专利名称：通过pH值反馈控制补碳培养微藻的方法
技术领域：
本发明属于微藻的培养领域，特别是涉及通过pH反馈控制补加二氧化碳培养微藻的方法。
背景技术：
微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分(如螺旋藻)，可用于食品、医药方面；含有多种色素(如紫球藻)，可用于化装品、生物工程和医学诊断；可以大量积累碳氢化合物，碳氢化合物含量可占干重的50％以上(如葡萄藻)，直接用于发电；某些微藻可以固氮，可用作天然肥料(如鱼腥藻)，通过营养控制可以作为优质饵料；某些微藻还含有抗生素及毒素，极具药用价值。微藻已成为食品、保健品、医药和精细化工的原料，显示出巨大的市场潜力。
微藻的培养方式可分为密闭式和开放式。开放式是指采用开放池培养装置，如跑道池、圆形浅池，它具有技术简单、投资低廉等特点，在螺旋藻、小球藻和盐藻的工业化生产中获得了应用(Chaumont D.，J.Appl.Phycol.，1993，5593-604；Bonnin G.，Spirulina Production Engineering Handbook，BECCMA ed.，Nantes，France，1992，140-159；Richmond A.，Progress inPhysiological Research，Vol.7，Biopress，Bristol.，1990，269-330；Borowitzka L.T.，Bioresource Technology，1991，38251-252)。密闭式是指采用不同结构的密闭式的光生物反应器，如气升式、搅拌式、管式等，可用于生产高价值产物(如药物或保健品)或作为开放池培养的种子罐(Hu Q.，J.Appl.Phycol.，1994，6391-396；Carlozzi P.，Appl.Microbiol.Biotecnol.，1996，4518-23；Lee Y.K.，J.Appl.Phycol.，1995，7(1)45-52；Hu Q.，Biotech.Bioeng.，1996，51(1)51-60；WohlgeschaffenG.D.，J.Appl.Phycol.，1992，425-29)。
微藻的生产要消耗CO2，向培养液中添加适量的碳源是提高培养密度的有效手段。可以采用添加NaHCO3、通过NaHCO3的解离提供CO2，也可以直接向培养体系加入CO2。对微藻而言，用NaHCO3的补碳效果不如CO2，原因在于随着CO2的消耗和NaHCO3的解离，会使培养体系的pH升高，而为了调节pH值又需加入盐酸等，不仅增加了成本，而且使得培养体系的盐度升高，不利于藻细胞的生长。但是到目前为止，CO2的用量靠人工经验调节，难以控制到正好满足藻细胞的需求，原因在于培养过程是时变过程，体系对CO2的利用率、实际吸收速率都随时间而变化。
另一方面，在微藻培养中维持一定的pH值有利于微藻的正常生长和代谢。调节pH一般采用加酸或加碱。最简单的自动控制方式是开关控制，其工作过程是，当pH超出设定值时装置自动向体系中加酸，当pH低于设定值时，装置自动向体系中加碱，从而维持一定的pH值。此外，还可以采用PID控制等控制方式，以获得更高的控制精度。但是，不论采用何种控制方式，其原理都是用酸碱调节pH。对微藻培养而言，这样的装置运行时不稳定，原因在于CO2的输入量靠人工经验调节。如果加入速率超过藻细胞的消耗速率，则体系的pH下降，使得pH控制装置自动加碱；如果加入速率低于藻细胞的消耗速率，随着CO2的消耗和HCO3-的解离，体系的pH会升高，使得pH控制装置自动加酸，结果是装置中产生了无用的盐，又浪费了资源。
使用CO2电极直接控制CO2的浓度，即采用CO2电极测定CO2的浓度，将测定信号反馈给仪表，然后由仪表控制CO2的添加，可使得CO2的浓度处于一定的范围。但是，这样的控制方式也面临着问题。一是CO2电极昂贵；二是CO2电极响应滞后，CO2浓度控制精度不高；三是仍不能避免由CO2电极控制的CO2的添加引起pH变化从而导致pH控制装置启动加酸或加碱。就是说，pH控制和CO2浓度的控制相互干扰，导致装置误加料。
发明内容
本发明的一目的在于克服采用NaHCO3补碳效果不佳，且会使培养体系的pH升高，增加成本；而直接通入CO2补碳时难以控制CO2的加入量正好满足藻细胞的消耗，同时也干扰pH本身的控制问题等，提供一种通过pH反馈控制补加二氧化碳培养微藻的方法。
本发明的再一目的是提供一种用于通过pH反馈控制补加二氧化碳培养微藻方法的设备。
