专利名称：基于纳米粒子的不对称聚合酶链反应技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种基于纳米粒子的不对称聚合酶链反应(PCR)技术。本发明还涉及用于该不对称PCR的引物集的制备。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)是分子生物学技术领域中极其重要的一种技术，它可以将样品中数量极少的靶序列通过多个“退火-延伸-变性”循环(通常为20-50个循环)，使得靶序列的数量呈现指数式的增长，最终获得百万数量级甚至更多的靶序列，从而便于用检测和操作。
然而，对于PCR扩增产物的分离，目前基本上都是通过电泳-割胶进行，缺乏简便有效的分离PCR扩增产物的方法。
众所周知，纳米技术领域是当今最热门的科学技术研究领域之一，将纳米技术应用于生物科学领域中所形成的新兴科学技术-纳米生物技术，是利用纳米技术研究和解决生命科学领域中的重大问题的科学，它正成为当前重要的前沿科学研究领域之一。
现在，磁性纳米粒子在生物技术领域中的应用前景日益受到人们的关注。磁性纳米粒子经常被用作生物样品的磁场分离。用磁性纳米粒子的分离方法操作简便、所需设备廉价，同时分离速度快，有利于保持样品的生物活性。目前，运用越来越广泛。
现有技术中的磁性纳米分离器多采用乳液聚合得到的高分子微球，其中包覆了纳米尺寸的磁性颗粒。然而，高分子微球的结构通常比较疏松，其中包含的磁性粒子在长时间保存过程中容易脱离微球并且会产生团聚现象，从而影响产品的性能；在磁性纳米粒子上用吸附或亲合作用固定活性物质时，容易脱落。
众所周知，在PCR反应时，若两引物的摩尔浓度比为1∶10至1∶500时，经PCR后可获得ssDNA，这种技术称之为不对称PCR。其原理为在PCR的过程中，当限制性引物(即数量较少的引物)因量少而消耗完后，非限制性引物(即数量较多的引物)会继续扩增，从而产生大量的ssDNA。单链DNA有着广泛的应用，例如用作探针。尤其是随着DNA芯片技术的发展，本领域需要大量高纯度的单链DNA分子。
然而，在本发明之前，并没有将纳米技术与不对称PCR结合的报道，而且本领域缺乏简便有效地制备和分离单链DNA的方法。因此本领域迫切需要开发新的简便有效地分离单链DNA扩增产物的技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种新式的基于纳米粒子的不对称PCR技术。
本发明的另一目的是提供一种简便有效地制备和分离单链DNA扩增产物的技术。
在本发明的第一方面，提供了一种用于不对称聚合酶链反应的引物集，所述引物集包括用于引发目的核酸扩增反应的单链寡核苷酸引物对，所述引物对的一个引物为限制性引物，该限制性引物是长度为10-100碱基的单链寡核苷酸，而另一引物为是基于纳米粒子的PCR引物，所述的基于纳米粒子的PCR引物具有下式结构Z-(X)n (I)其中X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物，而Z表示平均粒径为1-100nm的固体粒子，而“-”表示X和Z之间的共价键，n为1-1000的整数；并且所述的限制性引物与基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶10～1∶500。
在另一优选例中，所述的固体粒子是金纳米粒子或磁性纳米粒子。
在另一优选例中，所述的基于磁性纳米粒子的PCR引物具有以下结构(1)由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层；(2)在核壳型磁性纳米粒子上连接的单链寡核苷酸引物外壳层。
在另一优选例中，所述单链寡核苷酸引物外壳层是通过过硫键与内核层连接的单链DNA。
在另一优选例中，所述固体粒子是金纳米粒子，且单链寡核苷酸引物通过Au-S键直接连接在金纳米粒子上。
在另一优选例中，所述的限制性引物与基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶10～1∶500。
在另一优选例中，X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物。
在本发明的第二方面，提供了一种不对称聚合酶链反应方法，它包括步骤在适合扩增的条件下，使含模板核酸、引物集、dNTP、聚合酶的反应体系经历20-50个退火-延伸-变性的循环，从而形成PCR扩增产物，其中所述的引物集是本发明所述的用于不对称聚合酶链反应的引物集。
在另一优选例中，该方法还包括步骤对PCR扩增产物通过离心或磁场作用而分离出PCR扩增产物，所述的PCR扩增产物带有纳米粒子。
在本发明的第三方面，提供了一种基于纳米粒子的PCR引物的用途，所述的基于纳米粒子的PCR引物具有下式结构Z-(X)n (I)其中X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物，而Z表示平均粒径为1-100nm的固体粒子，而“-”表示X和Z之间的共价键，n为1-1000的整数，所述的引物被用于通过不对称PCR制备单链核酸产物。
在另一优选例中，所述的单链核酸产物被用于制造DNA芯片和DNA探针。
图1显示了SiO2包覆后的磁性纳米粒子的TEM图。
图2显示了连接PCR产物后的磁性纳米粒子的TEM图。
图3显示了在不同的退火温度下，基于纳米粒子PCR产物的电泳图，其中各泳道如下1分子量标准物；252℃；356℃；460℃；565℃。
