专利名称：人或动物卵细胞提取物及用于干细胞扩增与诱导分化的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞提取物及应用技术，具体涉及人或动物卵细胞提取物及其在干细胞扩增与诱导分化中的应用。
背景技术：
对卵细胞的研究，多年来，多涉及生育技术领域，对卵细胞提取物及其在干细胞扩增与诱导分化有关技术及应用的研究尚未见报导。
1997年以来，干细胞研究取得重要进展，研究发现人体间充质干细胞可以被诱导分化为神经、肌肉、皮肤、软骨、脂肪、肌腱、肝脏、血液及组织类型的成熟细胞。扩增诱导后移植到体内能和相应组织细胞良好整合，发挥特定的生物学功能，可以用来移植治疗多种组织退行性变、组织细胞变性坏死、组织损伤或缺损等，在临床有很好的应用前景。胚胎干细胞的研究有了可喜的成就，产生了克隆羊“多利”。
已有许多关于间充质干细胞的干细胞扩增与诱导分化方法和试剂的报道，有关报道所采用的技术方法和因素各不相同。广西医学院学报2002年6月第18卷第2期“人骨髓间质干细胞分离和培养扩增方法的研究”，是用胎牛血清(FCS)与L-DMEM培养液扩增取得满意效果。复旦学报(医学版)2003MAY，30(3)“人骨髓间充质干细胞的体外培养及诱导分化”，其扩增培养基内含有DMEM、胎牛血清、内皮细胞生长因子(ECGF)、地塞米松、胰岛素、β-磷酸甘油等。所见报道方法、试剂各异，没有形成标准。
发明内容
本发明提供一种直接从人或动物体内获得的卵细胞经人工提取而得的卵细胞提取物，本发明还提供该卵细胞提取物在体外干细胞扩增与诱导分化中的应用。本发明的卵细胞提取物在干细胞扩增与诱导分化应用中，显示出良好的扩增干细胞的扩增效率及诱导干细胞分化为其它细胞的诱导分化率，且效果好，重复性好，性能稳定。
相关名词注释(1)干细胞是各种成熟细胞的起源细胞，根据来源及分化潜能的不同，分为胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES)和成体干细胞(dult stem cells，ASCs)两类。有潜在的扩增及诱导分化性能；(2)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前研究较多的ASCs。广泛存在于成人骨髓、脂肪等多种组织中，而且具有多向分化潜能，可以在体内外被诱导分化为多种类型、不同功能的成熟细胞。在体外能达到50次以上倍增而保持其多向分化的潜能性。
(3)DMEM与F12培养基细胞培养通用基础培养基。
(4)卵细胞提取物从人或动物卵细胞中提取，分子量大小不等的复杂混合物。含有多种促进、调控及诱导细胞生长分化因子。
(5)定向诱导细胞提取物，分别从人或动物的不同组织如神经、肌肉、皮肤、软骨、脂肪、肌腱、肝脏、血液等组织细胞提取物，分子量大小不等的复杂混合物。含有多种特异性促进、调控及诱导向相应细胞生长分化因子，能诱导干细胞向所定向细胞分化。如神经细胞提取物能在其它因素的共同作用下，诱导干细胞向神经细胞方向分化。
(6)干细胞扩增用天然化合物或细胞因子等与干细胞在特定温度、湿度和二氧化碳条件下同培养一定时间后，干细胞数量大量扩增而保持其原有的生物学特性。
(7)干细胞诱导分化用天然化合物或细胞因子及等与干细胞在特定温度、湿度和二氧化碳条件下共同培养一定时间后，干细胞分化为成熟细胞。不同诱导因子和条件诱导后所得成熟细胞类型不同。
发明技术方案人或动物卵细胞提取物，主要包括以下方法制取卵细胞原料收集→洗净→细胞匀浆→冻融→沉淀或过滤→取上清液→分离去除大于20万道尔顿(Da)以上分子量物质→蛋白浓度测定→活性测定→除菌→分装。
具体方法为
(1)取人或动物卵细胞，用生理盐水洗涤2-3次；(2)在4℃以下，匀浆3-5次；(3)将匀浆液置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于隔水42℃的条件下彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；(4)在1-4℃条件下，去处沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；(5)获得的上清液，分离即去除大于20万道尔顿(Da)以上分子量的大分子物质，使获得的过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量低于20万道尔顿(Da)；(6)将获得的过滤液除菌，蛋白含量测定，活性测定，制成粉剂或水剂，于-20℃冻存或无菌分装，此为本发明的卵细胞提取物。
