专利名称：液－固两相发酵生产饲料用高活性纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全的高活性纤维素酶的制备方法，可做为饲料专用酶制剂，属于生物工程技术领域。
背景技术：
农作物秸秆数量巨大，每年各类秸秆有10亿吨，至今未能很好的利用，大量秸秆被焚烧，既造成环境污染，又极大的浪费了资源，因此，寻求秸秆高值生态化利用，是目前急待解决的问题。
作为可再生的生物质资源降解转化作用的主要酶种，纤维素酶长期受到科技界的高度重视，已开展了深入广泛的基础和应用研究。但研究多以降解纤维产糖、发酵生产能源和化工产品为主要目标。由于廉价石油和粮食的竞争，迟迟未能转入工业化生产。然而，近几年来，纤维素酶作为工业酶制剂已开始在纺织印染、制浆造纸、饲料加工、洗涤剂等行业中得到广泛的应用。例如作为酶整理剂，明显提高了棉麻织物质量，使产品高档化；用做废纸脱墨剂，改善了再生浆质量，减少了对环境的污染；用作饲料添加剂，增进了饲料的可消化性，提高了畜牧业效益等。从而使纤维素酶成为酶制剂工业中发展最快的新酶种之一，同时也有力地推动了上述产业的技术进步和产品的更新换代，产生巨大的经济效益和社会效益。
丝状真菌分泌的纤维素酶是包括内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖苷酶等多酶复合物，这多酶的协同，有利于完成纤维素的完全降解。对于饲料用酶，目的在于最大限度的消除饲料原料中的纤维素、半纤维素等抗营养因子的抗营养作用，提高饲料的可消化性，提高饲料利用率。因此，对于饲料纤维素酶的生产，除了开发高效的生产技术外，需要筛选或应用生物技术手段构建高产且内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全的工程菌株，开发饲料专用的纤维素酶制剂，以满足饲料生产的需要，最大限度的发挥作用。
由于纤维素酶需经纤维材料诱导而产生，又受葡萄糖等易代谢糖类的阻遏。国外纤维素酶生产主要采用纤维素粉或乳糖等作为碳源，补加蛋白胨、吐温80等高价辅料，并且采用液体深层发酵的方式生产。液体深层发酵，能耗高，发酵周期长，体积生产效率低，后处理工艺复杂，生产成本很高，并且发酵液易污染环境。相比之下，固体发酵技术，体积生产效率高，能耗低，后处理工艺简单，不污染环境，其难点在于发酵条件难于控制，易污染。国内已建成的十余家以固体发酵方式生产纤维素酶的发酵厂家都因技术工艺落后，均处于产酶不稳定、污染严重、生产不正常状态，不能形成工业化。因此，液固两相发酵生产纤维素酶的技术急需突破。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种液—固两相发酵生产饲料专用高活性纤维素酶的方法。
本发明利用玉米秸杆、麦秸农作物废弃物秸秆等廉价原料，利用高产内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全和高抗代谢物阻遏的木霉工程菌株，应用发酵工程、酶工程和生化工程技术，发酵生产并进一步提取制备高活性、高纯度的饲料用纤维素酶，应用于饲料行业，具有优良效果。
本发明的纤维素酶的制备方法步骤如下(1)采用高抗代谢物(葡萄糖)阻遏且内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全的康宁木霉(Trichoderma koningii V6)为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，灭菌，接种康宁木霉(Trichoderma koningii V6)生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备纤维素酶发酵培养物；(3)将发酵培养的纤维素酶发酵培养物加水浸泡，过滤，上清液为纤维素酶的提取液；(4)将纤维素酶提取液经浓缩，制得高活性的液体纤维素酶。将浓缩的纤维素酶经喷雾干燥，即得到高活性的粉状纤维素酶。
下面对本发明的纤维素酶的制备方法的各步骤具体说明如下(1)生产用液体菌种的制备。
培养基麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份和KH2PO40.03～0.04份，灭菌，冷却，接种康宁木霉(Trichoderma koningii V6)的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36小时，作为生产用液体种子待用。
(2)厚层通风发酵制备纤维素酶制剂培养物。
玉米秸粉和或小麦秸粉60～70份，麸皮30～40份，硫酸铵1～2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种接种步骤(1)的康宁木霉生产用液体菌种5～7份，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到纤维素酶的发酵物。所得发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)可达到500～700IU/g干曲。
(3)纤维素酶的提取上述纤维素酶的发酵培养物按1∶(9～11)的重量比加水浸泡10～13小时，过滤，过滤液即为纤维素酶的提取液。
