专利名称：一种能自行裂解成具抗菌和修复功能多肽的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由抗菌肽、凝血酶蛋白切割序列以及成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的构建、达和应用。
背景技术：
抗生素的发现是医学史上的一个里程碑，但是随着抗生素的大量使用，也使得致病菌的抗药性大大提高，更为严重的是，现在还出现了抗生素抗性的超级菌，几乎所有的抗生素对它们都没有作用。而抗菌肽则可以解决这些问题。
到目前为止，人类已发现并合成大量的抗菌肽，其中以昆虫抗菌肽为代表。实验表明，这些抗菌肽不仅对细菌、真菌有广谱抗菌能力，而且对病毒、原虫以及肿瘤细胞也有作用。此外，由于作用机制独特，抗菌肽无致畸病作用，无蓄积毒性、难产生抗药性以及对高等动物正常细胞无害等特点，抗菌肽可能成为抗生素的新来源。
昆虫抗菌肽可分为抗细菌肽、抗真菌肽和既抗细菌又抗真菌的抗菌肽。
根据氨基酸组成和结构特征，已研究的抗细菌肽分为四类，即形成两性分子α-螺旋的抗细菌肽类、有分子内二硫桥的抗细菌肽类、富含脯氨酸的抗细菌肽类以及富含甘氨酸的抗细菌多肽类。
1.形成两性分子α-螺旋的抗细菌肽类，以天蚕素类(Cecropins)为代表。这类抗细菌肽分子内有两性分子的α-螺旋结构，但不含半胱氨酸、不具二硫桥。目前，从昆虫体内发现了20多种Cecropin及其类似物。最著名的1981年Boman等首先分离出Cecropin A和B，次年又分离出Cecropin D。Cecropin的抗菌谱包括革兰氏阳性和阴性菌。
2.有分子内二硫桥的抗细菌肽类，与Cecropin相似，这类抗细菌肽分子内也形成两性分子的α-螺旋结构，但在这种肽分子中含有半胱氨酸，并形成分子内二硫桥。以昆虫防御素(insect defensins)为代表。目前，除了双翅目昆虫外，几乎所有目中都发现了昆虫防御素。昆虫防御素主要对革兰氏阳性菌起作用。
3.富含脯氨酸的抗细菌肽类，以apidaecins和abaecin为代表。这是80年代末才发现的一类新型昆虫抗菌肽。有15个-34个氨基酸残基组成，其中脯氨酸含量在25％以上。这类抗细菌肽分子只对革兰氏阴性菌起作用。
4.富含甘氨酸的抗细菌多肽类，以attacins和sarcotoxins II为代表。有研究表明，attacins只对少数种类、处于生长中的革兰氏阴性菌起作用。
昆虫抗真菌肽主要分为AFP、holotricin3和drosomycin。AFP是从麻蝇中分离出的一种抗真菌肽，起在蒸馏水和盐溶液中有较强的杀菌能力；holotricin3从鞘翅目昆虫幼虫中分离得到，富含甘氨酸和组氨酸；drosomycin由果蝇的幼虫和成虫经细菌诱导所得，具广谱抗真菌活性。
既抗细菌又抗真菌的昆虫抗菌肽，分为metchnikowin和thanatin，其中以死亡素(thanatin)为著名代表。死亡素是刺肩蝽成虫经诱导产生的一种抗菌肽，该抗菌肽对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌都有很强的抗菌活性。
抗菌肽的结构与功能是密切相关的。许多来自于不同物种的抗菌肽，其一级结构有不少相似之处。如肽的N端半分子富含亲水的氨基酸残基，C端则含较多的疏水氨基酸残基。目前新型杂合抗菌肽的设计主要集中在天蚕素(Crocepin)、蜂毒素(Melittin)和蛙皮素(Magainin)。有研究表明，Cecropin A及蛙皮素对革兰氏阳性菌和阴性菌均有杀死作用，对正常的真核细胞(如人的正常细胞)则没有杀伤作用。而蜂毒素是一种高效的杀菌蛋白，比前两者都好，但它对真核细胞有害。于是，Song等按照这几种抗菌肽的一级结构设计出一种杂合蛋白，既具有强杀菌效果，又对正常的真核细胞无害，还能杀死癌细胞。
目前，比较清楚的是昆虫抗细菌肽的作用机制，包括细胞膜电势依赖通道的形成，抑制细胞呼吸，抑制细胞外膜蛋白的合成以及抑制细胞壁的形成。现行的抗菌肽杀菌模型是通过以下3个步骤1.抗菌肽的多聚体与细胞膜相互吸引使抗菌肽结合到膜上；2.抗菌肽的疏水C端插入膜中，而形成两亲α-螺旋的N端留在膜界面上，3.两亲α-螺旋插入质膜，在质膜上形成较大的孔洞，从而使细菌死亡。
现时利用基因工程方法大量生产昆虫抗菌肽比较困难，主要问题是1.抗菌肽提取纯化技术。这是限制抗菌肽生产成本的主要因素；2.表达系统载体。动物源的抗菌肽在来源上十分有限，必须要通过基因工程的方法对抗菌肽进行表达。由于大部分抗菌肽对表达载体都有抗杀作用，一般选择酵母菌或者使抗菌肽以融合蛋白的形式表达，但这样又增加了后加工的难度；3.抗菌肽的稳定性和免疫反应问题。
