专利名称：应用含有二糖和葡萄糖的培养基高产量生产合子样子叶型松树胚的方法
技术领域：
本发明涉及在植物体外生产植物胚，并从植物胚任意生产植株的方法。
一种克隆松树的方法是在促进松树胚形成的条件下，对离体的活的松树组织进行体外处理，然后由处理的组织获得整个植株。可以在一种或多种植物生长激素和/或细胞分裂素的存在下培养离体的松树组织，来促进胚发生组织的形成和增殖，之后在促进子叶型松树胚形成的条件下培养该组织。然后使胚发芽长成松树。松树胚生成组织的一个实例是胚胎胚柄物质(embryonal suspensor masses)(ESMs)，其可通过体外组织培养由松树胚形成，所述松树胚从松树种子全裂而成。
图1显示的是液体培养物中的胚胎胚柄物质。图2显示的是由ESM形成的子叶型松树胚(可在胚顶部看到子叶)。
但是一个持续的问题正促进子叶型松树胚的有效形成，该胚可以高频率地发芽来产生松树植株。优选该体外形成的子叶型松树胚与在松树种子内，即在体内形成的合子型松树胚在形态学、解剖学和生物化学上都相似或相同。特别是，需要有方法能够比现有技术的方法体外生产更大量的合子样子叶型松树胚。优选地，通过本发明新方法生产的子叶型松树胚的发芽率和质量都高于现有技术方法所生产的子叶型松树胚。
本发明的方法各包括在含有二糖和葡萄糖的培养基之内或其上培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％(即，二糖在培养基中的浓度小于3％，葡萄糖在培养基中的浓度小于3％)。在一些实施方案中，该培养基包含葡萄糖(浓度小于3％)以及至少两种二糖，其中培养基中所有二糖的总浓度小于3％。该培养基还可以含有一种或多种吸收剂成分。本发明的方法还可进一步包括从根据本发明所制备的子叶型松树胚生产一株或多株松树(例如松树种群)的步骤。
在本发明的一些实施方案的实践中，在至少两种培养基上或其内持续培养胚发生组织，所述培养基的至少一种含有二糖和葡萄糖，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均小于3％。含有二糖和葡萄糖的培养基适于促进从胚发生组织到子叶型胚的发育及成熟。
这样，在一些实施方案中，本发明提供了产生子叶型松树胚的一些方法，该方法各包括以下步骤(a)在维持培养基上或在该培养基内培养胚发生组织(例如松树胚胚柄物质)；以及(b)在含有二糖和葡萄糖的发育培养基上培养根据步骤(a)处理的松树胚发生组织以形成子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度都小于3％。该发育培养基还可选择性地含有吸收剂成分。本发明这一方面的方法可以选择性地含有在起始培养基上或其内培养松树组织以获得胚发生组织的步骤，然后将该组织在如步骤(a)所述的维持培养基上或其内培养。
另一方面，本发明提供根据本发明的方法制备的子叶型松树胚。
本发明的方法可用于例如制备子叶型松树胚，该胚可例如通过遗传学上或生化手段而进一步具有一些特性，和/或可以使其发芽来产生小松树植株，如果需要的话，该植株可以长成成熟的松树。这样，本发明方法可以用于例如生产具有一种或多种期望特性，如生长速度快或木质改进的单株松树植株的克隆。例如，本发明的子叶型松树胚可以用于产生具有一种或多种期望特性，如生长速度快或木质改进的松树树林或森林。这些树木可用于生产木制品。
图2显示使用本发明方法制备的具有代表性的子叶型松树胚(可在胚的顶部见到子叶)。
在本文中，术语“子叶型胚”指具有一个或多个子叶的胚。
术语“二糖”指由两个单糖残基构成的碳水化合物。二糖的代表性例子包括麦芽糖，蔗糖，乳糖，纤维二糖，异麦芽糖，龙胆二糖，昆布二糖(laminarabiose)，壳二糖，木二糖(xylobiose)，菊粉二糖，甘露二糖，玻璃样生物糖醛酸(hyalobiouronic acid)，软骨胶素，以及纤维二糖醛酸(cellobiouronic acid)。