图4显示了在限制性引物与纳米引物的不同摩尔比情况下，不对称PCR产物的电泳图，其中各泳道如下1是分子量标准物；a是1∶1000，b是1∶500，c是1∶100，d是1∶10。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究后发现，为了简便有效地分离PCR扩增产物，仅改进扩增后的分离技术是不够的，必须在获得PCR扩增产物之前就对PCR技术进行改进。在本发明之前，本领域通常认为当短的寡核苷酸片段连接了固体颗粒后，其运动能力将大幅下降，因此不适合作为PCR的引物。然而本发明人却发现，与纳米颗粒相连的寡核苷酸片段仍然可以非常有效地作为PCR的引物，并由此开发了新的基于纳米技术的PCR，从而实现了PCR扩增产物的简便、快速、有效的分离。此外，本发明人还将本发明的基于纳米粒子的引物用于不对称PCR，从而首次开发出了制备和分离单链DNA都极其简便的“基于纳米粒子的不对称PCR技术”。
纳米粒子如本文所用，“纳米颗粒”与“纳米粒子”可互换使用，指平均粒径尺寸为1nm-100nm的固体颗粒。
可用于本发明的纳米粒子没有特别限制，只要其平均粒径尺寸为1nm-100nm，并且能够与寡核苷酸相连即可。
最常用的纳米粒子包括金纳米粒子和磁性纳米粒子。
纳米级的金纳米粒子是本领域中常用的，例如在DNA轰击法中，就是将携带外源基因的核酸分子连于纳米级的金粒子上，然后轰击宿主细胞，从而将外源基因导入宿主细胞。在本发明中，可用本领域常规方法将DNA偶联于纳米级金粒子。
更优选的纳米粒子是磁性纳米粒子。用于生物技术中的磁性纳米粒子一般要求具有如下的特性(1)粒子具有超顺磁性，易于吸附和洗脱；(2)粒子需要较大的磁化强度，以保证分离效率的灵敏度；(3)粒子表面要易于进行化学修饰，以和不同的生物和药物分子进行连接；(4)用于体内时要求有较好的生物相容性。纳米粒子通常为三明治结构，内核层一般为磁性纳米材料，中间为包覆层，目前已有的产品大多数采用高分子材料作为包覆层，最外层则修饰与生物组织有特异性作用的功能基团，以满足生物分离的要求。本领域用于分离核酸的磁性纳米粒子都可用于本发明。
一种特别优选的磁性纳米粒子是在发明名称为“磁性纳米粒子核酸分离器、及其制法和应用”的CN 03142274.81中国专利申请(2003年8月15日申请)中所公开的磁性纳米粒子。简而言之，这种优选的磁性纳米粒子核酸分离器含有如下的三层结构(1)由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层；(2)包覆内核层的3-巯基丙基三甲氧基硅烷中间层；
(3)包覆中间层的单链寡核苷酸引物外壳层。
在另一优选例中，核壳型磁性纳米粒子内核层包括内核和外壳。其中，所述内核层的内核成分选自铁的氧化物、镍、镍-铁合金、或其组合，更佳地内核成分是铁的氧化物。所述内核层的外壳成分选自二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合，更佳地所述内核层的外壳成分是二氧化硅。所述单链寡核苷酸引物外壳层是通过过硫键与中间层连接的单链DNA。
核壳型磁性纳米粒子内核层的内核成分除了铁的氧化物以外，还有镍(Ni)或者镍(Ni)和铁(Fe)等的合金。
核壳型磁性纳米粒子内核层的外壳成分除了二氧化硅等无机包裹层以外，还有琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物等有机包裹层。对于选定的外壳成分，可根据现有技术选用合适的内核层外壳形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的内核层外壳形成剂。
作为引物的单链DNA适用于本发明的单链DNA(即引物)的长度没有特别的限制，可与常规的PCR引物相同。通常平均长度约为10～100碱基，较佳地约为15～50碱基。
基于纳米粒子的PCR引物(简称为“纳米引物”)与CN 03142274.81中国专利申请中所述的磁性纳米粒子核酸分离器相比，用均一的PCR单链引物替换单链寡核苷酸引物外壳层中的单链DNA就可制得本发明的基于纳米粒子的PCR引物。
在一优选例中，本发明的基于纳米粒子的PCR引物的制备方法包括以下步骤(1)制备磁性纳米粒子用二次蒸馏水H2O分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/l，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的浓度为2～3mol/l。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃下陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
(2)二氧化硅在γ-Fe2O3表面的修饰将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30-60分钟，再向其中加入0.01～1g的γ-Fe2O3(磁性纳米粒子)，用超声波处理3分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30～60分钟使之均匀。取1ml一定浓度的浓氨水用2ml二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10～60分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～5ml的正硅酸乙酯(内核层外壳形成剂)，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～40℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于300～700℃的条件下锻烧1～4个小时，收集核壳型磁性纳米粒子。