(4)将上述滤液浓缩至原来体积的2/10～3/10，浓缩液经喷雾干燥制成高活性纤维素酶粉。酶活性可达到8000～10000IU/g干品(CMC酶活性)。
最后，经粉碎、质检、包装成品。
上述康宁木霉的二级液体菌种制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤A.斜面菌种(固体)将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶(3～6)重量比，80±1℃浸泡1小时，或煮沸半小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种康宁木霉，28～30℃培养。
B.二级菌种(液体)
培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～30℃下，摇床培养。
本发明选用的康宁木霉在含8～10％葡糖糖纤维素平板上，仍然具有分泌纤维素酶的能力，并且内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖糖苷酶酶谱全，从而满足饲料领域的应用要求。
本发明的优良效果在于选用高抗代谢物(葡萄糖)阻遏的高产纤维素酶且内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖糖苷酶酶谱全的木霉工程菌株，利用发酵工程技术、液-固两相发酵生产纤维素酶，发酵物酶活性可达到500～700IU/g干曲(CMC酶活)。纤维素酶发酵物经系列生化工程技术，制备高纯度的纤维素酶粉，活性可达到8000～10000IU/g干粉(CMC酶活)。农作物秸杆是储量巨大的农业废弃物资源之一，到目前为止，因为没有有效的资源化利用技术，使得这一资源的利用率很大，每年的大量秸杆被焚烧，不仅浪费了资源，而且对空气造成了严重的污染，成为我国目前亟待解决的问题。本发明在开发利用秸杆资源的的同时，无三废排出，避免秸杆焚烧对环境造成的严重污染，是一条农业废弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。
本发明采用抗降解物阻遏且内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全的木霉工程菌株，可在含废弃物的可溶性糖的培养基上快速生长，而又不受易代谢糖类对通常菌株所产酶的阻遏作用影响。使用这些工农业废液废渣制备培养基既降低了原料成本，又缩短了发酵周期。采用液固两相发酵技术，在温、湿气可控的无菌条件下发酵生产纤维素酶，提高了体积发酵效率，减少了污染，大大降低了运转成本。同时，该工程菌株分泌的纤维素酶，内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全，三类酶的协同作用，可高效消除饲料原料中粗纤维的抗营养作用，从而满足饲料领域对纤维素酶的要求，最大限度的发挥纤维素酶的作用。
具体实施方式
实施例1康宁木霉的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下A.斜面菌种(固体)将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶4重量比，80℃浸泡1小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖2份，琼脂1.5份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种康宁木霉(Trichoderma koningii V6)菌株，28～30℃培养。
B.二级菌种(液体)培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接上述斜面菌种的菌悬液4％重量百分比，28～30℃摇床培养。
实施例2纤维素酶的制备(1)生产用液体菌种的制备培养基麸皮10份、土豆5份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.5份、Na2HPO40.45份和KH2PO40.035份，灭菌，冷却，接种康宁木霉的二级液体菌种6份，通风搅拌，培养30小时，做为生产用液体菌种待用。
康宁木霉的二级液体菌种的制备如实施例1所述。
(2)厚层通风发酵制备纤维素酶制剂培养物原料玉米秸粉25份和小麦秸粉40份，麸皮40份，硫酸铵1份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种6份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24小时翻曲一次，发酵4天，即得到纤维素酶制剂培养物。
所得发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)700IU/g干曲。
(3)纤维素酶的提取上述纤维素酶的发酵培养物按1∶10的重量比加水浸泡12小时，过滤，过滤液即为纤维素酶的提取液。
(4)将上述滤液浓缩至原来体积的2/10，浓缩液经喷雾干燥制成高活性纤维素酶粉。酶活性9500IU/g干品(CMC酶活性)。
最后经粉碎、质检、包装成品。