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGFs)，共有十几种，其中主要包括酸性成纤维细胞生长因子(acidic Fibroblast Growth Factor，aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bovine FibroblastGrowth Factor，bFGF)两种，是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子。其中，aFGF在临床上具有广泛的应用前景，可用于创伤修复、心脑血管疾病治疗(如心肌缺血、脑中风等)、神经系统疾病(如帕金森氏症、阿尔茨海默病等)治疗等。
1.aFGF的主要生理功能(1)aFGF可以直接参与新生血管的形成。aFGF对血管内皮细胞有较强的趋化作用和促增殖作用，并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA)，进一步降解基底膜，同时诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构；(2)促进表皮细胞的增殖。体内体外实验表明，在烧伤创面应用aFGF后，免疫组化染色及显微镜观察显示，aFGF组的表皮细胞和全厚层皮肤组织的DNA含量高于生理盐水对照组，S期细胞数也明显高于对照组，表明aFGF可促进表皮细胞的有丝分裂，，从而促进表皮细胞的增殖，加速创面的愈合；(3)aFGF对中胚层及神经外胚层细胞的分化有明显的刺激作用。成神经细胞的分裂受aFGF的调节，分裂过程中出现轴突突起生长出生长锥、神经递质合成、递质小泡的转运等神经元特征。
aFGF与肝素及肝素类硫酸蛋白多糖有很强的亲和力，又名肝素结合生长因子1。它在没有肝素及肝素类硫酸蛋白多糖存在的条件下，在生理温度下是以非折叠的形式存在的，非常不稳定。实验证明，肝素及肝素类硫酸蛋白多糖与HAFGF结合后，不但能稳定HAFGF的分子构型，阻止其降解，降低热、酸、蛋白水解酶及氧化剂对其活性的影响，还能增强其生物学活性20-100倍，延长其生物作用。
2.aFGF基因的突变研究以及活性检测aFGF的氨基酸序列中有三个半胱氨酸残基(Cys)，分别位于第31、98、132位，其中第31、98位Cys在aFGF和bFGF中是一致的，而第132位Cys是aFGF独有的。与许多含Cys的胞外蛋白一般都通过形成二硫键来稳定结构不同，aFGF的Cys残基间不形成二硫键。用中性氨基酸如丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)取代Cys，不仅对aFGF的分子结构及生物学活性的影响很小，还能增加aFGF对热、酸及某些蛋白酶降解的稳定性。Harper JW等曾对AFGF的一些氨基酸残基进行修饰，研究修饰后的AFGF活性的变化，发现第133位的赖氨酸(Lys)甲基化后，AFGF与肝素及细胞表面受体的亲和力、促分裂活性均下降，表明Lys-133及其周围的结构，参与AFGF与肝素及跨膜受体的相互作用。
本发明可以解决融合蛋白分离纯化和获得大量抗菌肽的方法。由于抗菌肽是一类小分子肽，分离纯化极其困难，而成纤维细胞生长因子可以通过肝素凝胶柱层析纯化回收，因此，本发明(融合蛋白)可以通过肝素凝胶柱层析纯化回收，从而获得融合蛋白的纯品。本发明还有另一个优点是解决难于获得大量抗菌肽的问题。因为抗菌肽对表达载体，如大肠杆菌等有杀伤作用，要大量获得抗菌肽极其困难。而通过实验证明，抗菌肽与成纤维细胞生长因子融合后，其杀菌活性大大减少甚至消失，因此通过融合蛋白获得大量的抗菌肽是一个很好的办法。此外，本发明不需酶切或者化学方法裂解融合蛋白。由于人和哺乳动物的血液中含有各种凝血酶因子，因此，本发明(融合蛋白)在使用时会被凝血酶切割，自动裂解成有功能的抗菌肽和成纤维细胞生长因子。
发明内容
利用PCR技术构建编码含有抗菌肽、凝血酶切割序列和成纤维细胞生长因子的融合蛋白基因，克隆到毕赤酵母中间载体pPICZαA中，并转化至毕赤酵母(Pichiapastoris)。从转化子中筛选获得高表达量重组子，通过高密度发酵和肝素凝胶层析获得纯的融合蛋白。该融合蛋白可以应用到治疗哺乳动物的创伤、烧伤、烫伤的修复以及防止细菌和真菌感染。
具体实施例方式实施例一天蚕素(cecropin)及酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor)融合蛋白的表达设计并合成引物F1(SEQ ID NO22)、F2(SEQ ID NO23)、R1(SEQ ID NO24)和R2(SEQ IDNO25)。其中F1和R1两条引物含有不同的DNA限制性内切酶酶切位点，分别为XhoI和XbaI。而F1的5‘端在限制性内切酶酶切位点之后有信号序列，用以引导融合蛋白在宿主细胞中的分泌并在翻译后切除。引物F2的5’端和R1的3‘端含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列(SEQ ID NO26)。用两对引物(F1R2和F2R1)分别以含天蚕素基因及酸性成纤维细胞因子(1-154a.a)基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R1进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约21KD蛋白产物。
