专利名称：克雷伯杆菌利用甘油有氧发酵生产3－羟基丙醛的方法
技术领域：
本发明涉及3-羟基丙醛的生产方法，尤其是通过克雷伯杆菌Klebsiellapneumoniae DSM 2026在有氧条件下转化甘油生产3-羟基丙醛的方法。
背景技术：
3-羟基丙醛(3-HPA)在化学工业上具有很高的应用价值。它是一种有效的抗菌剂，可作为食品防腐剂或治疗辅助剂。它同时还是许多工业有机化合物如丙烯酸、丙烯醛、1，3-丙二醇等的前体。3-HPA经化学氧化可生成丙烯酸，丙烯酸目前一般是从石油加工中获得，可用于生产丙烯酸酯类、聚丙烯酸及其盐的重要聚合物单体。3-HPA加氢催化可生产1，3-丙二醇，1，3-丙二醇是生产新型聚酯(如PTT)、聚醚和聚亚氨酯的重要单体，PTT的生产和应用已成为当前国际上合成纤维开发的热点，其大规模生产将引发化纤产品结构的根本性调整。
目前，工业上主要通过环氧乙烷羰基合成或丙烯醛水合法生产3-羟基丙醛(3-HPA)，但是3-HPA稳定性差，合成后作为中间体必须随即参与下一步反应，迄今为止还没有商品化的3-HPA纯品。由于化学合成法生产3-HPA所用的催化剂体系复杂，制作工艺苛刻且不稳定，有些配位体有剧毒，合成工艺需高压，对设备要求较高，回收率又不高，加上所用的最初原料都是石油，在石油资源愈来愈贫乏、清洁生产呼声愈来愈响的今天，研究以可再生资源为原料、污染程度低的生物技术法生产3-HPA引起人们的高度重视。
1960年，Sobolov和Smiley首先报道了乳酸菌转化甘油生产3-HPA的代谢途径(甘油是葡萄糖酒精发酵或动植物脂肪加工的副产物，可视为可再生资源)，目前发现的能将甘油转化为3-HPA的微生物主要包括克雷伯杆菌、柠檬菌、肠细菌及梭状芽孢杆菌属等。在甘油转化为3-HPA的厌氧代谢途径中，甘油沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD+的甘油脱氢酶(GDH，EC 1.1.1.6)的作用下形成二羟基丙酮(DHA)，磷酸化后进入糖酵解途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B12为辅酶的甘油脱水酶(GDHt，EC 4.2.1.30)的作用下生成3-HPA，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR，EC 1.1.1.202)的作用下形成1，3-丙二醇，整个过程伴随着辅酶I的再生。由于3-HPA是细菌甘油代谢的中间产物，必须通过代谢调控手段使其胞外积累。Slininger等人在甘油中添加盐酸氨基脲，实现了3-HPA的胞外积累，但具体作用机理不详。
公告号为894140(公告日1990.10.9，专利号4,962,027，申请日1986.8.7)的美国专利公开了一种利用克雷伯杆菌，采用有氧发酵法生产3-羟基丙醛的方法，其采用的克雷伯杆菌为NRRLB-4011。
发明内容
本发明的目的是提供一种克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026利用甘油在有氧条件下发酵生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法。
本发明提供的克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026利用甘油有氧发酵生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，包括在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液发酵培养基中接种克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM2026，在有氧条件下生产3-羟基丙醛。
较优的生产方法，包括(1)将活化、保存的克雷伯杆菌Klebsiellapneumoniae DSM 2026按0.5-10％接种量接入种子培养基中，在温度30-40℃、有氧条件下，80-300r/min旋转培养10-40h，得到种子液；(2)将种子液离心分离，去上清液取菌体待用；(3)菌体按1-15g(细胞干重)/L接种量接入含有盐酸氨基脲10-60g/L和甘油10-100g/L的磷酸盐缓冲液发酵培养基中，在温度20-40℃和pH值5-9的条件下发酵5-30h，得到含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液。
上述3-羟基丙醛(3-HPA)生产方法中，其主要参数的最佳选择为种子液培养时间12h、菌体接种量2.16g/L、甘油含量30g/L、盐酸氨基脲含量26.8g/L、在温度28℃和pH值7.2的条件下发酵27h，得到含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液。经测定，其发酵液中3-HPA浓度达到15.48g/L，总得率和转化率分别为0.60g/g和75％。
本发明采用的克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026，属杆菌属，分类命名Klebsiella pneumoniae，本发明人于2001年8月从德国生物技术研究中心获得，其保藏号为DSM 2026。
本发明基于克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液培养基中有氧发酵，可实现3-羟基丙醛(3-HPA)转化的原理，对影响3-羟基丙醛(3-HPA)积累和稳定性的一些主要工艺参数，如菌种培养时间、接种量、甘油浓度、盐酸氨基脲浓度、培养温度和pH值等进行优化设计、试验，提供了一种以可再生资源为原料、污染程度低、高效的3-羟基丙醛(3-HPA)生物法生产技术。
具体实施例方式
利用克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026转化甘油有氧发酵制备3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，包括在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液发酵培养基中接种克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026，在有氧条件下生产3-羟基丙醛。
