一种新的人分泌蛋白hCGI－143的制作方法

专利名称：一种新的人分泌蛋白hCGI－143的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程学、肿瘤学、细胞生物学领域。具体地，本发明涉及一种新的分泌蛋白hCGI-143蛋白及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
背景技术：
分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，对多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。人体中分泌蛋白占人类蛋白质组的十分之一，它们参与了信号途径、血液凝固、免疫防御、癌症发生等多种过程，如消化酶、胞外基质与血浆中的很多主要因子，以及激素、神经肽、细胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潜在的临床应用价值，并已在实际上得到了广泛的应用，如生长激素、干扰素和白细胞介素等。
分泌蛋白是由信号肽(signal peptide)介导，进入内质网，然后分泌到细胞外。蛋白质分子中的信号肽研究开始于20世纪60年代，这方面的工作是在研究分泌蛋白的基础上进行的，当时的研究旨在了解，在核糖体上合成的新生肽链是通过何种途径被分泌到细胞外的。德裔美国科学家布洛贝尔(G.Blobel)，因对蛋白质分子中信号肽的开创性研究，获得了1999年度诺贝尔生理学或医学奖。
分泌蛋白区别于其他胞质蛋白的唯一共同的特征就是氨基末端信号肽序列。信号肽在各个蛋白中都不相同，但有一些较类似的性质。起始的甲硫氨酸后是一些多为亲水的带正电荷的残基，该区为n区，然后是7-15个残基的疏水区h区，该区富含亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸，最后的c区包含信号肽蛋白酶的剪切位点。在剪切位点的-1和-3多为倾向为丙氨酸或其他带短侧链的氨基酸，而在-4和-6位则为有助于剪切的脯氨酸。因此针对信号肽发展了许多遗传算法来进行信号肽的分析预测。预测信号肽和蛋白质结构域近年来得到迅猛发展，这极大地归功于机器学习方法的改善和更多的序列信息来训练这些算法。这其中比较有效的模型就是神经网络模型和隐藏的马科夫模型。
SignalP是目前最有效的预测信号肽和剪切位点的方法。该软件综合了神经网络模型和隐藏的马科夫模型，前者预测是否含信号肽蛋白，后者预测剪切位点。通过大量的序列样本进行训练(非同源的原核生物蛋白266个革兰氏阴性菌序列，141个革兰氏阳性菌序列；真核生物蛋白1011个非同源蛋白序列)，得到较高的准确性，真核生物准确性为78％，原核生物为89％。
分泌蛋白约占人类蛋白质组的十分之一，是一类功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导等过程中发挥着重要作用。发现与研究新分泌蛋白是目前功能基因组学研究的热点之一。
用SignalP2.0对人蛋白数据库进行信号肽预测，结合pSORT分析，初步确定候选基因。RT-PCR获得目的基因，构建到真核表达载体中使其表达，WESTERN BLOT验证生物信息学分析结果，确定基因是否表达分泌蛋白。
通过上述生物信息学预测与实验验证结合的方法，获得了1个新分泌蛋白hCGI-143。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的人分泌蛋白hCGI-143；本发明的另一目的在于提供了上述新的人分泌蛋白hCGI-143的制备方法；本发明的再一目的在于提供了与上述新的人分泌蛋白hCGI-143特异结合的抗体。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的本发明公开了一种分离的人分泌蛋白hCGI-143，所述分泌蛋白包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。优选的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本发明还公开了一种制备上述的分离的人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤(a)将编码具有人分泌蛋白hCGI-143活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hCGI-143蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸102-515位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hCGI-143蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hCGI-143蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hCGI-143蛋白活性的多肽。
优选的，上述步骤(a)中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸102-515位的核苷酸。
本发明还公开了能与权利要求1所述的人分泌蛋白hCGI-143多肽特异性结合的抗体。
本发明的分泌蛋白hCGI-143是一种功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。该分泌蛋白具有潜在的临床应用价值。


