利用埃希杆菌属细菌生产l－氨基酸的方法

专利名称：利用埃希杆菌属细菌生产l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及发酵生产L-氨基酸的方法，更具体地涉及来源于大肠杆菌的一个基因。该基因能提高L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸和L-苏氨酸的生产效率。
背景技术：
传统上，利用天然来源微生物菌株或对该微生物菌株特别修饰以提高L-氨基酸生产效率的突变株进行发酵，来实现L-氨基酸的工业生产。
现已公开了许多提高L-氨基酸生产效率的技术，例如用重组DNA转化微生物(参见美国专利4,278,765)。这些技术建立在提高参与氨基酸生物合成的酶活性和/或降低对生成的氨基酸起反馈抑制作用的靶标酶敏感性的基础之上(参见日本专利申请No 56-18596(1981)，WO 95/16042或美国专利5,661,012和6,040,160)。
另一方面，增高氨基酸的分泌活性也可以提高L-氨基酸产生株的生产效率。已经公开了一种属于棒状杆菌属的赖氨酸产生株，其赖氨酸分泌基因(lysE基因)的表达增加(WO 9723597A2)。此外，还公开了用于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或噻唑烷衍生物分泌的外泌蛋白的编码基因(美国专利5,972,663)。
目前，已公开了大肠杆菌中几个能增加L-氨基酸产量、编码产物推定为膜蛋白质的基因。rhtB基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸的耐受增加并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP994190A2)。rhtC基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸、L-苏氨酸更具耐受力，并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1013765A1)。yahN、yeaS、yfiK和yggA基因的额外拷贝能提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1016710A2)。
在本发明人早期曾获得了一个大肠杆菌K-12突变株，该突变株具有突变的thrR基因(在这里被称作rhtA23)，该突变与该菌株对基础培养基中高浓度的苏氨酸和高丝氨酸的耐受性有关(Astaurova，O.B.etal.，Appl.Biochem.Microbiol.，21，611-616，1985)。对于不同的大肠杆菌生产株系，突变分别提高了L-苏氨酸(SU974817)、高丝氨酸和谷氨酸盐(Astaurova，O.B.et al.，Appl.Biochem.Microbiol.，27，556-561，1991)的产量。
另外，本发明人发现rhtA基因位于大肠杆菌染色体的第18微小体(min)处，邻近编码谷氨酰胺转运体系组分的glnHPQ操纵子，而且与pexB基因和ompX基因之间的ybiF开放式阅读框一致。表达这个开放式阅读框编码的蛋白质的DNA单位定名为rhtA基因(rht高丝氨酸和苏氨酸耐受)。
此外，本发明人发现rhtA基因扩增也会增加细菌对高丝氨酸、苏氨酸的耐受性。rhtA23突变将在其ATG起始密码子-1位上的A替换为G(1997年8月24-29号在加利福尼亚旧金山市召开的第17届国际生物化学和分子生物学大会及1997年美国生物化学和分子生物学界年会论文摘要第457号)。已知起始密码子和SD序列的间隔区核苷酸组成、尤其是起始密码子即上游的序列极大地影响mRNA的翻译能力。现已发现起始密码子前三位的核苷酸的差异可造成基因表达水平相差20倍(Gold et al.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403 1981；Hui et al.，EMBO J.，3，623-629，1984)。因此，rhtA23突变可增加rhtA的基因表达。
rhtA基因编码一个由295个氨基酸残基组成，高度疏水，含10个预测跨膜区段的蛋白质。对大肠杆菌K-12株系核苷酸序列进行PSI-BLAST检索(Science，277，1453-1474(1997))显示至少有10个RhtA蛋白的类似物。其中包括由ydeD和yedA基因编码的蛋白质。较早些时候，人们发现ydeD基因参与半胱氨酸通路代谢产物的外泌(Dassler et al.，Mol.Microbiol.，36，1101-1112，2000；US5,972,663)。yedA基因可编码推断为跨膜亚单位的蛋白质，蛋白质(GenBank编码AE000287 U00096序列中8037～8957位氨基酸)的功能还不清楚。

发明内容
本发明的目的是提高L-氨基酸生产菌株的生产效率，并提供利用这样的菌株生产L-氨基酸的方法，例如生产L-苯丙氨酸和L-苏氨酸。