一种较佳的生产方法，包括(1)将250mL种子培养基(含甘油，20.0g/L；K2HPO4，3.4g/L；KH2PO4，1.3g/L；(NH4)2SO4，2.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；酵母浸膏，1.0g/L；CaCO3，2.0g/L；FeSO4·7H2O，5.0×10-3g/L；CaCl2，2.0×10-3g/L；微量元素，2.0g/L)置于500mL反应容器中，接入1mL经过活化、保存于LB培养基(含胰蛋白胨，10.0g/L；酵母浸膏，5.0g/L；NaCl，10.0g/L，pH7.0)的含克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026的菌液，在温度37℃、有氧条件下，120r/min旋转式摇床中培养12h，得到种子培养液。
(2)将种子培养液于温度1℃、8000r/min离心分离30min，去上清液取菌体待用。
(3)将一定量菌体悬浮于装有100mL发酵培养基(在100mM磷酸盐缓冲液中加入一定量的盐酸氨基脲和甘油)的250mL反应容器中，用新鲜配制的10M KOH调节pH值至7.2，在温度28℃下发酵27h，得到含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液。其中，菌体接种量、甘油含量以及盐酸氨基脲含量分别为2.16g(细胞干重)/L、30g/L和26.8g/L。
对上述生产过程的一些主要参数采用如下分析方法进行测定和计算(1)3-HPA含量的测定采用比色法测定。酸性条件下，3-HPA脱水生成丙烯醛，而丙烯醛与色氨酸试剂反应形成紫色复合物，该复合物在560nm处有最大吸收峰。由于3-HPA没有纯品，以丙烯醛替代作为标准品，因为1mol3-HPA脱水形成1mol丙烯醛。将D，L-色氨酸2.05g、浓盐酸4.17mL和甲苯2.5mL定容至1L蒸馏水中，即为色氨酸试剂。在大试管中，取3mL适当稀释的样品(含3-HPA的发酵液)与6mL浓盐酸、1.5mL色氨酸试剂混匀，40℃水浴恒温20min，560nm测定OD值。
(2)甘油含量的测定甘油含量测定采用改进的高碘酸钠氧化法。
(3)生物量测定采用细胞干重法测定。将克雷伯杆菌液进行系列稀释(OD620nm值在0.05～0.5之间)，在烘箱中105℃烘至恒重，称重，以菌体干重对光吸收作标准曲线。取适当稀释的克雷伯杆菌液样品620nm测吸光值，利用标准曲线转化为细胞干重浓度。
(4)3-HPA总得率和转化率计算3-HPA总得率(g/g)＝3-HPA浓度(g/L)/(甘油初始浓度(g/L)-甘油残留浓度(g/L))，理论上1mol甘油完全转化可以得到1mol 3-HPA，即1g甘油可以得到0.8g 3-HPA，因此，3-HPA转化率(％)＝3-HPA总得率(g/g)/0.8(g/g)×100％。
在最优化的生产条件下，即种子液培养时间12h、菌体接种量2.16g/L、甘油含量30g/L、盐酸氨基脲含量26.8g/L、在温度28℃和pH值7.2的条件下发酵27h，得到的含3-HPA的发酵液。经测定，发酵液中3-HPA浓度达到15.48g/L，总得率和转化率分别为0.60g/g和75％。
含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液经过相应的处理过程，即可得到3-羟基丙醛(3-HPA)。由于3-羟基丙醛(3-HPA)低温条件下比较稳定，将其在低于4℃的低温下保存。
权利要求
1.克雷伯杆菌利用甘油有氧发酵生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，包括在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液发酵培养基中接种克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026，在有氧条件下生产3-羟基丙醛，
2.根据权利要求1所述的生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，包括(1)将活化、保存的克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026按0.5-10％接种量接入种子培养基中，在温度30-40℃、有氧条件下，80-300r/min旋转培养10-40h，得到种子液；(2)将种子液离心分离，去上清液取菌体待用；(3)将菌体按1-15g(细胞干重)/L接种量接入含有盐酸氨基脲10-60g/L和甘油10-100g/L的磷酸盐缓冲液发酵培养基中，在温度20-40℃和pH值5-9的条件下发酵20-35h，得到含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液。
3.根据权利要求2所述的生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，优选的条件为种子液菌种培养时间12h、菌体接种量2.16g(细胞干重)/L、甘油含量30g/L、盐酸氨基脲含量26.8g/L、在温度28℃和pH值7.2的条件下发酵27h，得到含3-羟基丙醛(3-HPA)的发酵液。
4.根据权利要求2所述的生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，所述种子培养基含甘油，20.0g/L；K2HPO4，3.4g/L；KH2PO4，1.3g/L；(NH4)2SO4，2.0g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；酵母浸膏，1.0g/L；CaCO3，2.0g/L；FeSO4·7H2O，5.0×10-3g/L；CaCl2，2.0×10-3g/L；微量元素，2.0g/L。
5.根据权利要求2所述的生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026以菌液形式活化、保存于LB培养基中，所述LB培养基含胰蛋白胨，10.0g/L；酵母浸膏，5.0g/L；NaCl，10.0g/L，pH 7.0。
6.根据权利要求1、2所述的生产3-羟基丙醛(3-HPA)的方法，所述发酵培养基的制备方法为在磷酸盐缓冲液中加入适量的盐酸氨基脲和甘油。
全文摘要
本发明提供一种在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液发酵培养基中接种克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026，在有氧条件下生产3－羟基丙醛的方法。该生产方法优化的条件为种子液的培养时间12h、菌体接种量2.16g(细胞干重)/L、甘油含量30g/L、盐酸氨基脲含量26.8g/L、在温度28℃和pH值7.2的条件下发酵27h，得到含3－羟基丙醛(3－HPA)的发酵液。经测定，其发酵液中3－HPA浓度达到15.48g/L，总得率和转化率分别为0.60g/g和75％。
文档编号C12R1/22GK1778935SQ20041003637
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者方柏山, 陈宏文 申请人:华侨大学