一种金黄色葡萄球菌的lamp引物及其应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种金黄色葡萄球菌LAMP引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，分别为：F3：如SEQ ID NO：1所示；B3：如SEQ ID NO：2所示；FIP：如SEQ ID NO：3所示；BIP：如SEQ ID NO：4所示。本发明针对金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因，设计了一组引物，并应用该引物建立了敏感、特异的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。实验证明，本发明的LAMP检测方法的检测灵敏度和检出限是PCR方法的100倍；可以通过肉眼观察是否产生绿色荧光确定反应是否发生，使结果判定简便易行；与PCR技术比较省时省力，不需要昂贵的仪器和繁琐的电泳分析，更适合在基层应用。
【专利说明】-种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方法，用于金黄色葡萄球 菌的检测。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌的实验室检测方法有：传统分离培养及生化鉴定、免疫检测技术、 分子检测技术等。传统检测方法操作繁琐，检测时间长，且灵敏度较低；免疫学方法的特异 性和灵敏度都比较低；PCR方法敏感、准确、快速，但由于该检测方法需要昂贵的仪器设备 和繁琐的电泳操作，对检测人员有较高的技术要求，使其难以在基层和检测设备较薄弱的 地区应用，限制了该方法的普及和推广。
[0003] 环介导等温扩增（LAMP)是一种新的核酸扩增方法，能够在等温条件下高效扩增 靶基因，灵敏度和特异性高。而且，相比PCR需要昂贵的热循环仪，LAMP只需要很简单的设 备，如水浴锅即可。目前LAMP已经广泛应用于病毒、细菌和寄生虫等病原的检测。环介导等 温扩增技术的原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条 件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。利用4条不同的特异性引物识别靶基因的6个 特定区域，从而保证了其特异性更强、灵敏度更高，进而使反应的稳定性和可重复性更好。 具有高特异性和等温快速扩增的特点，可以在Ih之内，将靶DNA片段扩增IO 9?IOltl倍。
[0004] 目前国内外还缺少一种有效的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物及其应用方 法，特异性强且灵敏度高。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] -种金黄色葡萄球菌LAMP引物，包括两条内引物（FIP和BIP)和两条外引物（F3 和B3)，分别为 ：
[0008] F3 :如 SEQ ID NO :1 所示；
[0009] B3 :如 SEQ ID NO : 2 所示；
[0010] FIP :如 SEQ ID NO : 3 所示；
[0011] BIP :如 SEQ ID NO :4 所示。
[0012] 一种利用上述LAMP引物的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其使用的25 μ L反 应体系包括：按终浓度计，20mmol/L的Tris-HCl (pH8. 8)，10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的 硫酸铵、8mmol/L 的硫酸镁、0. 1 % v/v 的 Tween20、lmol/L 的甜菜碱、FIP 和 BIP 各 1. 6 μ mol/ L、F3 与 B3 各 0· 2mol/L，I. 4mmol/L 的 dNTP ;8U 的 Bst 大片断 DNA 聚合酶和 1 μ L 的 DNA 模 板；将上述反应体系在62. 5 C恒温反应45min，最后在80 C下保持IOmin后结束反应。
[0013] 每次反应设阴性对照（用灭菌双蒸水代替DNA模板）。
[0014] 反应结束后，利用目测和凝胶电泳法检测反应结果。
[0015] 目测：反应结束后，向各反应小管中加入1 μ L(1 :1000)的SYBRGreen I荧光染料， 在自然光下肉眼观察反应小管混合液的外观变化，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色， 则检测结果为阳性，如果保持染料原有的橙红色，则检测结果为阴性。
[0016] 凝胶电泳法：反应结束后，产物在1. 5 %琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min，加样量 为7μ L/上样孔。凝胶置于溴化乙锭（EB)中染色lOmin，在凝胶成像系统下检测、照像，如 出现梯型条带则判断为阳性，没有出现梯型条带则判断为阴性。
[0017] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
[0018] 本发明根据LAMP方法的原理，针对金黄色葡萄球菌特异性的nuc基因，设计了一 组引物，并应用该引物建立了敏感、特异的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。