图1是本发明实施例1的SignalP2.0软件分析SignalP-NN结果图像；图2是本发明实施例1的SignalP2.0软件分析SignalP-HMM结果图像；图3是本发明实施例1的hCGI-143基因及蛋白结构示意图；图4是本发明实施例1的10个代表性的物种的CGI-143基因序列比对结果图；图5是本发明实施例1的CGI-143基因进化树分析结果图；图6是本发明实施例1的人hCGI-143与小鼠、大鼠同源基因比较结果图；图7是本发明实施例2的hCGI-143基因琼脂糖凝胶电泳图；图8是本发明实施例2的Western blotting验证hCGI-143基因的分泌特性结果图；图9是本发明实施例3搜索genecard网站得到的hCGI-143芯片杂交的表达谱；图10是本发明实施例3搜索genecard网站得到的hCGI-143电子Northern表达谱；图11是本发明实施例3的人类多组织RNA印迹膜对hCGI-143基因的组织分布结果图；图12是本发明实施例4的免疫荧光显示hCGI-143蛋白在细胞中的分布图像；图13是本发明实施例4的hCGI-143蛋白分泌途径的荧光共定位分析结果图；图14是本发明实施例5的蛋白电泳结果图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1hCGI-143基因生物信息学分析1.序列相似性比对及进化树分析，采用软件Alignment，GeneDoc，Treeview。
信号肽、穿膜区域预测、亚细胞定位分析分别采用网上的共享web软件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUI http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能结构域和基元(motif)预测，采用了PROSITE http//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html，ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修饰位点分析采用了http//au.expasy.org/tools/。
结果hCGI-143蛋白(NP_057158)在基因组上定位于1q21.2上，由137个氨基酸组成，分子量为14289Da，成熟mRNA共903碱基(见SEQ ID NO.1)。
2.利用SignalP2.0软件分析该蛋白疏水性，根据结果，该蛋白N端序列为信号肽的可能性为99.5％。信号肽剪切位点最可能是20位和21之间。软件分析的图像结果见图1、图2，软件分析的数据结果如下SignalP-NN result#data> length＝70#Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 35 0.477 0.33 YESmax. Y 21 0.442 0.32 YESmax. S 6 0.947 0.82 YESmean S 1-200.787 0.47 YES#Most likely cleavage site between pos.20 and 21CLC-QGSignalP-HMM result#data>#PredictionSignal peptideSignal peptide probability0.995Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.345 between pos.20 and 213.从SOSUIsignal Result的结果来看，hCGI-143的N端有一段长20个氨基酸的信号肽段，没有穿膜区域。PSORT软件分析预测hCGI-143的分布为44.4％位于细胞外(包括细胞壁)，22.2％位于内质网，11.1％位于高尔基体中。11.1％位于液泡，11.1％位于核内。
4.对hCGI-143基因成熟mRNA(903bp)BLAST人基因组序列得到基因在基因组上的分布，如图3A所示基因只有1个外显子，在5’UTR中间有一个内含子，共跨越1,170bp。hCGI-143蛋白结构简单(图3B)，N端1-20aa为信号肽区域，39-104aa为BolA结构域。
5.用PROSITE http//us.expasy.org/prosite/分析HCGI-143，发现了以下修饰位点，如表1表1

6.以hCGI-143的蛋白序列在NCBI的nr数据库中进行序列同源性搜索，得到100条有同源性的基因，选取有10个代表性的物种的同源性较高的基因，进行序列比对，结果见图4和表2。采用Alignment与GeneDoc软件处理。同源区域主要在BolA结构域。
表2

7.进化树分析Treeview软件读取Alignment分析的数据得到结果如图5。
人、小鼠、大鼠基因与果蝇、疟蚊较为接近，与拟南芥、酵母、血吸虫、线虫、及大肠杆菌基因进化关系较远。酵母ScCGI-143蛋白是可能的DNA修复蛋白；线虫CeCGI-143基因的RNAi结果仍是野生型，没有明显的表型变化；大肠杆菌EcCGI-143蛋白可能通过参与调节胞壁质基因表达改变大肠杆菌形态Santos JM，Freire P，Vicente M，Arraiano CM.Thestationary-phase morphogene bolA from Escherichia coli is induced by stress during early stages ofgrowth.Mol Microbiol.1999 May；32(4)789-98.Induction of a growth-phase-dependent promotertriggers transcription of bolA，an Escherichia coli morphogene.EMBO J.1989 Dec1；8(12)3923-31.。所以在GO分类中把有BolA结构域蛋白的功能归到转录调节方面。