本发明的目标是通过对yedA基因的鉴定而实现的。yedA基因编码一种膜蛋白，它是RhtA的类似物，并不参与目标L-氨基酸的生物合成路径，而当细菌多拷贝载体上的该基因的野生型等位基因扩增时可增高微生物对几种氨基酸和氨基酸类似物的耐受。此外，yedA基因附加拷贝导入各种氨基酸产生株时，yedA基因可提高氨基酸的产量。本发明由此得以完成。
本发明内容如下1)埃希杆菌(Escherichia)属的L-氨基酸生产菌，其中通过增强细菌细胞内下面(A)或(B)所定义的蛋白质的活性提高细菌的L-氨基酸的产量(A)含有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白质。
(B)含有对序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列，且具有使细菌增强对例如苯丙氨酸、苏氨酸、高丝氨酸或半胱氨酸的L-氨基酸和/或例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸、S-(2-氨乙基)半胱氨酸或4-氮杂-DL-亮氨酸的氨基酸类似物的耐受性的活性。(在下文中，上述(A)或(B)定义的蛋白质称为“本发明的蛋白质”)；2)如上所述细菌，其中使用编码(A)或(B)所定义蛋白质的DNA转化该细菌，或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列，来增强(A)或(B)所定义蛋白质的活性。
3)如上所述细菌，其中转化使用含有所述DNA的多拷贝载体进行的。
4)生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养如前所述的细菌，并从培养基中收集所产生并积累的L-氨基酸。
5)如上所述的方法，该方法所产生的L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
6)如上所述的方法，其中细菌提高了苯丙氨酸生物合成基因的表达。
7)如上所述的方法，其中产生的L-氨基酸为L-苏氨酸。
8)如上所述的方法，其中细菌提高了苏氨酸操纵子的表达。
9)如上所述的方法，其中细菌提高了参与色氨酸生物合成的基因的表达。
10)生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌，以在培养基中生成并积累L-苯丙氨酸，所述细菌具有L-苯丙氨酸生产能力；从天冬氨酸或其衍生物和获得的L-苯丙氨酸来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。
11)如前所述的方法，进一步包括酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯，用天冬氨酸衍生物凝聚(condensing)L-苯丙氨酸低级烷基酯，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐，从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，产生α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。
本发明中除非另外注明，氨基酸均为L-构型。
本发明生产L-氨基酸的方法包括利用L-苯丙氨酸生产菌生产L-苯丙氨酸，该菌中本发明的蛋白质活性增加，所述蛋白质如含有SEQID NO2中氨基酸序列的蛋白质。另外，生产L-氨基酸的方法还包括利用L-苏氨酸生产菌生产L-苏氨酸，该菌中本发明的蛋白质活性增加，所述蛋白质如含有SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白质。
本发明详述如下本发明所涉及的细菌是埃希杆菌属的L-氨基酸生产菌，其中细菌产生L-氨基酸的量通过增强细菌细胞中本发明的蛋白质活性得以提高。
在本发明中，“L-氨基酸生产菌”是指在培养基中培养时能在培养基中产生并积累L-氨基酸的细菌。L-氨基酸的产生能力可以是细菌的某个野生株系所具有的性质，也可以通过繁育获得或提高。
本发明所涉及的细菌是增高了蛋白活性的埃希杆菌属L-氨基酸生产菌，这些蛋白能提高目标L-氨基酸的生产效率。具体地说，本发明所涉及的细菌是增高了本发明的蛋白质活性的埃希杆菌属L-氨基酸生产菌。更具体地说，本发明所涉及的细菌DNA的yedA基因在染色体中或细菌质粒中超表达，提高了L-氨基酸的生产能力，例如利用这样的生产菌株生产L-苯丙氨酸和L-苏氨酸。
本发明的蛋白质包含定义如下的蛋白(A)或(B)(A)包含有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白质。
(B)包含有对序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列的蛋白质，且具有使细菌增强对例如苯丙氨酸、苏氨酸、高丝氨酸或半胱氨酸的L-氨基酸和/或例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸、S-(2-氨乙基)半胱氨酸或4-氮杂-DL-亮氨酸的氨基酸类似物耐受性的活性。
