲除载体构建
[0035] 本实施例采用PJQ200SK(见图1，美国蒙大拿州立大学，蒂莫西?麦克德莫特 (Timothy R. McDermott)教授惠赠））敲除载体对sboA基因进行无痕敲除。敲除载体构建 过程如下：根据菌株GW4中sboA基因序列，设计带有BamHI和XbaI酶切位点上游同源片 段的引物PsboA-IF和PsboA-IR以及下游同源片段的引物PsboA-2F和PsboA-2R。然后配 置 PCR 体系：5yL10XPCR buffer，lyL dNTPs，左右引物各 lyL，2yL DNA 模板，0.5yL Taq DNA聚合酶，最后补水至50yL。PCR程序：95°C预变性5min，95°C变性45sec，5(TC退 火45sec，72°C延伸30sec，最后72°C延伸lOmin，循环次数设为30次。
[0036] PCR结束后，分别取5 μ L点样，使用Trans2K plus Marker (北京全式金公司）。1% 琼脂糖凝胶中电泳（120V，30min)后，在EB(Ethidiumbromide，溴化乙锭）中染色10min，之 后置于UVP凝胶成像系统（Alpha Innotech公司）下观察。如果扩增成功则采用PCR产物 纯化试剂盒（上海赛百盛公司）纯化。纯化步骤为：吸取0. 4mL纯化树脂（使用前充分混 匀）装入离心纯化柱中，然后分别加入100 μ L PCR反应液，颠倒混匀并静置5min，12000r/ min离心30s，倒掉收集管中的废液。再加入500 μ L 80%乙醇悬浮，12000r/min离心30s， 倒掉收集管中的废液。再重复上步操作一次，12000r/min离心2min，此时务必要除尽乙醇。 之后将离心纯化柱套入到一个干净的I. 5mL离心管中，加入预热的20 μ L TE缓冲液到纯化 树脂上（注意务必要加在管中心，不能粘在管壁上）。放置2min，12000r/min离心30s。离 心管中的液体即是纯化好的DNA片段sboA-F和sboA-R。最后，通过cross-over PCR的方 法将sboA-F 和 sboA-R 连接在一起。配置 PCR 体系：5yL IOXPCR buffer，lyL dNTPs，正 向引物和反向引物各luL，2yL DNA模板，0. 5yL Taq DNA聚合酶，最后补双蒸水至50yL。 PCR程序：95°C预变性 5min，95°C变性 45sec，50°C退火 45sec，72°C延伸 60sec，最后 72°C延 伸lOmin，循环次数设为30次。PCR完成后，经I %琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化PCR产物。 然后配置连接体系：加入7 μ L纯化好的DNA片段，1 μ L pGEM-Τ载体（购自美国Promega公 司）连接，IuL IOXDNA ligase Buffer 和 IyL DNA ligase，在室温下孵育 5h。
[0037] 待反应结束后，将10 μ L连接产物与E. coli DH5 α感受态细胞混合均匀，冰上放 置30min，42°C水浴热激45s后，立即冰上放置5min，再加入500mL预冷的LB培养基（配方 见附录）在37°C摇床中复苏培养lh，之后取100 μ L涂在添加有氨苄青霉素（Amp)、异丙基 硫代半乳糖苷（IPTG)和5-溴_4_氯_3_ Π引哚-β -D-半乳糖苷（X-gal)的LB固体平板上， 37°C培养过夜。待长出菌落后，用牙签挑取白色菌落，放入加有50 μ LCldH2O的1.5mL离心 管中，洗脱并打散菌体，l〇〇°C热激5min后立即冰上放置5min，重复上述步骤，最后12000r/ min离心5min后取上清作为DNA模板进行PCR(体系及程序同上）。PCR完成后，将阳性克 隆送上海生工生物技术公司测序。将测序结果与锑氧化酶基因SboA进行比对。如果正确， 分别抽提包含目的片段的pGEM-Τ载体和敲除质粒的PJQ200SK载体。然后配置50 μ L酶切 体系：36yL DNA，10yL10XTango Buffer，2yL BamHI 和 2yL XbaI，37°C酶切过夜。
