专利名称：检测与人类遗传性耳聋相关的wfs1基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法，尤其WFS1基因2328A→G突变的方法。
背景技术：
Wolframin基因位于人类染色体的4p16上，含33.4kb个DNA碱基，包括8个外显子(exon)。exon1未被编码，exon2-7为小编码片断，exon8为最大的外显子，有2.6kb长。大约有10个跨膜片断。
Wolframin蛋白质由890个氨基酸组成，分子量约为100kDa，是一种对糖苷内切酶敏感的膜糖蛋白。蛋白质结构中间有个疏水的区域(氨基酸330-650)，由9个螺旋状的跨膜部分构成，N端有一个亲水的部分位于细胞质外，C端部分位于细胞质内(参看图3)。65％存在于浆膜，26％存在于内质网中，还有4％存在于线粒体或细胞核中。荧光免疫染色显示在转染的COS-7细胞中，WFS1蛋白位于细胞质中，呈现特征性的网状结构，并与内质网有交迭。在鼠的脑组织中，无论在蛋白质和mRNA水平，WFS1在海马回、杏仁核、嗅神经核以及不规则皮质表层的神经元中浓集。
WFS1基因首先是Wolfram综合征(WSWolfram Syndrome)的致病基因。对于WFS1基因的研究开始于对Wolfram综合征的认识。WS(WolframSyndrome)即Wolfram综合征，由Wolfram和Wagener于1938年首次提出，是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经变性疾病。因为WS患者患有尿崩症(Diabetes Insipidus)、糖尿病(Diabetes mellitus)、视萎缩(Optic Atrophy)、耳聋(Deafness)四大典型并发病症，取其各病英文名称字首，又被称为DIDMOAD。WFS1基因突变可以引起神经的进行性退变性病变，病变为以轴突膨胀为特征的轴突营养不良，直接导致患者出现Wolfram综合征的种种复杂症状。
2001年，WFS1基因的突变被证实是导致低频感音神经性听力损失(LFSNHL)的原因之一，为DFNA6/14/38基因座位的致病基因。
自2001年以后，各国科学家通过对发现的不同家系的WFS1基因研究，不断发现了LFSNHL的突变位点。Bespalova 2001年，研究了多个家系，共报告了5个突变位点，它们是2266C＞T T699M；2146G＞A A716T；2505G＞A V779M；2656T＞C L829P，2662G＞A G831D。Komatsu 2002年通过研究日本的家系，报告了K634T。在这些突变中都未发现可以引起蛋白质的早熟、合成提前终止的突变。因此，对于WFS1基因突变与LFSNHL相关性的深入研究有望发现WFS1基因突变的真正致病机制。WFS1基因与Walfram综合征有关的突变有64％是失活的，因此可以说只有活化的WFS1基因突变才是导致低频听力损失的原因。
WFS1基因突变的发现开辟了一个令人惊奇的新领域，为耳聋患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。目前，通过国内外同行的研究仅发现了6个WFS1基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识WFS1基因对于正常听觉生理功能意义，更加深入的了解其与耳聋的关系。在以前所发现的6个突变位点中，都不是在中国人群中发现的，而我们此次首次在中国人群中发现WFS1基因新的突变位点，这提示这个突变位点可能是在中国人群中特有的突变，并且有可能存在着突变热点，这将有利于将来在临床上开展聋病患者的WFS1突变筛查工作，为耳聋患者诊断和治疗提供服务。
发明内容
发明人选取WFS1基因作为研究对象，通过在47名各种感音神经性耳聋患者和53名正常听力对照组中进行筛查，发现一个与耳聋有关的WFS1基因新的突变位点(2328A□G 720I□V，即编码区的第2158个碱基)。这一突变位点在53名对照组中均没有发现这一突变，说明这一突变位点与耳聋有关，这一突变位点位于Wolramin的细胞膜内区域。该发现从而为耳聋患者的诊断提供了一种新的途径，以及为耳聋患者提供了基因治疗的可能。
因此，根据，本发明提供了1、一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法，包括检测WFS1基因的第2328位碱基(编码区的第2158个碱基)的改变，或由该点突变引起的表达产物的相应改变或其互补序列的相应改变。
2、根据以上项1的方法，其中所述第2328位碱基的改变为A突变为G。
3、根据以上项1的方法，其中所述表达产物为所述WFS1基因表达的mRNA或蛋白。
4、根据以上项1的方法，其中通过扩增人体中全长或部分WFS1基因以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测。
5、根据以上项1的方法，其中通过将从组织中分离出来的WFS1基因与WFS1基因探针杂交来检测。
6、根据以上项5的方法，其中所述探针能够与序列表中序列1杂交。
7、根据以上项1的检测方法，其中通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。
8、根据以上项1的检测方法，其中通过从组织中分离出的WFS1基因与WFS1等位基因特异性探针杂交来检测所述碱基的改变。
9、一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的试剂盒，其包括扩增用引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。
10、根据以上项1的检测方法在耳聋的诊断或治疗中的应用。
正常WFS1基因的编码区2041-2220的碱基序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列2所示。突变基因的编码区2041-2220的碱基序列如序列表中序列3所示，其中编码区的第2158个碱基由A突变为G，其编码的氨基酸序列如序列4所示，其中第720位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸。
图1显示了WFS1编码区氨基酸与核酸碱基的对照。
附图简述图1WFS1编码区氨基酸与核酸碱基的对照突变位于WFS1的细胞膜内区。
图22.WFS1测序结果1.3WFS1突变1测序结果比对(左图为正常序列，右图为突变序列)*注测序图显示的序列为mRNA的互补序列。
图3Wolframin结构示意图。
图4不同连接蛋白氨基酸序列进化研究(提示突变位于高度保守区域)。多种Wolframin蛋白氨基酸序列序列比对，箭头所指为720I位点，可见所有蛋白中该位点均为异亮氨酸(I)，说明为高度保守区。
图5PCR反应条件。
在发明人进行的研究中，发明人收集耳聋遗传资源，建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。应用酚氯仿的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。应用在线引物设计软件Primer3设计引物(WFS1-FGTC TGT AGTGTG CCC CTG CT，WFS1-RCTC CAG GAT GGT GCT GAA CT)，包含WFS1整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序(例如应用ABI公司3730DNA测序仪)。得到的序列与Genebank中的序列比较确定了WFS1突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定Wolframin的突变位点。