人hCGI-143与小鼠、大鼠同源基因比较见图6，同源性很高，人与小鼠和大鼠基因的主要区别在N端的信号肽区域，SignalP预测结果显示小鼠和大鼠的hCGI-143同源基因没有信号肽，PSORT预测小鼠基因亚细胞分布为52.2％线粒体(mitochondrial)，39.1％细胞核(nuclear)，4.3％细胞骨架(cytoskeletal)，4.3％细胞质(cytoplasmic)；预测大鼠基因亚细胞分布为52.2％细胞质(cytoplasmic)，13.0％细胞核(nuclear)，8.7％线粒体(mitochondrial)，4.3％胞外(extracellular)，，包括细胞壁(cell wall)，4.3％细胞骨架(cytoskeletal)，4.3％空泡(vacuolar)，4.3％高尔基体(Golgi)，4.3％分泌系统的囊泡(vesicles of secretory system)，4.3％内质网(endoplasmic reticulum)。
表明虽然人与小鼠和大鼠的序列同源性达82％，但表达蛋白的亚细胞定位可能不同，也暗示着蛋白功能的不同。
实施例21.人hCGI-143基因的克隆和pcDNA3.1A-hCGI-143真核载体的构建1.1设计引物hCGI-143-pCDNA3.1A-FGGGCTCGAGATGCTGAGTGGGCGGCT(SEQ ID NO.3)(含Xho1限制性内切酶切点)hCGI-143-pCDNA3.1A-RGCGAATTCGGGGGTTCCTAGAGTTTTCTTG(SEQ ID NO.4)(含Ecor1限制性内切酶切点)1.2PCR反应成分 体积模板 0.4ul10×Buffer 1.0ul正向引物(10pmol/ul) 0.5ul反向引物(10pmol/ul) 0.5uldNTP Mix(10mM of each dNTP) 0.2ul
Pfu DNA聚合酶(5U/ul)0.1uldd H2O 7.3ul总体积 10ul从自制的人脑cDNA库中PCR获得hCGI-143的全长ORF片段。2％琼脂糖凝胶电泳图如图7。PCR条件94℃ 4min；94℃ 40s，60℃ 45s，72℃ 50min，35 cycle；72℃ 7min。
1.3Xho1 & Ecor1双酶切PCR产物、质粒成分体积纯化PCR产物(1ug)/质粒 5ul10×Buffer 21ulXho1(10U/ul)0.5ulEcor1(10U/ul) 0.5uldd H2O 3ul总体积 10ul37℃酶切4hr，70℃热失活 15min1.4连接成分体积片段双酶切产物(50ng/ul) 3ul载体双酶切产物(400ng/ul)0.3ul10×ligase Buffer 0.5ulT4DNAligase(6U/ul) 0.5uldd H2O 0.7ul总体积 5ul16℃连接 16hr。
1.5电转化以参数电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω进行电转化，将1μl连接产物转化至感受态细胞中，37℃，250rpm于LB培养液中振荡培养1hr，涂平板1.6菌落PCR鉴定在长有菌落的LB(Amp)平板上分别挑取多个菌落作PCR鉴定，PCR反应体系与上述PCR的体系相同。
1.7质粒提取将经PCR鉴定阳性克隆质粒hCGI-143-pcDNA3.1，采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)试剂盒抽提。所得质粒经核酸测序验证插入片段正确(由申友公司完成)。
2.Western blotting验证hCGI-143基因的分泌特性2.1转染真核细胞1)铺细胞预热DMEM(无血清，无抗生素)培养基和胰酶(0.1％trypsin)，37℃；CHO细胞接种密度是1-1.5×105/35mm培养皿；37℃，5％CO2培养5-24小时，使细胞贴壁；2)铺转染A质粒用量1～2ug，+100ul DMEM(无血清，无抗生素)，混匀；B脂质体Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(无血清，无抗生素)，混匀；A+B，混匀，室温静置15-45min，一般30min；培养细胞去上清，用DMEM(无血清，无抗生素)洗一次，加800ul DMEM(无血清，无抗生素)，滴入转染混合液，摇匀；如细胞贴壁性不好或不耐受无血清培养液，可用完全培养基；37℃，5％CO2培养5-24小时，换液为DMEM(10％FCS)，继续培养至总转染时间为48-72小时。
2.2Western Blotting1)样品处理上清处理收集细胞培养盘中的上清，13000rpm，8min。收集离心上清，取200ul纯化。
细胞处理用PBS(pH7.4)2ml洗盘中细胞两次，加200ul裂解缓冲液，冰上20分钟裂解。然后刮下细胞，将裂解液于4℃离心12000rpm，8min，回收上清，进行纯化。
TALON树脂预处理将1体积的TALON树脂贮存液于5000rpm离心5分钟，去上清，用1×E/W缓冲液洗两次，然后加等体积的1×E/W缓冲液得到50％的树脂混合液。
样品纯化在样品中加入适量的预处理过的50％Slurry，加入800ul1×E/W缓冲液，4℃结合2小时。8000rpm离心5分钟去上清，用1×E/W缓冲液洗3-4次，去除非特异结合的蛋白。