本发明提供的通过pH反馈控制补加二氧化碳培养微藻的方法，是基于这样的构思由于微藻生长需要消耗无机碳源。pH值与CO2的浓度相关联。随着游离CO2的消耗，pH值升高，而如果向溶液中补充CO2，pH则下降。将pH设定在一定范围内或一定值，当pH超过设定值时，及时供给CO2，使pH值回落到正常范围，则此时加入的CO2就补充了在此之前消耗的CO2，因而就可以实现将pH控制在一定范围内并同时补充CO2的效果。
本发明的通过pH值反馈控制补碳培养微藻的方法包括以下步骤(1).将培养基加入到培养装置内，根据藻的特点、培养基的特点或培养目的选用灭/除菌方法并实施灭/除菌；(2).将微藻种液接入步骤(1)灭/除菌后的培养基中，接种密度为常规(接种量一般是微藻种液占培养基总量的1～10％)，控制适宜的温度、光照，培养温度为(10～40℃)、光强为(30～300μmol photon·m-2·s-1)，适度机械搅拌或用空气搅拌；(3).根据藻的需要和采用的控制方式，预设培养液的pH值为5～13之间和其它控制参数(依采用的控制方式而异。如果用开关控制，需要设定开位的流量、拟控制的波动幅度、延迟时间等；如果用PID控制，需要设定比例、积分、微分常数等；以及设定数据采集、存储、处理、报警等所需的参数)；(4).培养过程中，根据培养液pH的实际测定值与预设培养液的pH值的差别，补充CO2，使培养体系的pH值保持在预设点附近的一定范围内(该范围可大可小，取决于培养对象、培养工艺的要求和控制仪表及传感器的测量精度和响应时间，±0.1至±1.0的范围都可以)。培养至藻细胞密度或者浓度达到预定值或者一定的时间或者其它可以终止培养的条件出现。这样，既维持了pH，又不使体系过多积累CO2，同时补充了碳源，改善了藻细胞的培养，还提高了CO2的利用率。
所述补充的CO2可以是除尘烟道气、工业CO2气体、混合有CO2的空气或其它气体、液态CO2，或者溶解有CO2的水溶液。这些用来提供CO2的混合物(特指烟道气)也可包含氮氧化物、硫氧化物等成分，在为微藻提供碳源的同时提供氮源和硫源(氮源和硫源也可以水溶液的形式另外提供)。
所述的微藻包括雨生红球藻、盐藻、螺旋藻、小球藻、紫球藻、鱼腥藻或聚球藻等。
所述的培养基可以是本领域熟知的任意适合微藻生长的培养基，如SM培养基、ASP2培养基、Zarrouk培养基、BG-11培养基、Medium A培养基等。
可利用如下设备实现本发明的通过pH反馈控制补加二氧化碳进行微藻培养的方法，设备示意图如图1所示(图1中省略了流量计、其它阀门、过滤器及其它辅助装置)。其包括pH传感器(电极)1、接收pH信号并发出控制指令(开关信号、模拟信号或数字信号)的控制装置2(能接收pH传感器发送的模拟或数字信号，并给执行机构发出模拟或数字指令的仪表或计算机，如带开关控制的pH计)、提供CO2来源的装置3、执行机构4(可以执行控制装置2的指令以调节二氧化碳的流量，如电磁阀、气动阀、液动阀或其它，可以是两位、多位或连续调节开度)、微藻培养装置5和其它气(如空气)源提供装置6。pH传感器1与控制装置2之间通过电缆连接或者无线连接，将pH传感器1获得的pH测定值传送给控制装置2，控制装置2的信号输出口与执行机构4的信号输入口通过电缆连接或者无线连接以传递执行指令，CO2来源装置3的输出口通过管道与执行机构4的输入口连通，执行机构4的输出口通过管道与微藻培养装置5的输入口连通，其它气源提供装置6的输出口通过管道与微藻培养装置5的输入口连通。
培养装置5另外还有用于混合培养液的搅拌或通气装置、有光照装置用于提供光源，光源可以是人工光源或自然光。培养装置5可以是密闭式的反应器(容器)或敞开式的培养池。气源提供装置6通常提供的是空气，用以进行气体搅拌，当不需要气体搅拌时，气源提供装置6为非必需。
所述的CO2来源装置3与执行机构4、执行机构4与微藻培养装置5，以及气源提供装置6与微藻培养装置5连结的管道上进一步安装有流量计、阀门和/或过滤器。(注过滤器取决于气源是否洁净和培养工艺是否要求除菌)本发明的方法利用了pH检测和控制技术，在培养装置内培养微藻细胞，维持了体系的pH值的同时又将二氧化碳补充给藻液，实现了微藻培养中自动补碳、自动控制pH值。与现有技术相比，本发明的优益之处在于1)取代用NaHCO3为碳源时，培养过程的pH升高、不得不加酸来调节pH的技术路线，还节约NaHCO3和酸，直接利用CO2；2)使得直接利用CO2为碳源，同时又维持了pH值。消除了CO2对常规pH控制的干扰而引起的常规pH控制装置超量加酸加碱。
3)比直接利用CO2电极控制CO2的添加从而控制CO2浓度的控制方式，既节约成本，又消除了CO2控制与pH控制的相互干扰；4)方便实施，操作简单，并可以缩短生产周期，适合于工业化生产。
图1.应用于本发明的方法的设备示意图。
附图标记1.pH传感器(电极) 2.控制装置 3.CO2来源装置4.执行机构 5.微藻培养装置 6.气源提供装置具体实施方式
实施例1.