(3)用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)修饰磁性纳米粒子表面取15mg磁性纳米粒子加入2～10ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取0.01～1g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～40℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100-300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
(4)单链DNA在磁性纳米粒子表面的修饰取一定量的已修饰了过硫键的单链DNA引物，加入到500μl的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于10～50℃的条件下反应12～36小时(DNA上的过硫键与中间层上的巯基反应，使DNA分子通过过硫键直接连接于中间层)。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到基于纳米粒子的PCR引物。
通常，在本发明的基于纳米粒子的PCR引物复合物中，引物与纳米粒子的摩尔比通常为1～100∶1，更佳地为1～20∶1。此外，引物与纳米粒子的重量比通常为1～10∶1，更佳地为1～4∶1。
基于纳米粒子的PCR反应使用本发明上述的基于纳米粒子的PCR引物所进行的PCR反应，就是基于纳米粒子的PCR反应。其中，当使用两种或更多引物进行PCR反应时，可以仅使用一种本发明的基于纳米粒子的PCR引物，也可以使用2种或更多种的本发明的基于纳米粒子的PCR引物，甚至PCR反应体系中所有的引物都是本发明的基于纳米粒子的PCR引物。
本发明基于纳米粒子的PCR反应包括本领域现有的各种PCR反应形式，例如常规的双引物PCR、巢式PCR、RT-PCR等。
本发明基于纳米粒子的PCR反应的条件没有特别限制，可以与现有的PCR反应条件完全相同，例如退火、延伸和变性温度，反应体系的离子强度等条件。简而言之，可以将本发明基于纳米粒子的PCR反应视为常规的PCR反应，唯一的区别仅在于使用的引物是连接有纳米粒子的引物而已。
在进行了PCR反应之后，可产生携带纳米粒子的扩增产物。利用这些携带的纳米粒子就可轻易地分离出扩增产物。例如，当纳米粒子是金颗粒时，可以利用高速离心法分离扩增产物。当纳米粒子是磁性纳米粒子时，可以利用磁场分离扩增产物。
这些分离的PCR扩增产物可以更方便地用于各种用途，例如DNA分子操作、DNA探针、制备DNA芯片和基因治疗等。
基于纳米粒子的不对称PCR反应不对称PCR反应与常规PCR反应基本相同，唯一的主要区别在于不对称PCR中一个引物的数量较少，被称为限制性引物，而另一个引物的数量较多，被称为非限制性引物。通常，限制性引物与非限制性引物的摩尔比为1∶10至1∶500。
与现有的不对称PCR技术相比，本发明的不对称PCR反应中，唯一的主要区别在于非限制性引物必须是本发明的基于纳米粒子的引物。至于其他方面，如聚合酶、dNTP浓度等诸多条件与现有技术中并无区别。
在本发明中，将非限制性引物共价键合到纳米粒子上，通过不对称PCR，可以获得大量连有纳米粒子的ssDNA，纳米粒子的存在将会有利于ssDNA产物的分离和纯化，比传统的凝胶电泳或阴离子交换层析分离法更为简单。得到的连有纳米粒子的ssDNA可以用于制备特定基因的核酸探针，直接进行该基因片段的序列分析。纳米粒子的存在还有利于探针的回收和再利用。
本发明的主要优点在于
(1)与传统PCR相比，本发明不仅可以进行不对称PCR，而且可以极其简便、快速和有效地分离单链DNA。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1磁性纳米粒子的内核层的制备方法采用改进的化学共沉淀制备磁性粒子的内核层，具体方法如下用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/l，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的浓度为2～3mol/l。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
实施例2核壳型核酸磁性纳米粒子的制备方法将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶2∶5的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30～60分钟，再向其中加入0.5g的γ-Fe2O3，用超声波处理6分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30分钟使之均匀。取1ml一定浓度的浓氨水用2ml二次蒸馏水稀释，30分钟后将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～3ml的正硅酸乙酯，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～30℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于400～700℃的条件下，锻烧1～4个小时，收集粒子。
