专利名称：：粪臭素代谢的遗传学标记的制作方法
技术领域：
：本发明涉及粪臭素的新的代谢产物，涉及鉴定与粪臭素代谢相关的新酶。本发明用于开发鉴定和降低公猪膻味(boartaint)的方法。
背景技术：
：为肉品生产而饲养的公猪通常在出生后不久就被阉割，以防止屠宰后的畜体中产生臭味(公猪膻味)。公猪膻味主要是由于高水平的16-雄甾烯类固醇(特别是5a(-雄甾-16-烯各酮))或者脂肪中的粪臭素而产生。EU研究项目AIR3-PL94-2482的最新结果表明，粪臭素对于产生公猪膻味的作用高于雄甾烯酮(Bonneau，M.，1997)。粪臭素是由尾肠中的细菌产生，这些细菌降解来自未消化的饲料的色氨酸或者由猪肠道内层细胞运转的色氨酸(Jensen和Jensen,1995)。粪臭素由肠道吸收，主要在肝脏中被代谢掉(Jensen和Jensen,1995)。高水平的粪臭素会在脂肪中积聚，在公猪中尤其如此。已经有人提出，退行性基因Ska.sup.l的存在导致降低了对粪臭素的代谢和清除(Lunds的m等人，1994;Friis，1995)。在反刍动物中，已经对粪臭素的代谢进行广泛的研究(Sm池等人，1993)，瘤胃细菌大量生成粪臭素并且对肺产生毒性作用(Yost，1989的综述)。猪体内的与粪臭素相关的代谢路径还未被充分描述。特别地，还不清楚仅某些未被阉割的公猪的脂肪内具有高浓度的粪臭素的原因。环境和饮食因素是重要的(Kjeldsen,1993;Hansen等人，1995)，但是不足以解释猪体内的脂肪中的粪臭素浓度发生改变的原因。Claus等人(1994)提出，脂肪粪臭素浓度高是由于雄激素和糖皮质激素作用使得肠道粪臭素生成增加的结果。LimdsWm等人(1994)报道一种对脂肪中的粪臭素浓度的遗传影响，这可能是由于对粪臭素的酶促清除进行遗传控制。肝脏是粪臭素代谢的主要部位，肝脏的酶促活性可能是粪臭素在脂肪中沉积的决定因素。B.aebutted.K等人(1995)描述了数种在血液和尿液中发现的粪臭素的肝脏代谢产物，主要类型为Mil和MIII。Mil是6-羟基粪臭素(pro-Mil)的硫酸盐偶联物，仅高浓度地存在于猪的血浆中，猪血浆能够迅速地将粪臭素从猪体内清除，而高的MIII浓度与粪臭素清除缓慢相关。因此，合成MII的能力是迅速代谢清除粪臭素的主要步骤，导致在脂肪中生成低浓度的粪臭素，从而产生低水平的公猪膻味。回顾前述内容，需要进行进一步的工作，彻底了解粪臭素在猪肝脏中的代谢，并鉴定相关的关键酶。对与粪臭素代谢相关的生物化学事件的了解，可以获得处理、减少或防止公猪膻味的新策略。此外，这些候选基因的多态性可被用作公猪膻味少的猪的可能标记。发明概述本发明人已经鉴定出由猪肝脏微粒体对粪臭素(3-甲基吲哚，3MI)进行第I阶段代谢所产生的新的代谢产物。所鉴定的代谢产物为3-羟基-3-甲基假吲哚(3-OH-3-methylindolenine)(HMI);3-甲基羟吲哚(3-methyloxindole)(3MOI);吲哚-3-甲醇(I-3C);和2-氨基苯乙酮(2-AM)。测量这些代谢产物在猪体内的水平，对于鉴定猪代谢粪臭素的能力及其产生公猪膻味的倾向性是有用的。本发明人还确定，粪臭素的代谢产物之一HMI被醛氧化酶代谢成为3-羟基-3-甲基羟吲哚(3-OH-3-methyloxindole)(HMOI)。因此，对于提高粪臭素代谢和降低公猪膻味来说，增强醛氧化酶的活性可能是有用的。因此，本发明提供用于增强3-甲基吲哚代谢从而降低公猪膻味的方法，包括增强猪体内的醛氧化酶活性。增强醛氧化酶的活性，可以使用(a)增强醛氧化酶的活性；或者(b)诱导或增强醛氧化酶基因的表达的物质。本发明人还确定，细胞色素P450酶CYP2A6也与猪肝脏微粒体对粪臭素的代谢相关。因此，本发明提供用于增强3-甲基吲哚代谢从而降低公猪膻味的方法，包括增强猪体内的CYP2A6的活性。增强CYP2A6的活性，可以通过使用如下物质，其(a)增强CYP2A6的活性；或者(b)诱导或增强CYP2A6基因的表达。鉴别出与粪臭素代谢相关的酶，使得可以开发用于筛选与粪臭素代谢中的那些酶相互作用的物质的方法。该筛选方法可用于鉴定可用于减少或处理公猪膻味的物质。本发明还包括生产公猪膻味发生率较低的猪的方法，其通过筛选具有高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6的猪，并且繁殖所选择的猪。根据下面的详细描述，本发明的其他特征和优点将是显然的。但是，应当理解，指示本发明的优选实施方案的详细描述和特定实施例仅作为说明目的，因为对于本领域技术人员来说，根据该详细描述，在本发明的精神和保护范围内的各种变化和改变是显然的。现参照附图描述本发明，其中图1是由猪肝脏微粒体生成的主要五种代谢产物的色谱图形，在250nm通过UV吸收检测。保持时间对应于9.16min，UV-1;11.24min，3-羟基-3-甲基羟卩引哚；14.42min，吲哚-3-甲醇；17.51min，3-甲基羟吲哚;19.43min，2-氨基苯乙酮;22.84min，亲本化合物(3-甲基卩引哚)。(A)含有2iig/ml各种代谢产物的标准混合物。(B)温育混合物。图2是(A)UV-l代谢产物[入匿(nm):204，238];(B)3-甲基羟吲哚[入咖x(腿):205，252];和(C)3-羟基-3-甲基羟吲哚[HMOI:入隱(nm):208，253]的UV光谱。图3A是代谢产物UV-1的LC-MS光谱。图3B是m/z148的子离子的MS/MS光谱。图4是代谢产物UV-1的iH-NMR光谱。图5显示由猪肝脏微粒体生成的3MI代谢产物的化学结构式和百分比。图6显示由醛氧化酶催化的将3-羟基-3-甲基假吲哚氧化转化为3-羟基-3-甲基羟吲哚。图7显示由3-羟基-3-甲基假吲哚生成3-羟基-3-甲基羟吲哚(HMOI)，由猪的细胞溶胶(cytosol)催化。每个数据点表示在3头猪上进行的重复试验的平均值。图8显示甲萘醌诱导抑制由3-羟基-3-甲基假吲哚生成3-羟基-3-甲基羟吲哚(HMOI)。每个数据点表示在3头猪上进行的重复试验的平均值。图9显示奎纳克林诱导抑制由3-羟基-3-甲基假吲哚生成3-羟基-3-甲基羟吲哚(HMOI)。每个数据点表示在3头猪上进行的重复试验的平均值。图10显示猪体内背部脂肪中3-甲基吲哚的含量与肝脏醛氧化酶活性相比的图形(n=30)。醛氧化酶活性被测定为每分钟由1毫克的胞质蛋白形成的3-羟基-3-甲基羟哼l哚(HMOI)纳摩尔数。图ll显示CYP2A6基因(SEQIDN0:3)与突变体(SEQIDNO:l)在位置1220上的序列比对，以粗体显示。图12显示来自猪肝脏的猪细胞色素P4502A6cDNA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。CYP2A6分离自猪cDNA文库。(SEQIDNO:18)该序列已经在GenBank中登记(登录号AY091516)。推导的氨基酸序列显示在相应的核苷酸序列的下方。CYP2A6的三个活性位点用下划线标出。核苷酸和氨基酸的数量显示在右侧。图13显示人CYP2A6(SEQIDNO:19)、CYP2A3(SEQIDNO:20)和猪2A6(SEQIDNO:21)的氨基酸序列比对。Glnl04、Phe209和His477被认为是人CYP2A6香豆素7-羟化酶活性的活性位点。CYP2A6香豆素7-羟化酶氧化代谢烟碱和可铁宁(cotinine)。氨基酸的数量显示在右侧。星号表示这些活性位点在人和猪之间是相同的。图14显示CYP2A6在不同猪组织中的表达的Northern印迹分析结果。总RNA分别从脾脏、胸腺、肝脏、肺部、卵巢、肾脏、小肠、心脏和睾丸中提取。在含2.0M甲醛的1.0o/。琼脂糖凝胶中，对20yg总RNA(每条泳道)进行电泳。将RNA转移到尼龙膜上，然后用dig-标记的猪CYP2A6cDNA进行杂交。