专利名称：白菜育性相关基因bcmf1及其分离方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别地，涉及一种白菜育性相关基因BCMF1及其分离的方法。
背景技术：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表达上的差异，获得与重要农艺性状相关的标记探针。结合文库筛选、染色体步移、RACE技术等实验手段，能够得到与重要农艺性状相关的全长基因序列。本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brasscia campestris L.ssp.chinensis Makino var.communis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育两用系(A/B line)表达差异分析，发现可育株系与不育株系的表达差异主要存在于花药。配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF1，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜育性相关基因BCMF1及其分离方法。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF1具有SEQ ID No.1的序列。BCMF1的最大ORF从第76号碱基开始，1419号碱基终止，1344个碱基编码447个氨基酸。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF1的分离方法，包括以下步骤1、经过cDNA-AFLP对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行分析，在A17和T17引物组合中获得可育株系特异基因片段BCMF-A17T17；2、将差异片段BCMF-A17T17进行回收、克隆和测序；
3、根据BCMF-A17T17片段的序列，设计两条特异引物(SP1和SP2)与3’RACE锚定引物进行配合，获得与BCMF-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端序列。
4、回收SP2与5’RACE锚定引物的扩增条带，克隆并进行测序，获得与BCMF-A17T17片段相关基因的cDNA的5’末端序列。
5、将三次测序结果拼接，得到与白菜育性相关基因BCMF1的cDNA全长序列，基因全长为1682bp。
6、应用BLAST和DNAStar软件对BCMF1序列进行分析比较以及ORF及其氨基酸序列的确定。
7、根据BCMF1全长序列设计一对引物，在基因组DNA中扩增基因组全长序列，结果表明，BCMF1基因组全长在不育株系和可育株系中同时存在，而且二者的长度大致相等，约2kb。
本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜核不育两用系表达差异分析，同时配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF1，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
图1是BCMF1基因在不同发育时期、不同器官的表达分析图。
图2是以基因组DNA为模板扩增BCMF1全长图。
具体实施例方式
下面以白菜育性相关基因BCMF1的克隆为例详细说明本发明。
1.cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系的优化(1)预扩增退火温度的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增中退火温度分别设定50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 5个变温梯度。测序胶电泳结果表明，52～56℃带纹稳定。
(2)预扩增循环次数的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增分别进行15、18、21和24不同的循环次数，PCR产物取5μL，在1.8％琼脂糖胶上电泳，四种不同循环次数的PCR结果都能看到一条弥散的带，但是带的强弱不同。随着循环次数的增加，电泳条带的亮度提高。
预扩增产物稀释20倍作为模板进行选择性扩增，产物经测序胶电泳结果显示，随着循环次数的增加，电泳带的颜色加深。综合分析电泳结果，预扩增循环次数为15～21是较佳条件，均可获得稳定的电泳结果。
(3)cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系中Mg2+浓度的选择试验结果表明，Mg2+浓度2.0～2.8mM范围内，测序胶电泳结果都比较好。
综上所述，在后面的试验中，cDNA-AFLP预扩增退火温度确定为53℃，预扩增循环次为20个循环，预扩增和选择性扩增的PCR体系中Mg2+浓度为2.3mM。
2.cDNA-AFLP技术对白菜核不育两用系表达差异的分析(1)cDNA-AFLP技术分析育性相关基因在不同器官的表达差异首先，进行了125对引物对白菜核不育两用系小蕾的cDNA-AFLP分析，11对引物产生11条差异条带，其中可育小蕾中特有的差异条带为8条，不育小蕾中特有的为3条。
随后，对可育株系和不育株系的莲座期叶片、开花期叶片、花茎和花蕾不同部位基因的表达差异进行cDNA-AFLP的分析表明花蕾之间存在差异，发现有的条带只在可育花蕾中特异表达；莲座期叶片之间、开花期叶片之间和花茎之间无差异。