步骤(1)的卵细胞可直接进行匀浆，也可以再加入1-4倍生理盐水稀释后再匀浆；步骤(5)的分离方法可以是高速离心、电泳、过滤膜过滤等方法，优选过滤膜在正压或负压条件下过滤截留。过滤膜的选用要求能截留下分子量大于20万道尔顿(Da)的大分子物质。产品用常规方法制成试剂，可粉剂或水剂。制成水剂时，蛋白质浓度大于4毫克/毫升为好，不论是粉剂或水剂，应用时，根据活性单位要求取量即可。
所述的人或动物卵细胞是直接从人或动物体取得的，动物以哺乳动物为好。
本发明的卵细胞提取物的生产过程，最好在低温条件下进行，减少活性损失，防止污染。冻融过程需反复进行至细胞完全破碎。蛋白质含量可因盐水加入的多少而不同，按本发明的制作方法提取，提取液中蛋白质浓度为1毫克/毫升以上。除菌方法以过滤为好。
人或动物卵细胞提取物在干细胞扩增与诱导分化中的应用，特别是在间充质干细胞的扩增及诱导分化的应用，表现出良好的扩增效率与诱导分化率，干细胞扩增500-1000倍以上，诱导分化率60％-90％以上。本发明所述卵细胞提取物试剂在干细胞扩增与诱导分化中的应用，可以是本发明的卵细胞提取物试剂结合现有技术的应用，也可以是将卵细胞提取物试剂在制备成干细胞扩增及诱导分化试剂盒的应用。所述试剂盒的应用可以是主要由基础培养基和卵细胞提取物和/或定向诱导细胞提取物制成的试剂盒中的应用，所述定向诱导细胞提取物试剂可以由现有技术的诱导分化试剂代换。所述基础培养基以选自DMEM与F12的混合培养基为好。所述定向诱导细胞提取物系列技术已同时另案专利申请。
本发明的诱导分化应用不受本发明的扩增技术限制，可应用于其它技术扩增的间充质干细胞的诱导分化。
应用试验及效果干细胞以间充质干细胞为例扩增培养15天，传代四次，将扩增后的间充质干细胞诱导分化为神经细胞，再培养15天，传代四次。结果显示扩增干细胞达1000倍以上，诱导分化为神经细胞的诱导分化率达到90％以上。
扩增细胞鉴定间充质干细胞判定标准形态梭形，呈火焰状有规则排列生长。表面分子标志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。鉴定结果符合。
诱导细胞鉴定(1)形态学符合神经细胞形态学特征；(2)神经元细胞特异性抗原标志鉴定采用免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定。结果为神经元的特异标志物神经元特异性烯醇酶(NSE)、神经特异性核蛋白(NeuN)、中间神经丝(NFOm)、tau蛋白和一些微管蛋白(tubulinOβ、MAPO2、TuJO1)呈阳性反应；(3)神经递质分析采用气/质谱分析，培养上清液中有多巴胺等神经递质产生。电生理分析有神经样放电。
鉴定结果符合。
有效量以每100毫升培养液含卵细胞提取物活性成份以蛋白质浓度表示，显示为含蛋白质1毫克以上即表现有活性，为有效活性范围，1-100毫克为更有效活性范围。在此活性范围内，扩增干细胞达500倍以上，诱导分化率达到60％以上。
所述卵细胞提取物的以上蛋白质含量的有效量活性范围，代表性覆盖间充质干细胞和胚胎干细胞的应用应当是有效的。已经证实，维甲酸和巯基乙醇对间充质干细胞的扩增和诱导分化是有效的，应用于胚胎干细胞也显示出相同的作用，说明胚胎干细胞和间充质干细胞有相以的扩增潜能，本发明的卵细胞提取物对胚胎干细胞的扩增应用是可行的。
所述人或动物卵细胞提取物中的成份及含量尚未明确，但卵细胞浆对胚胎发育和干细胞生长是有调控作用的。已有报导证实卵细胞浆中含有潜在调节细胞生长与分化的因子，提取物中还含有丰富的蛋白质及相关因子，为干细胞扩增及诱导分化提供了理想的综合营养环境，可使干细胞数量大量扩增而保持其原有的细胞生物学特性，这一点在上述间充质干细胞扩增应用中已得到证实。本发明的卵细胞提取物与其它定向诱导因素，如定向诱导细胞提取物结合，在干细胞的诱导分化应用中，表现为维持干细胞生长的同时诱导其向定向细胞分化，这一点在上述间充质干细胞诱导分化为神经细胞应用中已得到证实。