图15显示CYP2A6在猪肝脏中的遗传多态性、测序、western印迹分析和微粒体酶活性以及脂肪中的粪臭素水平。A，CYP2A6cDNA的PCR-SSCP分析。M:缺失突变；W:野生型。B，对缺失突变和野生型进行CYP2A6的测序分析。M:缺失突变的测序数据；W:野生型的测序数据。C，通过12%SDS-PAGE电泳从微粒体中分离的总蛋白，用小鼠抗人单克隆2A6-抗体进行免疫印迹。重复试验，将40yg来自肝脏微粒体的总蛋白加载到每条泳道中。M:来自具有CYP2A6的缺失突变的个体的总蛋白；W:来自野生型猪的肝脏的总蛋白。D，突变体和野生型的微粒体CYP2A6的活性和脂肪中的粪臭素水平。发明详述I.粪臭素的代谢产物本发明人已经鉴定由猪肝脏微粒体对粪臭素(3-甲基喷哚，3MI)进行的第I阶段代谢所产生的新的代谢产物。所鉴定的代谢产物为3-羟基-3-甲基假吲哚(HMI)、3-甲基羟吲哚(3M01)、卩引哚-3-甲醇(I-3C)和2-氨基苯乙酮(2-AM)。对于确定猪代谢粪臭素的能力及其对公猪膻味的倾向性来说，测量这些代谢产物在猪体内的水平是有用的。因此，本发明提供评价猪代谢3-甲基吲哚的能力的方法，包括检测来自猪的样品中的一种或多种选自3-羟基-3-甲基假吲哚(腹I)、3-甲基羟吲哚(3M01)、卩引哚-3-甲醇(I-3C)和2-氨基苯乙酮的代谢产物。由于粪臭素代谢产物还会发生第II阶段的硫酸化和葡萄糖苷化反应，该试验可以包括测量代谢产物的硫酸化和葡萄糖苷化产物。该样品可以是来自猪的任何生物学样品，优选为肝脏、血浆或脂肪。测量特定代谢产物的水平，可用于将猪划分为具有好的或差的粪臭素代谢能力。粪臭素代谢能力低可能是产生公猪膻味的原因，因此，对于鉴定具有公猪膻味的猪或者具有产生公猪膻味的风险的猪来说，该试验是有用的。进一步选择产生公猪膻味风险低的猪(即代谢能力好)，进行繁殖以生产公猪膻味低的猪。II.酶a)醛氧化酶本发明人还确定，粪臭素的代谢产物之一HMI被胞质金属黄素蛋白(metalloflavoprotein)醛氧化酶代谢成3-羟基-3-甲基羟B引哚(HMOI)。本发明人还确定，醛氧化酶粪臭素(或者3MI)的代谢中起重要作用，其催化活性与充分清除3MI相关。因此，增强醛氧化酶的活性可用于提高粪臭素代谢并且降低公猪膻味。因此，本发明提供用于增强3-甲基B引哚代谢的方法，包括增强猪体内的醛氧化酶活性。可以用(a)提高醛氧化酶活性；或者(b)诱导或增加醛氧化酶基因的表达的物质，来增强醛氧化酶的活性。还可以采用基因治疗方法来增强醛氧化酶的活性，其中离体或体内将编码醛氧化酶的核酸序列导入猪体内中。可采用从人、牛或兔子基因获得的信息克隆猪基因，获得编码醛氧化酶的核酸序列。如上提及，醛氧化酶活性与3MI清除相关。因此，检测猪体内的醛氧化酶的酶促活性可用于确定猪产生公猪膻味的倾向性。具有高醛氧化酶活性的猪产生公猪膻味的风险低于具有低醛氧化酶活性的猪。可以选择具有高醛氧化酶活性的猪，繁殖来生产低公猪膻味的猪。因此，本发明提供确定猪对公猪膻味的倾向性的方法，包括确定来自猪的样品中的醛氧化酶活性。在实施例2中详细描述了用于确定醛氧化酶活性的方法。b)CYP2A6本发明还确定，细胞色素P450酶CYP2A6也与由猪肝脏微粒体对粪臭素进行的代谢有关。因此，提高CYP2A6的活性对于增强粪臭素的代谢和减少公猪膻味是有用的。因此，本发明提供一种用于增强3-甲基口引哚的代谢的方法，包括提高猪体内的CYP2A6活性。用(a)提高CYP2A6活性；或(b)诱导或提高CYP2A6基因的表达的物质来增强CYP2A6的活性。还可以用基因治疗方法来增强CYP2A6的活性，其中离体或体内将编码CYP2A6酶的核酸序列导入猪体内。利用来自人基因的信息，通过克隆猪基因来获得编码CYP2A6的核酸序列。检测猪体内的CYP2A6催化活性，用于确定猪产生公猪膻味的倾向性。具有高CYP2A6活性的猪产生公猪膻味的风险低于CYP2A6活性低的猪。选择具有高CYP2A6活性的猪，繁殖生产低公猪膻味的猪。因此，本发明提供确定猪产生公猪膻味的倾向性的方法，包括确定来自猪的样品中的CYP2A6活性。c)筛选分析鉴定参与粪臭素代谢的酶，使得可以开发筛选与这些酶相互作用的从而调节粪臭素代谢的物质的分析方法。一个方面，本发明提供筛选增强醛氧化酶或CYP2A6活性的物质的方法。在本发明一个实施方案中，提供用于筛选通过提高醛氧化酶活性来增强猪体内的粪臭素代谢的物质的方法，包括步骤(a)在存在测试物质时，在醛氧化酶能够将底物转化为反应产物的条件下，将醛氧化酶底物与醛氧化酶反应；(b)分析反应产物、未反应的底物或未反应的醛氧化酶；(C)与对照比较，确定测试物质是否可选择地增强醛氧化酶活性从而能够提高粪臭素在猪体内的代谢。用于本发明的方法中的醛氧化酶底物包括HMI，HMI被代谢成HMOI。采用各种技术，包括测量醛氧化酶的蛋白质或者mRNA水平，或者通过检测醛氧化酶活性，来测定对醛氧化酶活性的诱导作用。可以用各种分析方法，包括实施例2中描述的分析方法和Rajagopalan等人，1966描述的那些方法来测量醛氧化酶活性。在本发明的另一个实施方案中，提供用于筛选通过提高CYP2A6活性来增强粪臭素在猪体内的代谢的物质，包括步骤(a)在存在测试物质时，在CYP2A6能够将底物转化为反应产物的条件下，将CYP2A6底物与CYP2A6反应；(b)分析反应产物、未反应的底物或未反应的CYP2A6;(c)与对照比较，确定测试物质是否可选择地增强CYP2A6活性从而能够提高粪臭素在猪体内的代谢。用于本发明的方法中的CYP2A6底物包括粪臭素和香豆素。采用各种技术，包括测量CYP2A6的蛋白质或者mRNA水平，或者通过如Aitio，1978描述检测CYP2A6活性，来测定对CYP2A6活性的诱导作用。用于本发明中的醛氧化酶和CYP2A6酶来自天然的、重组的或者商业的来源。表达酶的细胞或者肝脏微粒体也可以用于该方法中。根据如测试物质和底物的性质和含量等各种因素，选择使反应产物生成的条件。通过常规的分离技术，如盐析、色谱、电泳、凝胶过滤、分馏、吸收聚丙烯酰胺凝集电泳、凝集或者它们的组合，来分离反应产物、未反应的底物或者未反应的酶。为了便于对反应产物、未反应的底物或者未反应的酶进行分析，可以使用抗反应产物或者底物的抗体，或者标记的酶或底物，或者标记物质。抗体、酶、底物或物质用可检测的标记来标记，例如放射性标记、特定标记的抗体所识别的抗原、荧光化合物、特异于标记抗原的抗体和化学发光化合物。用于本发明的方法中的底物可以是不溶的。例如，该底物结合到合适的载体上。合适的载体的例子为琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)，羧甲基纤维素聚苯乙烯、滤纸、离子交换树脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、聚胺-甲基乙烯基-醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯基-马来酸共聚物、尼龙、丝等。载体的形状可以是，例如试管、检光板、圆盘、球形等。用已知的物理或化学方法，如溴化氰偶联，将酶、底物或物质与合适的不溶载体反应来制备不溶的酶、底物或物质。在另一个方面，本发明包括拥有筛选通过调节与粪臭素代谢相关的酶的转录或翻译来增强粪臭素代谢的物质的方法。在本发明的一个实施方案中，提供筛选通过提高编码醛氧化酶的基因的转录和/或翻译来增强粪臭素代谢的物质的方法，包括步骤(a)在存在测试物质时培养宿主细胞，该细胞包括含有编码醛氧化酶的核酸序列和该核酸序列转录或翻译的必需元件和任选地一种报道基因的核酸分子；和(b)将醛氧化酶的表达水平或者报道基因编码蛋白的表达水平与不存在测试物质时的用核酸分子转染的对照细胞比较。