一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病的基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用，属基因工程领域。
背景技术：
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是急性、高度接触传染性的病毒病。它是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的鸡的免疫抑制性传染病。传染性法氏囊病的传染性极强，能在一个鸡群中迅速传播。
该病的病原体IBDV有很强的抗失活能力。因此，在高传染压力的情况下除了采用严格的卫生学措施外疫苗的使用是必须的，也是一个强制的措施。这样做的主要目的是保护雏鸡在孵出后的数周内免受IBDV的感染。要达到这一目的有两个重要措施，首先要在产蛋种鸡的整个产蛋期间通过灭活油乳剂疫苗诱导出高滴度的母源抗体。另外，在雏鸡孵出后适时接种减毒活疫苗。活疫苗接种的时间非常关键。因为，在小鸡体内存在的母源抗体能中和活疫苗。然而，1986年超强毒株(vvIBDV)的出现使得预防免疫的形势发生了很大的变化。由于vvIBDV的毒力更强和抗原特性的变化，使它能突破母源抗体的保护和弱毒活苗接种后的保护。因此，传统的疫苗对vvIBDV失去了作用。开发新疫苗成为必然。新疫苗是未完全减毒的中等毒力活疫苗，其主要目的是提供足够强的免疫刺激以产生对超强毒株的保护作用。然而，这些中等毒力活疫苗本身可能会造成免疫抑制并干扰其它疫苗的免疫作用，如新城疫疫苗和马立克病疫苗。而且，中等毒力活疫苗免疫后感染超强毒株的病例仍然不断出现。另外一种对抗vvIBDV的有效方法是灭活疫苗，但这种灭活疫苗必需具有相当高的病毒抗原滴度才有作用。在高感染区一个最有效的灭活疫苗是用感染的法氏囊制备抗原。这种抗原的制备必需用vvIBDV感染鸡，然后宰杀感染鸡从法氏囊中提取所需抗原。这一过程需要屠宰大量鸡因而生产成本很高。针对现用IBDV疫苗的缺陷迫使人们探索新的改进疫苗和开发新疫苗，以控制IBDV感染减少经济损失。
近年来由于基因克隆和重组技术的日益完善和实用化，许多科学家研究开发了许多实验性重组IBD疫苗。这些疫苗多是以病毒为活载体的疫苗。主要载体病毒有fowl poxvirus，herpevirus of turkey，fowl adenovirus，Marek’sdisease virus，和Semlidk Forest virus。此外，体外表达VP2和产生IBDV类病毒颗粒也已被证实有免疫原性。以细菌为表达载体的活载体疫苗和亚单位疫苗也已研究多年。最近，有报道用酵母表达系统生产IBDV亚单位疫苗，在实验室研究和田间实验中取得较好的效果。用大肠杆菌表达系统研究开发亚单位疫苗和活菌载体疫苗的研究也进行了多年，但已知的研究结果是，大肠杆菌表达IBDV VP2蛋白无免疫原性或形成不溶性包含体无法用作疫苗。

发明内容
本发明的目的在于提供一种E.coli.BL21/pET-28a-VP2菌种和用该菌种生产IBD基因工程亚单位疫苗和生产IBD基因工程活菌载体疫苗的方法及应用。
本发明的技术方案是1、总RNA的提取总RNA使用生工UNIQ-10Trizol RNA提取试剂盒进行。简要过程如下法氏囊取自IBD病死鸡，研磨和匀浆。将细胞冻融3次。取50毫克组织匀浆置于一只聚乙烯离心管中，室温下加入0.5毫升Trizol试剂。加盖密封并剧烈振荡15秒。加氯仿/异戊醇100微升，剧烈振荡30秒。置4℃条件下12,000rpm离心15分钟。将上层水相的无色水溶液转入另外一只无RNA酶的离心管中，每450微升液体加无水乙醇150微升温和振摇。将整个溶液转入UNIQ-10柱和收集管中。室温放置2分钟。室温下12,000rpm离心1分钟。将柱从收集管中取出，弃去收集管中废液。将柱重新放入同一收集管中。加入450微升RW液于UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。室温12,000rpm离心1分钟。从收集管中取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放入同一个收集管中。重复前一步骤一次。将柱在12,000rpm下离心1分钟。将柱转入无RNA酶的离心管中。加50微升DEPC处理过的无RNA酶的水于柱中央的膜上，70℃保温2分钟。将管置12000rpm下离心1分钟。离心管中的溶液就是法氏囊和IBDV的总RNA。
2、VP2基因克隆根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA。取总RNA液8微升，加1微升40μmol/L反向引物70～80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟。随后依次加入4μ1M-MLV 5×RTbuffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入步骤1的标本管中，每管11微升，使总体积达20μ1，离心数秒钟后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活RT酶。
cDNA的PCR扩增10μl cDNA液，5μl 10×Ex Taq缓冲液，4单位TaKaRaEX Taq(一种高保真DNA聚合酶，同时能在扩产物未端给出一个额外A用于T载体连接)，两种40μmol引物各0.5μl。4μl dNTP混合液(每管2.5mM)，总体积为50μl。PCR温度循环程序为94℃，5分钟；(94℃60秒，64℃120秒，72℃120秒)循环35次；72℃，10分。用1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，相应的核酸带被切下，并用小量胶提取试剂盒进行纯化。分离的VP2片段被连接到pMD18-T载体上。连接的DNA质粒转化E.coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LBG板上的白色菌株被分离出来。提取质粒DNA，用限制性内切酶和PCR法分析VP2的存在和连接方向。
3、表达载体的构建将含有正确方向和序列的VP2基因片段用限制性内切酶切下，VP2基因片段用与上述相同的琼脂糖凝胶电泳后回收的方法进行回收。然后亚克隆到线性化的pET-28a载体上，线性化的过程使用相同的限制性内切酶。新质粒命名为pET-28a-VP2。将它用来转化E.coli.BL21。转化菌用PCR和限制内切酶进行鉴定。分离含有VP2的cDNA克隆并测序。