在本文中，术语“胚发生组织”指源自松科植株的任何组织，当用本发明的方法处理该组织时，其能够产生一个或多个子叶型松树胚。这样，术语“胚发生组织”包括例如松树胚胚柄物质。
除非另有说明，所有以百分数方式表达的浓度数值都是重量每体积百分数。
另一方面，本发明提供生产子叶型松树胚的方法。该方法包括在含有二糖和葡萄糖的培养基之内或其上培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％。
在本发明方法的一些实施方案中，产生的子叶型松树胚中至少有50％(例如至少60％，或例如至少70％，或例如至少80％，或例如至少90％)是合子样的(即，与处于相同发育阶段的合子子叶型松树胚具有相同的形态学特征和生理学属性)。这样，本发明方法的一些实施方案中，所产生的子叶型松树胚中有50％-100％(例如60％-90％，或70-80％)是合子样的。
根据本发明制备的子叶型松树胚通常都具有一种或多种下述特性与那些除了培养基中没有浓度小于百分之三的葡萄糖和/或二糖之外，其余处理相同的胚相比，本发明的胚更长(通常长出0.5mm-1.0mm)；每个胚都含有8-12子叶；并且根据本发明处理的胚与那些除了培养基中没有浓度大于百分之三的葡萄糖和/或二糖之外，其余处理相同的胚相比，发育更快(例如，在一些实施方案中，根据本发明制备的胚在9周内发育)。
本发明的方法可用于生产松科家族任何成员的子叶型胚，例如松属(genus Pinus)植物如火炬松(Loblolly pine)(Pinus taeda)。
可用于本发明的胚发生组织的一个实例是胚胎胚柄物质(ESMs)。ESMs可从取自松树种子的前子叶(precotyledonary)胚制备。在取出前子叶胚之前，种子通常要经过表面灭菌，然后将这些前子叶胚培养在能够形成ESMs的培养基上或其内，所述ESMs包括在通过出芽和分裂进行的增殖过程中的前期胚。如果需要的话，培养基可以含有能够刺激早期胚增殖的激素。可加入培养基中的激素可以是植物生长素(如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(如6-苄氨基嘌呤(BAP))。植物生长素可以例如以1mg/L-200mg/L的浓度使用。细胞分裂素的使用浓度可以是0.1mg/L-10mg/L。用于培养松树前子叶型胚以诱导ESMs形成的培养基的实例为实施例1中所述BM1。
本发明方法还包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％(例如小于2.9％，或例如小于2.8％，或例如小于2.7％，或例如小于2.6％，)。在本发明方法的一些实施方案中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为1％-2.5％。在本发明方法的一些实施方案中，二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为2％-2.5％。在本发明方法的一些实施方案中，二糖在培养基中的浓度为2.5％，葡萄糖在培养基中的浓度为1％。在本发明方法的一些实施方案中，培养基包含葡萄糖和至少两种二糖，其中葡萄糖在培养基中的浓度小于3％，而培养基中所有二糖的总浓度为1％到2.5％。在本发明方法的一些实施方案中，培养基包含葡萄糖和至少两种二糖，其中葡萄糖在培养基中的浓度小于3％，而培养基中所有二糖的总浓度为2％到2.5％。
在本发明方法的一些实施方案中，在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养胚发生松树组织6周-12周时间，例如从8周到12周，或例如从9周到11周，其中二糖和葡萄糖的浓度都小于3％。在本发明方法的一些实施方案中，在20-40℃例如21-24℃的温度下，在含有二糖和葡萄糖的培养基内或其上培养胚发生松树组织，其中二糖和葡萄糖的浓度都小于3％。