经透射电子显微镜(TEM)检测，其平均粒径大约为50nm。
实施例3基于纳米粒子的PCR引物的制备取15mg实施例2中制得的磁性纳米粒子加入2ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取0.01g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。用拉曼光谱检测表明，巯基被修饰到磁性纳米粒子的表面。
分别取一定量(浓度为76μM)的已修饰了过硫键的单链DNA引物。序列如下(1)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-TATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCT(5′-3′)，(2)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-TCTTTATAGTCCTG CGGGTTTCG(5′-3′)，(3)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-GGGATAA CGCAGGAAAG(5′-3′)，(4)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-AGG GT CGGAACAGGAG(5′-3′))，加入到等量的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到基于纳米粒子的PCR引物A。
用拉曼光谱检测表明，DNA引物被连接到了磁性纳米粒子表面。
实施例4基于纳米粒子的PCR引物的制备取15mg实施例2制得的磁性纳米粒子加入6ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20-60分钟；称取0.5g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
分别取一定量(浓度为76μM)的已修饰了过硫键的单链DNA引物。序列如下
(1)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)10-O-(PO3)-5′-TATTGGGCGCTCTTCCGCTTCC(5′-3′)，(2)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)10-O-(PO3)-5′-TCTTTATAGTCCTGTCGGTTTC(5′-3′)，(3)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)10-O-(PO3)-5′-GGG ATAACG CAGGAAA(5′-3′)，(4)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)10-O-(PO3)-5′-AG GGTCGG AACAGGA(5′-3′)，加入到等量的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到基于纳米粒子的PCR引物B。
实施例5基于纳米粒子的PCR引物的制备取15mg实施例2制得的磁性纳米粒子加入10ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取1g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
分别取一定量(浓度为76μM)的已修饰了过硫键的单链DNA引物。序列如下(1)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)8-O-(PO3)-5′-ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTC(5′-3′)，(2)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)8-O-(PO3)-5′-CTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGC(5′-3′)，(3)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)8-O-(PO3)-5′-GG ATAACGCAGGA AAGA(5′-3′)，(4)HO-(CH2)6-S-S-(CH2)8-O-(PO3)-5′-G GGTCGGAACAG GAGA(5′-3′)加入到等量的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到基于纳米粒子的PCR引物C。
实施例6基于纳米粒子的PCR引物的制备分别取一定量(40μg)的表面连接有活性巯基的磁性纳米粒子，加入一定量(40μl)的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝9.0)，超声分散均匀。