请参见图1，其中，pH传感器1为市售可蒸汽消毒的pH电极，控制装置2为带开关控制的pH计，CO2气源装置3由钢瓶提供，执行机构4是两位常闭电磁阀(通径8毫米)，微藻培养装置5是20升气升式光生物反应器(中国专利ZL99213569.9)，气源提供装置6是空气压缩机(提供空气)。管路中还安装有必要的流量计、过滤器和阀门等。在该20升气升式光生物反应器中培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis-F712，中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)。
培养基是用普通自来水配制的SM培养基。
通入热蒸汽使气升式光生物反应器中的培养基沸腾20分钟灭菌，冷却后通过反应器的接种口接入种液，反应器内培养基体积16升。初始藻细胞密度为1.0×105cells/mL。反应器内的温度控制在25±0.5℃，光照强度为3400Lux(或64μmol photon m-2s-1)。在控制装置2的仪表上将培养液的pH值设定在7.0，通入的空气流量为0.6L/分钟，二氧化碳的流量为80mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，控制装置的仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭执行机构的电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在7.0±0.15范围内。培养3天时，藻细胞密度达到7.23×106cells/mL，3天的平均生长速率为0.85d-1，获得的雨生红球藻粉的常规成分、氨基酸、脂肪酸以及类胡萝卜素的组成及含量与文献报道以及Aquasearch公司的产品NutraxanTM基本相似，总虾青素的含量为2.24％。
对比不控制培养液的pH的情况通入空气量为0.6L/分钟，二氧化碳流量为20mL/分钟，4天的平均生长速率为0.71d-1，培养4d时藻细胞密度为6.57×106cells/mL，而培养液的pH值从6.9上升到10.5；通入空气量为0.6L/分钟，二氧化碳流量为40mL/分钟，4天的平均生长速率为0.74d-1，培养4d时藻细胞密度为6.76×106cells/mL，而培养液的pH值从6.9下降到6.4；而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
实施例2.
所用设备同实施例1。在反应器中培养杜氏盐藻(Dunaliella salina1009，天津塘沽轻工部制盐研究所)。
培养基是用蒸馏水配制的ASP2培养基(去掉其中的维生素溶液和缓冲液)。配制培养基时为避免产生沉淀，将ASP2培养基中的MgSO4和CaCl2先分别溶解，在其它成分溶解并用足够量蒸馏水稀释后再加入这两种成分。再加入终浓度为12％的NaCl。
培养基不经过灭菌，直接通过反应器的接种口接入种液，反应器内培养基体积16升。初始藻细胞密度为8×104cells/ml。反应器内的温度控制在30±0.5℃。光照由反应器外围的15根36W日光灯和内光源的一根日光灯提供，平均每升藻液所得光能2W/L。在控制仪表2上将培养液的pH值设定在8.0，通入的空气流量为0.16L/分钟，二氧化碳的流量为30mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在8.0±0.15范围内，培养2d时藻细胞密度为1.5×105cells/mL，培养4d时藻细胞密度为1.92×106cells/mL，培养6d时藻细胞密度为2.23×106cells/mL。
对比不控制培养液的pH的情况通入空气量为0.16L/分钟，二氧化碳流量为10mL/分钟。培养2d时藻细胞密度为1.0×105cells/mL，而培养液的pH值从8.0下降到7.2；培养4d时藻细胞密度为1.42×106cells/mL，而培养液的pH值上升到10.2；培养7d时藻细胞密度为1.63×106cells/mL，而培养液的pH值下降到9.5。通入空气量为0.16L/分钟、二氧化碳流量为20mL/分钟，培养2d时藻细胞密度为0.87×105cells/mL，而培养液的pH值从8.0下降到6.5；培养4d时藻细胞密度为1.14×106cells/mL，而培养液的pH值上升到8.5；培养7d时藻细胞密度为1.73×106cells/mL，而培养液的pH值上升到9.2。而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
实施例3.