(2)可育株系与不育株系不同时期花蕾的cDNA-AFLP分析用22对引物对‘矮脚黄’白菜核不育两用系可育株系与不育株系的小蕾、中蕾、大蕾进行cDNA-AFLP分析，发现有4对引物在开花期产生5条差异条带；其中A17T17引物组合在可育株系中蕾和大蕾中产生表达特异条带；A8T10引物组合在可育株系中蕾中表达丰度高于不育株系，其余18对引物未发现差异条带。
(3)表达特异条带的Northern分析为了进一步验证cDNA-AFLP分析方法研究基因表达的可靠性，对A8T10引物组合中，可育中蕾表达丰度有差异的条带进行Northern验证，取可育株系和不育株系中蕾各20μg总RNA做Northern杂交。Northern杂交结果与cDNA-AFLP的结果一致，表明cDNA-AFLP技术研究植物雄性不育基因表达差异是可行的。
3.可育株系特异BCMF-A17T17基因片段的获得、回收与克隆用A17T17引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，发现可育株系的中蕾和大蕾中特异表达的一条带，在不育株系中未表达，而且在可育株系和不育株系的其它时期均未表达。将该基因片段命名为BCMF-A17T17。随后，用针尖将上述保存在的玻璃板上凝胶上BCMF-A17T17特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A17和T17。PCR产物电泳检测表明，该片段长度大约为300bp。克隆到T载体(pGEM-T Easy Vector，购自Promega公司)，将该重组质粒命名为pBCMF-A17T17。提取质粒，经酶切鉴定表明，BCMF-A17T17片段已重组到T载体中。
4.与BCMF-A17T17片段相关的基因的cDNA全长的获得(1)BCMF-A17T17测序为了进一步弄清该基因在花药发育中的功能，有必要分离该基因并测定其序列。为此将pBCMF-A17T17送上海博亚生物技术有限公司测序。测序结果该序列全长294bp，去掉引物序列，实际测到的该序列长度为258bp。序列经国际互联网(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences)BLAST查询表明，该序列与Caenorhabditis elegans cosmid Y64G10A的相似性较高，期望值Expect为0.006。其余基因与该基因的同源序列的长度小于24bp，期望值都大于0.06。根据网上搜索结果，未发现同源基因。
(2)与BCMF-A17T17片段相关基因的cDNA 3’末端的获得由于网上搜索没有发现同源基因，所以不能正确判断该基因的3’与5’末端以及正义链与反义链。但是对于正确设计RACE特异引物来说，可以根据cDNA-AFLP引物A17和T17的序列的方向，初步推定该基因的3’与5’末端。基于上述推定，以上面测序链假设为正义链，设计了该基因的RACE特异引物。序列真正的正义与反义链只能通过PCR扩增，产物测序后，才能确定链的方向。设计的两条特异引物分别为SP15’-CTG TTC CCC TGG AGT CTG ATGTA-3’；SP25’-ACT TCT ACA TCA GAC TCC AGG GG-3’。以3’RACE锚定引物分别与SP1和SP2组合，以反转录的可育中蕾双链cDNA为模板进行PCR扩增。3’RACE锚定引物(5’-AGG CCG AGG CGG CCG ACA TGT TTT-3’，双链cDNA合成试剂盒)与SP2的组合扩增出一条亮带，而3’RACE锚定引物与SP1组合未扩增出较亮的带；5’RACE锚定引物(5’-AAG CAG TGG TATCAA CGC AGA GT-3’，双链cDNA合成试剂盒)与SP1的组合扩增出一条约300 bp亮带，而5’RACE锚定引物与SP2未扩增出较亮的带。根据上述结果，可以初步推断该基因的方向。为进一步验证该基因的方向，回收较短3’末端条带，克隆到T载体，送上海博亚生物技术有限公司测序，得到与BCMF-A17T17片段相关基因的3’末端的序列。3’末端测序结果为320bp，基本符合电泳的结果；包含29个T的寡核苷酸序列，248个碱基重叠部分。说明这段序列就是其3’未端，但实际测出只有72个未知碱基。
(3)与BCMF-A17T17片段相关基因cDNA 5’末端的获得回收SP2与5’RACE锚定引物扩增得到的条带，并克隆到T载体上，送上海博亚生物技术有限公司测序，得到与BCMF-A17T17片段相关基因的cDNA5’末端的序列，长度为1423bp。
(4)与BCMF-A17T17片段相关的基因BCMF1的cDNA的全长序列的拼接及扩增将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A17T17片段相关基因的cDNA全长序列，基因全长为1682bp，我们将其命名为BCMF1基因。为得到BCMF1 cDNA全长序列，设计了一对引物，其序列为上述全长序列中划线部分加上酶切位点上游引物5’GAT GGA TCC AGG TCA TTC AAT TCA TTC C 3’(划线部分为BamH I酶切位点)；下游引物5’GCT TCT AGA GAT GTT AGC ATA TAGAAT GC 3’(划线部分为Xbar I酶切位点)。