在本发明的另一个实施方案中，提供用于筛选通过提高编码CYP2A6的基因的转录和/或翻译来增强粪臭素代谢的物质的方法，包括步骤(a)在存在测试物质时培养宿主细胞，该细胞包括含有编码CYP2A6的核酸序列和该核酸序列转录或翻译的必需元件和任选地一种报道基因的核酸分子；和(b)将CYP2A6的表达水平或者报道基因编码蛋白的表达水平与不存在测试物质时的用核酸分子转染的对照细胞比较。用包含编码适当酶的核酸序列的核酸分子转染合适宿主，制备用于本发明的方法中的宿主细胞。合适的转录和翻译元件来自各种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或者昆虫的基因。对适当的转录和翻译元件的选择依赖于所选择的宿主，容易由本领域技术人员来实现。这种元件的例子包括转录启动子和增强子或者RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。因此，根据所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他遗传元件结合到表达载体中，如复制起始点、其他的DNA限制位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列。还可以预期，必需的转录和翻译元件可以由酶的天然基因和/或其侧翼序列来提供。报道基因的例子是编码一些蛋白质的基因，此类蛋白质如绿色荧光蛋白、e-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或者免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白(优选为IgG)的Fc部分。通过报道蛋白的浓度改变来监控报道基因的转录，这些报道蛋白如e-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶。这使得可能可视化和分析酶的表达，特别是确定一种物质对酶表达的作用。合适的宿主细胞包括各种原核和真核宿主细胞，包括细菌的、哺乳动物的、酵母或者其他真菌的、病毒的、植物的或者昆虫的细胞。用于转染宿主细胞的方法在本领域是已知的(参见，Sambrook等人，MolecularCloningALaboratoryManual,第2版，冷泉巷实验室出版社，1989，其在此引入作为参考)。也可以将商业上可获得的宿主细胞用于本发明的方法中。例如，购自Gentest公司的h2A3和h2B6细胞适合用于本发明的筛选方法中。通过提高醛氧化酶或CYP2A6活性来增强粪臭素代谢的物质(包括通过上述方法筛选得到的物质)可用于降低或处理公猪膻味，或者可用于制备降低或处理公猪膻味的药剂。d)组合物将增强粪臭素代谢的物质(包括用本发明的方法鉴定的物质，其选择性地提高醛氧化酶或CYP2A6的活性)结合到药物组合物中。因此，本发明提供一种用于降低公猪膻味的药物组合物，其包括有效量的一种或多种增强粪臭素代谢的物质和药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。在此所用的术语"有效量"是指足以以一定剂量、在必需的时期内获得期望结果的量。在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包括有效量的一种物质，该物质选自(a)提高醛氧化酶活性的物质；(b)诱导或增强醛氧化酶基因表达的物质；(c)提高CYP2A6酶活性的物质；和(d)诱导或增强CYP2A6基因表达的物质。可以施用本发明的物质，用于口腔、体表、直肠、胃肠外、局部、吸入或脑内的应用。优选地，通过口腔(加入食物或饮用水中)或者作为一种注射制剂来施用该活性物质。在本发明的方法中，在此详细描述的和用本发明的方法从活性成分中鉴定的物质通常以混合物施用。根据特定的施用形式，如口服片剂、胶囊、药丸、糖浆等，选择的合适药物稀释剂、赋形剂或者载体，按照常规的兽医操作，将所鉴定的物质与所选择的稀释剂、赋形剂或者载体混合。例如，进行口服施用时，以片剂或胶囊的形式制备活性成分，包含在食物或饮用水中。在这种情形下，活性物质与口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体组合，该载体如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、硫酸钙、甘露醇等；对于以液体形式的口服施用，口服的活性物质与任何的口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体组合，该载体如乙醇、甘油、水等。如果期望或者需要，将合适的粘合剂、滑润剂、分解剂和着色剂结合到剂量形式中。合适的粘合剂包括淀粉、凝胶、天然的糖人葡萄糖或者e-乳糖、玉米甜味剂、天然的或合成的胶如阿拉伯树胶、西黄蓍胶(tragacanth)或者藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、腊等。用于这些剂量形式中的合适滑润剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。分解剂的例子包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、斑脱土、黄原胶等。凝胶胶囊含有活性物质和粉末状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。可以使用类似载体和稀释剂来制备压縮的片剂。将片剂和胶囊加工成缓释产品，以在一段时间内连续释放活性成分。压縮的片剂可以是用糖包裹或者膜包被，来掩盖任何让人不舒服的味道并且将片剂与空气隔离，或者用肠衣包被以在胃肠道中选择性地分解。用于口服施用的液体剂量形式可能含有着色剂和风味剂，提高接受程度。水、适当油、盐、水溶性葡聚糖和相关的糖溶液以及二元醇如丙二醇或聚乙二醇，都可被用作胃肠外溶液的载体。这种溶液还优选地含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，如果需要，含有缓冲物质。合适的稳定剂包括抗氧化剂，如硫酸氢钠、硫酸钠或者抗坏血酸，它们可单独使用或者组合使用，柠檬酸及其盐以及EDTA钠。胃肠外溶液还含有防腐剂，例如杀藻胺、甲基-或丙基-对羟基苯甲酸酯以及氯丁醇。可以以脂质体呈递系统的方式来施用在此详细描述的并用本发明的方法鉴定的物质，例如小的单层脂质体、大的单层脂质体和多层脂质体。脂质体可用各种磷脂制备，例如胆固醇、硬脂胺(stearylamine)或卵磷脂。将在此详细描述的并用本发明的方法鉴定的物质与可溶的聚合物结合，这种聚合物是可耙向的药物载体。这种聚合物的例子包括聚乙烯吡咯垸酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酸胺石碳酸、聚羟乙基-天冬酰胺石碳酸或者用棕榈酰残基取代的环氧乙烷-聚赖氨酸。该物质还可以与用于实现药物的控制释放的可生物降解的聚合物结合。合适的聚合物包括多聚乳酸、多聚乙醇酸、多聚乳酸和多聚乙醇酸的共聚物、多聚"己内酯(caprolactone)、多聚羟基丁酸、多聚正交酯、聚縮醛、多聚二羟基吡喃、多聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或亲两性的嵌段共聚物。合适的药学载体以及制备药学剂量形式的方法被公开在雷明顿药物禾斗学(Remington'sPharmaceuticalSciences),MackPublishingCompany中，其是本领域的标准教科书。不只一种在此详细描述的并用本发明的方法鉴定的物质可被拥有增强粪臭素的代谢。在这种情形下，该物质通过任何用以与药剂协同使用的传统方法来施用，作为同时或连续施用的单独的分开剂量单位，或者在单一的或者组合的剂量单位中与各种成分物理结合。