含有二糖和葡萄糖的培养基还可含有能够维持被培养的植物组织的营养素(例如，盐类)，以及一种或多种能够将培养基的重量摩尔渗透压浓度调整到期望范围内的试剂。例如，培养基的重量摩尔渗透压浓度可为250mM/Kg到450mM/Kg，例如250mM/Kg到350mM/Kg。培养基的pH也可以调整到期望的数值。例如，培养基的pH值可以为4.5-6.5，例如5.0-6.0。
含有二糖和葡萄糖的培养基可以是液态培养基或固态培养基。当应用液态培养基时，胚发生组织通常是被置于吸收支持物(如滤纸)之上，所述滤纸是在液态培养基中浸湿的。当应用固态培养基时，胚发生组织可以被置于培养基表面，还可部分地透过固态培养基的表面。这样，固态培养基包括部分凝固并允许胚发生组织充分渗透到培养基体内的培养基，还包含完全凝固，导致胚发生组织不能透过固化的培养基体的培养基。通过加入适量的胶凝剂，可如琼脂或脱乙酰吉兰糖胶，可使液态培养基完全或部分凝固。
已经发现，在含有二糖和葡萄糖的培养基中含有吸收剂成分可以进一步促进高产量地生产具有改进的发芽频率和质量的子叶型松树胚。吸收剂成分可以是在本方法使用浓度下对胚发生组织无毒的任何成分，其能够吸收存在于培养基中的生长促进激素和植物细胞在胚发育过程中产生的有毒化合物。这样，被吸收的激素就不能促进胚发生组织在培养基上或其内的发育，被吸收的毒素也不对植物细胞产生不利影响。在此，术语“吸收”包括吸收剂成分和培养基内一种或多种生长促进激素和/或毒素之间的任何化学或物理相互作用，这样生长促进激素和/或毒素都与吸收剂成分结合。
这样，在本发明方法的一些实施方案中，在含有生长促进激素如植物生长激素和/或细胞分裂因子的培养基上或其内培养胚发生组织以促进胚发生组织的增殖。当获得了足够的胚发生组织后，就可以将胚发生组织转移到不含有生长促进激素但是含有二糖和葡萄糖，并可选择性地含有一种或多种吸收剂成分的培养基上。吸收剂成分会结合培养基内的生长促进激素，这样就降低了胚发生组织的增殖速度，或完全停止了增殖，并且二糖和葡萄糖会诱导由胚发生组织产生松树子叶型胚。
可使用的吸收剂成分的非限制性实例包括活性碳，可溶性聚乙烯基吡咯烷酮，不溶性聚乙烯基吡咯烷酮，活性氧化铝和硅胶。吸收剂成分可以例如0.01g/L-5g/L的量存在。在一些实施方案中，吸收剂成分的量为0.05g/L-1g/L。在培养基中含有不止一种吸收剂成分(如至少两种吸收剂成分)的本发明方法的那些实施方案中，上述的浓度范围指培养基中吸收剂成分的总浓度。
实践本发明的一些实施方案时，在至少两个一连串培养基上或其内顺序地培养胚发生组织，其中至少一个培养基内含有二糖和葡萄糖，二糖和葡萄糖在培养基内的浓度都小于3％。含有二糖和葡萄糖的培养基适于促进从胚发生组织(例如用一种或多种生长激素处理过的胚发生组织)到子叶型胚的发育和成熟。子叶型松树胚具有改进的发芽频率和质量。
例如，在实践本发明的一些实施方案时，在适于促进细胞分裂和胚发生组织生长的维持培养基上或其内培养松树胚发生组织(如ESM)。维持培养基可以是固态培养基，或液态培养基，可以搅动该液态培养基以促进其中的胚发生组织生长和增殖。维持培养基可以含有维持胚发生组织的营养素，还可含有激素，如一种或多种植物生长素(如2，4-D)和/或细胞分裂素(如激动素，BAP)，其能够促进胚发生组织的细胞分裂和生长。如果使用了植物生长素，那么维持培养基中植物生长素的浓度可在例如0.1mg/L-10mg/L之间(如0.1mg/L-5mg/L)。如果培养基中存在不止一种植物生长素，上面所述的浓度指培养基中植物生长素的总浓度。如果使用了细胞分裂素，那么维持培养基中细胞分裂素的浓度可在例如0.1mg/L-2mg/L之间(如0.1mg/L-1mg/L)。如果培养基中存在不止一种细胞分裂素，上面所述的浓度指培养基中细胞分裂素的总浓度。
尽管不是必须，但是通常都期望含有麦芽糖作为维持培养基中的单一或主要糖源。麦芽糖的浓度可以为0.5mg/L-6mg/L，如1mg/L-3mg/L。