实施例二天蚕素及酸性成纤维细胞生长因子缺失改构体(19-154a.a)融合蛋白的表达设计并合成引物F3(SEQ ID NO27)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F1R2和F3R1)分别以含天蚕素基因及酸性成纤维细胞因子(19-154a.a)基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R1进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约19KD蛋白产物。
实施例三天蚕素及酸性成纤维细胞生长因子缺失改构体(27-154a.a)融合蛋白的表达设计并合成引物F4(SEQ ID NO28)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F1R2和F4R1)分别以含天蚕素基因及酸性成纤维细胞因子(27-154a.a)基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R1进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约18KD蛋白产物。
实施例四天蚕素及酸性成纤维细胞生长因子突变体(aFGF-Ser-2-3)融合蛋白的表达用两对引物(F1R2和F2R1)分别以含天蚕素基因及酸性成纤维细胞因子突变体(1-154a.a)基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R1进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约18KD蛋白产物。
实施例五天蚕素杂合肽(Cecropin AD)及酸性成纤维细胞生长因子(1-154a.a)融合蛋白的表达设计并合成引物R3(SEQ ID NO29)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F1R3和F2R1)分别以含天蚕素杂合肽基因及酸性成纤维细胞因子(1-154a.a)基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R1进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约21KD蛋白产物。
实施例六天蚕素杂合肽(Cecropin AD)及碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor)融合蛋白的表达设计并合成引物F5(SEQ ID NO29)和R4(SEQ ID NO30)，其中F5的5‘端含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列，而R4的5’端则含有XbaI酶切位点。用两对引物(F1R3和F5R4)分别以含天蚕素杂合肽基因及碱性成纤维细胞因子基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F1和R4进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约22KD蛋白产物。
实施例七非洲爪蟾蛙皮素(magainin)及碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的表达设计并合成引物F6(SEQ ID NO31)和R5(SEQ ID NO32)，其中F6的5‘端含有XhoI限制性内切酶酶切位点，而R5的5’端则含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F6R5和F5R4)分别以含蛙皮素基因及碱性成纤维细胞因子基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F6和R4进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约22KD蛋白产物。
实施例八甘蓝夜蛾防御素(defensin)及碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的表达设计并合成引物F7(SEQ ID NO33)和R6(SEQ ID NO34)，其中F7的5‘端含有XhoI限制性内切酶酶切位点，而R6的5’端则含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F7R6和F5R4)分别以含蛙皮素基因及碱性成纤维细胞因子基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F7和R4进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约22KD蛋白产物。