前文中“几个”氨基酸的具体指代数目根据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和类型而变化。它可以是2～30个，优选2～15个，对蛋白(A)来说更优选2～5个氨基酸残基。
“对L-氨基酸和/或氨基酸类似物的耐受性(resistance)”指细菌在含有某种浓度的L-氨基酸或其类似物的基础培养基中生长的能力，在这种浓度的L-氨基酸或其类似物存在时其它未修饰的或野生型的细菌或细菌的亲代株系不能生长；或是指细菌在含有L-氨基酸或其类似物的基础培养基中比其它未修饰的或野生型的细菌或细菌的亲代株系具有更快速生长的能力。L-氨基酸类似物可举例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸、S-(2-氨乙基)半胱氨酸、4-氮杂-DL-亮氨酸等。对L-高丝氨酸来说，上面提到的L-氨基酸或氨基酸类似物的浓度通常为1000～10000μg/mL，优选3000～5000μg/mL。对丝氨酸和半胱氨酸来说优选5000～7000μg/mL；对5-氟-DL-色氨酸来说通常0.1～1.0μg/mL，优选0.2～0.5μg/mL；对对-氟-苯丙氨酸来说通常为0.1～2.0mg/mL，优选0.5～1.0mg/mL；对4-氮杂-DL-亮氨酸和S-(2-氨乙基)半胱氨酸来说通常为0.1～2.0mg/mL，优选0.5～1.0mg/mL。
本发明所涉及的细菌还包括通过使用编码蛋白(A)或(B)的DNA转化前述细菌而使菌体内本发明的蛋白质活性增加的细菌；或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列而使菌体内本发明的蛋白质的活性增强的细菌。
用来修饰本发明所涉及的细菌的DNA可编码有L-氨基酸分泌活性的蛋白质。更具体地说，yedA基因即为此类DNA的代表。yedA基因可以通过如PCR等方式获得，PCR引物可依据SEQ ID NO1中的氨基酸序列设计。
本发明所涉及的DNA包含如下任意DNA，只要其编码的蛋白可由蛋白(A)中一个或几个位点上缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸得到，并且所得蛋白的活性不丧失。“几个”氨基酸的具体数目根据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和类型而变化，可以是2～30个，优选2～15个，对蛋白(A)来说更优选2～5个氨基酸残基。通过一些方式可能获得实质上与蛋白(A)相同的蛋白质的编码DNA，例如，运用定点突变缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸残基来修饰编码蛋白(A)的DNA的核苷酸序列。这样修饰的DNA能在常见的试剂和条件下诱变获得。这些处理方法，包括用羟胺诱变蛋白(A)的编码DNA，或对含有这样DNA的细菌用紫外线照射或用如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸之类的试剂诱变。
本发明所涉及的DNA包含在自然界分类中属于埃希杆菌属的不同株系和变种的各种变异DNA。编码变体的这些DNA能在严苛的条件下与yedA基因的全部或部分杂交后分离获得，它们编码的蛋白质可提高L-氨基酸的产量。术语“严苛的条件”在此是指某个特定的条件，在这样的条件下，形成所谓的“特异性杂交”，而不发生非特异的杂交。举例来说，严苛的条件包含这样一个情形，只有在此条件下高度同源的DNA之间，例如同源性不少于70％的DNA之间可杂交成功。或者，严苛的条件可代表如下情形，它包括常用的Southern杂交洗脱条件，比如60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS。对于那些编码变种的DNA和杂交yedA基因后的DNA产物，SEQ IDNO1核苷酸序列的一部分依然可以用作探针。这样的探针可以由依据SEQ ID NO1核苷酸序列制得的寡核苷酸作为引物，由含有SEQ IDNO1核苷酸序列的DNA片段为模板用PCR方法合成。举例来说，当用一个长度约为300bp的DNA片段作为探针时，Southern杂交洗脱的条件则变为50℃、2×SSC、0.1％SDS。
用编码蛋白质的DNA转化细菌意思是把该DNA导入菌体(如通过常规的方法)来增加本发明的蛋白质表达，增强其在菌体内的活性。
增高基因表达的方法包括增加基因的拷贝数目。基因拷贝数的增加可通过把基因引入能在埃希杆菌属细菌中行使功能的载体而实现。为达到此目的，优选使用多拷贝载体，例如pBR322、pUC19、pBluescriptKS+、pACYC177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b或其它此类载体。
此外，基因表达的增高可通过将多拷贝基因整合到细菌染色体上实现，其途径诸如同源重组或其它此类方法。
倘若两个或多个基因表达增高了，则这些基因可能处于同一质粒中或者分散在不同质粒里。也可以是其中一个基因定位于染色体上，而其它基因存在于质粒中。