[0038] 利用纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物。经I %琼脂糖凝胶电泳检测含量。然后 配置连接体系：加入5 μ L纯化好的DNA片段，3 μ L质粒pJQ200SK (美国蒙大拿州立大学蒂 莫西?麦克德莫特教授（Timothy R. McDermott)惠赠），1μ L IOXDNA ligase Buffer 和 IyL DNA ligase。随后，在室温下反应5h。将连接好的产物与E. coli DH5a感受态细胞 混合均匀，冰上放置30min，42°C水浴热激45s后，立即冰上放置5min，再加入500mL预冷的 LB培养基在37°C摇床中复苏培养lh，之后取100 μ L涂在添加有庆大霉素（Gm)的LB固体 平板上，在37°C培养过夜。之后进行PCR检测（方法同上），将阳性克隆进行划线保藏。
[0039] 2、双亲本杂交
[0040] 挑取受体菌株根癌农杆菌GW4 (Amplr,氨苄青霉素）和含供体质粒pJQ200SK (Gnf， 庆大霉素）的供体菌株E. coli S17-1单克隆进行活化。当菌液0D_值达到0.5-0. 6时， 于6000rpm离心5min收集I. 5-3mL菌体。收集得到的菌体利用ImLCldH2O或者生理盐水 重悬,在6000rpm离心5min再次收集菌体，重复洗涤2次。在最后一次洗涤过程中，将供体 菌E. coli S17-1与受体菌根癌农杆菌GW4合为一管，利用IOOyLCldH2O或者生理盐水重 悬后，滴加在铺于LB平板的滤纸片上，吹干后28°C倒置培养3-5d。
[0041] 当滤纸片上有明显可见的菌膜后，用5mLCldH2O或者生理盐水将菌洗下制成菌悬 液，再进行梯度稀释。各取100 μ L稀释度为10'KT5和KT6的菌悬液，均匀涂布于含有 100 μ g/mL Amp和50 μ g/mL Gm的固体CDM培养基上。分别涂布适当浓度的供体菌（同上） 和受体菌（同上）悬液作阴性对照，于28°C倒置培养48h。当抗性平板上长出克隆后，挑取 克隆，进行抗性和PCR验证（按常规方法），确定插入的准确性。
[0042] 3、蔗糖筛选实验
[0043] 将双亲本实验中获得的突变子在加入Gm抗性的LB培养基中震荡培养。当OD 6c?达 到0. 5-0. 6时，将100 μ L菌液涂布在含有20-25 %蔗糖的CDM平板上28°C倒置培养3-5d 后，挑取克隆进行抗性验证。选取在Amp抗性平板上可以生长但在Gm抗性平板上不能生长 的克隆利用引物PMsboA-lF/PMsboA-1R和PMsboA-2F/PMsboA-2R分别扩增，以野生型GW4 的DNA作为对照；如果用外部引物扩增片段与野生型片段大小刚好相差SboA基因的长度且 用内部基因无法扩增出sboA基因片段，则得到的菌株即判定为突变株GW4-AsboA。图3的 结果显示GW4中sboA基因敲除成功。
[0044] 4、互补实验及超表达实验
[0045] 使用带有PstI和BamHI酶切位点的引物CsboA-F和CsboA-F-R进行PCR扩增得 到sboA基因的完整序列，然后用限制性内切酶PstI和BamHI对纯化后的扩增产物和载体 pCPP30(美国蒙大拿州立大学蒂莫西?麦克德莫特教授（Timothy R. McDermott)惠赠）进 行双酶切。将酶切产物进行纯化，并配置10 μ L的连接体系。在室温下连接5h，然后通过热 激法将构建好的互补载体pCPP30-sb〇A转化到E. coli S17-1感受态细胞中。通过双亲本 杂交将载体pCPP30-sboA转化到GW4- Λ sboA中，再利用Tc和Amp抗生素以及PCR进行筛 选，获得互补株GW4-AsboA-C，图3PCR结果显示互补株构建成功。将构建好的互补载体 转入野生型GW4中得到超标达株GW4: : sboA，抽提质粒，利用PstI和BamHI双酶切验证GM 中是否含有该质粒。
[0046]实施例 2:野生菌株 GW4, sboA 突变株（GW4- Λ sboA)，sboA 互补株（GW4- Λ sboA-C) 和sboA超表达株（GW4: : sboA)的生长及铺氧化实验