经反复多次的实验，本发明的产品及应用技术，重复性和稳定性好。
现结合实施例对发明进一步阐述实施例1，卵细胞提取物的制备(1)取人或动物卵细胞10克，用生理盐水洗涤2-3次，加入等量的生理盐水备用；(2)组织匀浆或捣碎机在4℃条件下，1-3万转/分钟匀浆3-5次，每次1分钟；(3)将匀浆液置于-20℃冰箱冻存至完全冻结，一般24小时以上，然后在不高于42℃的条件下隔水彻底融化，如上条件反复冻融3-5次。按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；(4)在1-4℃的条件下自然沉降2-10小时，吸取上清液；(5)用3-4层无菌纱布过滤，去处沉渣和蛋白絮状物；(6)在4℃条件下，400-6008离心30分钟，取上清液(7)用过滤膜在正压或负压条件下过滤获得的上清液，截留大于20万以上分子量的大分子物质，使过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量低于20万道尔顿(Da)；(8)测定蛋白质浓度为20毫克/毫升，过滤除菌，用生理盐水稀释成10毫克/毫升浓度，-20℃冻存或无菌分装。
实施例2，间充质于细胞扩增试剂盒，卵细胞提取物蛋白10毫克/毫升每100毫升试剂盒各组份取用量(1)DMEM与F12混合培养基90毫升；(2)人体卵细胞提取物 10毫升；各组份独立包装。
试剂盒中可以有常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。
扩增方法1、间充质干细胞分离、纯化按常规方法从骨髓、脂肪等组织中分离获得单个核细胞，先进行细胞原代贴壁培养后用间充质干细胞的表面特异标志抗原进行正、负免疫筛选，获得纯间充质干细胞。若细胞数量足够，也可直接用分离获得的单个核细胞进行分离纯化。
2、如取10ml培养液，则取试剂盒中(1)9.8ml、(2)0.2ml，此为活性蛋白质含量20％，将试剂盒培养液与细胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下反复传代四代培养，连续观察细胞生长状况。显示扩增效率为1100倍。
3、诱导细胞鉴定间充质干细胞判定标准形态梭形，呈火焰状有规则排列生长。表面分子标志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。鉴定结果符合。
实施例3，间充质干细胞诱导分化为神经细胞试剂盒，卵细胞提取物蛋白10毫克/毫升神经细胞提取物蛋白10毫克/毫升每100毫升试剂盒各组份取用量(1)DMEM与F12混合培养基80毫升；(2)人体卵细胞提取物 10毫升；(3)神经细胞提取物 10毫升；各组份独立包装。
试剂盒中可以有常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。
诱导培养方法
1、间充质干细胞分离、纯化按常规方法从骨髓、脂肪等组织中分离获得单个核细胞，先进行细胞原代贴壁培养后用间充质干细胞的表面特异标志抗原进行正、负免疫筛选，获得纯间充质干细胞。若细胞数量足够，也可直接用分离获得的单个核细胞进行分离纯化。依据实验目的和细胞数量，先进行细胞扩增培养到所需数量或直接用本试剂进行诱导。
2、间充质干细胞贴壁培养将间充质干细胞用基础培养基稀释为1×105细胞/ml，按×104细胞/cm2密度接种到培养瓶(皿)中，按间充质干细胞体外扩增方法进行体外培养至细胞长满瓶壁，2/3以上细胞融合后进行诱导培养。间充质干细胞判定标准形态梭形，呈火焰状有规则排列生长。表面分子标志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。
3、诱导培养移出贴壁培养细胞后的培养液，用生理盐水洗1-2次，将上述量的细胞进行诱导，需试剂盒培养液总体积为10ML，则DMEM/F12培养基9ml，卵细胞提取物0.5毫升，神经细胞提取物0.5毫升，此10ml培养液中含两种细胞提取物蛋白质各5mg，活性蛋白质含量分别为50％。将试剂盒培养液与细胞的混合物置于37℃、5％CO2、85％湿度条件下培养，连续观察细胞生长状况。
