专利名称：检测或定量测定线粒体dna3243变异的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测和定量线粒体DNA 3243突变的方法及其试剂盒。
背景技术：
线粒体DNA第3243位上A→G突变(mt3243)是一种在1％日本糖尿病患者中存在的突变，并且在由单基因异常引起的糖尿病状况中发生频率最高。线粒体基因异常地特征之一是正常和异常线粒体DNAs以各种比例共存，这种状态称作异胞质基因。mt3243突变异胞质基因的比率据说与病理学状况的进展程度有关，并且认为其可用于测定病理学状况的进展程度或治疗效果。
如果存在mt3243突变，那么在突变的位置上出现限制性内切酶的识别位点。因此，可由通过PCR扩增DNA以便扩增包括突变位置的部分、用限制性内切酶消化扩增产物以及通过电泳测定DNA是否已经被消化的方法(PCR-RFLP)检测突变(例如，参考The JapaneseJournal of Clinical Pathology，vol.44，8，pp.778-782，1996)。
由于PCR将几个分子的模板扩增几十亿次，因此甚至痕量的污染物都可能导致假阳性或假阴性结果。在PCR-RFLP中，需要收集扩增产物并将其在PCR后用限制性内切酶进行处理，因而扩增产物可能污染随后的反应体系。相应地，可能获得假阳性或假阴性结果。
此外，将DNA用限制性内切酶处理，然后在PCR完成后进行电泳。因此，检测所需的时间变得非常长。另外，因为该过程复杂，所以很难自动化。此外，因为在PCR期间重复进行变性和退火，所以正常型序列和突变型序列可能错误地相互结合。这种产物不被限制性内切酶识别，因此其不被消化(只有当双链都是突变型时，DNA才被限制性内切酶消化)。因此，在异胞质基因比率的定量中，突变型的比例变得比实际值更低。
与此同时，作为一种等位基因特异性扩增方法，一种称作MASA(突变等位基因特异性扩增)法的方法是已知的(例如，参考SekiyaT.等编，“PCR Front Line-From Basic Techniques ToApplications”，Kyoritsu Shuppan，pp.140-142，1997)。在这种方法中，使用一个引物的3’端设计成为是突变的核苷酸的引物对，通过进行PCR反应特异性扩增突变等位基因。
此外，通过使用荧光变化取决于扩增产物量的系统；通过测量荧光实时定量PCR扩增产物；以及基于所述结果，定量样本中的核酸(实时定量PCR)的方法也是已知的。根据该方法，通过进行MASA法，可定量由MASA方法获得的扩增产物。
此外，通过PCR扩增含有突变的区域，然后通过使用荧光染料标记的核酸探针进行解链曲线分析，以及根据解链曲线分析的结果分析突变的方法也是普遍已知的(Clinical Chemistry，vol.46，5，pp.631-635，2000；日本专利申请公开(Kokai)No.2002-119291)。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测和定量mt3243突变的方法及其试剂盒。此外，本发明的另一个目的是鉴定有效检测mt3243突变的淬灭探针并因此提供检测mt3243突变的方法及其试剂盒。
本发明的发明人发现通过以线粒体DNA中含有mt3243突变的特异性区域为基础设计引物对，可由MASA方法检测mt3243突变。
关于探针的设计，关于上述使用探针方法的文献仅教导，探针应当设计成当一端用荧光染料标记的淬灭探针与靶核酸杂交时，两个或更多探针-核酸杂交体的核苷酸对应当在末端部分形成至少一对G和C。对于mt3243突变，本发明的发明人设计了满足上述条件的淬灭探针并且尝试用于检测。然而，能用于检测的淬灭探针不是很容易获得的。
本发明的发明人发现通过基于含有mt3243突变的特异性区域设计淬灭探针，可使用淬灭探针通过解链曲线分析检测mt3243突变。
本发明是在上述发现的基础上完成的并且提供下列各项。
(1)一种检测具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，其包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行PCR以及检测扩增产物，其中用于PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
(2)根据(1)的方法，其中用于PCR的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(3)一种定量具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，其包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行定量PCR以及定量扩增产物，其中定量PCR是一种使用荧光变化取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR中的扩增产物，并且在测量结果的基础上定量样品中DNA的方法，且用于定量PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
(4)根据(3)的方法，其中用于定量PCR的引物包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(5)一种测定样品中所含线粒体DNA 3243突变的异胞质基因比率的方法，其包括
(a)通过如在(3)或(4)中所定义的方法定量具有线粒体DNA 3243突变的DNA，