另一方面，用强启动子替代其天然启动子起调控作用也可使本发明所涉及的DNA的基因表达增高。启动子的强度根据RNA合成起始的频率来判定。Deuschle，U.，Kammerer，W.，Gentz，R.，Bujard，H.描述了评价启动子强弱的方法，并举出了强启动子的例子(大肠杆菌中的启动子一个标志菌体结构更替的体内强度体系，EMBO J.1986，5，2987-2994)。举例来说，λ噬菌体PL启动子就是强的组成型启动子。其它已知的强启动子有lac启动子、trp启动子、trc启动子等等。可以将利用强启动子和增多基因拷贝相结合。
染色体DNA的制备、杂交、PCR、质粒的制备、DNA的消化和连接、转化、寡核苷酸引物的选择等可采用本领域中的技术人员所熟知的常规方法。这些方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.编著的，冷泉港实验室出版社出版的《分子克隆实验指南》第三版(2001)等著作中有描述。
将前述DNA导入可生产L-氨基酸的埃希杆菌属细菌可获得本发明所涉及的细菌。或者，也可通过将生产L-氨基酸的能力传给具有前述DNA的埃希杆菌属细菌而获得本发明所涉及的细菌。
埃希杆菌属的具体细菌并无特殊限定，只要它有生产L-氨基酸的能力或者它能获得这种能力。这样的埃希杆菌属细菌的例子包括大肠杆菌。
埃希杆菌属的氨基酸生产菌可举例描述如下苯丙氨酸生产菌埃希杆菌属的苯丙氨酸生产菌株可以作为亲代株系来增强本发明的蛋白质活性，例如，菌株AJ12739(tyrA∷Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)、含有pheA34基因(US5,354,672)的菌株HW1089(ATCC 55371)、突变的MWEC101-b菌株(KR8903681)、菌株NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(US4,407,952)等。同样的，属于埃希杆菌属的大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604的大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPB-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)等苯丙氨酸生产菌株也可以作为亲代株系来增强本发明的蛋白质活性(欧洲专利EP488424B1)。
苏氨酸生产菌埃希杆菌属的苏氨酸生产菌株可作为亲代株系来增强本发明的蛋白质的活性，例如，菌株MG442(VKPM B-1628)(Gusyatiner，et al.，Genetika(in Russian)，14，947-956，1978，US4,278,765)；VKPM B-3996(US6,165,756)；VKPM B-5318(US6,132,999)；BP-3756和BP-4072(US5,474,918)；FERM BP-3519和FERM BP-3520(US5,376,538)等。
本发明方法包含生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-氨基酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-氨基酸。同样的，本发明方法包含生产L-苯丙氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-苯丙氨酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-苯丙氨酸。同样，本发明方法也包含生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-苏氨酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-苏氨酸。
在本发明中，在培养基中培养微生物、收集和纯化L-氨基酸等可以采用和常规发酵生产氨基酸的方法相类似的方法。所用的培养基可以是合成的或者是天然的，只要该培养基含有碳源、氮源、矿物质和必要时微生物生长需添加的其它适当营养物质。碳源可以包括各种碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖以及各种有机酸。根据微生物同化作用的不同，也可用醇类，包括乙醇和甘油作为碳源。至于氮源，包括各种铵盐(氨水和硫酸铵等)，其它的含氮化合物如胺类，天然来源的氮源(如蛋白胨、豆类水解产物和发酵消化的微生物等)。矿物质，包括单磷酸钾盐、硫酸锰、氯化钙等。必要时培养基中还要加入其它的营养素，举例来说，微生物(酪氨酸缺陷型)的生长需要酪氨酸，培养基中就要另外加入足量的酪氨酸。
培养时优选在有氧状态中进行，比如通风状态下振摇和搅拌培养基，温度为20～40℃，更优选30～38℃下培养。培养的pH值为5～9，优选6.5～7.2。培养时的pH值可以用氨水、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液来调整。一般来说，一至五天的培养可使目标L-氨基酸在液体培养基中累积。