可以单独施用活性试剂，但是通常与一种药学载体一起施用，这种载体根据所选择的施用路径和在此描述的标准药学实践来选用。e)遗传学筛选本发明还包括鉴定编码负责猪体内的粪臭素代谢的酶的基因的多态性，这种酶包括上文详细描述的醛氧化酶和CYP2A6。从对粪臭素的代谢能力强的猪(因而产生公猪膻味的概率低)体内鉴定编码这些酶的基因，用于开发公猪膻味发生率低的猪品系。此外，鉴定这些基因，用作鉴定倾向于产生公猪膻味的发生率低的猪的标记。因此，本发明提供一种用于生产产生公猪膻味的发生率较低的猪的方法，其包括选择表达高水平醛氧化酶和/或CYP2A6的猪；和繁殖所选择的猪。还可生产生成高水平醛氧化酶和/或CYP2A6的转基因猪。用传统方法制备转基因猪。例如，用重组分子来导入(a)编码醛氧化酶的基因或(b)编码CYP2A6的基因。通过一种技术，如转染、电穿孔、注射等，将这种重组构建体导入细胞中，如胚胎干细胞。通过Southern印迹、Northem印迹或者或通过本领域已知的其他方法，鉴定具有高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6的细胞。然后，将这种细胞与胚胎干细胞融合，生成转基因动物。通过，如用早期胚胎如八细胞期的胚胎汇集胚胎干细胞，将生成的囊胚体外移植到受体雌性个体中，产生生成的聚集嵌合体的种系传播，从而实现了突变的种系传播。这种转基因猪与具有类似表型的猪交配，生产产生公猪膻味的发生率低的猪，类似表型为高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6。如下非限制性的实施例用于阐明本发明实施例实施例l:粪臭素代谢产物的鉴定材料与方法化学药品。3-甲基吲哚(3MI)、口引哚-3-甲醇(13C)、吲哚-3-乙醛、卩引哚-3-羧酸、2-氨基苯乙酮和来自/7Wx的H-2型硫酸酯酶购自Sigma-Aldrich加拿大有限公司(Oakville，ON，加拿大)。羟B引哚、3-甲基羟吲哚(3MOI)和3-羟基-3-甲基羟吲哚(HMOI)分别用Kende和Hodges(1982)以及Skiles等人(1989)的方法合成。可信的5-羟基-3-甲基喷哚和6-羟基-3-甲基U引哚(6-硫酸羟粪臭素(6-sulfatoxyskatole)的形式)是JensHansen-Moller(DanishMeatResearchInstitute,Roskilde，丹麦)惠赠。为了从6-硫酸羟粪臭素获得6-羟基-3-甲基B引哚，在含有90单位/ml的H-2型硫酸酯酶的总体积0.5ml乙酸缓冲液，pH5.0中水解该化合物。4(TC下，在摇床水浴中水解4小时，加入0.5ml冰冷乙腈，终止反应并沉淀蛋白。以7,500rpm离心15分钟，将50pl澄清的上清液加载到层析柱上，采用在"分析层析"中描述的条件。微粒体制备。从30头未经过阉割的公猪中获取肝脏样品，该公猪通过将欧洲野猪X瑞典约克夏猪的F3代公猪与瑞典约克夏母猪回交(Squires和Lundstrom，1997)而获得。用液氮冷冻肝脏样品，存储在-80。C下。对于微粒体的制备，将部分解冻的肝脏样品切碎，使用Ultra-Turax匀衆仪(Janke和Kunkel，GDR)，用4倍体积的0.05MTris-HCl缓冲液pH7.4(含有0.15MKC1、1mMEDTA和0.25M蔗糖)进行匀浆。以10,000xg离心匀浆20分钟，生成的上清液再以100,000xg离心60分钟，获得微粒体沉淀。将沉淀悬浮在0.05MTris-HCl缓冲液，pH7.4中，达到20mg蛋白/ml的最终浓度，并分析前存储在-8(TC下，该缓冲液含有20%甘油、1mMEDTA和0.25M蔗糖。通过Smith等人(1985)的方法，用购自Pierce化学公司(Rockford，Ill.，美国)的二辛可宁酸蛋白分析试剂确定蛋白质浓度，牛血清白蛋白作为标准物。微粒体温育。37"C下，将2mg微粒体蛋白用溶解在0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的0.4mM3MI禾Q4mMNADPH温育30分钟(在10-40分钟的时间范围内，代谢产物的产量是线性的)，该缓冲液中含有5mMMgCl2和1mMEDTA。温育的体积为0.5ml。在37'C进行3分钟的预温育期后，加入NADPH来起始反应，用0.5ml冰冷乙腈来终止反应。重复对所有30个样品进行温育，对照的温育不用NADPH。在加入乙腈后，旋涡搅动混合物，以5000rpm离心20分钟。通过高效液相色谱(HPLC)对澄清上清液的50pl等分试样进行分析。分析层析。用Spectra-Physics系统(Spectra-Physics，圣何塞，加利福尼亚州，美国)进行分析HPLC，该系统由SP8800梯度泵、具有50|11注射环(injectionloop)的SP8880自动取样器、SP光谱100UV检测仪和光谱系统FL-2000荧光检测仪。该HPLC方法是对先前报导的双梯度系统方法(Baek等人，1995)的改进。用反相ProdigyODS，5pm，250X4.6mm柱(Phenomenex，托兰斯，加利福尼亚州，美国)分离3MI及其代谢产物。流动相由两种溶剂组成，A(0.01M磷酸二氢钾缓冲液pH3.9)和B(乙腈)，采用如下梯度0分钟—90%A，6分钟—80%A;12分钟—70%A;18分钟—30%A;25分钟10。/。A;26分钟90。/。A;35分钟—90%A。所有的梯度是线性的，流速设定为1.2ml/分钟。在250nm下监测吸光率；在分别为286nm和350nm的激发和发射波长下监测荧光强度。温育后，立即对3MI代谢产物进行HPLC分析。通过比较保持时间和共同注入标准物(比较代谢产物混合物与可信的标准物的峰值)，确定代谢产物。通过制备性HPLC来分离和纯化代谢产物。为了获得足以进行UV光谱分析的含量的代谢产物，进行大规模的温育(最终体积为4ml)，采用与上述相同浓度的反应物。用Spectra-PhysicsSP8800梯度泵(Spectra-Physics,圣何塞，加利福尼亚州，美国)、装配了500^1注射环的手动注射器(Rheodyne，Cotati，加利福尼亚州，美国)和SP光谱100UV检测仪，进行制备性HPLC。用反相Waters制备性HPLCC18，10jim，300X7.6mm柱(^VatersAssociates,DivisionofMillipore公司分公司，Milord，Mass.，美国)，分离3MI的代谢产物。流动相与上述相同，而流速设定为3.0ml/分钟。根据保持时间确定代谢产物为HMOI、I3C、3MOI和2-氨基苯乙酮，收集足量的对应于这些代谢产物的峰值，用于确定它们的UV光谱。用前面在"分析性层析"下描述的方法，通过HPLC确定所收集的馏分的纯度。由猪肝脏微粒体生成的代谢产物之一不能根据保持时间的比较来确定；由于这种代谢产物的吸收发生在紫外线光谱外，而且事实上它是从柱中洗脱出来的第一个代谢产物(Babol等人，1998a)，被命名为UV-1。对应于该代谢产物的峰值，在9.1-10.1分钟之间洗脱出来，在进行多次500W注射收集，并且进行HPLC-MS分析，附加一次H-NMR和UV光谱分析。紫外线光谱分析。记录HPLC代谢产物HMOI、I3C、3MOI和2-氨基苯乙酮的紫外线光谱(200-300nm)。记录所用可信标准物的紫外线光谱，并与分离的代谢产物的光谱比较。用4054型LKBBiochromUV-Visible分光光度计(PharmaciaLKBBiochrom有限公司，剑桥，英国)。由于产量低，不可能分离足量的羟基粪臭素来确定它们的紫外线光谱。代谢产物UV-1的LC/MS。通过LC-MS分析代谢产物UV-1，采用如下条件采用Prodigy5ODS-2，5pm，150X3.2mm柱(Phenomenex，托兰斯，加利福尼亚州，美国)和水乙腈(50:50)作为流动相进行HPLC。