本发明所述的突变可以通过本领域已知的任何检测方法来进行，例如扩增人体中全长或部分WFS1基因以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测，或通过将从组织中分离出来的WFS1基因与WFS1基因探针杂交来检测，或通过从组织中分离出的WFS1基因与WFS1等位基因特异性探针杂交来检测所述碱基的改变，或通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。
所用的杂交探针可以是与正常的WFS1核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素，发色物质或荧光物质标记。在进行探针检测前，优选PCR扩增目标基因。尤其，利用等位基因特异探针，可以筛查已被确定的突变是否存在。
另外，还可以通过检测该基因的表达产物，如蛋白和mRNA来检测该基因的突变。
本发明还提供一种检测耳聋相关基因WFS1——(720I□V)突变位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测WFS1基因(720I□V)突变的一种或多种成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中WFS1基因720I□A突变位点的试剂盒。可含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末拌特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。并说明使用方法如下PCR扩增用软件Primer 3对WFS1基因的编码区设计PCR引物反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度62℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。
PCR产物纯化将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后至另一洁净的96孔板中。
测序反应及验证以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样与ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的图谱进行分析。与Genebank中的标准序列比较可以发现突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测WFS1——720I□A突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋治疗方法中。例如，在检测为发生了突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可进行基因治疗。
WFS1基因——720I□V突变检测方法实施例实施例1一、WFS1基因编码区的PCR扩增1.对象聋病门诊收集的非综症型低频性感音神经性耳聋47例，正常对照53例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。
2.基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天1.抗凝血用PBS作1倍稀释。
2.在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温离心1000×g 20分。
3.吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g 10分。
4.将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100□l)，蛋白激酶k100-200□g/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。
5.用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，离心5000×g 10分钟。6吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000×g 10分钟。
7.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000×g 10分钟。
8.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9.加入2.5倍体积的无水乙醇。
10.-20℃沉淀DNA过夜。
第二天11.高速离心，10000×g，10分钟，4℃。
12.弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟。
13.弃上清，吹干。
14.用TE缓冲液溶解，(400□l TE/5ml全血，600-800TE/10ml全血)15.分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。
二、WFS1基因扩增——PCR反应条件引物序列WFS1-FGTC TGT AGT GTG CCC CTG CTWFS1-RCTC CAG GAT GGT GCT GAA CT反应体系25ul名 称 原液浓度 加样量(□l)体系终浓度Buffer 10× 2.51×dNTP 2.5mM 3.0400□MPrimers 10□M 1 7.5pmolAmpliTaq poiymerase 5units/□l1□l 1U/□lTemplate 100ng/□l 1 10ng/□l
ddH2O补齐至25□l。
其中Buffer、dNTP、primers、Tag酶为上海生工公司合成。
反应条件反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件如图5所示。
实施例2PCR产物直接测序PCR产物纯化1.向装有PCR产物的96孔板中加入50微升无菌水，混匀。
2.将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。
3.向纯化板中再次加入50微升的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。
4.将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。
5.保存在-20度冰箱中。
电泳定量1.样品准备DNA(2ul)+上样缓冲液(6ul)共8ul×96取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6ul，在从装有质粒的腔板中，每孔用排枪移出质粒DNA(2ul)，转移到点样板上、混匀、用离心机甩一下(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。
2.流程1)配胶(0.8％琼脂糖)称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5□TBE中(500ml锥形瓶)。
2)溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。