[0047] 挑取野生型GW4, sboA突变株GW4- Λ sboA，sboA互补株GW4- Λ sboA-C和超表达株 GW4: : sboA的单克隆，分别接种于5mL CDM培养基中，28°C摇床振荡培养24h。取其新鲜菌 液各 100 μ L 分别接种到含有 10 μ mol/L Sb (III)和 50 μ mol/L Sb(III)的 IOOmL CDM 培 养基中。28°C摇床振荡培养，以不加Sb(III)的条件作为对照。
[0048] 根据菌株生长状况，每隔8h取一次样，用于测定OD6tltl(600nm波长处的吸光值， DU800型分光光度计）和培养基中不同形态锑的含量。采用高效液相色谱-氢化物发生-原 子荧光光谱仪（HPLC-HG-AFS)测定培养基中锑含量。直到菌体达到稳定期后停止取样。将 各个阶段取样所得的〇D_和培养基中不同价态锑含量数据绘制成曲线图（见图4)，进行对 比观察分析。
[0049] 图4结果显示：敲除sboA基因的sboA突变株GW4-Λ sboA，锑氧化速率降低了 27 %，而sboA互补株GW4- Λ sboA-C的锑氧化表型得到回复，而超表达菌株GW4: : sboA的锑 氧化速率提高了 34%，说明sboA基因确实影响了菌株的Sb(III)氧化表型。
[0050] 实施例3 :SboA在大肠杆菌Ε. coli S17-1中超表达和锑氧化鉴定
[0051] 将实施例1中的互补载体pCPP30_sboA转入不含sboA基因的E. coli S17-1 中，使其在E. coli中异源表达。以野生型E. coli S17-1和转入pCPP30空载的E. coli S17-l(pCPP30)作为对照，检测其Sb(m)氧化表型。
[0052]将活化好的菌株 S17-1 (pCPP30-sboA)，S17-1 (pCPP30)和 S17-1 接种于 LB 培养 基中进行扩大培养，再低速离心（5000rpm)收集菌体并用50mM Tris-HCKpH = 8. 0)洗涤 2遍。然后接种于含0.02%酵母粉和10 μ MSb (III)的CDM培养基中并调整菌体量使初始 OD6tltl达到0. 5左右。置于37°C摇床进行培养。分别于0. 5h、lh、l. 5h和2h取样测定OD6tltl 及不同形态锑含量。
[0053] 实施例4:SboA对Sb (III)的体外氧化实验
[0054]使用高保真酶Fast Pfu DNA Polymerase (Transgen) PCR扩增 sboA 的基因全长，所 用引物为EsboA-F/EsboA-R。纯化回收PCR产物，与抽提的pET28a(+)载体（德国Novagen 公司赠送）同时使用E C〇RI-HindIII37°C双酶切过夜，然后将酶切产物纯化，连接后将表达 载体转入E. Co I i高效表达菌株BL21 StarTM (DE3) pLy sS感受态中，挑选阳性克隆，最终得到 SboA的表达菌株E. coli BL21 (pET28a-sboA)。将该表达菌株接种至5mL含有100 μ g/mL Kan的LB培养基中，37°C过夜培养。将ImL过夜培养的菌液接种到IOOmL含有100 μ g/mL Kan的LB培养基中，培养2-3h至OD6tltl达到0. 3-0. 4时，加入终浓度0. 2mM的IPTG，28°C诱 导2h。
[0055] 将培养好的菌体使用8000r/min，4°C离心全部收集，用含有300 μ M NaCl的50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)洗涤3次后，最终用IOmL含有上述缓冲液重悬，并充分打散。细胞 在冰上经过30%超声波破碎至澄清后，120001'/1^11，41：离心101^11。取上清加入终浓度 为20mM的咪唑，与ImL预处理过的ProfinityTM IMAC Resins(Bio-RAD)混匀，4°C的垂直 摇床上结合2h，使得含有组氨酸标签的可溶目的蛋白与树脂充分结合。然后将树脂与蛋 白混合物转移到IOmL的蛋白纯化管中，先用含有20mM的咪唑50mM Tris-HCl (pH8. 