用双向LC泵(HewlettPackard1090系列II/L，PaloAlto，加利福尼亚州，美国)来呈递流动相。洗脱液经过样品喷射阀Rheodyne7010(Rheodyne，Cotati，加利福尼亚州，美国)，以0.7ml/分钟的流速进入装配有电暈放电针的气压化学电离(APCI)源中。通过自动取样器(HewlettPackard1090系列II/L，PaloAlto，加利福尼亚州，美国)注射20|11的样品体积。用VGQuattroII三倍四极质谱分析仪(FisonsUK有限公司，Altrincham，英国)进行质谱分析(MS)检测。用MassLynx软件包，进行仪器操作控制、数据获取和数据加工。液氮作为干燥和保护的气体，流速分别为200和50升/小时。以阳离子模式操作仪器，离子源温度为150。C，电暈放电针的电压为+3.75kV，锥面电压(conevoltage)为15V。在内部扫描延迟为10秒的全扫描模式下，以400amu/秒的速度扫描第一个四极，从m/z125-700中获得LC/MS的总离子色谱。以连续的形式获取数据。通过将质子化分子离子([M+H].sup.+)从第一个四极传递给含有超纯氩的第二个四极，用串联质谱分析(MS/MS)来进行产物扫描。10秒内从m/z50到450扫描第三个四极，记录产物的色谱。撞击能量在-20到-50eV间变化，优化所选择的质子化分子离子的破碎。代谢产物UV-1的NMR光谱分析。分离UV-1代谢产物，用基本上如上述的温育条件来进行NMR分析。但是，该温育包含lmnol细胞色素P450，而不是2mg的总蛋白。通过上述HPLC条件，从其他微粒体的3MI代谢产物中分离UV-1，使用由LDCAnalyticalConstametric4100溶剂呈递模块(ThermoQuest,里维埃拉，Fla.，美国)、HewlettPackard1040A二极管阵列检测仪和HewlettPackard9000系列HPLC工作站(HewlettPackard公司，惠灵顿，Del.，美国)组成的系统。通过HPLC纯化UV-1，在SavantSpeed-Vac(SavantInstruments,Farmingdale，纽约，美国)中浓縮后，从两种相同温育操作中收集。由于不稳定的UV-l会发生聚合和降解，不可能将浓縮物干燥。因此，将样品蒸发到200L的体积和在注射到HPLC中在进行纯化。但是在这种情形下，水性的流动相由O.OIM磷酸氢二钾缓冲液，pH9.0组成，处于99.9原子％氧化氚中。由于UV-1的不稳定性，当将其蒸发至干燥时，最终的纯化步骤有必要在NMR溶剂氧化氳中进行。再次收集UV-1，蒸发到250L的最终体积，直接添加到Shigemi丽R管中。用VarianUnityl雨a600MHz薩R(VarianAssociates公司，PaloAlto，加利福尼亚州，美国)，在氧化氚中获取.sup.lH-NMR光谱。结果HPLC。由猪肝脏微粒体生成的代谢产物都不与吲哚-3-羧基乙醛或吲哚-3-羧酸一起被洗脱。但是，通过UV和/或荧光检测来测量与HMOI、3MOI、13C、2-氨基苯乙酮一起被洗脱的代谢产物，以及两种羟基粪臭素(5-和6-羟基-3-甲基吲哚)。羟吲哚代谢产物(HMOI和3MOI)以及吡咯环打开的代谢产物(2-氨基苯乙酮)不发出荧光，通过UV吸收来检测和定量；通过荧光检测来检测和定量I3C和羟基粪臭素。当微粒体温育物形成峰值时，根据保持时间来鉴定所有代谢产物，与其对应的可信标准物一起进行色谱分析。在250nm下通过UV吸收监测的微粒体温育物和标准混合物的色谱图形显示在图1中。UV光谱分析。根据在HPLC上的保持时间鉴定的代谢产物(HMOI、3MOI、13C和2-氨基苯乙酮)的UV光谱与可信标准物的UV光谱相同。用水作为溶剂，记录代谢产物的光谱，最大吸收值的波长如下HMOI:入脂x(nm》208，253;3MOI:Xmax(nm):205，252;I3C:入薩(nm):221，278;2-氨基苯乙酮入max(nm):228,257。3-甲基吲哚的UV光谱为人max(nm):224，281;UV画1代谢产物UV光谱为Amax(nm):204，238。UV-i的UV光谱与图2所示的羟吲哚代谢产物3M0I和HMOI的光谱相似。将pH从3改变为H，不改变UV-1的光谱；该红移的缺乏表明该未知代谢产物具有不游离的石碳酸基团。室温下，将分离的UV-1保存在乙腈水溶液中，以7天的间隔通过HPLC分析该溶液6周。6周后，仅保留约25%原始化合物，UV-1转化成3M01。3MOI和UV-l相对于时间的线性回归的斜率表明，在HPLC-UV分析中，对UV-1摩尔响应因子是3MOI的2.95倍。代谢产物UV-1的结构数据。分离的UV-1的质谱分析产生一个m/z148[M+H].sup.+的分子离子，主要部分在m/z133[M—CH3]+，104[M--H3C—C—OH]+和77(质子化的苯环)(图3)。代谢产物UV-1的^-NMR光谱显示在图4中。给出了质子信号的归属(assignment),以化学位移(多样性、整合和归属)列出1.4(s，3H，—CH3);6.8(d，2H，H-5和H-6);7.2(d，2H，H-4和H-7);8.4(s，1H，H-2)。在8.4处的单峰(singlet)被指定是3-羟基-3-甲基假吲哚的C-2上的质子。该质子连接到sp.sup,2杂交的C-2上，C-2也被相邻的氮原子去屏蔽。因此，该质子高度去屏蔽，在所提议的结构中位于其他所有质子的前场(downfield)。在2.0处，有荧光对应于污染物乙腈的甲基质子的单峰。由于纯化样品所采用的方式，要去除存在于HPLC有机相中的所有乙腈是极其困难的。总之，发现了7种由猪肝脏微粒体生成的3MI的代谢产物3M01、HMOI、6-羟基-3-甲基卩引哚(6-羟基-3MI)、13C、2-氨基苯乙酮、5-羟基-3-甲基吲哚(5-羟基-3MI)，和命名为UV-1的代谢产物。当假设摩尔吸收率超过3MOI2.95倍来量化UV-l时，所生成的总纳摩尔量平均占微粒体温育过程中代谢的3MI分子的％.0%(86.5-105.0%的范围)。猪肝脏微粒体显育中鉴定的七种代谢产物的产率显示在表1中。UV-1代谢产物的产率最高(750.7pmol/mg蛋白/分钟)，而5-羟基-3MI的产率最低(5.1pmol/mg蛋白/分钟)。对于相同代谢产物的产率，最大的个体间的差异是显著的。例如，UV-1代谢产物以1556.3pmol/mg蛋白/分钟的速度由一头猪的微粒体生成，而其他微粒体以180.5pmol/mg/蛋白/分钟的速度生成该化合物律1)。以较大的量生成的代谢产物是UV-1，其平均占所生成的所有代谢产物的45.1%。含有的羟吲哚占总代谢产物的46.4%:平均所生成的代谢产物的27.9Q/。对应于3M01，而18.5%对应于HMOI。其他代谢产物以较少的含量生成。6-羟基-3MI占代谢产物的4.9%，13(3占2.7%，而2-氨基苯乙酮和5-羟基-3MI仅分别占代谢产物的0.5%和0.3%。这些代谢产物的化学结构和产量比例显示在图5中。讨论先前，在猪体内仅鉴定了三种阶段I的3MI代谢产物HMOI和羟基粪臭素，5-羟基-3MI和6-羟基-3MI。已经发现HMOI存在于猪血浆和尿液中(Baek等人，1997)，以及猪肝脏微粒体温育物中(Babol等人，1998a);在猪血清(Baek等人，1997)和猪肝脏微粒体温育物(Babol等人，1998a)中都检测到6-羟基-3MI，而5-羟基-3MI仅被报导存在于猪血清中(Baek等人，1997)。在本研究中，在微粒体温育物都检测到所有三种代谢产物，报导生成4种新的代谢产物。在如山羊、小鼠和大鼠等物种中确定的3MI生物转化路径之一是生成羟吲哚衍生物3MOI和HMOI(Frydman等人，1972;Smith等人，1993)。