2)蛋白电泳及转膜常规蛋白电泳分离样品；15％分离胶，60V 30min，160V 1hr20min。
PVDF膜用甲醇浸湿10min，去离子水冲洗，再转移到转移缓冲液中平衡20分钟；电泳胶置转移缓冲液中平衡20分钟；厚纸垫板也置于转移缓冲液中平衡。
按下列顺序放置转膜仪负极—垫板—电泳胶—PVDF膜—垫板—正极。
转膜半小时，电压15伏。
3)膜的封闭3％脱脂牛奶&2％BSA/PBST 50ml，水平摇床，室温封闭4小时；也可以先室温封闭若干时间，再放入4℃冰箱，过夜；4)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封闭液稀释一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀释倍数1000倍；将膜完全没于一抗稀释液中。水平摇床，室温2小时，也可过夜。
5)洗涤先用PBST短暂地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗10分钟；3*10分钟，室温洗涤；6)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封闭液稀释二抗，10000倍稀释；水平摇床，室温2小时；7)洗涤先用PBST短暂地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗10分钟；3*10分钟，室温洗涤；8)检测将检测试剂(ECL plus)从4℃取出，在打开前平衡至室温；将检测试剂的A液与B液以40∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1ml/cm2；膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面；室温2分钟；用镊子夹起PVDF膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂；膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间10秒；先用10秒时间多压几张，再延长时间压一张或几张，延长时间压片的时候，洗最先压的片子。结果见图8。
实施例3人hCGI-143基因的组织表达谱1.电子Northern表达谱搜索genecard网站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，分别得到hCGI-143芯片杂交的表达谱与电子Northern表达谱，见图9与图10。
搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，得到unigene的表达信息。
结果表明hCGI-143在新生胎儿的胰腺中高量表达。
2.Northern印迹材料和试剂随机引物标记试剂盒(random primer DNA labeling kit)购自宝生物工程(大连)有限公司)人类多组织RNA印迹膜和快速杂交液(ExpressHyb hybridization solution)均购自Clontech公司20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g柠檬酸钠88.23g，同位素P32购自PE公司。
洗膜溶液I(wash solution I)2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000ml洗膜溶液II(wash solution II)0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml方法步骤(1)杂交膜的预处理(第一次所用的膜不需要这样的高温去探针处理，第二、三次再用同一块膜时才用此法，第一次仅用膜于2×SSC浸泡10分钟)在0.5％SDS溶液中处理印迹膜100℃10min，从加热炉上取下来，室温冷却10min。
(2)预杂交(prehybridization)68℃预热ExpressHyb solution。
将膜放入2×SSC中，浸泡10分钟左右。把湿润好的膜贴杂交管管壁轻轻移入，避免产生气泡。
变性sperm DNA(100℃水浴5min，立即放入冰中，5min)。5ml ExpressHyb+50μl spermDNA于15ml管子中充分混匀，然后再倒入杂交管中。
杂交炉中，68℃，10rpm/min，大于2小时。
(3)标记探针(labeling primer)探针是cDNA，PCR，切胶，纯化cDNA片断，形成模板。
随机引物标记采用标记试剂盒，操作如表3。
表3


加EDTA终止反应(终浓度30mM)室温，1min。附0.5M EDTA用量在1.5-3.0μl。
(4)纯化探针，用G25(或G50)柱子，原理凝胶过滤柱子平衡混匀柱子中的平衡液，掰掉柱子的封闭端，将柱子置于一新的离心管中，3000rpm，2min。倒掉平衡液在室内的自来水池中，3000rpm，再离心1min。
柱子置于一新的离心管中，加入标记好的探针液，3000rpm，2min，收集探针于1.5ml离心管中。从而去除掉未标记的[α-32P]dCTP，小片断(小于300bp)，留下较大片断约500bp。
(5)杂交纯化后的探针应立即变性100℃，5分钟，立即冰上5分钟。
把收集后的探针(25μl左右)加入到杂交管中的预杂交液中，切记勿将探针直接加到膜上，轻轻混匀，把杂交管再移入杂交炉中。68℃，2hours，10rpm.