表达序列测序结果atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg48Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg1 5 10 15agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc96Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act 144Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct 192Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac 240Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr65 70 75 80aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac 288Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr85 90 95aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca 336Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc 384Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg 432Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140atg tct gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta 480Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg 528Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly165 170 175tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa 576Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata 624Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg 672Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc 720Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata 768Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc 816Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac 864Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca 912Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag 960Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg 1008Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta 1056Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg 1104Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val355 360 365agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa eta gca aag aac ctg gtc 1152Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg 1200Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca 1248Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc 1296Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc 1344Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445cgg gcc ata agg aaa gct tgc ggc cgc act cga gca cca cca cca cca 1392Arg Ala Ile Arg Lys Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro450 455 460cca ctg aga tcc ggc tgc taa 1413Pro Leu Arg Ser Gly Cys End465 4704、大肠杆菌中的表达过程挑取大肠杆菌BL21/pET-28a-VP2单菌落，接种于10ml的LB+Kan培养液中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～1.0，加入IPTG使终浓度为1mmol/L或加入α-乳糖至终浓度20mmol/L，37℃再培养5小时。取出后5000rpm×10min。将菌体沉淀重悬于1/10体积(1ml)的PBS液中。加溶菌酶至100μg/ml，同时加入1/10体积的TritonX-100，PMSF 3μl，37℃保温1小时。反复冻融3次，用超声波细胞破碎器处理剪切DNA至溶液不再粘稠。12,000g离心15分钟，分离可溶部分和不溶部分。对可溶部分进行抗原活性检查。
5、疫苗的制备IBD亚单位油乳剂疫苗的制备将上述溶菌液的上清用20-45％饱和度的硫酸铵沉淀。收集沉淀重溶于适量的PBS液中，转入透析袋中对PBS进行透析。将溶液稀释至VP2的AGP抗原滴度为1/16。按1份VP2蛋白溶液加2份油乳剂，并进行分散制成油乳剂疫苗(油乳剂的制备矿物油∶司本-80＝9∶1，充分混匀后加入4％吐温-80，2％硬脂酸铝，充分混合，高压蒸汽灭菌后备用)。
大肠杆菌BL21/pET-28a-VP2IBD活菌载体疫苗制备其过程与前述的“表达载体的构建”过程相同，但不作溶菌处理。收集菌体加入适量的稳定剂冻干处理后备用。
IBD中等毒力活疫苗B87的准备IBD活疫苗系中国杭州荐量兽用生物制品有限公司生产，按说明书要求用灭菌生理盐水稀释后备用。
6、免疫实验(1)试验鸡从荆州康尔美种鸡场购买200只1日龄艾维因商品肉仔鸡。第18(12)日龄时，对每只鸡采血，以琼脂凝胶免疫扩散试验(AGP)检测母源抗体。剔除母源抗体阳性鸡，将母源抗体阴性鸡随机分成5组，分别为A、B、C、D、E、组。
(2)接种方法均为肌肉注射。
(3)分组及免疫接种表1 鸡免疫实验分组及免疫接种

(4)攻毒试验IBDV强毒株BC 6/85，购自中国兽药监察所，用2×104鸡胚半数感染量(EID50)/ml攻毒时，每只鸡肌肉注射0.1ml。第二次免疫接种后10天攻毒。
(5)免疫效果确定依据攻毒后第10天剖杀试验鸡。检查法氏囊，并观察其外观色泽。取一部分法氏囊作组织切片，以观察组织学病理变化。
法氏囊组织学异常变化分析依据，见表2。
表2 IBDV感染后法氏囊损伤组织学评分系统