(b)通过定量线粒体DNAs的方法定量线粒体DNAs，所述方法包括使用从样品获得的DNA作为模板进行定量PCR以及定量扩增产物，其中定量PCR使用荧光变化取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR中的扩增产物，以及在测量结果的基础上定量样品中的DNAs，和
(c)从(a)和(b)的结果中计算线粒体DNA 3243突变的异胞质基因比率。
(6)根据(5)的方法，其中在步骤(b)中使用的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
(7)根据(3)到(6)中任何一项的方法，其中该系统包括其5’端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列或者从SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列，或者包括其3’端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，并且其具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及测量荧光染料的荧光。
(8)用于如在(1)中所定义方法的试剂盒，其包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
(9)根据(8)的试剂盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(10)用于如在(3)中所定义方法的试剂盒，其包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
(11)根据(10)的试剂盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(12)用于如在(5)中所定义方法的试剂盒，其包括第一引物对，所述第一引物对包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物，以及用于定量线粒体DNAs的第二引物对。
(13)根据(12)的试剂盒，其中所述第一引物对包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
(14)根据(12)的试剂盒，其中所述第二引物对包括具有SEQID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
(15)根据(10)-(14)中任何一项的试剂盒，其进一步包括其5’端用荧光染料标记的核酸探针，其中杂交后荧光染料的荧光减少，并且其具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列或者具有从SEQ IDNO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列，或者包括其3’端用荧光染料标记的核酸探针，其中杂交后荧光染料的荧光减少，并且其具有与从SEQ ID NO2核苷酸中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
(16)末端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
(17)根据(16)的核酸探针，其中所述核酸探针具有SEQ ID NO21或22的核苷酸序列。
(18)一种检测突变的方法，其包括通过使用荧光染料标记的核酸探针对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析和测量荧光染料的荧光，以及在解链曲线分析结果的基础上检测突变，其中单核苷酸多态性是在线粒体DNA中第3243位上的突变，且核酸探针是如在(16)或(17)中所定义的核酸探针。
(19)根据(18)的方法，其中扩增样品中所含核酸中含有单核苷酸多态性位点的区域以获得显示单核苷酸多态性的核酸。
(20)根据(19)的方法，其中所述扩增是通过使用DNA聚合酶的方法进行的。
(21)根据(20)的方法，其中所述扩增是在存在核酸探针时进行的。
(22)用于如在(18)中所定义方法的试剂盒，其包括其末端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
(23)根据(22)的试剂盒，其中所述核酸探针具有SEQ ID NO21或22的核苷酸序列。
(24)根据(22)或(23)的试剂盒，其进一步包括通过使用DNA聚合酶的方法用于扩增线粒体DNA中含有第3243位突变的区域的引物。
在本发明的说明书中，与目标核苷酸序列互补的核苷酸序列意思是与全长目标核苷酸序列的目标核苷酸序列互补的核苷酸序列。
附图简述
图1显示通过实施例1的方法(使用引物F-24和R-19)获得的总序列的定量结果。
图2显示通过实施例1的方法(使用引物F-24和R-mt-16)获得的突变型序列的定量结果。
图3显示通过实施例1的方法(使用引物F-24和R-mt-16)获得的含有不同比例突变基因的样品的定量结果。
图4显示不能鉴定突变的淬灭探针的位置。
图5显示能鉴定突变的淬灭探针的位置。
图6显示通过实施例2的方法获得的含有不同比例突变基因的样品的定量结果。在图中，“野生的”表示野生型，“突变的”表示突变型。
实现本发明的最佳方式
<1>本发明的第一种检测方法
技术领域：
本发明的第一种检测方法是检测具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，包括使用从样品获得的DNA作为模板进行PCR并检测扩增产物，其特征是用于PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