3)凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60□左右，加入1滴EB(约10ul，10mg/ml)，摇匀。
4)铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。
5)上胶将平板放入已盛有电泳液(0.5□TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。
6)加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。
7)走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。
8)定量当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，定量。(涉及Quantity One软件的使用)□DNA/Hind□经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是23Kb，9Kb，6Kb，4Kb，2.1Kb，2Kb，通常以第三条带(6Kb)为标准定量，根据□DNA/Hind□的总浓度是500ng/ul，可以算得第三条带的浓度为62ng/ul，然后再依次定量，用去离子水将模板浓度调整至100ng/ul。
□DNA/Hind□电泳条带见下 23K 9K 6K 4K 2K 1K单条带浓度＝DNA标准总浓度×单条带片段长度/DNA标准全长例第三条带浓度＝500ng/ul×6Kb/48.5kb＝62ng/ul●DL2000经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp而构成，DL2000的总浓度是300ng/5ul。一般取3ul+5ul(溴酚蓝)电泳。每条带的DNA量约为30ng。
实施例3测序反应-BigDye 3.1测序反应1.测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
2.为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。
3.目前的反应体系为5ul，各种试剂加入量如下
4.样品放于PCR仪上做如下反应
5.反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间会纯化的样品放置于4□冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20□冰箱冷冻。
测序纯化-BigDye3.1测序纯化1.使用机械手程序15在384孔板的每个孔中加入20ul 80％乙醇，4,000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm，2.在每孔中加入30ul 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；3.重复第2步的操作；4.重复第2步的操作；5.将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；6.加入5ul甲酰胺，封膜，离心后置于-20□冰箱中；7.上机器前95□变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。
测序结果如图2所示。突变存在于第2328位碱基(编码区的第2158位，A→G)。
实施例4突变位点进化研究1.突变分析应用DNAStar(Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列。
2.进化研究在数据库中找出各种不同物种的4种Wolframin蛋白氨基酸序列，应用ClustalX软件进行比对分析。通过研究发I760位点在Wolramin蛋白家族中高度保守(参看图4)。
实施例5检测耳聋相关基因WFS1——2328A□G突变位点试剂盒及其应用1.试剂盒含有扩增用引物WFS1-FGTC TGT AGT GTG CCC CTG CTWFS1-RCTC CAG GAT GGT GCT GAA CTPCR扩增用Taq酶5u/ul10×缓冲液(含15ml MgCl2)dNTP 2MmBig-Dye mix2.使用方法主要包括如下步骤A提取DNA，利用上述引物，进行PCR反应；BPCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genebank中的标准序列比较确定突变位点的存在。
C按正常阅读框进行翻译以确定Cx31氨基酸突变位点。
具体方法参见实施例1、2、3。
应理解，在阅读了本发明的上述内容以后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>检测与人类遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>180<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(2041)..(2220)<223>
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权利要求
1.一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法，包括检测WFS1基因的第2328位碱基(编码区的第2158个碱基)的改变，或由该点突变引起的表达产物的相应改变或其互补序列的相应改变。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第2328位碱基的改变为A突变为G。
3.根据权利要求1的方法，其中所述表达产物为所述WFS1基因表达的mRNA或蛋白。
4.根据权利要求1的方法，其中通过扩增人体中全长或部分WFS1基因以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测。
5.根据权利要求1的方法，其中通过将从组织中分离出来的WFS1基因与WFS1基因探针杂交来检测。
6.根据以上项5的方法，其中所述探针能够与序列表中序列1杂交。
7.根据权利要求1的检测方法，其中通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。
8.根据权利要求1的检测方法，其中通过从组织中分离出的WFS1基因与WFS1等位基因特异性探针杂交来检测所述碱基的改变。
9.一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的试剂盒，其包括扩增用引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。
10.根据权利要求1的检测方法在耳聋的诊断或治疗中的应用。
全文摘要
一种检测与遗传性耳聋相关的WFS1基因突变的方法，包括检测WFS1基因的第2328位碱基(编码区的第2158个碱基)的改变，或由该点突变引起的表达产物的相应改变或其互补序列的相应改变。本发明进一步涉及检测上述基因突变位点的试剂盒及应用。另外本发明还涉及上述该检测方法的应用。
文档编号C12Q1/68GK1699595SQ20041000911
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者王秋菊, 沈岩, 刘穹, 王荣光, 韩东一, 杨伟炎 申请人:北京诺赛基因组研究中心有限公司