培养后，固态物如菌体能通过离心或膜过滤的方式从液体培养基中分离出来，接着目标L-氨基酸可以用常规的方法如离子交换，浓缩和结晶来收集和纯化。
举例来说，采用本发明方法获得的苯丙氨酸可以用作生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯(还称作“天冬氨酰苯丙氨酸酯(aspartame)”)。这就是说，本发明方法包括以L-苯丙氨酸为原料生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法。该方法包含用本发明前述方法生产的苯丙氨酸和天冬氨酸或其衍生物来进行α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的合成。低级烷基酯可以指甲酯、乙酯、丙酯等等。
本发明方法中，由苯丙氨酸以及天冬氨酸或其衍生物来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的具体过程并无特殊限定，可采用能用L-苯丙氨酸或其衍生物合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的任意常规方法。具体的，举例来说，α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的生产可能经由下列步骤(US3,786,039)L-苯丙氨酸酯化得到L-苯丙氨酸低级烷基酯；L-苯丙氨酸烷基化酯和氨基及β-羟基被保护、α-羟基被酯化激活的L-天冬氨酸衍生物反应，此衍生物包括N-酰基-L-天冬氨酸酐，例如N-甲酰基-、N-苄氧羰基-或N-对-甲氧基-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐；浓缩得到N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸和N-酰基-β-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸混合物，如果浓缩反应体系在37℃下解离常数为10-4或更低的有机酸存在，混合物中α型对β型的比率会增加(日本专利申请No.51-113841)；然后从混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸，再将其氢化，获得α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸。
实施本发明的最佳模式本发明将在以下实施例中得到更具体的解释。
实施例1从大肠杆菌中克隆yedA基因已测定了大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列(Science，277，1453-1474，1997)。PSI-BLAST检索发现其基因组上至少有10个rhtA基因旁系同源物(paralogues)，其中包括yedA基因。yedA基因编码产物推测为能跨膜的亚单位，该亚单位的功能还不清楚。
根据报道的核苷酸序列，合成了如SEQ ID No.3(引物1)和No.4(引物2)所示的两个引物。引物1的序列与起始密码子上游179～153的核苷酸序列互补，并在其5′末端加入了限制性内切酶BamHI的识别位点。引物2的序列与终止密码子下游53～77的核苷酸序列互补，并在其5′末端加入了限制性内切酶SalI的识别位点。
通过常规方法制得大肠杆菌TG1菌株的染色体DNA。使用Taq聚合酶(Fermentas)在“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”PCR仪中进行PCR反应，条件如下95℃ 40秒，47℃ 40秒，72℃ 40秒，共30个循环。扩增得到的、含yedA基因及其启动子的片段用BamHI和SalI双酶切后，与经过同样双酶切的载体pUC19或pAYCTER3连接，分别得到质粒pYEDA1和pYEDA2。pAYCTER3载体是pAYC32的衍生物。pAYC32是在质粒RSF1010的基础上构建的，有中度的拷贝数，非常稳定(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，来源于RSF1010 Tn1质粒的广泛宿主载体，Plasmide，1986，V.16，PP.161-167)。pAYCTER3载体是按如下步骤将来自pUC19质粒的接头和强终止子rrnB引入pAYC32质粒取代其启动子而得到的。首先，以SEQ ID No.5和No.6描述的序列作为引物，PCR扩增来自pUC19的接头，用限制性内切酶EcoRI和BglI酶切扩增产物；同样以SEQ IDNo.7和No.8描述的序列作为引物pCR扩增终止子rrnB，用限制性内切酶BglI和BclI酶切扩增产物；而后将这两个DNA片段连接到经EcoRI和BclI预先处理过的pAYC32质粒上。这样即获得了pAYCTER3质粒。