(7)免疫接种后鸡体内抗IBDV抗体产生情况见表3。
表3 实验鸡体内抗IBDV抗体AGP检测结果出率

由表3可见，C组(E.coli.BL21/pET28a-VP2活菌苗组)和D组(VP2亚单位油剂苗组)的抗体阳性均达100％。而E组商品疫苗抗体阳性检出率为33.3％。
(8)攻毒后第10天实验验鸡的法氏囊组织学检查结果表4表4 组织学检查法氏囊损伤评分结果

本发明具有以下优点和积极效果(1)本菌种能稳定可靠的表达IBDV VP2蛋白。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP2蛋白的抗原活性，生产成本较低。
(2)该菌种可用来生产基因工程亚单位疫苗和基因工程活菌载体疫苗，用于IBD的预防。
(3)将表达的VP2蛋白纯化后可作为基因工程抗原用于ELISA的标准抗原制备，或AGP等其它标准抗原的制备。
中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)分类命名Escherichia coli BL21/pET-28a-VP2保藏日期2004年5月24日保藏单位中国武汉武汉大学邮编430072保藏编号CCTCC NOM204038具体实施方式
将编码IBDV超强毒株的VP2基因连接到pET-28a质粒上构成表达质粒pET-28a-VP2，转化Escherichia coli BL21，得到基因工程菌种Escherichia coliBL21/pET-28-VP2。该菌种可用于基因工程亚单位疫苗的生产，为IBD的预防提供一个新方法。该菌种也可用于VP2基因工程抗原的生产，用于鸡血清抗IBD抗体的检测。
基因序列Organization ApplicantCity湖北荆州Country中国PostalCode434025PhoneNumber07168496979EmailAddressrongjunl@public.js.hb.cn<110>OrganizationName长江大学<120>Title一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用<130>AppFileReference一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用<140>CurrentAppNumbercn<141>CurrentFilingDate2004-08-28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>Length1413SequenceNameIBDV subunit vaccine VP2 gene sequence<212>TypeDNA<213>OrganismNameInfectious bursal disease virusFeature<221>FeatureKeyCDS<222>LocationFrom1<222>LocationTo1413<400>PreSequenceString1atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180cctggtttcc ctggctcaat tgtgggcgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480ggggaggggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600gacaggccca gagtctacac tataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660caagcaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcggacaat 840gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc1020aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg1080tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca1140aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact1260gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga1320gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggaaag cttgcggccg cactcgagca1380ccaccaccac caccactgag atccggctgc taa 1413Sequence<210>2<211>Length470<212>TypePRT<213>OrganismNameInfectious bursal desease virus<221>FeatureKeyVP2<222>LocationFrom1<222>LocationTo470<400>PreSequenceString2MTNLQDQTQQ IVPFIRSLLM PTTGPASIPD DTLEKHTLRS ETSTYNLTVG DTGSGLIVFF 60PGFPGSIVGA HYTLQSNGNY KFDQMLLTAQ NLPASYNYCR LVSRSLTVRS STLPGGVYAL120NGTINAVTFQ GSLSELTDVS YNGLMSATAN INDKIGNVLV GEGVTVLSLP TSYDLGYVRL180GDPIPAIGLD PKMVATCDSS DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QAGGVTITLF SANIDAITSL240SIGGELVFQT SVQGLILGAT IYLIGFDGTA VITRAVAADN GLTAGTDNLM PFNIVIPTSE300ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAS GSLAVTIHGG NYPGALRPVT LVAYERVATG360SVVTVAGVSN FELIPNPELA KNLVTEYGRF DPGAMNYTKL ILSERDRLGI KTVWPTREYT420DFREYFMEVA DLNSPLKIAG AFGFKDIIRA IRKACGRTRA PPPPPLRSGC 470
权利要求
1.一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗生产的菌种，其特征在于Escherichia coli BL21/pET-28a-VP2，CCTCC NOM204038。