平均起来，在本研究中，46.4%由猪微粒体生成的代谢产物对应于这两种羟吲哚衍生物；该发现表明，在猪体内，在数量上，氧化路径是十分重要的。已经在大鼠肝脏微粒体温育物(Frydman等人，1972)、山羊肺部和肝脏微粒体温育物(Huijzer等人，1987)和山羊尿液(Hammond等人，1979)中鉴定了3M01。Babol等人(1998a)在猪微粒体温育物中观察到的代谢产物之一被命名为"UV-3"，本研究的结果表明，该代谢产物对应于3MOI。已经从施用3MI的猪的尿液中分离到3MI、丽OI的其他羟吲哚衍生物(Baek等人，1997)，还报导这些衍生物是由猪肝脏微粒体生成(Babol等人，1998a);HMOI还是施用放射标记的3MI的小鼠产生的主要尿液代谢产物(Skiles等人，1989)，另外，它们还存在于人(Albrecht等人，1989)和山羊(Smith等人，1993)的尿液中。有趣的是，在本研究中，猪肝脏微粒体生成大量3MOI和HMOI的氧化衍生物。在其他研究物种中，这些代谢产物之一占主导地位。在山羊中，主要生成3MOI(Hammond等人，1979)，而在小鼠中，HMOI占主导地位(Sm池等人，1993)。3MI的3-甲基基团可被氧化成乙醇。乙醛和羧酸官能团(Ham腸nd等人，1979)。在本研究中，发现猪肝脏微粒体仅生成3-甲基基团(吲哚-3-甲醇)的乙醇官能团。代谢产物具有强烈的荧光性，在紫外线下吸收，虽然先前已经报导其是由猪肝脏微粒体生成(由Babol等人，1998a命名为F_i)，其结构是未知的。重要的是，进一步代谢吲哚-3-甲醇的乙醇官能团可能是由乙醇脱氢酶催化的；如果这种理论是正确的，该反应的产物口引哚-3-羧基乙醛不会在微粒体温育物中产生。在碳原子4、5、6或7的任何一个上都会发生3MI的芳香环的羟基化；但是，试验证据表明，位置5和6上的羟基化是主要的。1962年，Jepson及其同事证实了兔子肝脏微粒体的羟基色胺、吲哚乙酸及其对应于6-羟基衍生物的相关吲哚。微粒体系统需要NADPH和氧气，不会生成5-或7-羟基吲哚(Jepson等人，1962)。Mahon和Mattok(1967)分析了IO位正常的人受试者的尿液，发现所有样品都含有6-羟基粪臭素，而9份样品含有5-异构体，虽然5-异构体的排泄率约为6-异构体的50%，在三份样品中检测到7-羟基粪臭素，7-羟基粪臭素的排泄率仅为6-异构体的5%。所有的受试者都不排泄4-羟基粪臭素(Mahon和Mattok，1967)。Baek等人(1995)在猪血清中发现了5-羟基-3MI和6-羟基-3MI的偶联物。在本研究中，6-羟基-3MI的平均产率约比5-异构体的产率高11倍，表明位置C6上的羟基化是主要的。Frydman等人(1972)发现，在用兔子肝脏微粒体温育3-MI后，生成两种吡咯环打开的代谢产物。这两种化合物被鉴定为2-甲酰胺苯乙酮(formamidoacetophenone)和2-氨基苯乙酮；所生成的代谢产物中的33%对应于2-甲酰胺苯乙酮，12%对应于2-氨基苯乙酮，和5%对应于3-M0L在本研究中发现，2-氨基苯乙酮由所有被分析的肝脏样品生成，平均百分比为0.5%，比Frydman等人(1972)报导的大鼠的百分比低得多。在文献中，没有关于由猪代谢3MI生成2-氨基苯乙酮的报导。代谢产物UV-1的^-NMR、LC-MS和UV-光谱特征表明，该化合物对应于3-羟基-3-甲基假吲哚。UV-1是一种不稳定的化合物，是3MI和3MOI之间的中间产物。实际上，UV-1被转化成3MOI，说明该化合物是3MOI的前体，可能是2，3-环氧-3-甲基吲哚，Sm他等人(1993)己经推测了2，3-环氧-3-甲基吲哚的结构，更加可能是2，3-环氧-3-甲基吲哚的开环产物3-羟基-3-甲基假吲哚(Skordos等人，簡a，簡b)。化合物(147)的分子量及其断裂模式与epoxyde或亚胺具有可比性(图3)，但是在238nm下具有入，的UV光谱(图2)与亚胺的结构更为一致。147的分子量还对应于3MI的芳香石碳酸代谢产物；但是，当在不同pH获取分离UV-l的UV光谱时，并不显示出在石碳酸吲哚中观察到的典型红移。而且，实际上，代谢产物UV-1的UV光谱与3MOI和HMOI的光谱(图2)十分相似，表明代谢产物UV-1与两种羟吲哚的任何一种在结构上是相关的；这些在吡咯环的2-原子位置上被氧化的代谢产物具有显著区别于3MI或其他代谢产物如13C、2-氨基苯乙酮或羟基粪臭素的光谱。最后，UV-1的^-NMR光谱(图4)与将该代谢产物指定为(assignment)3-羟基-3-甲基假吲哚是一致的。本研究的结果表明，猪肝脏微粒体在体内生成了3MI的七种主要代谢产物。从数量上看，猪肝脏微粒体在阶段I生物转化3MI的主要路径是形成羟吲哚的衍生物和形成3-羟基-3-甲基假吲哚。3MI在不同物种中的代谢命运的不同解释了物种对发生3MI诱导的肺中毒的倾向性的差异。3MI被广泛地代谢为羟B引哚衍生物可解释由Carlson和Yost(1989)报导的在猪身上未表现出肺中毒(pneumotoxicity)。亲电子代谢产物3-亚甲基-喷哚，被推断是由细胞色素P-450酶产生的3MI反应产物，是肺部微粒体温育物中的I3C的前体和以可检测量存在的易受影响的形式I3C(Skiles和Yost，1996)。在该体外试验中，少于3%的由猪肝脏微粒体生成的代谢产物对应于I3C,这可能还解释了猪缺乏遭受3MI-诱导的肺部损伤易感性的原因。观察到代谢产物产率存在大的个体间差异。阶段I代谢中的这些差异可能是由于细胞色素P450酶的个体差异，而且应当对该组织进行进一步的研究。先前已经报导，CYP2E1在猪代谢3MI中起重要作用(Squires和Lundstr6m，1997;Babol等人，1998a)，但是其他异构酶的作用还未被确定。Babol等人(1998b)报导，一些由猪肝脏微粒体生成的3MI代谢产物的硫酸化和葡萄糖苷酸化。但是，需要更多的试验来确定由本研究确定的3MI的不同代谢产物的整个阶段II的代谢。实施例2:醛氧化酶材料与方法化学药品。甲萘醌、奎纳克林和别嘌呤醇购自Sigma-Aldrich加拿大(Oakville，ON，加拿大)。可信的HMOI由犹他州大学的药理学和毒性学学院的G.S.Yost博士惠赠。HMI用猪肝脏微粒体生产，如先前描述的制备性HPLC分离和纯化(Diaz等人，1999)。冷冻干燥分离的HMI，并在-2(TC下保存在干燥器中，直到使用。制备猪肝脏胞质。从30头未经过阉割的公猪中获取肝脏样品，该公猪通过将欧洲野猪X瑞典约克夏猪的F3代公猪与瑞典约克夏母猪回交(Squires和Lundstrom，1997)而获得。用液氮冷冻肝脏样品，存储在-80"C下。对于胞质馏分的制备，将部分解冻的肝脏样品切碎，使用Ultra-Turax匀浆仪(Janke和Kunkel，GDR)，用4倍体积的0.05MTris-HCl缓冲液pH7.4(含有0.15MKC1、1mMEDTA和0.25M蔗糖)进行匀浆。以10，000xg离心匀浆20分钟，生成的上清液再以100,000xg离心60分钟，获得胞质馏分和微粒体沉淀。分析前将胞质馏分存储在-8(TC下。通过Smith等人(1985)的方法，用购自Pierce化学公司(Rockford，Ill.，美国)的二辛可宁酸蛋白分析试剂确定蛋白质浓度，牛血清白蛋白作为标准酶分析。为了研究AO在HMI转化为HMOI中的作用，进行含有HMI、猪肝脏胞质和不同浓度所选择的AO抑制剂甲萘醌和奎纳克林的温育。重复进行温育，并对三种随机选择的猪胞质样品进行温育。通过"色谱分析"下描述的HPLC检测和量化的HIMOI形成。测量AO活性为每分钟由每毫克胞质蛋白形成的HMOI。分析混合物含有O.05M磷酸钠缓冲液(pH7.4)，在250iU的最终分析体积中具有5mMMgCl2和1mMEDTA、1mg胞质蛋白禾P1UgHMI。