(6)洗膜低严紧度洗膜室温，SDS 0.05％(wash solution I)A把杂交液倒入废液缸中，用wash solution I洗膜1次(3×50ml)，全部倒入废液缸中，再快速洗二次，废液均倒入废液缸中。
B室温，40min，3×50ml，continuous agitation，洗液用自来水冲尽。
高严紧度洗膜50℃，SDS 0.1％(wash solution II)洗液用自来水冲尽。50℃，每次40min，于摇床中洗，换液5次。
注意在洗膜的过程中，要经常测一测同位素含量，只要剂量达到300左右或以下，就可以停止洗膜。
(6)封膜，压片(保证膜在整个实验过程中都是湿润的)，用保鲜膜封膜，尽量无气泡，以保证膜处在湿润状态。膜放于磷屏上。(注意磷屏要事先消磁半小时)，压12小时左右即可。电脑扫描信号，使用的程序是arraytool-MCD-scan control.
采用Clontech公司的人类多组织RNA印迹膜对该基因的组织分布进行研究。该印迹膜含12种组织，脑、心、骨骼肌、结肠、胸腺、脾、肾、肝、小肠、胎盘、肺、外周血白细胞。
结果见图11。
实施例41hCGI-143蛋白的亚细胞定位1.1原理及目的将带有外源基因的质粒转染单层培养贴壁细胞，外源基因以融合或非融合的形式在细胞中表达，用针对融合或非融合蛋白的抗体处理细胞，再用FITC标记的二抗处理，随后在荧光显微镜下观察，细胞内结合有荧光二抗的部分会在单色光的激发下，发出荧光，从而可以判断表达的蛋白在细胞中的分布。
1.2材料及试剂COS-7细胞或Hela细胞，100×PLA(多聚赖氨酸)一抗Tag抗体(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特异抗体，1∶50-1∶200稀释(PBS/5％BSA)，二抗FITC-goat-anti-mouse IgG，驴抗兔CyTM2IgG，1∶50稀释(PBS/5％BSA)PBS(pH7.4)、BSA、Tween-20、Tritonx-100、8％PFA(多聚甲醛)无色指甲油、固定液(mounting solution sigma)35mm dish、盖玻片(corninglabware&equipment 22mm seq.)蜡笔(pappen polysciences co.)1.3方法步骤(1)铺细胞盖玻片可浸在酒精中，用时在酒精灯上烧去乙醇，铺在35mm培养皿中，加入2ml 1×PLL(H2O)稀释，(可以先在每个dish中加入无菌水980ul，再加入20ul 100×PLA)，放37℃培养箱，30min；35mm培养皿用无菌水洗2次；接种细胞，对于COS-7，接种密度为1.0-1.5×105/35mm培养皿；37℃，5％CO2培养过夜。
(2)脂质体转染2ug pcDNA3.1A-hCGI-143质粒(3)荧光抗体染色转染48-60h后，取出培养皿，置冰上5min，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml；加入2％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml，冰上30min固定；洗涤，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；Blocking，PBS/5％BSA，1ml/dish，室温，2hrs；洗涤，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2(可省略)；吸去dish中的洗涤液，用镊子取出盖玻片，有细胞的一面朝上，放在吸水纸上；用蜡笔沿盖玻片的四周划一个方框，并沿玻片的中心线划一条线，使左右两半大小相当；擦干原dish，将盖玻片放回，玻片的一半加40-50ul PBS/5％BSA，另一半加一抗稀释液；置湿盒内，4℃，过夜，或4℃，2hrs；洗涤，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；玻片的两半都加二抗稀释液，4℃，2hrs；洗涤，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；取干净的载玻片一块，作上标记，滴一滴mounting solution，约15-20ul；用镊子取出盖玻片，边缘搭在纸巾上吸去多余液体，细胞面朝下，贴在载玻片上，不要有气泡；盖玻片的边缘四周刷上无色指甲油，待干；擦去盖玻片上表面析出的PBS盐份(optional)；避光保存在干燥的容器内。
免疫荧光显示hCGI-143蛋白分布在除细胞核以外的细胞质中(图12)。
2.hCGI-143蛋白的分泌途径分泌蛋白的一般分泌途径有两种经过内质网、高尔基细胞器然后分泌；不经过内质网、高尔基细胞器，直接分泌。为分析hCGI-143蛋白的分泌途径，将pcDNA3.1-hCGI-143-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)质粒共转到CHO细胞中，进行荧光共定位分析(图13)(方法同上，二抗使用驴抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi质粒有高尔基细胞器膜定位信号，使表达的融合蛋白定位在高尔基体上，通过共聚焦荧光显微镜分析判断hCGI-143蛋白是否定位在高尔基体内。A图表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的细胞定位情况(绿色)，B图表示标有Cy5的二抗对目的基因的亚细胞定位的检测(红色)，C图表示A与B图的重叠。在C图中黄色表示A、B图中的蛋白共定位。如图所示hGH，P28分别做为阳性和阴性对照。P28蛋白已知定位于细胞核内，没有黄色显现，人生长激素(hGH)是通过高尔基细胞器分泌的分泌蛋白。所以hCGI-143蛋白的确部分定位在高尔基体内，说明hCGI-143蛋白的分泌途径是典型的或是依赖内质网、高尔基细胞器的分泌。