实施例2yedA基因扩增对于大肠杆菌TG1菌株对氨基酸及氨基酸类似物的耐受性的影响将pYEDA1、pYEDA2质粒和pUC19及pAYCTER3载体分别导入大肠杆菌TG1菌株，由此获得TG1(pYEDA1)、TG1(pYEDA2)、TG1(pUC19)、TG1(pAYCTER3)菌株。
利用含有梯度浓度抑制剂的M9葡萄糖基础琼脂平板检测这些菌株在有氨基酸及氨基酸类似物存在时的生长能力。从培养过夜的基础培养基(含质粒的菌株另加了100μg/mL的氨苄霉素)中取106到107个细菌点到这些平板上。37℃下培养44小时后评价生长状况，结果如表1所示。
表1

*含pAYCTER3载体的TG1菌株与它有相同的结果+生长良好 -不生长 n.d.未确定实施例3yedA基因扩增对于苯丙氨酸生成的影响以生产苯丙氨酸的大肠杆菌AJ12739菌株作为亲代株，用含有yedA基因的质粒转化该菌株。菌株AJ12739于2001年11月6日被俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)(俄罗斯，113545莫斯科，1stDorozhny proezd，1)保藏，保藏号VKPM B-8197。
用pYEDA2质粒或pAYCTER3载体转化生产苯丙氨酸的AJ12739株系，分别得到AJ12739/pYEDA2和AJ12739/pAYCTER3菌株。将这些菌株在加入100mg/L氨苄霉素的营养肉汤培养基中37℃下培养18小时，然后取0.3mL接种到含100mg/L氨苄霉素的发酵培养基中，在20×200mm的试管里37℃下用摇床振摇培养48小时。培养结束后，用薄层层析的方法检测培养基中累积的苯丙氨酸的量。10×15cm的TCL板铺上0.11mm的不加荧光指示剂的吸附性硅胶(Sorbpolymer股份公司，krasnodar，俄罗斯)。硅胶板用以下的流动相展开丙-2-醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝40∶40∶7∶16(v/v)。2％水合茚三酮丙酮溶液作为显色剂。结果如表2所示。
发酵培养基的组分(g/L)葡萄糖 40.0(NH4)2SO416.0K2HPO41.0MgSO4·7H2O 1.0FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·5H2O 0.01盐酸硫胺 0.0002酵母浸膏 2.0酪氨酸 0.1CaCO330.0葡萄糖和硫酸镁分别进行灭菌处理。碳酸钙于180℃干热灭菌2小时。pH值调为7.0。抗生素在灭菌后加入培养基。
表2

从表2可以看出yedA基因的扩增提高了AJ12739菌株对苯丙氨酸的生产效率。
实施例4yedA基因扩增对苏氨酸生成的影响用pYEDA1质粒或pUC19载体转化已知的生产苏氨酸的大肠杆菌菌株VNIIGenetika MG442(Gusyatiner，et al.，1978，Genetika(inRussian)，14，P.947-956)(依照布达佩斯条约保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)，保藏号VKPM B-1628)，得到菌株MG442/pYEDA1和MG442/pUC19。
将这些菌株在加入100mg/L氨苄霉素的营养肉汤培养基中37℃下培养18小时，然后取0.3mL接种到含100mg/L氨苄霉素的发酵培养基中，在20×200mm的试管里37℃下用摇床振摇培养48小时。培养结束后，用薄层层析的方法检测培养基中累积的苏氨酸的量。吸附性板用以下的流动相展开丙-2-醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝25∶25∶7∶6(v/v)。2％水合茚三酮丙酮溶液作为显色剂。结果如表3所示。
发酵培养基的组分(g/L)葡萄糖 50.0(NH4)2SO410.0K2HPO41.0MgSO4·7H2O 0.4FeSO4·7H2O 0.02MnSO4·5H2O 0.02盐酸硫胺 0.0002酵母浸膏 1.0CaCO320.0
葡萄糖和硫酸镁分别进行灭菌处理。碳酸钙于180℃干热灭菌2小时。pH值调为7.0。抗生素在灭菌后加入培养基。
表3

从表3可以看出yedA基因的扩增提高了MG442菌株对苯丙氨酸的生产效率。
工业适用性本发明提供了用埃希杆菌属的细菌生产L-氨基酸的方法，依照此方法，氨基酸，例如L-苯丙氨酸和L-苏氨酸的生产效率将增加。
序 列 表<110>味之素公司<120>利用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法<130>B889SMOP1407<140>