对于抑制试验，在分析混合物中测试不同最终浓度的甲萘醌(0、2、5—、10、25、50和100uM)或奎纳克林(0、0.05、0.1、0.25、0.5禾01.0mM)。将甲萘醌溶解在乙醇(最终分析浓度4%，v/v)，对无抑制剂的对照活性无作用；将奎纳克林溶解在缓冲液中。37。C下在摇床水浴中温育10分钟；用250U1冰冷乙腈终止反应。在加入乙腈后，漩涡搅拌混合物，以7,500rpm离心15分钟。用400ul水稀释400nl的澄清上清液的等分试样，立即用高相液相色谱(HPLC)分析100ul混合物。需要用水稀释，以避免色谱峰值的引导(leading)。用外部标准物来量化HMOI产量。对照包括用煮沸的胞质的温育和未添加胞质进行的温育。用0.1、0.5和l.OmM别嘌呤醇进行与上述相同条件下进行的温育，以研究XO对将HMI酶促转化为HMOI的作用。色谱分析。用Spectra-Physics系统(Spectra-Physics，圣何塞，加利福尼亚州，美国)进行HPLC，该系统由SP8800梯度泵、具有100nl注射环的SP8880自动取样器和SP光谱100UV检测仪组成。该HPLC方法是对先前报导的双梯度系统方法(Baek等人，1997)的改进。用反相ProdigyODS，5pm，250X4.6mm柱(Phenomenex，托兰斯，加利福尼亚州，美国)分离HMOI和HMI。流动相由两种溶剂组成，A(0.01M磷酸二氢钾缓冲液pH3.9)和B(乙腈)，采用如下梯度O分钟--90%A，6分钟—80%A;12分钟--70%A;18分钟—30%A;25分钟10%A;26分钟90%A;35分钟-90%A。所有的梯度是线性的，流速设定为1.2ml/分钟。在250nm下监测吸光率。温育后，立即进行HPLC分析。测量3MI的脂肪含量。对3MI脂肪含量的测量，从每头猪身上获取背部脂肪样品，用比色分析测量其中的3MI含量(Mortensen和Sorensen，1984)。所有分析重复进行。统计分析。用统计分析系统(SAS，1995)计算皮尔森相关系数、线性回归分析和单因子ANOVA。结果猪胞质以时间依赖的方式(图7)催化HMI转化为HMOI(图6)。在这些分析条件下，发现HMOI的形成为线性(r2=0.995)长达10分钟(图7)。在温育前加入煮沸的胞质或者当未将胞质加入到分析混合物中时，无HMOI生成。将醛氧化酶抑制剂甲萘醌或奎纳克林加入含有HMI和胞质蛋白质的温育混合物，降低以剂量依赖的方式形成HMOI。当未加入抑制剂时，将所生成的总量HMOI视为100%。在浓度为lOyM甲萘醌时，仅检测到在缺乏甲萘醌时形成的HMOI的33.3%,而在浓度为100pM的甲萘醌时，无HMOI生成(图8)。在浓度为50uM的奎纳克林时，观察到对照HMOI产量的75.5%，而为1mM浓度时，观察到对照HMOI产量的43.4%(图9)。由于即使奎纳克林浓度比甲萘醌浓度高10倍(lmM比iU00M)也不足以完全消除将HMI转化为HMOI，甲萘醌是更为可能的反应抑制剂。将多达l.OmM别嘌昤醇加入到分析混合物中，并不影响将HMI转化为HMOI(数据未显示)。AO活性估计为每分钟由每毫克胞质蛋白质生成的HMOI的纳摩尔数，30头用于本研究中的猪的AO活性与3MI脂肪含量相比显示在图10中。这两个变量间的皮尔森相关系数为-0.70(P<0.001)，而决定系数为r2=0.49。用于解释3MI脂肪含量是AO活性的函数的线性回归模型为-脂肪中的3MI=0.22-AO活性0.042763。该模型极其显著(P<0.001)。所有样品中的3MI的脂肪含量范围在0.07-0.3mg/kg，平均值为0.15mg/kg，而AO活性范围在0.25到3.53nmolHMOI/mg蛋白/分钟，平均值为1.27nmolHMOI/mg蛋白/分钟。根据每头猪的3MI脂肪含量，将结果划分为如下三类高3MI沉积(0.2mg/kg3MI或更高)、中度3MI沉积(0.11-0.19mg/kg3MI)和低沉积(0.1mg/kg3MI或更低)。Lundstr6m和Bo皿eau(1996)已经通过感官分析证明，0.2-0.25mg/kg或更高的3MI含量导致产生难以接受的臊味。这三类猪的3MI脂肪含量和AO活性的平均值显示在表2中。讨论甲萘醌被充分证明是AO的抑制剂(Johns，1967;Krenitzky等人，1974;Rodrigues，1994)，而对甲萘醌抑制敏感的生物化学反应引起AO(Beedham等人，1995;Rashidi等人，1997)。Rodrigues(1994)发现，在10iiM的浓度下，甲萘醌完全消除Nl-甲基烟碱和AO模型底物的氧化。在本试验中，浓度为lOyM甲萘醌降低56.7%的HMOI形成，而在100wM甲萘醌时，无HMOI生成，表明完全抑制其催化活性。所观察到的HMOI产量和甲萘醌浓度之间相反的剂量依赖关系有力地证明了在猪胞质中，AO负责将HMI生物转化为HMOI的酶。奎纳克林被报导为一种抵抗所有底物的竞争性的醛氧化酶抑制剂(Ki=1.5X10—6M)(Rajagopalan禾口Handler,1964)。在本试验中，在抑制将HMI转化HMOI中，奎纳克林的效率低于甲萘醌，但是奎纳克林在更大的程度上抑制反应。奎纳克林抑制HMOI生成还表明，由HMI生成HMOI是由AO催化的。另一个方面，当将别嘌呤醇加入到反应混合物中未观察到抑制作用，表明XO与HMI转化为HMOI的氧化代谢无关。N-杂环阳离子构成AO底物的主要基团(Beedham，1985)。环胆原子的季胺化刺激杂环发生亲质子取代，从而增强化合物发生酶催化的连接的反应活性(Beedham，1985)。HMI是最近被鉴定的由猪微粒体酶生成的N-杂环季胺化的代谢产物(Diaz等人，1999)，因此，其构成了AO催化氧化的合适底物。本研究的结果有力地证明了猪胞质中存在的AO活性负责HMI的氧化，生成极性更高、更加稳定的代谢产物HMOI。当肝脏AO活性相对于3MI的脂肪含量作图(以HMOI生成来测量)，观察到明显的反比例关系(图9)。该结果表明，肝脏AO活性与3MI清除相关。相对高的决定系数(r2=0.49)表明几乎50。/。的3MI的脂肪含量变化是由肝脏中的AO酶促活性引起的。显示在表2中的结果也表明在大量清除猪体内的3MI时，AO活性是重要的。高的3MI的脂肪含量还有低酶促活性相关(平均值分别为0.24mg/kg3MI和0.80nmolHMOI/mg蛋白/分钟)，而低3MI水平与高酶促活性相关(平均值分别为0.09mg/kg3MI和2.73nmolHMOI/mg蛋白/分钟)。划分为高3MI沉积的猪的平均AO活性比那些划分为低沉积的猪低3.4倍；该差异是显著的(P<0.05)。本研究的结果暗示，AO在猪体内的3MI代谢中起重要作用，其催化活性与充分清除3MI相关。猪体内的AO酶促活性可以用作一种潜在的标记，用于鉴定在脂肪中含有低水平3MI的猪，这将最终有助于控制"公猪膻味"。甲萘醌通常被用作猪饲料中的维生素K的来源(NationalResearchCouncil,1987)。推荐的含量为2.5mg/kg用于生长料，2.0mg/kg用于肥育料(Patience等人，1995)。由于甲萘醌是一种有效的AO抑制剂，该酶在3MI的代谢中似乎是重要的，猪饲料中不应当存在过量的甲萘醌。有可能某些情况下的"公猪膻味"是由于饲料中的高含量甲萘醌引起的，高含量的甲萘醌导致在猪脂肪中产生高水平的3MI。还需要研究以确定通常用于猪饲料中的甲萘醌水平是否能够抑制AO活性。此外，已经观察到饲料中高水平的铜导致钼缺乏，从而引起低AO活性，这是因为钼是AO酶的协同因子(Beedham，1985)。避免在猪饲料中使用过量铜是重要的，以避免AO活性降低和可能产生"公猪膻味"。实施例3:CYP2A6在猪肝脏微粒体代谢3-甲基吲哚中的作用用选择性的化学抑制剂，研究不同细胞色素P450酶对3-甲基吲哚(3MI)代谢的作用。