可以将维持培养基的重量摩尔渗透压浓度数值调整到期望的范围之内，例如100mM/Kg-250mM/Kg，或者100mM/Kg-200mM/Kg。维持培养基的pH也可以调节到期望的范围内，例如4.5-6.5，或5.0-6.0。通常在20-40℃，例如21-24℃的温度下，在维持培养基内或其上培养胚发生组织。一种合适的维持培养基的实例为本文实施例1中所述的BM2。
在维持培养基上或其内培养胚发生组织直到胚发生组织已经增殖到了期望的量(例如通过培养的胚发生组织的质量所测定的)。然后该胚发生组织就可以被转移到适于促进高质量子叶型松树胚发育的发育培养基中。尽管发育培养基也可以是液态培养基，但发育培养基通常是固态培养基。
发育培养基含有二糖和葡萄糖，其浓度都小于3％(如小于2.9％，或小于2.8％，或小于2.7％，或小于2.6％)。在一些实施方案中，二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度均为1％-2.5％。在一些具体实施方案中，二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度为2％-2.5％。
发育培养基可以含有维持胚发生组织的营养素(如盐类)。合适的发育培养基通常不含生长促进激素，如植物生长素和细胞分裂素，但是可以含有激素脱落酸。当培养基中使用了脱落酸时，所用的脱落酸的浓度范围为1mg/L-200mg/L，例如从1mg/L-100mg/L。可以将发育培养基的重量摩尔渗透压浓度数值调整到期望的范围之内，例如250mM/Kg-450mM/Kg，或者250mM/Kg-350mM/Kg。发育培养基的pH也可以调节到期望的范围内，例如4.5-6.5，或5.0-6.0。通常在20-40℃，例如21-24℃的温度下在发育培养基内或其上培养胚发生组织。一种合适的发育培养基实例为本文实施例1中所述的BM3。
在本发明方法的一些实施方案中，胚发生组织培养在发育培养基内或其上培养6周到12周时间，例如6周到9周。
这样，在一些实施方案中，本发明提供了产生子叶型松树胚的方法，该方法包括以下步骤(a)在维持培养基上或其内培养胚发生松树组织(例如松树胚胎胚柄物质)；和(b)在含有二糖和葡萄糖的发育培养基上培养根据步骤(a)处理的松树胚发生组织以形成子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度都小于3％。该发育培养基还可选择性地含有吸收剂成分。本发明该方面的方法可以选择性地包括在起始培养基上或其内培养松树组织以获得胚胎发生组织的步骤，然后将该组织在如步骤(a)所述的维持培养基上或其内培养。
在另外一些实施方案中，本发明提供了生产子叶型松树胚的方法，该方法包括以下步骤(a)在固态维持培养基上培养胚发生松树组织(例如松树胚胚柄物质)；(b)在液态维持培养基内培养根据步骤(a)处理的松树胚发生组织；和(c)在含有二糖和葡萄糖的固态发育培养基上培养根据步骤(b)处理的胚发生组织以形成子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度都小于3％。该发育培养基还可选择性地含有吸收剂成分。本发明该方面的方法可以选择性地包括在起始培养基内培养松树组织以获得胚胎发生组织的步骤，然后将该组织在如步骤(a)所述的维持培养基上培养。
使用本发明方法产生的子叶型松树胚可选择性地发芽以形成小松树植株，如果需要的话，它可长成松树。子叶型松树胚可在固态发芽培养基如本文实施例1中所述的培养基BM5上发芽。发芽的植株可被转移到土壤中以进一步生长。例如，发芽的植株可以被栽种到温室的土壤中并在被移植到户外之前使其生长。通常光照子叶型松树胚以促进发芽。通常，本发明方法的所有步骤，除发芽外，都在暗处进行。