所用设备同实施例1。在反应器中培养钝顶螺旋藻(SpirulinaPlatensis，439，中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)。
培养基是用去离子水配制的Zarrouk培养基。
通入热蒸汽使培养基沸腾20分钟灭菌，冷却后通过反应器的接种口接入种液，反应器内培养基体积16升。初始藻细胞浓度为0.02g/L。反应器内的温度控制在30±1℃。光照强度为127μmol photon m-2s-1。在控制仪表2上将培养液的pH值设定在9.4，通入的空气流量为5.0L/分钟，二氧化碳的流量为70mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在9.4±0.15范围内。培养11天时，藻细胞浓度达到4.8g/L。
对比不控制pH的情况通入空气量为5.0L/分钟，二氧化碳流量为60mL/分钟，培养13d时藻细胞浓度为4.1g/L，而培养液的pH值从9.4下降到8.8；二氧化碳流量为40mL/分钟，培养13d时藻细胞浓度为2.36g/L，而培养液的pH值从9.4上升到10.5；而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
实施例4.
所用设备同实施例1。在反应器中培养钝顶螺旋藻(SpirulinaPlatensis，439，中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)。
培养基是用去离子水配制的Zarrouk培养基(去掉其中的NaHCO3)。
通入热蒸汽使培养基沸腾20分钟灭菌，冷却后通过反应器的接种口接入种液，反应器内培养基体积16升。初始藻细胞浓度为0.02g/L。反应器内的温度控制在30±1℃。光照强度为127μmol photon m-2s-1。在控制仪表2上将培养液的pH值设定在8.0，通入的空气流量为5.0L/分钟，二氧化碳的流量为70mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在8.0±0.15范围内，培养13天时，藻细胞浓度达到3.1g/L。
对比不控制pH的情况通入空气量为5.0L/分钟，二氧化碳流量为60mL/分钟，培养13d时藻细胞浓度为2.45g/L，而培养液的pH值从8.0下降到7.4；二氧化碳流量为50mL/分钟，培养13d时藻细胞浓度为2.33g/L，而培养液的pH值从8.0上升到8.5；而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
实施例5.
所用设备同实施例1。其中培养装置5为2.5L气升式光生物反应器(ZL01142298.X公开)。在反应器中培养鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC7120，法国巴斯德研究所)。
培养基是用去离子水配制的BG-11培养基。
将装有2L培养液的反应器在高压蒸汽灭菌锅中高温灭菌，冷却至室温，在超净台内将150mL种液接入。初始藻细胞密度为0.04克/升。反应器内的温度控制在29±1℃，光强为100μmol.m-2.s-1。在控制仪表2上将培养液的pH值设定在7.5，通入的空气流量为0.4L/分钟，二氧化碳的流量为20mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在7.5±0.1范围内，培养8d时藻细胞浓度为4.1g/L。
对比不控制pH的情况通入空气量为0.4L/分钟，二氧化碳流量为6mL/分钟，培养8d时藻细胞浓度为2.86g/L，而培养液的pH值从7.5上升到8.8；二氧化碳流量为12mL/分钟，培养8d时藻细胞浓度为3.36g/L，而培养液的pH值从7.5下降到6.9；二氧化碳流量为20mL/分钟，培养8d时藻细胞浓度为2.55g/L，而培养液的pH值从7.5下降到6.2；而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
实施例6.