5.基因组中BCMF1基因全长的获得利用上述扩增全序列的引物以两用系基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳结果表明，BCMF1基因组全长在不育株系和可育株系中同时存在，而且二者的长度大致相等，约2kb。由此表明该基因在不育株系和可育株系中都存在，只是在不育株系未表达。为了进一步验证这两个片段的序列相似性以及该基因的内含子外显子等特征，回收和克隆上述两个基因组全长序列，送上海博亚生物技术有限公司测序，得到可育株系BCMF1基因序列。可育株系BCMF1测序结果长度为2001个碱基，应减去酶切位点碱基6个和保护碱基3个，测序长度为1983bp。测序结果为可育株系与不育株系DNA碱基序列一致，因此，不育株系的测序结果未列出。由此说明该材料不育性状的的突变位点不在该处，可能在该基因的上游。
6.BCMF1基因序列分析(1)BCMF1基因DNA序列与cDNA序列的对比分析利用DNATools软件辅以人工分析，将BCMF1基因DNA序列与cDNA序列进行对比分析，结果表明，该基因DNA序列包含4个外显子和3个内含子。BCMF1基因的三个内含子基本符合植物内含子长度，约为50～150bp，除第二个内含子的起始两个密码子外，其余起始与终止双核苷酸为GT-AT；第二个内含子则以GG开始。
(2)BCMF1的ORF及其氨基酸序列的确定将得到的BCMF1全长cDNA序列利用DNAStar软件进行了ORF的分析和氨基酸序列的确定。BCMF1的最大ORF从第76号碱基开始，1419号碱基终止，1344个碱基编码447个氨基酸。
(3)BCMF1编码的蛋白质的基本特征分析 用DNAstar软件对BCMF1编码的蛋白质的基本特征进行了分析。结果表明，BCMF1编码蛋白质的分子量(Molecular Weight)为48121.53 Daltons；等电点(Isolectric Point)为9.102；pH7.0时的电荷为10.962；碱性氨基酸Strongly Basic(+)AminoAcids(K，R)59；酸性氨基酸Strongly Acidic(-)Amino Acids(D，E)48；疏水氨基酸Hydrophobic Amino Acids(A，I，L，F，W，V)121；极性氨基酸Polar Amino Acids(N，C，Q，S，T，Y)152。将BCMF1编码的蛋白序列通过PSORT服务器(www.psort.nibb.ac.jp/form2.html)对其定位预测，结果表明该基因位于包括细胞壁的胞外的概率为55.6％。
按照上述的操作步骤，即可以获得白菜育性相关基因BCMF1的全长序列图1示出了BCMF1基因在不同发育时期、不同器官的表达分析。1、3、5、7、9和11泳道分别为不育株系的莲座叶、花茎叶、花茎和小蕾、中蕾、大蕾；2、4、6、8、10和12泳道分别为可育株系的莲座叶、花茎叶、花茎和小蕾、中蕾、大蕾。
图2示出了以基因组DNA为模板扩增BCMF1全长。1为Marker；2为不育株系DNA为模板扩增的电泳结果；3为可育株系DNA为模板扩增的电泳结果；4为可育中蕾cDNA为模板扩增的电泳结果。
根据图1和图2可见，BCMF1的cDNA全长序列和基因组序列全长均能被扩增获得，而且BCMF1基因只在可育株系中蕾和大蕾花药中特异表达，由此确定该基因是与花药发育相关的基因。本发明将为人工创建不育材料提供物质条件。
白菜育性相关基因BCMF1的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的序列表<110>浙江大学<120>白菜育性相关基因BCMF1及其分离方法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1683<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>1gaggtcattc aattcattcc ttacaaacaa aaaaatataa ttttcttttt aaaaaaacaa 60aaagataaaa gaataatggc aagagttcat ctattgttat gcttcaccct tctatttgca120tctgtaaccc tttttgacgc gacttcagct tttctgaagc taaagccatc tttgcctcag180attgaagatc cgaagacggt gggtgatgtg gaaggctaca ctgttcaagt agtgatggta240tttgtggggg acctcgagaa agaatgtcct aaaacaagca aattcaaaat gttcttcgac300aaactcagag gatttgccaa gtatgtttgc ccactaaaaa catctggcaa aaaggatgat360gatgacttga aggccaaaga agcaggcatc ctcaaaacca ttgcctcttt tgctattgga420aggataaaga gggaaattca agaggagaaa caggaagcta tcgaaacctt taagtttatg480
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Ile Lys Asn Met Glu Glu Leu Asn Ala Ile Tyr Ala Lys Ile Val Ser370 375 380Gln Asn Gln Ser Lys Lys Gly Gly Ala Met Thr Cys Thr Pro Glu Gln385 390 395 400Arg Ser Arg Asp Tyr Asp Asp Asn His Gln Val Gly Thr Ser His Asn405 410 415Pro Val Arg Tyr Gly Cys Tyr Tyr Glu Tyr Asn Phe Asp Asn Tyr Phe420 425 430Tyr Phe Tyr Phe Tyr Ile Arg Leu Gln Gly Asn Ser Ala Gly Lys435 440 44权利要求