本发明方法可以用于例如产生具有一种或多种期望特性例如生长速度快的单株松树的克隆。这样，一方面本发明提供产生遗传学相同的子叶型松树胚的方法。本发明该方面的方法各包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养遗传学相同的松树胚发生组织，以产生遗传学相同的子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％。
另一方面，本发明提供合子样子叶型松树胚群体。在一些实施方案中，子叶型松树胚群体中至少有50％(例如至少60％，或例如至少70％，或例如至少80％，或例如至少90％)的子叶型松树胚是合子样的。这样，在本发明该方面的一些实施方案中，子叶型松树胚群体中有50％-100％(例如60％-90％，或70-80％)的子叶型松树胚是合子样的。本发明方法可用于产生本发明的合子样子叶型松树胚群。这样，一方面本发明提供通过本发明方法制备的子叶型松树胚群体。
下述实施例仅为说明目前被认为是实施本发明的最佳方式，但不应被解释为对本发明的限制。实施例1本实施例显示本发明的用于产生火炬松(Pinus taeda)群体、子叶型胚、以及胚的发芽的代表性方法。
从受精后4-5周的种子中取出含有合子胚的大配子体。去除种皮，但除了将珠心末端(nucellar end)切除外，不进一步将胚从周围配子体中分离出来。将锥形体保存在4℃待用。在即将除去不成熟的胚之前，种子经历灭菌过程初始清洗和去污剂处理，然后在15％H2O2中灭菌10分钟。每次处理后都用灭菌的蒸馏水彻底清洗外植体。
表1列出了用于火炬松胚发生组织的代表性培养基的组成。
表1
阶段I-诱导将带有完整胚的无菌配子体置于固体BM1培养基上，在22℃-25℃环境中以24小时暗周期保存3-5周。时间的长短取决于被培养的特别基因型。这段时期末，形成白色粘性物质，其与最初的外植体结合。显微镜检测典型地显示大量与该物质结合的早期胚。其特征通常为具有与具有致密细胞质和大核的小头(small head)相连的长的薄壁胚柄。
诱导培养基的重量摩尔渗透压浓度有时可以高达170mM/kg。通常约为160mM/kg或更低(如150mM/kg)阶段II——维持和增殖将取自诱导期产生的物质的早期胚置于凝固的BM2凝胶化维持和增殖培养基上。这与诱导培养基的区别在于生长激素(植物生长素和细胞分裂素)减少了至少一个数量级。通过将肌醇的量增加到0.5％w/v，该培养基的重量摩尔渗透压浓度通常由诱导培养基的重量摩尔渗透压浓度升至约180mM/kg或更高。温度和光周期还是22-25℃，保持24小时黑暗。转移到液态培养基进一步传代培养之前，在BM2固态培养基上培养胚12-14天。该液态培养基具有类似的组成但是不含胶凝剂。在固态维持阶段末期的胚在外观上通常类似于阶段I的胚。在液体维持培养基上传代培养5-6周后，形成了高级的早期胚。其特征为平滑的胚头(embryonal heads)，估计其具有超过100个细胞，还有多个胚柄。
对于火炬松(pinus taeda)，维持培养基的渗透势通常在约180-400mM/kg的范围内。维持培养基渗透势最通常约为诱导或增殖培养基的1.5倍左右。
阶段III——胚的发育来自阶段II培养物的高级早期胚被转移到置于基座上的滤纸支持物上，该基座已浸透液体发育培养基。该培养基完全不含生长激素，或仅含极低水平，并且其与阶段I和II具有相同低水平的渗透剂(osmoticant)。存在麦芽糖和葡萄糖。还可含有脱落酸以促进进一步发育。还可以含有吸收剂成分(如活性碳，可溶性和不溶性聚乙烯基吡咯烷酮，活性氧化铝和硅胶)，其浓度可以为约0.1-5g/L，或约0.25-2.5g/L。
该培养基的渗透势可高于维持培养基。例如，其渗透势可以高达350mM/kg或更高。发育优选在完全黑暗中进行，温度22-25℃，直到已经发育出伸长的子叶型胚。发育时间通常为几周，如6-9周。
然后在4℃-10℃，在不含有PEG或ABA的培养基(如培养基BM7)中培养胚3-4周。
阶段IV——干燥将仍然在滤纸支持物上的胚从基座上提起，置于封闭的容器内约3周，所述容器置于K2SO4的饱和溶液或水之上，相对湿度97％。