实施例3纤维素酶的制备如实施例2所述，所不同的是(1)生产用液体菌种的制备培养基麸皮11份、土豆6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.6份、Na2HPO40.5份和KH2PO40.04份，灭菌，冷却，接种康宁木霉的二级液体菌种10份，通风搅拌，培养34小时，作为生产用液体菌种待用。
(2)厚层通风发酵制备纤维素酶制剂培养物原料小麦秸粉60份，麸皮35份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，25小时翻曲一次，发酵4.5天，即得到纤维素酶制剂培养物。所得发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)650IU/g干曲。
其他同实施例2。
实施例4纤维素酶的制备如实施例2所述，所不同的是步骤(2)厚层通风发酵制备纤维素酶制剂培养物原料玉米秸粉35份和小麦秸粉35份，麸皮30份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.9(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5.5份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，28小时翻曲一次，发酵5天，即得到纤维素酶制剂培养物。所得发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)600IU/g干曲。
实施例5纤维素酶的制备如实施例2所述，所不同的是步骤(3)纤维素酶的提取是将步骤(2)的纤维素酶制剂培养物按1∶11的重量比加水浸泡11小时，过滤，过滤液即为纤维素酶的提取液。
步骤(4)将上述滤液浓缩至原来体积的3/10，浓缩液经喷雾干燥制成高活性纤维素酶粉。酶活性8500IU/g干品(CMC酶活性)。
权利要求
1.纤维素酶的制备方法，步骤如下(1)采用高抗代谢物阻遏且内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖糖苷酶三类酶酶谱全的康宁木霉为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，灭菌，接种康宁木霉生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备纤维素酶发酵培养物；(3)将发酵培养的纤维素酶发酵培养物加水浸泡，过滤，上清液为纤维素酶的提取液；(4)将纤维素酶提取液经浓缩，制得高活性的液体纤维素酶，将浓缩的纤维素酶经喷雾干燥，即得到高活性的粉状纤维素酶。
2.如权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)生产用液体菌种的制备如下培养基麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均为重量份，煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份和KH2PO40.03～0.04份，均为重量份，灭菌，冷却，接种康宁木霉的二级液体菌种，5～10份，重量份，通风搅拌，培养24～36小时。
3.如权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)厚层通风发酵制备纤维素酶制剂培养物具体如下玉米秸粉和或小麦秸粉60～70份，麸皮30～40份，硫酸铵1～2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0，重量比，，灭菌，冷却，接种接种步骤(1)的康宁木霉生产用液体菌种5～7份，重量份，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天。
4.如权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中纤维素酶的发酵培养物加水浸泡，是按1∶9～11的重量比加水浸泡10～13小时。
5.如权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中滤液浓缩至原来体积的2/10～3/10。
全文摘要
液－固两相发酵生产饲料用高活性纤维素酶的方法，属于生物工程技术领域。选用高抗代谢物阻遏的高产纤维素酶且内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖糖苷酶酶谱全的康宁木霉工程菌株，利用体发酵工程技术、液－固两相发酵生产纤维素酶，发酵物酶活性可达到500～700IU/g干曲，纤维素酶发酵物经系列生化工程技术，制备高纯度的纤维素酶粉，活性可达到8000～10000IU/g干粉。应用于饲料行业。本发明在开发利用秸秆资源的的同时，无三废排出，避免秸秆焚烧对环境造成的严重污染。
文档编号C12N1/14GK1648244SQ200410036448
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月7日 优先权日2004年12月7日
发明者张玉忠, 孙彩云, 陈秀兰, 刘玉庆, 陈蕾蕾, 宋桂经 申请人:山东大学