取用二次蒸馏水稀释成76μM的引物。序列如下(1)HO-(CH2)8S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-ATTGGG CGCTCTTCCGCT-TCCTC(5′-3′)，(2)HO-(CH2)8-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-CTTTATAGTC-CTGTCGGGTTTCGC(5′-3′)，(3)HO-(CH2)8-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-GG ATAACGCAGGAAAGA(5′-3′)(4)HO-(CH2)8S-S-(CH2)6-O-(PO3)-5′-G GGTCGGAACAGGAGA(5′-3′)取20μl引物，向其中加入20μl上述缓冲液，混合均匀，在室温的情况下，潮湿的空气中，反应24h。反应完毕后，用4000转/分的速度离心分离，弃去上清液；用二次蒸馏水清洗沉淀至少两次后，用同样的转速分离，弃去上清液，保留粒子，得到基于纳米粒子的PCR引物D。
实施例7基于纳米粒子的PCR反应在本实施例中，使用实施例3-6制备的引物A-D进行聚合酶链反应。条件如下(1)反应温度和时间i)94℃预变性3min；94℃变性50s；退火温度为52℃，时间设为50s；72℃延伸30s；反应完毕后，72℃再延伸4min；45个循环。
ii)94℃预变性3min；94℃变性50s；退火温度为56℃，时间设为50s；72℃延伸30s；反应完毕后，72℃再延伸4min；45个循环。
iii)94℃预变性3min；94℃变性50s；退火温度为60℃，时间设为50s；72℃延伸30s；反应完毕后，72℃再延伸4min；45个循环。
iv)94℃预变性3min；94℃变性50s；退火温度为65℃，时间设为50s；72℃延伸30s；反应完毕后，72℃再延伸4min；45个循环。
(2)反应物的用量两条引物都连接磁性纳米粒子时的反应物的用量。本实验选用30μl体系。二次蒸馏水19μl，标准缓冲液3μl，标准浓度的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的上游和下游引物(实施例3-6制备)各取2μl，原始浓度稀释100倍的模板PSK为1μl，Taq酶1μl。
一条引物都连接磁性纳米粒子时的反应物的用量。本实验选用30μl体系。二次蒸馏水20.75μl，标准缓冲液3μl，标准浓度的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的引物取2μl，没有连接磁性纳米粒子的引物取0.25μl，原始浓度稀释100倍的模板PSK为1μl，Taq酶1μl。
结果用透射电子显微镜(TEM)对连接PCR引物之前的纳米粒子和进行了PCR反应之后的纳米粒子进行拍照，结果见图1和图2。从中可以看出，SiO2包覆后的磁性纳米粒子(未连接引物)的边缘很光滑。而PCR反应后，连接了PCR产物后的磁性纳米粒子则边缘很模糊，而且有一些团聚。
实施例8PCR产物的分离(a)PCR产物与磁性纳米粒子的分离对实施例7的PCR反应产物用4000转/分的速度离心分离(注也可额外施加磁场)，取出磁性粒子，用二次蒸馏水分散，向其中加入一定量的巯基乙醇，使其最终的浓度达到3％，在37℃的条件下，反应8h以上。
(b)琼脂糖电泳检测将上述的反应后的溶液在4000转/分的速度下离心分离，取上清液进行琼脂糖胶电泳。
结果如图3所示，表明在3种反应条件(实施例7中反应条件i)、ii)和iii))下，均可以进行PCR。
实施例9基于纳米粒子的PCR反应重复实施例7中的反应条件ii)，不同点仅在于用一条常规引物(O.25μl)和一条基于纳米粒子的引物(2μl)替换原来的两个基于纳米粒子的引物。
结果表明，同样获得了连接有纳米粒子的PCR扩增产物。
实施例10基于纳米粒子的不对称PCR反应在本实施例中，将本发明实施例3-6中制备的基于纳米粒子的PCR引物中的任意一条(图4所示的是实施例3制备的引物的实验结果)作为非限制性引物，将同对引物中另一条常规引物作为限制性引物，以原始浓度稀释100倍的模板PSK为1μl为模板(1)反应用量a.二次蒸馏水19.9μl，标准缓冲溶液(500mmol/L KCl；100mmol/LTris-HCl(pH＝8.3)；15mol/L MgCl2；0.1％明胶)3μl，2mol/L的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的一条引物20pmol，不连粒子的限制性引物0.02pmol，PSK模板1μl，Taq酶1μl，总体积为30μl。(限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶1000)b.二次蒸馏水19.85μl，标准缓冲溶液3μl，2mol/L的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的一条引物20pmol，不连粒子的限制性引物0.04pmol，PSK模板1μl，Taq酶1μl，总体积为30μl(限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶500)。
c. 二次蒸馏水19.8μl，标准缓冲溶液3μl，2mol/L的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的一条引物20pmol，不连粒子的限制性引物0.2pmol，PSK模板1μl，Taq酶1μl，总体积为30μl(限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶100)。
