专利名称：白菜育性相关基因bcmf2及其分离方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别地，涉及一种白菜育性相关基因BCMF2及其分离的方法。
背景技术：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表达上的差异，获得与重要农艺性状相关的标记探针。结合文库筛选、染色体步移、RACE技术等实验手段，能够得到与重要农艺性状相关的全长基因序列。本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brasscia campestris L.ssp.chinensis Makino var.commumis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育两用系(A/B line)表达差异分析，发现可育株系与不育株系的表达差异主要存在于花药。配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF2，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜育性相关基因BCMF2及其分离方法。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF2具有SEQ ID No.1的序列。BCMF2的最大ORF从第67号碱基开始，1329号碱基终止，1263个碱基编码420个氨基酸。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF2的分离方法，包括以下步骤1、经过cDNA-AFLP对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行分析，在A18和T16引物组合中获得可育株系特异基因片段BCMF-A18T16-1。
2、将差异片段BCMF-A18T16-1进行回收、克隆和测序。
3、根据BCMF-A18T16-1片段的序列，设计两条特异引物(SP1和SP2)与3’RACE锚定引物进行配合，获得与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA的3’末端序列。
4、回收SP2与5’RACE锚定引物的扩增条带，克隆并进行测序，获得与BCMF-A18T16-1片段相关基因的cDNA的5’末端序列。
5、将三次测序结果拼接，得到与白菜育性相关基因BCMF2的cDNA全长序列，基因全长为1263bp。
6、应用BLAST和DNAStar软件对BCMF2序列进行分析比较以及ORF及其氨基酸序列的确定。
本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜核不育两用系表达差异分析，同时配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF2，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
图1是BCMF2基因在不同发育时期、不同器官的表达分析图。
具体实施例方式
下面以白菜育性相关基因BCMF2的克隆为例详细说明本发明。
1.cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系的优化(1)预扩增退火温度的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增中退火温度分别设定变50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃5个温度梯。测序胶电泳结果表明，52～56℃条带稳定。
(2)预扩增循环次数的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增分别进行15、18、21和24不同的循环次数，PCR产物取5μL，在1.8％琼脂糖胶上电泳，四种不同循环次数的PCR结果都能看到一条弥散的带，但是带的强弱不同。随着循环次数的增加，电泳条带的亮度提高。
预扩增主物稀释20倍作为模板进行选择性扩增，产物经测序胶电泳结果显示，随着循环次数的增加，电泳带的颜色加深。综合分析电泳结果，预扩增循环次数为15～21较好，均可获得稳定的电泳结果。
(3)cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系中Mg2+浓度的选择试验结果表明，Mg2+浓度2.0～2.8mM范围内，测序胶电泳结果都比较好。
综上所述，在以后的试验中，cDNA-AFLP预扩增退火温度确定为53℃，预扩增循环次为20个循环，预扩增和选择性扩增的PCR体系中Mg2+浓度为2.3mM。
2.与BCMF-A18T16-1片段相关的基因在不同发育时期、不同器官的表达分析以cDNA-AFLP分析得到的差异表达BCMF-A18T16-1片段为探针，与‘矮脚黄’白菜两用系可育株系和不育株系的莲座叶、花茎叶、花茎和小蕾、中蕾、大蕾总RNA进行Northern杂交。结果表明，该片段相关基因只在可育中蕾和可育大蕾中有较强的杂交信号，大蕾的杂交信号强于中蕾，其它不同时期和不同部位未发现杂交信号；不育株系不同发育时期、不同发育器官未发现杂交信号。说明与BCMF-A18T16-1片段相关的基因只在可育株系中蕾和大蕾花药中特异表达。
3.与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA全长的获得(1)BCMF-A18T16-1的克隆测序 将BCMF-A18T16-1片段克隆至T载体(pGEM-T Easy Vector，购自Promega公司)，随后把重组质粒p BCMF-A18T16-1克隆送上海博亚生物技术有限公司进行测序，测序结果表明，其长度为303bp，去掉划横线的cDNA-AFLP引物部分，实际测得序列长度为268bp。