实施例九刺肩蝽死亡素(thanatin)及碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的表达设计并合成引物F8(SEQ ID NO35)和R7(SEQ ID NO36)，其中F8的5‘端含有XhoI限制性内切酶酶切位点，而R7的5’端则含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F8R7和F5R4)分别以含蛙皮素基因及碱性成纤维细胞因子基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F8和R4进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约22KD蛋白产物。
实施例十果蝇抗真菌肽(anti-fungal peptide)及碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的表达设计并合成引物F9(SEQ ID NO37)和R8(SEQ ID NO38)，其中F9的5‘端含有XhoI限制性内切酶酶切位点，而R8的5’端则含有凝血酶蛋白切割位点的核苷酸序列。用两对引物(F9R8和F5R4)分别以含蛙皮素基因及碱性成纤维细胞因子基因的质粒为模板进行PCR反应，获得的产物再作为模板，用引物F9和R4进行PCR反应。将最终的PCR产物克隆和测序。用XhoI和XbaI双酶切并连接到同时用XhoI和XbaI消化产生的pPICZαA载体上。通过电穿孔法转化到毕赤酵母细胞中，随后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培养基中选择。从而获得稳定表达融合蛋白的克隆。通过aFGF抗体的Western杂交测定并用SDS-PAGE证实蛋白表达水平，其显示约22KD蛋白产物。
实施例十一融合蛋白的纯化及细胞活性测定将发酵的上清首先过CM-Sepherose FF离子交换柱，用含0.01M-1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白质溶液。再过肝素亲和层析柱，用含0.06M-3M氯化钠的磷酸盐(10Mm-50mM)缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰溶液，即得融合蛋白纯品。将人3T3肿瘤细胞培养至对数生长阶段，按每孔7000-8000个细胞的比例接入到96孔细胞培养板上，加入含10％小牛血清的1640培养基，37℃培养24小时。去培养基，换入含0.4％的1640培养基继续培养24小时。去培养基，加入含不同浓度不同种类的缺失突变aFGF蛋白，同时以纯化的野生型样品作阳性对照，加入PBS溶液作为空白对照。培养24-48小时后每孔各加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4-6小时。去培养基，加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，室温放置0.5小时，放入酶标仪中用A570测量。
实施例十二融合蛋白的抑菌实验在平皿上铺一层含1.5％琼脂粉的LB培养基作为底基。待底基凝固后，配制含0.7％琼脂粉的LB培养基，等温度降至45度时加入正处于对数生长期的大肠杆菌K12D31，充分混匀，迅速倒到平皿中。待凝固后，用打孔器在固体培养基中打孔。然后在孔中加入适量的融合蛋白。37度过夜培养，以相同浓度的抗菌肽、人酸性成纤维细胞生长因子以及无菌水作为对照。结果发现，抗菌肽能抑制周边细菌的生长，而融合蛋白、人酸性成纤维细胞生长因子以及无菌水都不能抑制细菌的生长，这说明该融合蛋白不能抑制细菌的生长，可以利用酵母甚至大肠杆菌作为表达载体来扩大生产。
实施例十三用凝血酶切割融合蛋白并将切割产物进行抑菌圈和促细胞分裂活性实验在缓冲条件下(0.05MHepes，0.25M NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)，加入20微克的融合蛋白，37度水浴。分别在0.5、1.0、6、12、24小时取样，并进行SDS-PAGE电泳。余样按照实施例十一和十二中方法进行促细胞分裂活性和抑菌圈实验。SDS-PAGE电泳发现，融合蛋白在水浴0.5小时后开始分解，随着时间的延长，分解得越明显。抑菌圈实验证明，分解后的抗菌肽有抑菌活性，但没有野生型的高。而促细胞分裂活性则与野生型的人酸性成纤维细胞生长因子没有显著性差异。