[0019] 本发明的LAMP检测方法的检测灵敏度和检出限是PCR方法的100倍；可以通过肉 眼观察是否产生绿色荧光确定反应是否发生，使结果判定简便易行；与PCR技术比较省时 省力，不需要昂贵的仪器和繁琐的电泳分析，更适合在基层应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是实施例2中LAMP反应结果；图1中：A为肉眼观察到的反应结果，B为紫外 灯下观察到的反应结果（1、阴性反应，2、阳性反应，3-5为检测样品）。
[0021] 图2是实施例2中LAMP特异性检测结果；图2中：M :marker，l :阴性对照，2 :金黄 色葡萄球菌，3 :大肠杆菌，4 :无乳链球菌，5 :鼠伤寒沙门氏菌，6 :表皮葡萄球菌。
[0022] 图3是实施例3中LAMP方法与PCR方法灵敏度检测比较结果；图3中，A为LAMP 方法灵敏度检测结果（M :Marker ; 1?4 : ΙΟ3、ΙΟ2、101、阴性对照），B为PCR方法灵敏度检测 结果（M :Marker ;1 ?5 :106、105、104、103、10 2)。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024] 本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施 例中所用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 本发明各实施例中部分材料为：Bst大片段DNA聚合酶购于New England Biolabs 公司；甜菜碱（分析纯）购于Sigma公司；Tap DNA聚合酶、dNTP、细菌基因组DNA提取试剂 盒购于宝生物工程（大连）有限公司；SYBR Green I荧光染料、琼脂糖购于日本TaKaRa公 司。
[0026] 金黄色葡萄球菌（Sta. aureus ATCC 25923)、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 35218)、无乳链球菌（Str agalactiae CVCC1886)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium CVCC542)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis CICC23664)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0027] 本发明各实施例中部分仪器为：Thermocell恒温金属水浴锅（杭州博日科技有限 公司，中国）；PCR仪My cyCler(Bi〇-Rad公司，美国）；核酸通用型电泳仪JY1000C(北京 六一仪器公司，中国）；电泳槽DYCP-31DN(北京六一仪器公司，中国）；紫外凝胶成像系统 WD-9413C (北京六一仪器公司，中国）。
[0028] 实施例I :LAMP引物的设计
[0029] 引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，4条引物序列见表1。
[0030] 表ILAMP引物序列
[0031]
【权利要求】
1. 一种金黄色葡萄球菌的LAMP引物，其特征在于：所述引物为： F3 :如 SEQ ID NO :1 所示； B3 :如 SEQ ID NO :2 所示； FIP :如 SEQ ID NO :3 所示； BIP :如 SEQ ID NO :4 所示。
2. -种利用如权利要求1所述LAMP引物的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征 在于：所述LAMP检测方法使用的25μ L反应体系包括：按终浓度计，20mmol/L的Tris-HCl， ρΗ8· 8,10mmol/L 的氯化钾、10mmol/L 的硫酸铵、8mmol/L 的硫酸镁、0· 1 % v/v 的 Tween20、 lmol/L 的甜菜碱、FIP 和 BIP 各 1. 6 μ mol/L、F3 与 B3 各 0· 2mol/L，1. 4mmol/L 的 dNTP ;8U 的Bst大片断DNA聚合酶和1 μ L的DNA模板；将上述反应体系在62. 5°C恒温反应45min， 最后在80 C下保持lOmin后结束反应。
3. 根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：每次反应设 阴性对照，用灭菌双蒸水代替DNA模板。
4. 根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：反应结束 后，向各反应小管中加入1 μ L的SYBRGreenI荧光染料，在自然光下肉眼观察反应小管混合 液的外观变化，如果染料颜色由开始的橙色变为绿色，则检测结果为阳性，如果保持染料原 有的橙红色，则检测结果为阴性。
5. 根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于：反应结束 后，产物在1. 5 %琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min，加样量为7 μ L/上样孔；凝胶置于溴化 乙锭中染色l〇min，在凝胶成像系统下检测、照像，如出现梯型条带则判断为阳性，没有出现 梯型条带则判断为阴性。
【文档编号】C12Q1/14GK104293954SQ201410538032
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】周巍, 张岩, 杨岚, 李永波, 马超峰, 李月华, 刘涛, 刘红冉 申请人:河北省食品检验研究院