专利名称：一种分子克隆快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及核酸技术领域，是分子生物学技术的补充，具体地说是涉及到快速鉴定外来核酸碱基序列片断，重组到质粒载体中的阳性克隆技术，该技术的特征及其用途。
背景技术：
分子生物学中对于核酸碱基序列的研究，历来是一个重要的领域，分子克隆是经常使用到的技术，它使广泛联系、多样的分子生命现象，以大量、单一的形式呈现在研究者的面前，进一步的商业开发，使这一技术变得非常方便实用。该技术包含多个环节，其中的一个重要环节，就是阳性克隆的鉴定。目前的阳性克隆鉴定方法有多种，包括兰白斑筛选、限制性内切酶消化以及PCR等，这三个是目前最经典的方法，理论上均能达到筛选阳性克隆目的，但实际运用中却存在着一些问题。兰白斑筛选的克隆会因为一些实际因素，比如兰白斑颜色不够明显、兰白斑菌落污染等，而使挑选的克隆存在假阳性。限制性内切酶消化方法一般要求质粒较高的纯度，而且常用的是用重组连接时的同一限制性内切酶，多为两种不同的酶，因此需要两次酶切，所需时间在两天左右。PCR方法本身存在假阳性的缺点。这些缺陷在一定程度上影响了分子克隆技术作用的发挥，有待进一步完善。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子克隆快速鉴定方法，这是完善分子克隆技术的一种方法，具体说是快速鉴定阳性克隆的手段。
本发明方法包括一是快速提取质粒，二是单酶多切和RNA消化。快速提取质粒能够在一毫升左右的菌液中，约半个小时内得到满足克隆鉴定的质粒量，具体操作可参见[赵振芬等.直接用酚和氯仿快速提取质粒.生物技术，1995，5(6)32-33]；单酶多切和RNA消化是对前面提取的质粒，经单一的核酸限制性内切酶把目的碱基序列片段，或者部分碱基序列片段切割下来，核酸限制性内切酶位点可以是载体本身自带的，也可以是载体与目的片段中的、或者是连接中形成的相同碱基序列，组成多个相同的核酸限制性内切酶位点，加入相应的核酸限制性内切酶和反应缓冲液，同时再加入RNA酶，一定温度条件下切割重组分子和消化RNA，约2个小时内完成，加上普通电泳约半小时，将在半天内完成阳性克隆的鉴定方法。
具体步骤为1.快速提取质粒(1)离心收集培养过的质粒转化细菌液体单克隆经摇床培养过夜后的菌液0.5～1毫升，或者摇床培养5～8小时的数毫升菌液，高速离心沉淀，倒置弃上清，尽量沥干液体；(2)低渗液体悬浮细菌加入0.4～0.6毫升的低渗透液体，震荡悬浮细菌；(3)核酸提取液抽提质粒加入等体积的核酸提取液(饱和苯芬∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，振荡混匀1分钟。再高速离心3～10分钟，吸上清于另一干净的eppendorf管中。然后加入等体积的异丙醇，混匀，高速离心3～10分钟，弃上清；(4)洗涤质粒加入1～1.5毫升的70％乙醇漂洗，然后弃去液体，并尽量使酒精挥发干；2.单酶多切和RNA酶消化(1)根据重组质粒选用多切位点单一限制性内切酶对重组核酸分子碱基序列用DNA分析软件DNASIS2.5选择多个相同的限制性内酶切位点，重点在于能够分辨出阳性克隆的单一酶多切识别位点，选用高效、低价，在重组核酸分子碱基序列中同时切割多个位置的核酸限制性内切酶。
(2)质粒溶解及酶处理用一定量的无菌蒸馏水溶解步骤1中提取的质粒，然后按照核酸限制性内切酶说明书，加入酶和缓冲液，同时也加入RNA酶至终浓度5微克每微升，混匀离心，按产品说明书要求反应1～2小时，使核酸限制性内切酶与RNA酶同时在一个反应体系中作用。
(3)电泳配制普通DNA电泳Agarose凝胶，把上述处理过的质粒和标准核酸片段上样，约100伏电泳约半小时；(4)鉴定将电泳结束的胶，置于DNA摄像仪下观察，根据标准核酸片段，推测核酸限制性内切酶切割核酸片段大小。
本发明的特点是(1)操作简便阳性克隆的鉴定只要求知道重组质粒中有无目的片段，因此有部分操作要求并不很高，比如本发明中提取的重组质粒，存在着细菌DNA和RNA污染的情况，但对实验结果并没有影响。而且快速提取重组质粒，以及单一酶切和同时消化RNA减少了操作步骤。所以较其他的阳性克隆鉴定方法更简单、方便。(2)经济由于本发明的操作简便，使得完成阳性克隆的鉴定在当天即可完成，从时间上说很即时，而且试剂等耗费很少，表现出了高效率的特点，为发展分子克隆技术提供了快速高效手段。(3)虽然PCR鉴定也很即时，但既要合成引物，也有假阳性的困扰，而本发明克服了这一不足。(4)常规的双核酸限制性内切酶，每种酶作用需要8～16个小时，而本发明单一核酸限制性内切酶一次性处理，对阳性克隆质粒鉴定仅需半天时间，既快又节约。
说明书附1为pGEM-T Easy载体及其克隆限制性内切酶位点。
图2为TA克隆重组质粒经Not I酶消化后电泳图。
图3为重组质粒分子经EcoR I作用后电泳图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。通过下列实施例对本发明的技术特征做详细的描述，但本发明范围不仅限于以下实施例中。