<141>2002-11-21<150>RU 2001131570<151>2001-1 1-23<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>921<212>DNA<213>大肠杆菌<400>1atgcgtttcc gccagttgtt accgcttttt ggcgcgctgt ttgcgttgta tatcatttgg 60ggctcaacct attttgtcat tcggattggc gtggaaagct ggcctccgtt aatgatggcg 120ggcgttcgat tcctggcagc cggtatttta ttgctggcat ttttgctact gcgcggacac 180aaactccccc cgctacgtcc gctgctcaat gccgcgctga ttggcctgtt attgctggct 240gtcggtaatg gcatggtgac ggttgccgaa catcaaaatg ttccttccgg catcgccgcc 300gtagtggttg caaccgtgcc cctctttacc ctgtgcttca gccgcctgtt tggcattaaa 360acgcgcaaac tggaatgggt gggtattgcc attgggcttg ccggaatcat catgctcaat 420agcggtggaa atttaagcgg caatccgtgg ggcgcgattc tgattttaat cggctcgatt 480agctgggcgt ttggctcagt ttatggctcg cgcattacct tacctgtagg gatgatggcg 540ggtgcgattg agatgctggc ggcaggcgtg gtgttaatga tcgcgtcgat gattgcgggt 600gaaaaactga cggcgctccc ttccctttca ggcttccttg cggtcggcta tctggcgctg 660tttggttcga ttatcgccat caacgcttat atgtatttaa tccgtaatgt cagtccggct 720ctcgccacca gctacgctta cgttaacccg gtggtcgcgg tcttgctggg tacgggactg 780ggtggagaaa cactgtcgaa gattgaatgg ctggcgctcg gcgtaattgt cttcgcggtg 840gtactggtca cgttgggaaa atatctcttc ccggcaaaac ccgtagttgc gccagttatt 900caggacgcat caagcgagta a 921<210>2<211>306
<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Arg Phe Arg Gln Leu Leu Pro Leu Phe Gly Ala Leu Phe Ala Leu1 5 10 15Tyr Ile Ile Trp Gly Ser Thr Tyr Phe Val Ile Arg Ile Gly Val Glu20 25 30Ser Trp Pro Pro Leu Met Met Ala Gly Val Arg Phe Leu Ala Ala Gly35 40 45Ile Leu Leu Leu Ala Phe Leu Leu Leu Arg Gly His Lys Leu Pro Pro50 55 60Leu Arg Pro Leu Leu Asn Ala Ala Leu Ile Gly Leu Leu Leu Leu Ala65 70 75 80Val Gly Asn Gly Met Val Thr Val Ala Glu His Gln Asn Val Pro Ser85 90 95Gly Ile Ala Ala Val Val Val Ala Thr Val Pro Leu Phe Thr Leu Cys100 105 110Phe Ser Arg Leu Phe Gly Ile Lys Thr Arg Lys Leu Glu Trp Val Gly115 120 125Ile Ala Ile Gly Leu Ala Gly Ile Ile Met Leu Asn Ser Gly Gly Asn130 135 140Leu Ser Gly Asn Pro Trp Gly Ala Ile Leu Ile Leu Ile Gly Ser Ile145 150 155 160Ser Trp Ala Phe Gly Ser Val Tyr Gly Ser Arg Ile Thr Leu Pro Val165 170 175Gly Met Met Ala Gly Ala Ile Glu Met Leu Ala Ala Gly Val Val Leu180 185 190Met Ile Ala Ser Met Ile Ala Gly Glu Lys Leu Thr Ala Leu Pro Ser195 200 205Leu Ser Gly Phe Leu Ala Val Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Gly Ser Ile