0)缓 洗脱杂蛋白数次。再依次用40、60、100、200、300、400、500mM的咪唑洗脱蛋白。最终纯化 出来的蛋白使用 10% 的 SDS-PAGE 检测（Liu GH，Liu MY，Kim EH et al.A periplasmic arsenite-binding protein involved in regulating arsenite oxidation. Environ Microbiol, 2012, 14 (7) : 1624-1634)，用常用的考马斯亮蓝R250染色，并观察结果。纯化出 来的蛋白加入10%的甘油保存于_80°C冰箱中。
[0056] 将菌株GW4-AsboA接种于含10μΜ Sb(III)的50mL CDM培养基中，28°C培养24h 后收集全部菌体。用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)洗涤3次并重悬后，至于冰上超声破碎细 胞，12000r/min离心，取上清液作为含有Sb (III)氧化过程中所需电子受体的缓冲体系。再 向该体系中加入ΙμΜ Sb(III)，200yM辅酶NADP+，和不同浓度的SboA蛋白，最终用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)将体系补齐至5mL，并在28°C孵育0. 5h。以不加辅酶的体系作为对照， 通过高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪（HPLC-HG-AFS)分别检测不同浓度梯度 的SboA氧化Sb (III)的含量。
[0057] 附录
[0058] (I)LB培养基配方（IL)
[0059] 胰蛋白胨IOg
[0060] 酵母提取物5g
[0061] NaCl IOg
[0062] 溶解后用10M NaOH调节pH至7. 0,补加CldH2O定容至1L，高温灭菌。
[0063] (2) CDM培养基配方
[0064]溶液 A(IL):
[0065] MgSO4* 7112O 20 g NlliCIIOy Na^SO+ IOg
[0066] K2HPO4-SH2O 0.13 g CaCl3-II2O 0.67 g CiiI5NaO3 50g
[0067] ddH20定容至1L，高温灭菌。
[0068] 溶液 B (IL):
[0069] FeSO4 · 7H20 I. 33g
[0070] ddH20定容至1L，过滤除菌。
[0071] 溶液 C(IL):
[0072] NaHCO3 79. 8g
[0073] ddH20定容至1L，过滤除菌。
[0074] 配制IL CDM培养基：在887. 5mL无菌水中加入IOOmL溶液A，2. 5mL溶液B，IOmL 溶液C，调节pH至7.0。
【权利要求】
1. 一种分离自根癌农杆菌的锑氧化酶基因 sboA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1 中第1-855位碱基所示的序列。
2. -种分离自根癌农杆菌的锑氧化酶基因 sboA，其特征在于该基因编码的蛋白质序 列如序列表SEQ ID N0:2所示。
3. 包含SEQ ID NO :1中第1-855位碱基所示的序列的锑氧化酶基因 sboA的大肠杆 菌（Escherichia coli)BL21/pET28a-sboA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO :M2014437。
4. 如序列表SEQ ID NO :1中第1-855位碱基所示的序列的锑氧化酶基因 sboA在氧化 环境锑污染中的应用。
5. 如权利要求4所述的锑氧化酶基因 sboA在氧化环境锑污染中的应用，其特征在于， 所述的锑是三价锑或五价锑。
【文档编号】C12N1/21GK104357463SQ201410538034
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】王革娇, 李璟欣, 王倩, 杨碧荣, 李明顺, 史曼曼, 郭玮 申请人:华中农业大学