样品不作特别限制，只要它含有线粒体。其实例包括血液、口腔拭子、组织等。在可制备线粒体DNAs的条件下以普通方式从这些样品中获得DNAs。
在本发明的第一种检测方法中可通过普通的PCR方法进行PCR，只是除了将从样品中获得的DNA用作模板，并且使用特异性引物。
在本发明中使用的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。也就是说，在PCR中使用的引物之一是具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
该引物的3’端是mt3243突变的位点。因此，只有当该引物退火时才发生通过DNA聚合酶的延伸反应，因此特异性扩增具有突变型序列的DNA。因此，可通过检测扩增产物来检测具有mt3243突变的DNA。
可以以与设计常规PCR引物对的方法相同的方式设计用于PCR的引物，只是除了将它们在能进行PCR的区域中设计并且包括其3’端应当设计成是上述mt3243突变位点的引物。引物的长度和Tm通常是12到40聚体以及40到70℃，优选地分别是16到30聚体和55到60℃。引物对的引物可能不等长。然而，优选引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃内)。Tm值是通过最相邻方法计算得到的值。引物对的实例包括具有SEQ ID NO3和5核苷酸序列的引物。
根据本领域技术人员已知的方法，考虑到PCR条件，可设计在特异性区域中的上述引物对。可通过使用设计引物的计算机程序设计引物对。
可根据常规PCR方法选择PCR条件。用于本发明第一种检测方法的PCR反应混合物组成的一般实例如下。
表1
此外，用于本发明第一种检测方法的温度循环的一般实例如下，且这种温度循环通常重复25到40次。
(1)在90到98℃变性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
当在一个步骤中进行退火和延伸时，例如，可使用60到70℃持续10到180秒的条件。
在本发明的第一种检测方法中，可根据检测扩增产物的常规方法检测扩增产物。例如，可通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，或者在存在当结合扩增产物时其荧光发生改变的底物时测量荧光(例如，结合双链DNA的荧光染料，由于结合等原因其荧光强度发生改变)。
<2>本发明的定量方法
技术领域：
本发明的定量方法是一种定量具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行定量PCR和定量扩增产物，其特征在于定量PCR是一种使用其中荧光改变取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR中的扩增产物以及在测量结果的基础上定量样品中DNA的方法，用于定量PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
样品DNA和引物的制备为如上述关于本发明检测方法中那样解释的。
可根据已知的方法进行定量PCR，其中通过使用荧光变化取决于扩增产物量的系统并且测量荧光来实时定量PCR的扩增产物，以及在结果的基础上定量样品中的DNA。这种方法的实例包括使用与扩增产物杂交的荧光-标记探针的方法、使用特异性结合双链DNA的试剂的方法等。
荧光-标记探针的实例包括在5’端与荧光染料结合并且在3’端与吸收荧光染料所发射能量的淬灭底物结合的探针(例如，TaqMan探针)、其末端用杂交后荧光减少的荧光染料标记的核酸探针(例如，见日本专利申请公开No.2002-119291)等。
作为实例，下面通过参考其末端用杂交后荧光减少的荧光染料标记的核酸探针(淬灭探针)，将解释可在本发明中使用的探针。在这个实施方案中，淬灭探针设计成，当探针与靶核酸杂交时，包括两个或更多核苷酸对的探针-核酸杂交体应当在末端部分中形成至少一对G和C。根据上述设计的并且其5’端用荧光染料标记的探针的实例包括具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列或者从SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列的那些探针。此外，3’端用荧光染料标记的探针的实例包括具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的那些探针。
在本发明中所使用的淬灭探针可能与在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的淬灭探针相同，只是除了其应当具有上述这类核苷酸序列外。在本发明中所使用的淬灭探针的核苷酸序列的实例包括SEQ ID NOS6到10的序列。作为荧光染料，可使用在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的那些荧光染料，且其具体实例包括FAM(商标)、TAMRA(商标)、BODIPY(商标)FL等。可根据常规方法将荧光染料结合到寡核苷酸上，例如，通过在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的方法。
除了通过使用特异性引物对扩增线粒体DNA中含有mt3243突变的区域外，可根据基于测量荧光染料荧光的实时PCR方法进行本发明的定量方法。在本发明的定量方法中，在存在上述探针时进行扩增，且本领域技术人员根据所使用的探针可以很容易地调整扩增反应的条件等。
