专利名称：与人类感音神经性耳聋相关的wfs1突变基因及其在诊断遗传性耳聋中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的WFS1突变基因，具体地说涉及WFS1基因2766G→A杂合突变，该突变基因与人类感音神经性耳聋特异相关。
本发明还涉及应用新的WFS1突变基因检测人类遗传性耳聋的检测方法。
本发明还涉及新的WFS1突变基因在诊断遗传性耳聋中的应用。
背景技术：
一、Wolframin蛋白的结构与功能Wolframin基因位于人类染色体的4p16上，含33.4kb个DNA碱基，包括8个外显子(exon)。exon1未被编码，exon2-7为小编码片断，exon8为最大的外显子，有2.6kb长。大约有10个跨膜片断。
Wolframin蛋白质由890个氨基酸组成，分子量约为100kDa，是一种对糖苷内切酶敏感的膜糖蛋白，。蛋白质结构中间有个疏水的区域(氨基酸330-650)，由9个螺旋状的跨膜部分构成，N端有一个亲水的部分位于细胞质外，C端部分位于细胞质内。65％存在于浆膜，26％存在于内质网中，还有4％存在于线粒体或细胞核中。荧光免疫染色显示在转染的COS-7细胞中，WFS1蛋白位于细胞质中，呈现特征性的网状结构，并与内质网有交迭。在鼠的脑组织中，无论在蛋白质和mRNA水平，WFS1在海马回、杏仁核、嗅神经核以及不规则皮质表层的神经元中浓集。
二、WFS1与Wolfram综合征WFS1基因首先是Wolfram综合征(WSWolfram Syndrome)的致病基因。对于WFS1基因的研究开始于对Wolfram综合征的认识。WS(WolframSyndrome)即Wolfram综合征，由Wolfram和Wagener于1938年首次提出，是一种罕见的常染色体隐性遗传的神经变性疾病。因为WS患者患有尿崩症(Diabetes Insipidus)、糖尿病(Diabetes mellitus)、视萎缩(Optic Atrophy)、耳聋(Deafness)四大典型并发病症，取其各病英文名称字首，又被称为DIDMOAD。WFS1基因突变可以引起神经的进行性退变性病变，病变为以轴突膨胀为特征的轴突营养不良，直接导致患者出现Wolfram综合征的种种复杂症状。
三、WFS1与耳聋2001年，WFS1基因的突变被证实是导致低频感音神经性听力损失(LFSNHL)的原因之一，为DFNA6/14/38基因座位的致病基因。
自2001年以后，各国科学家通过对发现的不同家系的WFS1基因研究，不断发现了LFSNHL的突变位点。Bespalova 2001年，研究了多个家系，共报告了5个突变位点，它们是2266C＞T T699M；2146G＞AA716T；2505G＞AV779M；2656T＞C L829P，2662G＞A G831D。Komatsu 2002年通过研究日本的家系，报告了K634T。在这些突变中都未发现可以引起蛋白质的早熟、合成提前终止的突变。因此，对于WFS1基因突变与LFSNHL相关性的深入研究有望发现WFS1基因突变的真正致病机制。WFS1基因与Walfram综合征有关的突变有64％是失活的，因此可以说只有活化的WFS1基因突变才是导致低频听力损失的原因。
四、展望WFS1基因突变的发现开辟了一个令人惊奇的新领域，为耳聋患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。目前，通过国内外的研究仅发现了6个WFS1基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识WFS1基因对于正常听觉生理功能意义，更加深入的了解其与耳聋的关系。在以前所发现的6个突变位点中，都不是在中国人群中发现的，因此对中国人群中可能存在的WFS1基因突变进行研究将对于遗传性耳聋的临床诊断和治疗有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一个与遗传性耳聋相关的新的WFS1突变基因，该WFS1基因具有2766G→A杂合突变，相应地其编码蛋白氨基酸具有866D→N突变。
本发明的另一个目的在于提供诊断人类遗传性耳聋的方法，通过检测来自于一个体的待测样本中是否存在WFS1基因2766G→A(866D→N)突变而判断该个体的耳聋发生原因，进而为临床诊断和治疗提供参考。
本发明的再一目的在于提供WFS1基因2766G→A突变基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用。
根据本发明的一方面，通过在82名各种感音神经性耳聋患者和83名正常听力对照组中进行筛查，发现一个与感音神经性耳聋有关的WFS1基因新的突变位点(2766G→A 866D→N)。这一突变位点在83名对照组中均没有发现这一突变，说明这一突变位点与耳聋特异相关，这一突变位点位于Wolramin的细胞膜内区域。通过对不同物种的Wolframin蛋白氨基酸序列的进化研究证明，该突变位于Wolframin蛋白的高度保守区。
根据本发明的另一方面，诊断人类遗传性耳聋的方法是通过检测来自于患者的待测样本中是否存在WFS1基因2766G→A突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤1)采集待测个体的样本，例如血样、体液或组织，提取DNA；2)以该DNA为模板，以针对WSF1基因或WSF1基因2766碱基附近编码区设计的PCR引物进行PCR反应得到PCR反应产物；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序分析，将所得的序列与WSF1正常基因的标准序列进行比较，确定是否存在2766G→A突变位点；4)按照正常阅读框进行翻译以确定是否存在866D→N氨基酸突变位点；5)根据以上结果判断待测个体是否为WSF12766G→A基因突变导致的感音神经性耳聋。
在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的WFS1核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用引物设计软件设计了一对PCR引物，包含WSF1整个编码区，其序列为WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’WSF1正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NT 034692。
本发明进一步提供用于检测WFS1基因2766G→A突变的试剂盒，试剂盒中可以包括以下几种试剂的一种或几种的组合从待测样本中提取DNA的试剂；
用于扩增样本DNA中WSF1基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂；以及对PCR扩增产物进行测序的试剂。