(2)与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得 根据测序结果及网上同源比较结果，设计了3’RACE特异引物SP1和SP2，其序列为SP15’-CAT GGC TCC AAG TGT GTG CCA GTC C-3’；SP25’-CCCTAA AGG AGA TTT CTT GGC T-3’。其中，SP1引物最后一个碱基与SP2引物的第一个碱基相差20个碱基。以可育大蕾双链BCMF-A18T16-1cDNA为模板，与3’RACE锚定引物(5’-AGG CCG AGG CGG CCG ACA TGT TTT-3’，双链cDNA合成试剂盒)进行嵌套式PCR扩增，电泳结果表明，第二次产物分子量略小于第一，第二次PCR产物的长度约为1200bp。回收3’RACE第二次PCR的电泳条带，克隆到T载体，送上海博亚生物技术有限公司测序。测序结果如图3。与BCMF-A18T16-1片段相关的基因3’端序列的长度是1177bp，去掉引物序列，实际扩增到1157bp，符合电泳结果；末尾有27个A的寡聚核苷酸序列。由此证明扩增的3’末端是正确的。
(3)与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA的5’末端的获得 根据BCMF-A18T16-1片段设计5’RACE的特异引物SP3和SP4，其序列如下SP35’-CAC ACT TGG AGC CAT GTG TTT AGA A-3’；SP45’-CAC CGA GATATT CAC CAT TAG C-3’。其中，SP3引物最后一个碱基与SP4第一个碱基相差105个碱基。与5’RACE锚定引物(5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3’，双链cDNA合成试剂盒)进行嵌套式PCR扩增。将扩增的长片段回收连接到T载体上，送上海博亚生物技术有限公司测序。测序结果表明，与BCMF-A18T16-1相关基因的5’端长度为193bp。减去特异引物，测序的实际长度为173bp。
(4)与BCMF-A18T16-1片段相关的基因(BCMF2)的cDNA的全长序列的拼接 对上述三测序结果的测序结果拼接，与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA的全长序列为1485bp，我们将其命名为BCMF2基因。
4.BCMF2基因的cDNA全长序列的分析经国际互联网搜索，BCMF2基因cDNA全序列与拟南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA序列相似性最高，为83％。
利用DNA Star软件对BCMF2基因ORF进行分析，发现该基因最大ORF为1263bp，起始密码子ATG位于第67位，终止密码子为TAA，位于第1329位。ATG上游-3、-2和-1位核苷酸分别为A、C和C，+4位为核苷酸为G，这是一个典型的Kozak结构。这一结构对于蛋白质合成的40S起始复合物正确识别启始密码子具有很重要的作用。将ORF翻译成氨基酸，编码420个氨基酸且具有SEQ ID No.5的序列。经国际互联网比较，BCMF2基因编码的蛋白质的氨基酸序列与拟南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA编码的蛋白质的氨基酸序列的相似性最高，为79％。
按照上述的操作步骤，即可以获得白菜育性相关基因BCMF2的全长序列。
图1示出了BCMF2基因在不同发育时期、不同器官的表达分析。1、3、5、7、9和11泳道分别为不育株系的莲座叶、花茎叶、花茎和小蕾、中蕾、大蕾；2、4、6、8、10和12泳道分别为可育株系的莲座叶、花茎叶、花茎和小蕾、中蕾、大蕾。
根据附图1可见，BCMF2基因只在可育株系中蕾和大蕾花药中特异表达，由此确定该基因是与花药发育相关的基因。本发明将为人工创建不育材料提供物质条件。
白菜育性相关基因BCMF2的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5的序列表<110>浙江大学<120>白菜育性相关基因BCMF2及其分离方法<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1485<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>1gacttttaaa tttgtcaaca catctttaaa agaagaaaaa agcaaaaata aaaagatatt 60atcaccatgg ctggcgcaag aagtttggtc aaggcaaatc atactaatgt aggctcatta 120attttaatgg ccttggtgtt tggttcttgc gtagctaatg gtgaatatct cggtggccgc 180cgtggccttg ccgctgttgc cggcaaccct acggtctttg atattactaa gaatggagca 240gtgggaaatg gtgccaccga ttcttccaag gcgtttctaa acacatggct ccaagtgtgt 300gccagtcctg taccagcaac gctactagtc cctaaaggag atttcttggc tggtccagta 360atttttgctg gtccatgcaa gagcaaagtg accgtcgaag ttcagggcac aatcatcgct 420ccaccaagcg gatacccgac tcctgaatgg ttcttattcg aacatgtcga taatgtcgtc 480
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<400>5
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Val Thr Cys Gly Pro Gly His Gly Leu Ser Val Gly Ser Leu Gly Lys260 265 270Thr Pro Asn Glu Glu Asn Val Ala Gly Ile His Phe Arg Asn Cys Thr275 280 285Met Lys Asp Thr Asp Asn Gly Leu Arg Ile Lys Ser Trp Gly Gly Ser290 295 300Ser Pro Ser Thr Ala Val Asp Ile Thr Thr Glu Asp Ile Met Met Thr305 310 315 320Asn Val Lys Asn Pro Ile Ile Ile Asp Gln Asn Thr Gly Ser Arg Gly325 330 335Gly Asp Ser Lys Val Ala Ile Ser Asn Val Leu Phe Lys Asn Val Arg340 345 350Gly Thr Thr Ile Thr Lys Asp Glu Val Gln Phe Met Cys Ser Lys Ser355 360 365Val Pro Cys Lys Gly Val Ser Val Val Asp Val Glu Leu Asn Phe Val370 375 380Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Ser Ser Ser Gly Gly Leu Val Gly Ala385 390 395 400Leu Cys Thr Asn Ala Asn Val Ile Phe Gly Gly Lys Leu Ser Phe Pro405 410 415Leu Cys Pro Lys420