d.二次蒸馏水19.75μl，标准缓冲溶液3μl，标准浓度的dNTP溶液2μl，连接有磁性纳米粒子的一条引物20pmol，不连粒子的限制性引物2pmol，PSK模板1μl，Taq酶1μl，总体积为30μl(限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶10)。
(2)PCR反应条件94℃预变性1-5min；94℃变性20-80s，退火温度为58-68℃，时间为20-80s，72℃延伸20-80s，20-50个循环；72℃延伸2-6min。
(3)PCR产物的检测按照实施例8将PCR产物与磁性纳米粒子分离后用3％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，当限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶500-1∶10范围时，在凝胶电泳图上可以同时看到目标双链和单链(如图4所示)。
(4)单链DNA扩增产物的分离将扩增产物95℃变性10min，4000转/min的速度离心分离(注也可额外施加磁场)，去除上层清液并多次离心清洗，从而获得单链DNA。该DNA被用作探针而固定在DNA芯片上。
实施例11基于纳米粒子的不对称PCR反应重复实施例10的过程，不同点在于用平均粒径约70nm的金纳米粒子替换磁性纳米粒子，并且在分离单链DNA扩增产物时仅通过5000转/min离心分离。
结果表明，当限制性引物基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶500-1∶10范围时，可获得目标单链。离心分离后获得的DNA被用作探针而固定在DNA芯片上在不偏离本发明的实质和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改动或修改，这些等价的形式同样落在本申请所附权利要求书所限定的范围内。
权利要求
1.一种用于不对称聚合酶链反应的引物集，其特征在于，所述引物集包括用于引发目的核酸扩增反应的单链寡核苷酸引物对，所述引物对的一个引物为限制性引物，该限制性引物是长度为10-100碱基的单链寡核苷酸，而另一引物为是基于纳米粒子的PCR引物，所述的基于纳米粒子的PCR引物具有下式结构Z-(X)n (I)其中X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物，而Z表示平均粒径为1-100nm的固体粒子，而“-”表示X和Z之间的共价键，n为1-1000的整数；并且所述的限制性引物与基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶10～1∶500。
2.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的固体粒子是金纳米粒子或磁性纳米粒子。
3.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的基于磁性纳米粒子的PCR引物具有以下结构(1)由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层；(2)在核壳型磁性纳米粒子上连接的单链寡核苷酸引物外壳层。
4.根据权利要求3所述的引物集，其特征在于，所述单链寡核苷酸引物外壳层是通过过硫键与内核层连接的单链DNA。
5.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，所述的限制性引物与基于纳米粒子的PCR引物的摩尔比为1∶10～1∶500。
6.如权利要求1所述的引物集，其特征在于，X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物。
7.一种不对称聚合酶链反应方法，它包括步骤在适合扩增的条件下，使含模板核酸、引物集、dNTP、聚合酶的反应体系经历20-50个退火-延伸-变性的循环，从而形成PCR扩增产物，其特征在于，所述的引物集是权利要求1所述的引物集。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤对PCR扩增产物通过离心或磁场作用而分离出PCR扩增产物，所述的PCR扩增产物带有纳米粒子。
9.一种基于纳米粒子的PCR引物的用途，所述的基于纳米粒子的PCR引物具有下式结构Z-(X)n (I)其中X表示长度为10-100碱基的单链寡核苷酸引物，而Z表示平均粒径为1-100nm的固体粒子，而“-”表示X和Z之间的共价键，n为1-1000的整数，其特征在于，所述的引物被用于通过不对称PCR制备单链核酸产物。
10.如权利要求9所述用途，其特征在于，所述的单链核酸产物被用于制造DNA芯片和DNA探针。
全文摘要
本发明涉及一种基于纳米粒子的不对称PCR技术，其中所用的非限制性引物是基于纳米粒子的PCR引物，它具有下式结构Z－(X)n；其中X表示长度为10－100碱基的单链寡核苷酸引物，而Z表示平均粒径为1－100nm的固体粒子，而“－”表示X和Z之间的共价键，n为1－1000的整数。本发明还涉及基于纳米粒子的不对称聚合酶链反应。本发明可极其简单、快速和高效地制备和分离单链DNA扩增产物。
文档编号C12P19/00GK1721544SQ200410052808
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者沈鹤柏, 周海清, 朱龙章 申请人:上海师范大学