例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测WFS1基因2766G→A突变的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测WFS1基因2766G→A突变的一种或多种成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中WFS1基因2766G→A突变位点的试剂盒。可含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对WFS1-F和WFS1-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。并说明使用方法如下1)PCR扩增用软件Primer 3对WFS1基因的编码区设计PCR引物反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度62℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。
2)PCR产物纯化将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后至另一洁净的96孔板中。
3)测序反应及验证以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样与ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的图谱进行分析。与Genbank中的标准序列比较可以发现突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测WFS1——866D→N突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋治疗方法中。
根据本发明的再一方面，提供WSF12766G→A突变基因在诊断人类遗传性耳聋疾病中的应用，通过检测待测个体中是否存在WSF 1基因2766G→A突变，而判断该个体的耳聋发生原因及类型。
本发明首次提供了在中国人群中存在的WFS1基因新的2766G→A突变基因，并证明了该突变基因与感音神经性耳聋特异相关，而且这个突变位点可能是在中国人群中特有的突变，并且有可能存在着突变热点，这对于耳聋患者的诊断有重要的意义。本发明同时提出了通过检测患者中是否存在WFS1基因新的2766G→A突变而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法。这将有利于在临床上开展聋病患者的WFS1突变筛查工作，为耳聋患者诊断和治疗提供服务。
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。
图1为WFS1编码区氨基酸与核酸碱基的对照，图中显示突变位于WFS1的细胞膜内区；图2为WFS1基因测序结果图；其中左图为正常序列测序结果，右图为突变序列测序结果，左图与右图序列顺序关系为全反互补图3为Wolframin蛋白结构示意图，标示出866D→N氨基酸突变位点；图4为来源于不同物种的Wolframin蛋白氨基酸序列比对，箭头所指为866D位点，图中显示来源于不同物种的所有Wolframin蛋白该位点均为天冬氨酸(D)，提示了WSF 1突变基因的866D→N突变位于高度保守区。
发明的
具体实施例方式
选取WFS1基因作为研究对象，通过在90名各种感音神经性耳聋患者和83名正常听力对照组中进行筛查，发现一个与耳聋有关的WFS1基因新的突变位点(2766G→A 866D→N)。这一突变位点在83名对照组中均没有发现这一突变，说明这一突变位点与耳聋有关，这一突变位点位于Wolramin的细胞膜内区域。发生突变的具体结果总结于下表1，并对结果进行了卡方检验，p值＜0.01，说明突变发生人数在2组中有差异，差异有统计学意义。
表1、90例耳聋患者和83例正常听力对照组WFS1基因新的2766G→A突变统计
卡方检验，P＝0.00实施例1一、WFS1基因编码区的PCR扩增1.对象聋病门诊收集的非综症型低频性感音神经性耳聋90例，正常对照83例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。
2.基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天1.抗凝血用PBS作1倍稀释。
2.在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温离心1000×g 20分。
3.吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g 10分。
4.将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。
5.用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，离心5000×g 10分钟。
6.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000×g 10分钟。
7.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000×g 10分钟。
8.吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。
9.加入2.5倍体积的无水乙醇。
10.-20℃沉淀DNA过夜。
第二天11.高速离心，10000×g，10分钟，4℃。
12.弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟。
13.弃上清，吹干。
14.用TE缓冲液溶解，(400μl TE/5ml全血，600-800TE/10ml全血)15.分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。
二、WFS1基因扩增——PCR反应条件引物序列WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’反应体系25ul
其中缓冲液、dNTP、引物、Tag多聚酶为上海生工公司生产。
反应条件反应在ABI公司9700热循环仪上进行。
实施例2PCR产物直接测序
PCR产物纯化1.向装有PCR产物的96孔板中加入50微升无菌水，混匀。
2.将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。
3.向纯化扳中再次加入50微升的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。
4.将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。
5.保存在-20度冰箱中。
电泳定量1、样品准备DNA(2ul)+上样缓冲液(6ul)共8ul×96取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6ul，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2ul)，转移到点样板上、混匀、用离心机甩一下(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。
2、流程配胶(0.8％琼脂糖)称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。
溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。
凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10ul，10mg/ml)，摇匀。
铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。
上胶将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。
加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入待测的PCR样品。
走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。
定量当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，定量。
所用做标记的MARKER为DL2000经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp而构成，DL2000的总浓度是300ng/5ul。一般取3ul+5ul(溴酚蓝)电泳。每条带的DNA量约为30ng。
实施例3测序反应BigDye 3.1测序反应采用美国应用生物系统公司(ABI公司)BigDyeTM Terminaors试剂盒，可在一个反应管中完成循环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。
1.测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
2.为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。
3.目前的反应体系为5ul，各种试剂加入量如下
4.样品(实施例2中的PCR产物)放于PCR仪上做如下反应
反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间会纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。
测序纯化-BigDye3.1测序纯化1.使用机械手程序15在384孔板的每个孔中加入20ul 80％乙醇，4,000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；2.在每孔中加入30ul 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；3.重复第2步的操作；4.重复第2步的操作；5.将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；6.加入5ul甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；7.上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。
实施例4突变位点进化研究1.突变分析应用DNAStar(Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列。
2.进化研究在数据库中发现只有鼠类和人类有WFS1的同源基因，而在人类，此基因主要存在于神经系统中，少量在肌肉组织中，找出家鼠、肌肉、仓鼠及人类神经组织中的4种Wolframin蛋白氨基酸序列，应用ClustalX软件进行比对分析。通过研究发现D866N位点在Wolramin蛋白家族中高度保守。
实施例5检测耳聋相关基因WFS1-2766G→A突变位点试剂盒及其应用1.试剂盒含有扩增用引物WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’PCR扩增用Taq酶5u/ul10×缓冲液(含15ml MgCl2)dNTP2mMBig-Dye mix
2.使用方法主要包括如下步骤A提取DNA，利用上述引物，进行PCR反应；BPCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在。
C按正常阅读框进行翻译以确定Wolframin氨基酸突变位点。
具体方法参见实施例1、2、3。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员应理解，在阅读了本发明的上述内容以后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围内。
权利要求
1.WFS1突变基因，其特征在于其具有2766G→A杂合突变，所述突变基因与人类感音神经性耳聋相关。
2.权利要求1所述的WFS1突变基因，其特征在于所述突变基因编码的氨基酸具有866D→N突变位点。
3.一种检测方法，其特征在于通过检测来源于待测个体的样本中是否存在权利要求1所述的WFS1基因突变位点，而诊断待测个体遗传性耳聋的发生和类型。
4.权利要求3所述的检测方法，包括下述步骤1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA；2)以所述DNA为模板，以针对WSF1基因或WSF1基因2766碱基附近编码区设计的PCR引物进行PCR反应得到PCR反应产物；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序分析，将所得的序列与WSF1正常基因的标准序列进行比较，确定是否存在2766G→A突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否为WSF12766G→A基因突变导致的感音神经性耳聋。
5.权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述进一步包括下述步骤5)按照正常阅读框进行翻译以确定是否存在866D→N氨基酸突变位点。
6.权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR引物序列为WFS1-F5’-TTC GAC CGC TAC AAG TTT GA-3’WFS1-R5’-GGG AGG AGA GGG AAT CTC AT-3’
7.一种检测试剂盒，用于诊断人类遗传性耳聋，包括下述一种或几种试剂的组合从待测样本中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA中WSF1基因或WSF1基因2766碱基附近编码区的PCR引物及相应的PCR反应试剂；以及对PCR扩增产物进行测序的试剂。
8.权利要求1所述WSF1突变基因在诊断人类遗传性耳聋疾病中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有2766G→A杂合突变的WFS1突变基因突变，该基因与人类感音神经性耳聋相关，本发明还提供了通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法。该突变基因和检测方法将有利于在临床上开展聋病患者的WFS1突变筛查工作，为耳聋患者诊断和治疗提供服务。
文档编号C12Q1/68GK1733917SQ200410009578
公开日2006年2月15日 申请日期2004年9月17日 优先权日2004年9月17日
发明者王秋菊, 沈岩, 刘穹, 李庆忠 申请人:中国人民解放军总医院, 北京诺赛基因组研究中心有限公司