用于本发明定量方法的PCR反应混合物组成的一般实例如下。
表2
此外，温度循环的一般实例如下，且这种温度循环通常重复25到40次。
(1)在90到98℃变性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
当在一个步骤中进行退火和延伸时，例如，可能提及60到70℃，持续10到180秒的条件。
在本发明的定量方法中，在进行PCR时进行检测。因此，反应完成后不必处理扩增产物。因此，没有被扩增产物污染的风险。此外，在进行PCR时进行检测，可显著减少检测所需时间。此外，因为用与扩增所需的相同装置进行检测，所以不必移动容器。因此，方法的自动化也很容易。此外，因为不使用限制性内切酶，所以该方法显示高定量性(quantitativity)。
本方法也高度灵敏，并且甚至能用于检测1％或更低的异胞质基因比率。因此，通过用上述定量方法定量具有mt3243突变的DNA并且定量总线粒体DNAs，可在那些定量结果的基础上获得mt3243突变的异胞质基因比率。也就是说，本发明提供一种测定mt3243突变异胞质基因比率的方法。本发明测定方法的特征是包括(a)通过本发明的定量方法定量具有线粒体DNA 3243突变的DNA，(b)通过定量线粒体DNAs的方法定量线粒体DNAs，所述方法包括使用从样品获得的DNA作为模板进行定量PCR和定量扩增产物，其中定量PCR使用荧光变化取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR扩增产物，和根据测量的结果定量样品中的DNAs，以及(c)从(a)和(b)的结果中计算线粒体DNA 3243突变的异胞质基因比率。
除了将引物设计成不管存在或不存在mt3243突变都能扩增线粒体DNAs外，可以以与步骤(a)中相同的方式进行步骤(b)。
可以以与设计常规PCR引物对的方法相同的方式设计用于步骤(b)中PCR所使用的引物对。引物的长度和Tm通常是12到40聚体和40到70℃，优选分别是16到30聚体和55到60℃。引物对的引物可能不等长。然而，优选引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃内)。Tm值是通过最相邻方法计算得到的值。在步骤(b)中使用的引物对优选绝大部分与在步骤(a)中所使用的引物对重叠。通过设计上述引物对，可减少引物对之间的差异对扩增效率的影响，并且可获得正确的异胞质基因比率。引物对的实例包括具有SEQ ID NOS3和4核苷酸序列的引物对。
因为可在步骤(a)中获得突变型线粒体DNAs的定量值，以及可在步骤(b)中获得总线粒体DNAs的定量值，所以可通过将(a)的定量值除以(b)的定量值获得异胞质基因比率。因为在步骤(c)中使用步骤(a)和(b)的定量结果，所以可同时进行步骤(a)和(b)，或者可首先进行它们之中的任何一个步骤。
<3>本发明的检测试剂盒
本发明的检测试剂盒是一种用于本发明第一种检测方法的试剂盒。该试剂盒的特征是包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
引物是如在上述关于本发明检测方法中所解释的。
在本发明的试剂盒中，引物可作为混合物提供或者分开地包括在其中。
本发明的检测试剂盒除了引物外可进一步包括PCR和/或检测扩增产物必需的试剂。
<4>本发明的定量试剂盒
本发明的定量试剂盒是一种用于本发明定量方法的试剂盒。该试剂盒的特征是包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
本发明的定量试剂盒优选地包括其5’端用荧光染料标记的核酸探针(淬灭探针)，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列，或者具有从SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列。
引物和淬灭探针是如上述关于本发明定量方法中所解释的。
本发明的定量试剂盒除了淬灭探针外可进一步包括本发明定量方法中PCR所必需的试剂。当使用本发明的定量试剂盒测量异胞质基因比率时，在步骤(b)中所使用的本发明定量试剂盒中的引物对优选绝大部分与在步骤(a)中所使用的引物对重叠。
在本发明的定量试剂盒中，可分别包括淬灭探针、引物和其它试剂，或者可作为混合物提供其一部分。
<5>本发明的探针和本发明的第二种检测方法
技术领域：
本发明的探针是其末端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
本发明的探针可类似于在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的淬灭探针，只是除了其具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列(在mt 3243突变中具有突变型核苷酸的序列)中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在本发明中所使用的淬灭探针的核苷酸序列的实例包括SEQ ID NOS21和22的核苷酸序列。作为荧光染料，可使用在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的那些荧光染料，其具体实例包括FAM(商标)、TAMRA(商标)、BODIPY(商标)FL等。可以以普通方式将荧光染料结合到寡核苷酸上，例如，通过在日本专利申请公开No.2002-119291中所描述的方法。