4、诱导细胞鉴定(1)形态诱导前细胞呈长梭形，火焰状生长，有规则排列，细胞核大，胞浆成份相对少。培养3天左右，细胞逐渐变圆，然后伸出突起，形成多突起神经细胞样细胞。
(2)神经元细胞特异性抗原标志鉴定采用免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定。结果为神经元的特异标志物神经元特异性烯醇酶(NSE)、神经特异性核蛋白(NeuN)、中间神经丝(NFOm)、tau蛋白和一些微管蛋白(tubulinOβ、MAPO2、TuJO1)呈阳性反应。
(3)神经递质分析采用气/质谱分析，培养上清液中有多巴胺等神经递质产生。
(4)诱导率95％。
经多个实施例的扩增及诱导分化培养，均获得较满意的效果，显示出良好的重复性和稳定性。在干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞、肝细胞等的应用中同样是可行的。本发明的技术方案不受实施例的限制。
权利要求
1.一种人或动物卵细胞提取物，主要包括以下方法制取卵细胞原料收集→洗净→细胞匀浆→冻融→沉淀或过滤→取上清液→分离去除大于20万道尔顿(Da)以上分子量物质→蛋白浓度测定→活性测定→除菌→分装。
2.根据权利要求1所述的人或动物卵细胞提取物，其特征在于，主要包括以下方法制取(1)取人或动物卵细胞，用生理盐水洗涤2-3次；(2)在4℃以下，匀浆3-5次；(3)将匀浆液置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于隔水42℃的条件下彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；(4)在1-4℃条件下，去处沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；(5)获得的上清液，分离除去大于20万道尔顿(Da)以上分子量的大分子物质，使获得的过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量低于20万道尔顿(Da)；(6)将获得的过滤液除菌，蛋白含量测定，活性测定，于-20℃冻存或无菌分装，此为本发明的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的人或动物卵细胞提取物，其特征在于，步骤(1)的卵细胞中加入1-4倍生理盐水稀释备用。
4.根据权利要求2或3所述的人或动物卵细胞提取物，其特征在于，步骤(5)的分离方法是用过滤膜在正压或负压条件下过滤截留。
5.根据权利要求1或2所述的人或动物卵细胞提取物，其特征在于，所述动物是哺乳动物。
6.权利要求1的人或动物卵细胞提取物在体外干细胞扩增与诱导分化中应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是在间充质干细胞扩增与诱导分化中的应用或是在胚胎干细胞扩增中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述应用是在制备试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中基础培养基是DMEM与F12的混合培养基的应用。
全文摘要
本发明涉及人或动物卵细胞提取物及用于干细胞扩增与诱导分化，为干细胞扩增与诱导技术提供了新的试剂，是卵细胞原料收集→洗净→细胞匀浆→冻融→沉淀→取上清液→截留除杂→分装而得，应用是作为试剂或制成试剂盒中的应用，作为试剂在干细胞的扩增与诱导分化中应用显示出良好的扩增效率及诱导分化率。扩增及诱导分化的细胞可以用来移植治疗多种组织退行性变、组织细胞变性坏死、组织损伤或缺损等，在临床有很好的应用前景。
文档编号C12N5/06GK1563362SQ20041003318
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月3日 优先权日2004年4月3日
发明者潘兴华, 庞荣清, 李俊, 陆家海 申请人:成都军区昆明总医院, 潘兴华