实施例1 TA克隆质粒的快速提取电泳、割胶、回收柱纯化的PCR扩增产物四个片段547、506、669、756bp，用pGEM-T Easy载体重组(参见
图1)，载体两个末端多克隆位点碱基序列中，分别存在着同样的核酸限制性内切酶位点，如Not I、EcoR I和BstZ I等酶，这在本发明中很有用。使用TA克隆试剂盒(Promega公司)重组目的片段和载体，然后感染感受态细菌(INV a F’)，37度细菌培养箱过夜，挑取单克隆于LB培养液中摇床培养，过夜菌液0.5～1毫升，或者摇床培养5～8小时的数毫升菌液，离心沉淀，弃上清，加0.5毫升的低渗透液体(TESTE pH 7.5 NaCl0.1M)悬浮细菌。再加0.5毫升的核酸提取液(饱和苯芬∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，振荡混匀1分钟。再13000rpm离心5分钟，吸上清于另一干净的eppendorf管中，然后加入等体积的异丙醇，混匀，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用70％的乙醇漂洗，尽量使酒精挥发干。
实施例2 Not I酶处理取实施例1提取的重组质粒，经碱基序列DNASIS2.5分析，查找一种核酸限制性内切酶，可以在多位点切割重组质粒碱基序列，能够在凝胶电泳图上区分出目的片段，这里将对实施例1中的TA克隆使用核酸限制性内切酶Not I(Invitrogen公司)，然后，对实施例1提取质粒加入16ul的TE(pH 7.5)溶解，1ul的RNA酶(RNase I 10mg/ml)、1ul的Not I、2ul相应的10×buffer，混匀，37度水浴约2小时。然后加入电泳上样缓冲液，与标准核酸片段同时点样在1％的Agarose凝胶上，100伏电压电泳30分钟，最后在DNA紫外摄影仪中观察结果(参见图2)，每个样本中有4条DNA带，从下往上依次为RNA、目的片段、载体pGEM-T Easy片段和部分细菌基因组DNA。参照标准片段，在500～750bp附近的分别是目的片段547、506、669、756bp，说明克隆是阳性的，完成鉴定。
实施例3 EcoR1酶处理将实施例1中提取的三个片段506、669、756bp与pGEM-T Easy载体重组的质粒，如实施例2使用核酸限制性内切酶EcoR I(Invitrogen公司)处理，其它条件同，最后的结果参见图3，图中MDL2000，1pGEM-T Easy-547，2pGEM-T Easy-669，3pGEM-T Easy-756。每个样本中有4条DNA带，从下往上依次为RNA、目的片段、载体pGEM-T Easy片段和部分细菌基因组DNA。参照标准片段，在500～750bp附近的分别是目的片段506、669、756bp，说明克隆是阳性的，得到了鉴定。
实施例4 其它克隆质粒的提取和其他酶处理实施例1的方法也实用于其它克隆质粒的提取，用实施例2和3的方法，找到区别出阳性克隆的单一核酸限制性内切酶多切位点，象TA克隆中的NotI、EcoR I和BstZ I等酶，能够满足这个条件的，均实用于本发明专利。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种分子克隆快速鉴定方法，包括快速提取质粒，其特征是还包括单酶多切和RNA消化，具体通过以下步骤实现(1)快速提取质粒①离心收集培养过的质粒转化细菌液体，②低渗液体悬浮细菌，③核酸提取液抽提质粒，④洗涤质粒，(2)单酶多切和RNA消化①根据重组质粒选用多切位点单一限制性内切酶，②质粒溶解及酶处理，③电泳，④鉴定。
2.根据权利要求1所述的分子克隆快速鉴定方法，其特征是步骤(2)的单酶多切和RNA消化是对步骤(1)提取的质粒，经单一的限制性内切酶把目的碱基序列片段，或者部分碱基序列片段切割下来。
3.根据权利要求1所述的分子克隆快速鉴定方法，其特征是步骤(2)限制性内切酶位点可以是载体本身自带的，或是载体与目的片段中的、或是连接中形成的相同碱基序列，组成多个限制性内切酶位点。
4.根据权利要求1-3所述的任一分子克隆快速鉴定方法，其特征是组成多个限制性内切酶位点后，同时用RNA酶消化RNA。
全文摘要
本发明提供一种分子克隆快速鉴定方法，包括一快速提取质粒，二单酶多切和RNA消化。快速提取质粒能够在一毫升左右的菌液中，约半个小时内得到满足克隆鉴定的质粒量。单酶多切和RNA消化是对前面提取的质粒，经单一的限制性内切酶把目的碱基序列片段，或者部分碱基序列片段切割下来，组成多个限制性内切酶位点，同时用RNA酶消化RNA，经电泳，完成阳性克隆的鉴定。本发明方法仅需半天时间就可完成阳性克隆质粒鉴定，表现出了高效率的特点，是一种操作更简单、方便，效率更高，试剂等耗费很少的完善分子克隆技术的快速鉴定方法。
文档编号C12Q1/68GK1635151SQ200410067739
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者郑树, 陈功星, 张佳炜 申请人:浙江大学医学院附属第二医院