本发明的第二种检测方法是一种检测突变的方法，其通过使用用荧光染料标记的核酸探针对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析和测量荧光染料的荧光，以及在解链曲线分析结果的基础上检测突变来实现，且其特征是单核苷酸多态性是3243突变，且核酸探针是本发明的探针。
除了扩增含有mt3243突变的区域和使用本发明的探针外，可根据核酸扩增和解链曲线分析(Tm分析)的常规方法进行本发明的第二种检测方法。
作为核酸扩增的方法，优选使用聚合酶的方法，其实例包括PCR、ICAN、LAMP等。当通过使用聚合酶的方法进行扩增时，优选在存在本发明的探针时进行扩增。本领域技术人员可根据所使用的探针很容易地调整扩增的反应条件和其它条件。在这种方法中，核酸扩增后只分析探针的Tm，因而反应完成后不必处理扩增产物。因此，没有被扩增产物污染的风险。此外，因为用与扩增所需的相同装置进行检测，所以甚至不必移动容器。因此，方法的自动化也很容易。
作为例子，下面通过参考使用PCR的情况，将进一步解释该方法。可以以与设计常规PCR中引物对方法相同的方式设计用于PCR的引物对，只是除了将其设计成应当扩增出能与本发明探针杂交的区域。引物的长度和Tm通常是12到40聚体和40到70℃，优选分别是16到30聚体和55到60℃。引物对的引物可能不等长。然而，优选引物的Tm值基本上相等(相差通常在2℃内)。Tm值是通过最相邻方法计算得到的值。引物对的实例包括具有SEQ ID NO2和3核苷酸序列的引物的引物对。
优选在存在本发明探针时进行PCR。这使得不用在扩增反应完成后进行任何处理扩增产物的操作就能够进行Tm分析。本领域技术人员可根据所使用的探针很容易地调整引物的Tm值和PCR的反应条件。
PCR反应混合物组成的一般实例如下。
表3
此外，温度循环的一般实例如下，且该温度循环通常重复25到40次。
(1)在90到98℃变性1到60秒
(2)在60到70℃退火10到60秒
(3)在60到75℃延伸10到180秒
当在一个步骤中进行退火和延伸时，例如，可提及60到70℃，持续10到180秒的条件。
除了测量结合本发明探针的荧光染料的荧光外，可以以常规方式进行Tm分析。可通过使用具有适于荧光染料的波长的激发光并且测量发射波长的光强度来测量荧光。在Tm分析中温度增加速率通常是每秒钟0.1到1℃。用于Tm分析的反应混合物的组成没有特别限制，只要具有与探针核苷酸序列互补序列的探针和核酸可相互杂交即可。然而，单价阳离子浓度通常是1.5到5mM，且pH通常是7到9。因为使用DNA聚合酶的扩增方法如PCR的反应混合物通常满足这些条件，所以扩增后反应混合物可用于Tm分析。
可在Tm分析结果的基础上以普通方式检测mt3243突变。在本发明的第二种检测方法中的检测不仅包括检测存在或不存在突变，而且包括定量突变型DNA和测定野生型DNA和突变型DNA的比率。
<6>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是一种用于本发明第二种检测方法的试剂盒。该试剂盒的特征是包括其末端用荧光染料标记并且杂交后荧光染料的荧光减少的核酸探针(淬灭探针)，其中探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
淬灭探针是如上述关于本发明的探针所解释的。
本发明的试剂盒除了淬灭探针外，可包括在本发明第二种检测方法中核酸扩增所必需的试剂，特别是，用于使用DNA聚合酶扩增的引物。
在本发明的试剂盒中，可分别包括淬灭探针、引物和其它试剂，或者可作为混合物提供其一部分。
实施例
通过参考下列实施例将更具体地解释本发明。
实施例1
根据含有人线粒体3243 A→G突变(mt3243突变)位点的核苷酸序列(SEQ ID NO2，第243位核苷酸对应于线粒体基因中的第3243位置)，设计表4中所示的引物，以便能扩增含有mt3243突变的区域。在表4中，SEQ ID NO2的核苷酸序列中用核苷酸数字标出了位置。
表4
引物
然后，设计表5中所示末端具有C的探针。在表5中，在SEQ IDNO1或2的核苷酸序列中用核苷酸数字标出了位置。此外，核苷酸序列中的大写字母代表mt3243突变的位置，且3’端的(P)意思是磷酸化的。用BODIPY(商标)FL以常规方式标记探针。
表5
探针
通过使用整合了mt3243突变周围区域的质粒作为样品和iCycler(Bio-Rad)，在下面所示的条件下进行实时PCR。在实时分析中激发波长和检测波长分别是490nm和530nm。
表6
反应混合物的组成
1.用于定量正常序列和突变型序列的系统(用于定量总线粒体DNA数目的系统)
2.定量突变型序列的系统(定量具有突变的线粒体DNAs数目的系统)
表7
制备含有具有各种拷贝数的正常型序列的质粒的样品作为样品，并在上述系统1中通过使用探针5FL-3-30作为探针进行定量。结果显示于图1中。正如从图中所示结果看到的，其进一步证实定量是可行的。
制备含有具有各种拷贝数的突变型序列的质粒的样品作为样品，并在上述系统2中通过使用探针5FL-3-30作为探针进行定量。结果显示于图2中。正如从图中所示结果看到的，其进一步证实定量是可行的。
制备含有各种比率的具有突变型序列的质粒和具有正常型序列的质粒的样品混合物作为样品，并在上述系统2中通过使用探针5FL-3-30作为探针进行定量。结果显示于图3中。当通过使用上述系统1定量相同的样品时，计算突变型序列的比率，获得与制备样品时的比率一致的结果。
当探针5FL-1-24、5FL-1-26、5FL-1-28和5FL-mut-5-23用作探针时，也获得类似的结果。