权利要求
1.一种白菜育性相关基因BCMF2，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的序列。
2.一种白菜育性相关基因BCMF2的分离方法，其特征在于，包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A18T16-1基因片段的获得用A18/T16引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，发现可育株系的中蕾和大蕾中特异表达的一条带在不育株系的中蕾和大蕾中中未表达，而且在可育株系和不育株系的其它时期也未表达；将该基因片段命名为BCMF-A18T16-1。2)BCMF-A18T16-1基因片段的回收、克隆与测序用针尖将上述BCMF-A18T16特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A18和T16；PCR产物电泳检测表明，该片段长度大约为300bp；克隆到T载体，将该重组质粒命名为pBCMF-A18T16-1；提取质粒，经酶切鉴定，结果表明，BCMF-A18T16-1片段已重组到T载体上，测序得出该片段为303bp，具有SEQ ID No.2的序列。3)与BCMF-A18T16-1片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得设计3’RACE特异引物SP1和SP2。SP1引物最后一个碱基与SP2引物的第一个碱基相差20个碱基。以可育大蕾双链cDNA为模板，以3’RACE锚定引物分别与SP1和SP2组合进行嵌套式PCR扩增，电泳结果表明，第二次产物分子量略小于第一，第二次PCR产物的长度约为1200bp。回收3’RACE第二次PCR的电泳条带，克隆到T载体，送上海博亚生物技术有限公司测序。与BCMF-A18T16-1片段相关的基因3’端序列的长度是1177bp，去掉引物序列，实际扩增到1157bp，符合电泳结果；末尾有27个A的寡聚核苷酸序列。具体序列见SEQ ID.3。4)与BCMF-A18T16-1片段相关基因的cDNA的5’末端的获得设计5’RACE的特异引物SP3和SP4，SP3引物最后一个碱基与SP4第一个碱基相差105个碱基。与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，测序获得与BCMF-A18T16片段相关基因的5’末端的具有SEQ ID No.4的序列。5)与BCMF-A18T16-1片段相关的基因BCMF2的cDNA的全长序列的拼接将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A18T16-1片段相关基因的全长序列，基因全长为1485bp，我们将其命名为BCMF2基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列。6)BCMF2的ORF及其氨基酸序列的确定通过BLAST分析比较，BCMF2基因cDNA全序列与拟南芥多聚半乳糖醛酸酶mRNA序列相似性高达83％，将得到的BCMF2全长cDNA序列利用DNAStar软件进行了ORF的分析和氨基酸序列的确定。发现该基因最大的ORF为1263bp，起始密码子ATG位于第67位，终止密码子为TAA，位于第1329位。ATG上游-3、-2和-1位核苷酸分别为A、C和C，+4位为核苷酸为G，这是一个典型的Kozak结构，这一结构对于蛋白质合成的40S起始复合物正确识别启始密码子具有很重要的作用。该ORF可以编码420个氨基酸且具有SEQ ID No.5的序列。
3.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF2的分离方法，其特征在于，所述用DNAStar软件进行氨基酸序列的确定中，BCMF2的最大ORF从第67号碱基开始，1329号碱基终止，1263碱基编码420个氨基酸且具有SEQ IDNo.5的序列。
4.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF2的分离方法，其特征在于，所设计的两条3’RACE嵌套式特异引物为SP15’-CAT GGC TCC AAG TGTGTG CCA GTC C-3’和SP25’-CCC TAA AGG AGA TTT CTT GGC T-3’。
5.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF2的分离方法，其特征在于，所设计的两条5’RACE嵌套式特异引物SP35’-CAC ACT TGG AGC CATGTG TTT AGA A-3’和SP45’-CAC CGA GAT ATT CAC CAT TAG C-3’。
全文摘要
本发明以“矮脚黄”白菜隐性雄性不育两用系为材料，采用cDNA－AFLP方法对白菜可育株系和不育株系的时空表达特征进行分析，分离与育性基因相关的差异表达基因，Northern杂交进一步验证其空间表达特征；通过RACE技术获得BCMF2的cDNA全长序列，并对全长序列进行生物信息学分析。该方法适用于所有等基因系或近等基因系的植物群体，将为人工创建不育材料提供物质条件。
文档编号C12Q1/68GK1587413SQ20041005285
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者曹家树, 王永勤, 余小林, 叶纨芝, 向珣, 卢钢 申请人:浙江大学