1.一种白菜育性相关基因BCMF1，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的序列。
2.一种权利要求1所述的白菜育性相关基因BCMF1的分离方法，其特征在于，包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A17T17基因片段的获得用A17/T17引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，发现可育株系的中蕾和大蕾中特异表达的一条带在不育株系的中蕾和大蕾中中未表达，而且在可育株系和不育株系的其它时期也未表达；将该片段命名为BCMF-A17T17。2)BCMF-A17T17基因片段的回收、克隆与测序用针尖将上述BCMF-A17T17特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A17和T17；PCR产物电泳检测表明，该片段长度大约为300bp；把该片段克隆到T载体，将该重组质粒命名为pBCMF-A17T17，提取质粒，经酶切鉴定，结果表明，BCMF-A17T17片段已重组到T载体上，测序得出该片段为294bp，具有SEQ IDNo.2的序列。3)与BCMF-A17T17片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得设计两条特异引物SP1和SP2，以3’RACE锚定引物分别与SP1和SP2组合，以反转录的可育中蕾双链cDNA为模板进行PCR扩增，得到与BCMF-A17T17片段相关基因的3’末端的具有SEQ ID No.3的序列。4)与BCMF-A17T17片段相关基因的cDNA的5’末端的获得回收SP2与5’RACE锚定引物的扩增条带，测序获得与BCMF-A17T17片段相关基因的5’末端的具有SEQ ID No.4的序列。5)与BCMF-A17T17片段相关的基因BCMF1的cDNA的全长序列的拼接将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A17T17片段相关基因的全长序列，基因全长为1682bp，我们将其命名为BCMF1基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。6)BCMF1的ORF及其氨基酸序列的确定通过BLAST分析比较，BCMF1基因cDNA全序列仅与拟南芥的At3g28980基因有较高的相似性，把得到的BCMF1全长cDNA序列利用DNAStar软件进行了ORF的分析和氨基酸序列的确定。7)BCMF1基因组DNA全长序列的PCR扩增为得到BCMF1全长序列，设计了一对引物，以两用系基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳结果表明，BCMF1基因组全长在不育株系和可育株系中同时存在，而且两者的长度相等，约2kb。由此表明该基因在不育株系和可育株系中都存在，只是在不育株系未表达。为了进一步验证这两个片段的序列相似性以及该基因的内含子外显子等特征，回收和克隆上述两个基因组全长序列，测序得到可育株系BCMF1具有SEQ ID No.5的序列。比较cDNA和基因组DNA的序列可知，BCMF1基因组序列中含有3个内含子。
3.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF1的分离方法，其特征在于，所述用DNAStar软件进行氨基酸序列的确定中，BCMF1的最大ORF从第76号碱基开始，1419号碱基终止，1344个碱基编码447个氨基酸，该肽链具有SEQ ID No.6的序列。
4.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF1的分离方法，其特征在于，所设计的两条特异引物为SP15’-CTG TTC CCC TGG AGT CTG ATG TA-3’和SP25’-ACT TCT ACA TCA GAC TCC AGG GG-3’。
5.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF1的分离方法，其特征在于，所设计的两条基因组特异引物，其序列为上游引物5’GAT GGA TCC AGGTCA TTC AAT TCA TTC C 3’，下游引物5’GCT TCT AGA_GAT GTT AGC ATA TAGAAT GC 3’。
全文摘要
本发明以“矮脚黄”白菜隐性雄性不育两用系为材料，采用cDNA－AFLP方法对白菜可育株系和不育株系的时空表达特征进行分析，分离与育性基因相关的差异表达基因，Northern杂交进一步验证其空间表达特征；通过RACE技术获得BCMF1的cDNA全长序列，并对全长序列进行生物信息学分析。该方法适用于所有等基因系或近等基因系的植物群体。
文档编号C12Q1/68GK1609219SQ20041005285
公开日2005年4月27日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者曹家树, 王永勤, 余小林, 叶纨芝, 向珣, 卢钢 申请人:浙江大学