在图1到3中，垂直轴代表与反应开始时强度有关的荧光强度，其被认为是100％，且水平轴代表PCR循环数。
实施例2
在含有人线粒体3243A→G突变(mt3243突变)位点的核苷酸序列(SEQ ID NO2，第243位核苷酸对应于线粒体基因中第3243位)的基础上设计表8中所示的引物，以便可扩增含有mt3243突变的区域。在表8中，在SEQ ID NO1的核苷酸序列中用核苷酸数字标出了位置。
表8
引物
然后，设计表9中所示末端具有C的探针。在表9中，在SEQ IDNO1的核苷酸序列中用核苷酸数字标出位置。此外，核苷酸序列中的大写字母代表mt 3243突变的位置，且3’端的(P)意思是磷酸化的。用BODIPY(商标)FL或TAMRA(商标)以常规方式标记探针。
表9
探针
通过使用整合了mt3243突变周围区域的质粒作为样品和Smart循环仪系统(Cephied)，在下面所示条件下进行PCR和Tm分析。在Tm分析中激发波长和检测波长分别是450到495nm和505到537nm(BODIPY FL)以及527到555nm和565到605nm(TAMRA)。
表10
反应混合物的组成
表11
通过使用每种探针进行PCR和Tm分析。作为结果，仅当使用探针3T-mt-R2-18、3T-mt-R2-17、3FL-mt-R2-18和3FL-mt-R2-17时，在Tm分析中观察到可分析的荧光强度的变化。在图4和5中显示相对于含有mt 3243突变的核苷酸序列的探针的位置。在图中所显示的野生型序列和突变型序列分别对应于SEQ ID NOS1和2核苷酸序列中的第214到263位核苷酸。此外，在图中，F表示荧光染料。基于图4和5中所示的位置，认为探针是否可用于Tm分析取决于与荧光染料结合的C的位置，而探针的长度不是那么重要，只要包括多态性位点即可。
制备各种比率的含有具有突变型序列的质粒和含有具有正常型序列的质粒的样品混合物作为样品，且通过使用探针3FL-mt-R2-17进行定量。结果显示于图6中。无论突变型序列的比率如何，都可区别性地检测出突变型序列(突变的)和正常型序列(野生的)。
当使用探针3T-mt-R2-18、3T-mt-R2-17和3FL-mt-R2-18时，也获得相似的结果。
在图6中，垂直轴代表具有反符号(inverted sign)的荧光强度的一次导数值(-dF/dt)，而水平轴代表温度(℃)。
工业应用性
根据本发明，提供了检测和定量线粒体DNA 3243突变的方法及其试剂盒。
此外，根据本发明，提供了有效检测mt 3243突变的淬灭探针，并且进一步提供了通过使用所述探针检测mt 3243突变的方法及其试剂盒。因为在几十秒内完成Tm分析，所以可显著降低检测所需时间。根据本发明优选的实施方案，其中联合存在探针时的核酸扩增和Tm分析，在核酸扩增后只分析探针的Tm，因此反应完成后不必处理扩增产物。因此，没有被扩增产物污染的风险。此外，因为可用与扩增所需相同的装置进行检测，所以甚至不必移动容器。因此，方法的自动化也很容易。
序列表
<110>Arkray，Inc.
<120>检测或定量测定线粒体DNA 3243变异的方法及其试剂盒
<130>G873-OPC4052
<150>JP 2003-111173
<151>2003-04-16
<150>JP 2003-114382
<151>2003-04-18
<160>22
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>等位基因
<222>243
<400>1
ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 60
gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctaccttc aaattcctcc120
ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga180
tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc240
agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt300
aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca360
ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac420
gtggtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa480
gagcccctaa aacccgccac500
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>等位基因
<222>243
<400>2
ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac 60
gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctaccttc aaattcctcc120
ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga180
tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc240
agggcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt300
aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca360
ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac420
gtggtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa480
gagcccctaa aacccgccac500
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ctcaacttag tattataccc acac24
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ttttatgcga ttaccgggc 19
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
atgcgattac cgggcc 16
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>6
cagggtttgt taagatggca ggg 23
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>7
ccaagaacag ggtttgttaa gatg24
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>8
ccaagaacag ggtttgttaa gatggc 26
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
ccaagaacag ggtttgttaa gatggcag28
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
cacccaagaa cagggtttgt taagatggca 30
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
catctcaact tagtattata cccacac 27
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
agaggaattg aacctctgac tg 22
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
tttgttaaga tggcagggcc 20
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
tttgttaaga tggcagggcc c 21
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
gcgattaccg ggccctgcca tc 22
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>16
ccgggccctg ccatcttaac 20
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>17
ttaagatggc agggccc17
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
ttaagatggc agggcc 16
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>19
gattaccggg ccctgccatc 20
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>20
gcagggcccg gtaatc 16
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>21
gggccctgcc atcttaac 18
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>22
ggccctgcca tcttaac1权利要求
1.一种检测具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，其包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行PCR以及检测扩增产物，其中用于PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
2.根据权利要求1的方法，其中用于PCR的引物包括具有SEQ IDNO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
3.一种定量具有线粒体DNA 3243突变的DNA的方法，其包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行定量PCR以及定量扩增产物，其中定量PCR是一种使用荧光变化取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR中的扩增产物，并且在测量结果的基础上定量样品中DNA的方法，且用于定量PCR的引物包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
4.根据权利要求3的方法，其中用于定量PCR的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