实施例十四融合蛋白修复受伤哺乳动物皮肤以及抗菌实验采用常规的方法使正常健康的白兔或者白鼠皮肤受损，如擦伤、创伤等，滴入一定量的绿脓杆菌、金葡萄菌或者大肠杆菌等，再滴加500～2000ng的融合蛋白，饲养1-10天，以加无菌水为对照，观察实验结果。结果发现，加入融合蛋白的皮肤在第二天开始结枷，没有细菌感染的迹象，而对照组则有细菌感染的现象。加入融合蛋白后，动物受伤的皮肤在4-7天内痊愈，而对照组则需6-14天。
权利要求
1.表达一种融合蛋白，它包括(a)抗菌肽蛋白序列；(b)凝血酶蛋白切割位点；(c)成纤维细胞生长因子蛋白序列。
2.权利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的抗菌肽蛋白序列、凝血酶蛋白切割位点和成纤维细胞生长因子蛋白序列从融合蛋白的N端到C端依次编码。
3.权利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的抗菌肽蛋白序列可以是抗细菌肽、抗真菌肽或者既抗细菌又抗真菌的抗菌肽以及它们的变异体。
4.权利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的凝血酶蛋白切割位点指通过蛋白酶或者其它蛋白剪切剂优先剪切的氨基酸序列，有用的蛋白酶切割位点包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO41所示的氨基酸序列。
5.权利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的成纤维细胞生长因子可以是酸性成纤维细胞生长因子(包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列)或者是碱性成纤维细胞生长因子(包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列)以及它们的变异体(包含SEQ ID NO4～20所示的氨基酸序列)。
6.权利要求1中所述的融合蛋白经过不同的凝血酶蛋白切割可以裂解成两种蛋白，而两种蛋白的N端或者C端分别含有不同数量的组成凝血酶蛋白切割序列的氨基酸残基。其中蛋白酶切割序列1(SEQ IDNO1)时，产生的抗菌肽蛋白的C端含有3个氨基酸(KLV)，而成纤维细胞生长因子蛋白的N端也含有3个氨基酸(PRS)；而蛋白酶切割序列II(SEQ IDNO41)时，产生的抗菌肽蛋白的C端含有4个氨基酸(Ile-Glu/Asp-Gly-Arg)，而成纤维细胞生长因子蛋白的N端则不含任何氨基酸。
7.权利要求3和权利要求5中所采用的术语“变异体”，不仅指全长蛋白，而且还分别指特定变异体和等位变异体，以及其它天然产生或者非天然产生的变异体。例如由常规的基因工程方法产生的的氨基酸突变体、个别氨基酸化学修饰突变体以及具有野生型蛋白生物活性片段等。它们与本文所公开的抗菌肽或者成纤维细胞生长因子天然产生的蛋白质序列至少有60％相似或50％相同，更优选的至少75％相似或者55％相同和最优选的80％相似或60％相同。
8.回收蛋白方法，可以通过肝素琼脂糖凝胶柱或者分子筛回收整个融合蛋白；也可以人工加入凝血酶(哺乳动物或者人)切割融合蛋白，从而获得具有抗菌活性的抗菌肽和皮肤修复功能的成纤维细胞生长因子，最后采用常规的纯化方法分别回收两种蛋白，例如采用肝素琼脂糖凝胶柱或者分子筛等。
9.本发明(融合蛋白)的组合物通过任何合适的给药方式给予哺乳动物或人，用以治疗创伤、烧伤、烫伤等疾病，以及可以防止和治疗细菌或者真菌感染。
10.权利要求11中所述的给药方式为直接给予体表局部组织部位；所述的组合物是指包含部分水或生理上可匹配的液体悬浮液或溶液。
全文摘要
所公开的内容为一种抗菌肽、凝血酶蛋白切割序列以及成纤维细胞生长因子的融合蛋白序列。所述的抗菌肽可以是抗细菌肽、抗真菌肽、同时抗细菌和真菌肽以及基因工程杂合肽。而成纤维细胞生长因子可以是酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)或者碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。可以将编码上述融合蛋白的核苷酸序列插入到合适的表达载体中并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行表达。哺乳动物体内的各种凝血酶能特异性识别该融合蛋白中的凝血酶切割序列并切割融合蛋白，使得该融合蛋白能裂解为具有抗菌功能得抗菌肽和修复功能的成纤维细胞生长因子。所公开的内容还有使用这种融合蛋白治疗哺乳动物的创伤、烧伤、烫伤的修复以及防止细菌和真菌的感染。
文档编号C12N15/62GK1504573SQ0314034
公开日2004年6月16日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者李校堃, 苏志坚, 郑青, 黄亚东, 吴晓萍, 许华, 何峰, 冯雅, 刘太胜, 李校 申请人:广州暨南大学医药生物技术研究开发中心, 广州暨南大学医药生物技术研究开发中