实施例5人hCGI-143基因原核细胞表达和纯化在该实施例中，将全长的人HCGI-143编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表达载体pGEX-5x-1Pharmacia公司产品，全长4969bp，为含谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表达载体。含Ptac启动子，氨苄青霉素抗性，GST后接多克隆位点，含三个读框的终止码，GST与目的基因之间有Factor Xa识别位点。
合成引物正向引物GGGAATTCCCGGTGGAGGCCGCC(SEQ ID NO.5) 酶切位点EcoRI反向引物CCCCTCGAGTCAGGGGGTTCCTAGAGTTTTC(SEQ ID NO.6) 酶切位点XhoI以上引物均由上海申友公司合成菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前构建的pcDNA3.1A-HCGI-143质粒为模板，设计合适引物扩增基因片段，设计引物时使扩增出的片段去掉编码信号肽的一段。这样通过原核细胞表达出的蛋白才与真核细胞中分泌到胞外的蛋白相同。终止密码子采用基因本身的终止密码子。
(1)PCR反应采用相应引物根据下列组分进行PCR反应成分体积10×PCR Buffer 5ulpcDNA3.1A-HCGI-143质粒模板 0.2ulPrimer(Forward，10pmol) 1ulPrimer(Reverse，10pmol) 1uldNTP Mix(10mM of each dNTP) 1ulpfu DNA polymerase(5U/ul) 1ulddH2O 40.8ul总体积 50ul94℃3min；94℃变性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃总延伸7min。
(2)胶回收采用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit参照操作手册割胶回收。
(3)酶切载体片段和扩增片段根据下列组分进行酶切反应成分 体积基因片段的回收产物(1ug) 16ul10×NEB Buffer 3 32ulNotI(10U/ul) 1ulEcoRI(12U/ul) 1ul总体积20ul37℃酶切12hr，70℃热失活 15min(4)连接酶切好的载体和扩增片段根据下列组分进行连接反应成分 体积pGEX-5x-1DNA(250ng/ul) 0.5ul插入片段(50ng/ul) 2ul10×连接buffer 1ulT4 DNA连接酶(6U/ul)1ulddH2O 0.5ul总体积 5ul16℃连接12hr。
(5)转化参见分子克隆实验指南(6)菌落的PCR鉴定在长有菌落的LB(Amp)平板上分别挑取多个菌落作PCR鉴定，PCR反应体系与上述PCR的体系相同。
(7)质粒小抽采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)参照产品操作手册抽提质粒，质粒测序，插入片段正确。
2hCGI-143蛋白的原核表达和纯化2.1材料Glutathione Sepharose 4B购买自Pharmacia公司；Factor Xa购买自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述构建好的pGEX5x-HCGI-143质粒。
2.2方法(1)小量表达构建的表达菌种接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm过夜培养。过夜培养的饱和菌1∶50接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培养至OD600＝0.6。不同浓度的IPTG诱导，继续培养3-5hr。8000rpm离心10min，去上清，加500ml1×PBS，重悬菌体。取出20ul走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)大量表达及样品处理根据小量表达的条件放大，菌体重悬。加入1M DTT至最终浓度为5mM，PMSF至最终浓度为100ug/ml。冰浴超声裂解细胞成匀浆。加20％Triton X-100至终浓度1％，冰浴30min。12000rpm离心10min，分装上清，-20℃储存。
(3)纯化将冻存细胞上清13000rpm，4℃，离心10分钟，取上清。加入适量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃摇动混匀2hr。Glutathione Sepharose 4B的预处理方法见该试剂盒的操作手册。3000rpm离心5分钟，去上清，重悬于PBS中，重复洗涤四次，上柱。用PBS洗涤至所测OD值接近空白对照PBS。换用GST Elution buffer洗脱，测每一收集管的OD值收集洗脱后的蛋白，装入透析带透析，期间适当换透析液1×PBS。透析后收集袋内液体，测蛋白浓度，并用蛋白电泳检测，蛋白电泳结果见图14。
3hCGI-143蛋白的抗体制备和纯化3.1材料Protein A Sepharose CL-4B购自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗体。
此部分工作由上海生物工程中心动物房完成(2)收集的免疫后兔子血离心收集上清，得到抗血清，Western检测所得抗体的效果和特异性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B纯化所得抗血清，并用结合有GST蛋白的GlutathioneSepharose 4B出去其中的抗GST抗体。