210 215 220Ile Ala Ile Asn Ala Tyr Met Tyr Leu Ile Arg Asn Val Ser Pro Ala225 230 235 240Leu Ala Thr Ser Tyr Ala Tyr Val Asn Pro Val Val Ala Val Leu Leu245 250 255Gly Thr Gly Leu Gly Gly Glu Thr Leu Ser Lys Ile Glu Trp Leu Ala260 265 270Leu Gly Val Ile Val Phe Ala Val Val Leu Val Thr Leu Gly Lys Tyr275 280 285Leu Phe Pro Ala Lys Pro Val Val Ala Pro Val Ile Gln Asp Ala Ser290 295 300Ser Glu305<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3aagggatccc tctcattttt attgt25<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4aagcgtcgac cgagcgtctg gaa 23
<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gaccatagat ctgaattcga gctcggtac29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6acggccagat ctaagcttgc atgcctgca29<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7aacagtgatc atttgcctgg cggcagtagc gcgg 34<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>8ataaaaagct tagatctcaa aaagagtttg tagaaacgca a4权利要求
1.埃希杆菌属的L-氨基酸生产细菌，其中通过增强细菌细胞内下面(A)或(B)所定义的蛋白质活性提高细菌的L-氨基酸的产量(A)含有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白质；(B)含有对序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列，且具有使细菌增强对L-氨基酸和/或氨基酸类似物的耐受性的活性的蛋白质。
2.根据权利要求1的细菌，其中使用编码(A)或(B)所定义蛋白质的DNA转化该细菌，或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列来增强(A)或(B)所定义蛋白质的活性。
3.根据权利要求2的细菌，其中转化使用含有所述DNA的多拷贝载体进行。
4.生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求1～3任意一项中的细菌，并从培养基中收集所产生并积累的L-氨基酸。
5.根据权利要求4的方法，其中所产生的L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
6.根据权利要求5的方法，其中细菌提高了苯丙氨酸生物合成基因的表达。
7.根据权利要求4的方法，其中产生的L-氨基酸为L-苏氨酸。
8.根据权利要求7的方法，其中细菌提高了苏氨酸操纵子的表达。
9.生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求1～3任意一项的细菌，以在培养基中生成和积累L-苯丙氨酸，所述细菌具有L-苯丙氨酸生产能力；和从天冬氨酸或其衍生物和获得的L-苯丙氨酸来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。
10.权利要求9中所述方法，进一步包括酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯；用天冬氨酸衍生物凝聚L-苯丙氨酸低级烷基酯，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐；从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯；氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，产生α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。
全文摘要
通过在培养基中培养埃希杆菌，并从培养基中收集产生并积累的L－氨基酸来生产L－氨基酸(例如L－苯丙氨酸或L－苏氨酸)，其中通过增强yedA基因编码的蛋白质活性而提高了这些细菌对L－氨基酸的生产效率。
文档编号C12P13/22GK1615360SQ02827478
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月21日 优先权日2001年11月23日
发明者V·A·里斯特斯, M·V·维图斯基纳, M·M·古斯亚蒂纳, M·K·兹亚特蒂诺夫, V·Z·阿维蒂安, E·A·萨拉索瓦, V·G·多罗森科, S·V·马斯科 申请人:味之素株式会社