阶段V——发芽将来自阶段IV的仍置于滤纸支持物上的干燥的子叶型胚置于浸透了液体发芽培养基的基座上24小时使其复水。然后将胚单个地置于固体BM5培养基上使其发芽。这是通过减少蔗糖，肌醇和有机氮而改性的基础培养基，其缺乏生长激素。在23-25℃，16小时光周期-8小时暗周期的条件下，在BM5培养基上培养胚，直到获得的小植株具有发育良好的胚根和胚轴以及绿色子叶型结构和上胚轴。如果需要的话，子叶型胚还可以转变成人工种子。
由于碳水化合物浓度减少，故发芽培养基的渗透势进一步降低，低于发育培养基的渗透势。通常低于约150mM/kg(如约100mM/kg)。
阶段VI——转化从发芽培养基上取出阶段V的小植株并植于含有等比例泥炭和细珍珠岩的土壤中。实施例2本实施例显示在含有2.5％麦芽糖和1％葡萄糖的发育培养基上培养火炬松体细胞胚的胚发育和发芽频率效果。
试验了三种火炬松基因型基因型A，基因型B，和基因型C。在含有1升BM2培养基的烧瓶中培育每种基因型的胚胎胚柄物质(ESM)。每瓶ESM均沉淀15分钟，培养基被抽气，沉淀的细胞被转移到新的器皿中。向细胞中加入等体积的BM6培养基，然后再沉淀10分钟。去除一半BM6培养基，沉淀细胞的1.5ml等分式样(一个细胞对BM6比率为1∶0.5)被直接转移到发育培养基BM3(包含葡萄糖和麦芽糖)和BM4(含有麦芽糖，但不含葡萄糖)，以及BM2，BM5，BM6和BM7上。
在发育培养基上培养4周后，观察到培养基BM3比培养基BM4更快地促进了发育。其它培养基与对照培养基没有区别。在发育培养基上培养12周后，BM3培养基上培养的胚比BM4培养基上培养的胚更大，更长，更象合子胚。在BM3培养基上培养的胚在8周后开始发育子叶。相比于BM4培养基上培养的胚的4-6个子叶，BM3培养基上培养的胚具有8-10个子叶(基因型A产生了一些具有14-16个子叶的胚)。这样，在含有麦芽糖和葡萄糖的发育培养基(BM3培养基)培养胚能够比其它培养基产生更大量，质量更好的胚，具有更多子叶和可见的圆顶。表2显示BM4和BM3培养基上产生的合子样火炬松胚的数目。
表2
从BM3和BM4平板中选出合子样胚并转移到基座上带有滤纸的皮氏平板中，该基座已浸透了BM7培养基。用石蜡膜密封皮氏板并冷藏。4周后，将带有胚的滤纸转移到含有约100ml水的品红盒子(Magenta box)中的网桥(mesh bridge)上。在盒子中干燥3周后，将带有胚的滤纸转移到含有浸透了液态BM5培养基的基座的皮氏板上。24小时后，将胚转移到发芽箱中的固态BM5培养基上。将该箱置于黑暗处1周，然后转移到亮室中。
BM3上产出的胚的发芽频率是BM4上产出的胚发芽频率的近2倍。而且，BM3培养基上产出的芽质量优于BM4上产出的芽。例如，对于基因型A和B，培养基BM3上的两极芽具有粗直的胚轴，且上胚轴生长旺盛。与此相反，BM4上产出的两极芽具有弯曲、相对较细的胚轴。
本发明的优选实施例已说明和描述，可以想见，对本发明进行各种改变是显而易见的，但仍不背离本发明的精神和范围。
权利要求
1.生产子叶型松树胚的方法，所述方法包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中所述二糖和所述葡萄糖在培养基中的浓度均低于3％。
2.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织包含胚胎胚柄物质。
3.权利要求1的方法，其中至少60％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。
4.权利要求1的方法，其中至少70％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。
5.权利要求1的方法，其中至少80％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。