预处理Protein A Sepharose CL-4B，见产品说明；用Wash/binding buffer(20mM磷酸钠溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配制50％的Slurry；样品准备，血清样品用Wash/bindingbuffer 1∶1稀释；将平衡好的50％ Slurry倒入柱子填充，使树脂在重力作用下自然沉降；用10倍柱体积的Wash/binding buffer平衡柱子；上样，样品加至树脂顶部。流出液重复上柱三遍；用10倍柱体积的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白；用4倍柱体积的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脱，收集流出液，每管200ul，测定280OD值。直至无蛋白洗出；再生柱子，4倍Elution Buffer继续洗脱后用Wash/bindingbuffer大量洗。
实施例6CHO hCGI-143蛋白稳定表达细胞株构建2μg真核表达质粒用脂质体转染到CHO细胞(35mm培养皿)，培养48小时；消化至100mm培养皿，加G418至终浓度1000μg/ml(CHO)培养2-3星期直至有克隆形成；去培养皿内的培液，PBS洗两次，胰酶浸泡过的无菌滤纸片覆盖于克隆上，消化数分钟后转移至24孔培养皿，继续培养；Western blot鉴定表达目的蛋白的克隆。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>一种新的人分泌蛋白hCGI-143<130>NP-1346<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>903<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(102)..(515)<220>
<221>sig_peptide<222>(102)..(161)<220>
<221>polyA_signal<222>(816)..(821)<400>1ccagagtcct ggccctgagc gggaatcgca gtggccgagg ctgagcggca ggcggatcgc 60cccgaccctc actcctggcg tctgagtctc tggcgtagcc c atg ctg agt ggg cgg 116Met Leu Ser Gly Arg1 5ctg gtc ctg ggt ctg gtc tcc atg gct ggc cgc gtt tgt ttg tgc cag 164Leu Val Leu Gly Leu Val Ser Met Ala Gly Arg Val Cys Leu Cys Gln10 15 20ggc agc gcg gga tcc ggg gcc atc ggt ccg gtg gag gcc gcc att cgc 212Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ile Gly Pro Val Glu Ala Ala Ile Arg25 30 35acg aag ttg gag gag gcc ctg agc ccc gag gtg cta gag ctt cgc aac 260
Thr Lys Leu Glu Glu Ala Leu Ser Pro Glu Val Leu Glu Leu Arg Asn40 45 50gag agc ggt ggc cac gcg gtc ccg cct ggc agt gag act cac ttc cgc308Glu Ser Gly Gly His Ala Val Pro Pro Gly Ser Glu Thr His Phe Arg55 60 65gtg gct gtg gtg agc tct cgt ttc gag gga ctg agc ccc cta caa cga356Val Ala Val Val Ser Ser Arg Phe Glu Gly Leu Ser Pro Leu Gln Arg70 75 80 85cac cgg ctg gtc cac gca gcg ctg gcc gag gag ctg gga ggt ccg gtc404His Arg Leu Val His Ala Ala Leu Ala Glu Glu Leu Gly Gly Pro Val90 95 100cat gcg ctg gcc atc cag gca cgg acc ccc gcc cag tgg aga gag aac452His Ala Leu Ala Ile Gln Ala Arg Thr Pro Ala Gln Trp Arg Glu Asn105 110 115tct cag ctg gac act agc ccc cca tgc ctg ggt ggg aac aag aaa act500Ser Gln Leu Asp Thr Ser Pro Pro Cys Leu Gly Gly Asn Lys Lys Thr120 125 130cta gga acc ccc tga accccaagag agggaggacc aggatccgaa tgggctgggt555Leu Gly Thr Pro135gagcacgaat taccgaggcc ttccctttga tacagtccag gatttgtaag ggatgaagac 615ccctgggccc cattctgttg gggtccatac