2.根据权利要求1所述的菌种，其特征在于在制备过程中连接到pET-28a上的修饰过的传染性法氏囊病毒VP2基因序列和推导的氨基酸序列，此序列为atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg 48Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg1 5 10 15agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc 96Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act 144Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct 192Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac 240Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr65 70 75 80aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac 288Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr85 90 95aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca 336Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc 384Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg 432Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140atg tct gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta 480Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile GIy Asn Val Leu Val145 150 155 160ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg 528Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly165 170 175tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa 576Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata 624Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg 672Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc 720Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata 768Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc 816Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac 864Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca 912Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag 960Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg 1008Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta 1056Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg 1104Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val355 360 365agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca aag aac ctg gtc 1152Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg 1200Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca 1248Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc 1296Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc 1344Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445cgg gcc ata agg aaa gct tgc ggc cgc act cga gca cca cca cca cca 1392Arg Ala Ile Arg Lys Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro450 455 460cca ctg aga tcc ggc tgc taa 1413Pro Leu Arg Ser Gly Cys End465 470
3.根据权利要求1或2所述的菌种，其特征在于诱导表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的方法，这种表达蛋白是可溶性具有抗原活性的蛋白，可用于制备鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗。
4.根据权利要求1或2所述的菌种，其特征在于经诱导表达，冷冻干燥后可直接用作活菌载体疫苗，预防鸡传染性法氏囊病。
5.根据权利3所述的菌种，其特征在于诱导表达出来的VP2蛋白，经过纯化后可作为基因工程抗原，用于传染性法氏囊病的抗体检测。
全文摘要
本发明涉及一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗生产的菌种，其特征是Escherichia coli BL21/pET－28a－VP2，CCTCC NOM204038。该菌种的构建过程是先在表达质粒pET－28a上插入传染性法氏囊病毒的VP2蛋白基因构建成原核表达质粒；然后用该表达质粒转化大肠杆菌BL21，IBDV的VP2蛋白基因是从湖北荆州分离的超强IBDV野毒株中克隆出来的。使用乳糖作为诱导剂，诱导Escherichia coli BL21/pET－28a－VP2表达VP2蛋白，经过适度纯化后可加入油乳剂制成油乳剂疫苗。此疫苗可用于肉用仔鸡、蛋鸡、种鸡等预防传染性法氏囊病。
文档编号C12N15/33GK1754959SQ20041008006
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月27日 优先权日2004年9月27日
发明者荣俊, 程太平, 刘晓娜, 杨待建 申请人:长江大学