6.权利要求1的方法，其中至少90％的子叶型松树胚具有6-12个子叶。
7.权利要求1的方法，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为1％-2.5％。
8.权利要求1的方法，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度均为2％-2.5％。
9.权利要求1的方法，其中培养基含有至少两种二糖，其中二糖在培养基中的总浓度为1％-2.5％。
10.权利要求1的方法，其中培养基含有至少两种二糖，其中二糖在培养基中的总浓度为2％-2.5％。
11.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养6周-12周。
12.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养8周-12周。
13.权利要求1的方法，其中松树胚发生组织在含有二糖和葡萄糖的培养基上或在该培养基内培养9周-11周。
14.权利要求1的方法，其中含有二糖和葡萄糖的培养基的重量摩尔渗透压浓度为250mM/kg-450mM/kg。
15.权利要求1的方法，其中含有二糖和葡萄糖的培养基的pH为4.5-6.5。
16.权利要求1的方法，其中培养基进一步含有吸收剂成分。
17.权利要求16的方法，其中吸收剂成分选自活性碳，可溶性聚乙烯基吡咯烷酮，不溶性聚乙烯基吡咯烷酮，活性氧化铝和硅胶。
18.权利要求17的方法，其中吸收剂成分是活性碳。
19.权利要求16的方法，其中吸收剂成分的浓度为0.01g/L-5g/L。
20.权利要求16的方法，其中吸收剂成分的浓度为0.05g/L-1g/L。
21.权利要求16的方法，其中培养基含有至少两种吸收剂成分，其中吸收剂成分在培养基中的总浓度为0.01g/L-5g/L。
22.权利要求16的方法，其中培养基含有至少两种吸收剂成分，其中吸收剂成分在培养基中的总浓度为0.05g/L-1g/L。
23.权利要求1的方法，其中子叶型火炬松胚是从火炬松胚发生组织制备的。
24.权利要求1的方法，其中培养基是液态培养基。
25.权利要求1的方法，其中培养基是固态培养基。
26.生产子叶型松树胚的方法，所述方法包括以下步骤(a)在维持培养基上或在该培养基内培养松树胚发生组织；和(b)在含有葡萄糖和二糖的发育培养基上或在该培养基内培养根据步骤(a)处理的松树胚发生组织，以形成子叶型松树胚，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度均小于3％。
27.权利要求26的方法，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度均为1％-2.5％。
28.权利要求26的方法，其中二糖和葡萄糖在发育培养基中的浓度均为2％-2.5％。
29.根据权利要求1的方法制备的子叶型松树胚群体，其中至少50％的胚为合子样的。
30.权利要求29的子叶型松树胚群体，其中至少60％的胚为合子样的。
31.权利要求29的子叶型松树胚群体，其中至少70％的胚为合子样的。
32.权利要求29的子叶型松树胚群体，其中至少80％的胚为合子样的。
33.权利要求29的子叶型松树胚群体，其中至少90％的胚为合子样的。
全文摘要
本发明提供生产子叶型松树胚的方法。本发明方法各包括在含有二糖和葡萄糖的培养基上或其内培养松树胚发生组织以产生子叶型松树胚的步骤，其中二糖和葡萄糖在培养基中的浓度都小于3％。本发明还提供根据本发明方法制备的子叶型松树胚。
文档编号A01H4/00GK1476750SQ0311027
公开日2004年2月25日 申请日期2003年4月9日 优先权日2002年4月9日
发明者巴莫德·K·古普塔, 黛安娜·霍尔姆斯特伦, 邦尼·拉森, 霍尔姆斯特伦, 巴莫德 K 古普塔, 拉森 申请人:韦尔豪泽公司