atactctccg aagatagcaa cttgcttcag 675gtcaaagtga acccgagaaa agagaagaat cactcactac tgctcttgcc ctggactatt 735caggaagggc agcccggatg ttccatgtta aatcgtgaca gaattgcacc agacctgatg 795agttggaaac aatcctatac attaaaagaa attacactat gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 855aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 903<210>2<211>137<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2
Met Leu Ser Gly Arg Leu Val Leu Gly Leu Val Ser Met Ala Gly Arg1 5 10 15Val Cys Leu Cys Gln Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ile Gly Pro Val20 25 30Glu Ala Ala Ile Arg Thr Lys Leu Glu Glu Ala Leu Ser Pro Glu Val35 40 45Leu Glu Leu Arg Asn Glu Ser Gly Gly His Ala Val Pro Pro Gly Ser50 55 60Glu Thr His Phe Arg Val Ala Val Val Ser Ser Arg Phe Glu Gly Leu65 70 75 80Ser Pro Leu Gln Arg His Arg Leu Val His Ala Ala Leu Ala Glu Glu85 90 95Leu Gly Gly Pro Val His Ala Leu Ala Ile Gln Ala Arg Thr Pro Ala100 105 110Gln Trp Arg Glu Asn Ser Gln Leu Asp Thr Ser Pro Pro Cys Leu Gly115 120 125Gly Asn Lys Lys Thr Leu Gly Thr Pro130 135<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>3gggctcgaga tgctgagtgg gcggct26<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gcgaattcgg gggttcctag agttttcttg30<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gggaattccc ggtggaggcc gcc 23<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cccctcgagt cagggggttc ctagagtttt c 3权利要求
1.一种分离的人分泌蛋白hCGI-143，其特征在于，所述分泌蛋白包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如权利要求1所述的一种分离的人分泌蛋白hCGI-143，其特征在于，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
3.一种制备权利要求1的分离的人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤(a)将编码具有人分泌蛋白hCGI-143活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hCGI-143蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸102-515位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hCGI-143蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hCGI-143蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hCGI-143蛋白活性的多肽。
4.如权利要求3所述的一种制备人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸102-515位的核苷酸。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求1所述的人分泌蛋白hCGI-143多肽特异性结合的抗体。
6.一种含有权利要求1的人分泌蛋白hCGI-143的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种人类新的分泌蛋白hCGI－143。本发明的分泌蛋白是一种功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用。该分泌蛋白具有潜在的临床应用价值。
文档编号C12N15/12GK1721438SQ200410052848
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者周宇波, 朱智东, 朱弘, 黄健, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心