所用设备同实施例1。在反应器中培养转hTNF-α基因聚球藻7002(trans-hTNF-αSynechococcus sp.PCC7002，中国科学院植物研究所；原始藻种PCC7002，法国巴斯德研究所)培养基是用蒸馏水配制的Medium A培养基(去掉其中的缓冲液；VitaminB12在消毒后再加入到培养基中)。
将装有2L培养液的反应器在高压蒸汽灭菌锅中高温灭菌，冷却至室温，在超净台内将150mL种液接入，并加入终浓度均为50μg/ml的氨苄青霉素和硫酸链霉素。初始藻细胞密度为0.04克/升。反应器内的温度控制在35±0.5℃，光强为100μmol.m-2.s-1。在控制仪表2上将培养液的pH值设定在8.2，通入的空气流量为0.2L/分钟，二氧化碳的流量为10mL/分钟(电磁阀开)或0(电磁阀闭)。培养过程中，仪表根据测定的培养液的pH和设定的培养液的pH的差别，自动打开或关闭电磁阀4以调节培养液的pH。培养过程中培养液的pH值保持在8.2±0.15范围内，培养8d时藻细胞浓度为3.5g/L。
对比不控制pH的情况通入空气量为0.2L/分钟，二氧化碳流量为2mL/分钟，培养5d时藻细胞浓度为1.7g/L，而培养液的pH值从8.2上升到9.2；二氧化碳流量为6mL/分钟，培养5d时藻细胞浓度为2.8g/L，而培养液的pH值从8.2下降到7.6；二氧化碳流量为10mL/分钟，培养5d时藻细胞浓度为2.2g/L，而培养液的pH值从8.2下降到6.7；而在一定的二氧化碳流量下，采用加盐酸和加NaOH来控制培养液的pH的培养不成功。
权利要求
1.一种通过pH反馈控制补加二氧化碳进行微藻培养的方法，其特征是该方法包括以下步骤(1).将微藻种液接入到培养基中；(2).预设培养液的pH值；(3).根据培养液的pH的实际测定值与预设培养液的pH值的差别，补充CO2，使培养体系的pH值保持在预设点±0.1至±1.0附近，培养至藻细胞密度或者浓度达到预定值，或者所需的时间，或者可以终止培养的条件出现。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤(1)的接种密度为微藻种液占培养基总量的1～10％，温度为10～40℃、光强为30～300μmol photon·m-2·s-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤(2)预设培养液的pH值为5～13。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述补充的CO2是除尘烟道气、工业CO2气体、混合有CO2的空气、液态CO2或溶解有CO2的水溶液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的微藻包括雨生红球藻、盐藻、螺旋藻、小球藻、紫球藻、鱼腥藻或聚球藻。
6.一种用于权利要求1～5任一项所述的方法的设备，该设备包括pH传感器(1)、接收pH信号并发出控制指令的控制装置(2)、提供CO2气源的装置(3)、执行机构(4)、微藻培养装置(5)和气源提供装置(6)，其特征是pH传感器(1)与控制装置(2)之间通过电缆连接或者无线连接，将pH传感器(1)获得的pH测定值传送给控制装置(2)，控制装置(2)的信号输出口与执行机构(4)的信号输入口通过电缆连接或者无线连接以传递执行指令，CO2来源装置(3)的输出口通过管道与执行机构(4)的输入口连通，执行机构(4)的输出口通过管道与微藻培养装置(5)的输入口连通，气源提供装置(6)的输出口通过管道与微藻培养装置(5)的输入口连通。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征是所述的培养装置(5)是密闭式的反应器或敞开式的培养池。
8.根据权利要求6或7所述的装置，其特征是所述的培养装置(5)里有用于混合培养液的搅拌或通气装置以及光照装置。
9.根据权利要求6所述的装置，其特征是所述的CO2来源装置(3)与执行机构(4)、执行机构(4)与微藻培养装置(5)，以及气源提供装置(6)与微藻培养装置(5)连结的管道上进一步安装有流量计、阀门和/或过滤器。
10.根据权利要求6所述的装置，其特征是所述的控制装置(2)是能接收pH传感器发送的模拟或数字信号，并给执行机构发出模拟或数字指令的仪表或计算机。
全文摘要
本发明属于微藻的培养领域，特别是涉及通过pH反馈控制补加二氧化碳培养微藻的方法。本发明预设培养液的pH值在一定范围内，根据培养液的pH的实际测定值与预设值的差别，补充CO
文档编号C12M3/00GK1724637SQ200410009360
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月21日 优先权日2004年7月21日
发明者丛威, 康瑞娟, 蔡昭铃 申请人:中国科学院过程工程研究所