5.一种测定样品中所含线粒体DNA3243突变的异胞质基因比率的方法，其包括
(a)通过如在权利要求3或4中所定义的方法定量具有线粒体DNA3243突变的DNA，
(b)通过定量线粒体DNAs的方法定量线粒体DNAs，所述方法包括使用从样品获得的DNA作为模板进行定量PCR以及定量扩增产物，其中定量PCR使用荧光变化取决于扩增产物量的系统，通过测量荧光实时定量PCR中的扩增产物，以及在测量结果的基础上定量样品中的DNAs，和
(c)从(a)和(b)的结果中计算线粒体DNA 3243突变的异胞质基因比率。
6.根据权利要求5的方法，其中在步骤(b)中使用的引物包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
7.根据权利要求3到6中任何一项的方法，其中该系统包括其5’端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列或者从SEQ ID NO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列，以及测量荧光染料的荧光。
8.用于如在权利要求1中所定义方法的试剂盒，其包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
9.根据权利要求8的试剂盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
10.用于如在权利要求3中所定义方法的试剂盒，其包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物。
11.根据权利要求10的试剂盒，其包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
12.用于如在权利要求5中所定义方法的试剂盒，其包括第一引物对，所述第一引物对包括具有与从SEQ ID NO1核苷酸序列中第243位核苷酸开始并且长12到30个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物，以及用于定量线粒体DNAs的第二引物对。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述第一引物对包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO5核苷酸序列的引物。
14.根据权利要求12的试剂盒，其中所述第二引物对包括具有SEQ ID NO3核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO4核苷酸序列的引物。
15.根据权利要求10-14中任何一项的试剂盒，其进一步包括其5’端用荧光染料标记的核酸探针，其中杂交后荧光染料的荧光减少，并且其具有从SEQ ID NO1核苷酸序列中第212位或215位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列或者具有从SEQ IDNO2核苷酸序列中第222位核苷酸开始并且长15到40个核苷酸的核苷酸序列。
16.末端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
17.根据权利要求16的核酸探针，其中所述核酸探针具有SEQ IDNO21或22的核苷酸序列。
18.一种检测突变的方法，其包括通过使用荧光染料标记的核酸探针对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析和测量荧光染料的荧光，以及在解链曲线分析结果的基础上检测突变，其中单核苷酸多态性是在线粒体DNA中第3243位上的突变，且核酸探针是如在权利要求16或17中所定义的核酸探针。
19.根据权利要求18的方法，其中扩增样品中所含核酸中含有单核苷酸多态性位点的区域以获得显示单核苷酸多态性的核酸。
20.根据权利要求19的方法，其中所述扩增是通过使用DNA聚合酶的方法进行的。
21.根据权利要求20的方法，其中所述扩增是在存在核酸探针时进行的。
22.用于如在权利要求18中所定义方法的试剂盒，其包括其末端用荧光染料标记的核酸探针，且其中杂交后荧光染料的荧光减少，其中核酸探针具有与从SEQ ID NO2核苷酸序列中第230位核苷酸开始并且长14到40个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且探针的3’端用荧光染料标记。
23.根据权利要求22的试剂盒，其中所述核酸探针具有SEQ IDNO21或22的核苷酸序列。
24.根据权利要求22或23的试剂盒，其进一步包括通过使用DNA聚合酶的方法用于扩增线粒体DNA中含有第3243位突变的区域的引物。
全文摘要
一种使用定量测定PCR检测具有线粒体DNA3243变异的DNA的方法，所述PCR使用具有与从SEQ ID NO1碱基序列中第243位碱基开始并且长12到30个碱基的碱基序列互补的碱基序列的引物。此外，提供了一种检测具有线粒体DNA 3243变异的DNA的方法，其中使用末端用荧光染料标记的核酸探针，其中杂交后荧光染料的荧光减少，所述核酸探针具有与从SEQ ID NO2碱基序列中第230位碱基开始并且长14到40个碱基的碱基序列互补的碱基序列，且所述核酸探针的3’端用荧光染料标记。
文档编号C12N15/09GK1806052SQ20048001664
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者平井光春 申请人:爱科来株式会社