筛选P450酶的8种化学抑制剂对猪微粒体中的3MI代谢的抑制特异性a-萘磺酮(CYP1A2)、8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen)(CYP2A6)、薄荷呋喃(menthoforan)(CYP2A6)、磺胺二甲基苯基吡唑酮(sulphaphenazole)(CYP2C9)、奎纳定(quinidine)(CYP2D6)、4-甲基吡唑(CYP2E1)，二乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate)(CYP2E1，CYP2A6)和三乙酰竹桃霉素(troleandomycin)(CYP3A4)。在微粒体温育物中，不同的3MI代谢产物的生成仅受CYP2E1和CYP2A6抑制剂存在的影响。在第二个试验中，通过Western印迹分析，筛选一组猪微粒体(n=30)中的CYP2A6含量，以及7-羟基化活性(CYP2A6活性)。蛋白质含量和酶促活性与3MI的脂肪含量相关。本研究的结果表明，对CYP2A6水平和/或活性的测量是3MI诱导的公猪膻味的一种有用标记。表l:猪肝脏微粒体生成的3MI代谢产物的产率(pmol/mg微粒体蛋白/分钟)(r^30)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*11.丄=未检测到表2<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>同一列中的a《是指缺乏相同上标的之间具有显著的差别(P<0.05)。实施例4根据本发明，联合不同形式的细胞色素P450酶如CYP2A6，用于鉴定和选择公猪膻味不同的猪。例如，按照本发明，鉴定CYP2A6基因的缺失突变体，其产生阅读框移码和缺失的功能突变，在猪体内产生更高的粪臭素水平。本发明人已经克隆了猪的CYP2A6异构体。本发明人发现一种导致阅读框移码和成熟前终止的缺失突变。这种动物肝脏中的CYP2A6(香豆素7-羟化酶)酶活性为零，脂肪中的粪臭素水平高。鉴定了另一种多态性，导致nt编号124上的a转变为c，而SEQIDNO:3(野生型)的氨基酸编号42的Phe变为Leu。按照本发明，还鉴定了猪体内与粪臭素代谢相关的其他基因多态性(其他的细胞色素P450相关基因)，根据猪产生公猪膻味的倾向性来遗传鉴定和选择猪。一旦确定一种基因或基因产物与特定特性之间的关系时，对编码这种蛋白质的基因进行筛选，确定其作为标记的多态性，这种标记用于显示这些动物在相关特性方面的差异。这些基因的多态性使得可以鉴定遗传学标记，用于特定的品种或遗传品系(geneticline)或动物，在动物幼年时确定其产生公猪膻味的可能性。按照本发明，鉴定了其他形式的CYP2A6，其会引起移码，产生成熟前终止密码子和功能缺失，导致在猪体内产生较高的粪臭素水平。用在此公开的CYP2A6的新序列，或者上文的SEQIDNO:18或3，在此公开的SEQIDNO:1的突变体(缺失124nt和422)、SEQIDNO:5的突变体(仅缺失124nt)和SEQIDNO:7(仅缺失422)的突变体，可以开发检测是否存在这种改变形式CYP2A6的方法。这些检测方法包括但是不限于PCR、SSCP等。因此，本发明涉及动物体内具有经济价值的特性的遗传学标记。基于醛氧化酶路径和CYP2A6与粪臭素生成相关的发现，该标记表现为与公猪膻味相关的等位基因或者其他基因形式。因此，本发明涉及遗传学标记和在特定的动物、品种、品系、种群(population)或类群(group)的一头动物中鉴定这些标记的方法，其中动物体内的粪臭素代谢被增加、降低或者改变，从而增加、降低或者改变公猪膻味。任何鉴定这些标记的存在与否的方法都可以使用，包括，例如单链构象多态性(SSCP)分析、碱基删除序列扫描(BESS)、RFLP分析、异源双链分子分析、变性梯度凝胶电泳和温度梯度电泳、等位基因PCR、连接酶链式反应直接测序、小型测序、核酸杂交、微阵列检测编码与粪臭素代谢相关酶的基因。在本发明的保护范围内还包括分析存在该多态性时发生的蛋白质构象和序列的改变。多态性可能是或者可能不是导致结果的突变，但是指示存在这种改变，可以分析产生这种表型差异的基因或蛋白质的基础。如下是用于分析本发明的遗传学标记的技术的概括。在本发明中，从动物中获取遗传物质的样品。样品可以从血液、组织、精液等获得。通常，外周血细胞用作来源，遗传物质为DNA。获得足量细胞，以提供足够用于分析的DNA。这种含量是已知的，容易由本领域技术人员确定。通过本领域技术人员知晓的技术从血细胞中分离DNA。核酸的分离和扩增从任何便捷的来源中分离基因组DNA样品，包括唾液、口腔细胞、发根、血液、脐带血(cordblood)、羊水、间质液(interstitialfluid)、腹水、绒毛膜和任何其他合适的细胞或者具有完整的间期细胞核或者中期细胞的组织样品。从固体组织中获取细胞，如从鲜新或者冷冻的器官或者从组织样品或者活组织检查中获得。样品中含有不是天然地与生物材料混杂的化合物，如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养剂抗生素等。用于从这些各种来源中分离基因组DNA的方法被描述在，例如Kirby，ZWJF/"g"n'油'wg，爿"/旨ot/Mc"o"，W.H.Freeman&Co.纽约(1992)中。还可以从培养的原代或者次级细胞培养物或者从来源于上述组织样品的任何之一的转化细胞系中分离基因组DNA。还使用动物RNA样品。如上文的Sambrook等人中所述，从表达该基因的组织中分离RNA。RNA可以是总细胞RNA、mRNA、polyA+RNA，或者它们的任何组合。为了获得最好的结果，将RNA纯化，也可以是纯化的胞质RNA。可以将RNA反转录成DNA，然后将DNA作为扩增模板，使得PCR直接扩增出特定的RNA转录本群体。参见，例如Sambrook，同上文，Kawasaki等人，PCRTechnology中第8章(1992)同上文，和Berg等人，/fMm.Ge"ef.85:655-658(1990)。PCR扩增最常用的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)，如美国专利4,683,195;4，683,202和4，965，188中所描述，这些专利的每一份在此引入作为参考。如果用PCR在血细胞中扩增目标区域，应当将肝素化的全血加到封闭的真空管中，与其他样品分开，戴干净的手套。为了获得最佳结果，在收集血液后应立即进行加工；如果不可能做到这一点，应当在fC下将血液保存在封闭容器中，直到使用。还应当分析其他生理液体中的细胞。当使用这些液体的任何一种时，应当通过离心从液体成分中分离液体中的细胞。用无菌的、一次性解剖刀和无菌针头(或者两片解剖刀)，在5mmPetri培养皿中粗略地切碎组织。在本领域技术人员知晓的各种专业手册中描述了从组织切片上去除石蜡的方法。为了通过PCR扩增样品中的目标核酸序列，该序列必须能够被扩增系统中的成分接近。一种分离目标DNA的方法是粗提取，可用于相对较大的样品。简而言之，用标准方法，通过在无菌的Ficoll-Hypaque梯度上分层，分离来自血液样品的单核细胞、来自羊水的羊膜细胞(amnk)cyte)、培养的绒毛膜细胞等。收集间期细胞，进行DNA提取前，在无菌磷酸缓冲盐水中洗涤三次。如果对来自外周血淋巴细胞DNA进行检测，进行渗压休克(用蒸馏水处理沉淀IO秒钟)，如果在初次洗涤后可见残余的红血球，再洗涤两次。这将防止血色素携带的亚铁血红素基团对PCR反应的抑制作用。如果在样品收集后不立即进行PCR检测，则将106细胞的等分试样沉淀在无菌的Eppendorf管中，将干燥沉淀冷冻在-2(TC下，直到使用。将细胞重悬(每100ii1有106个去核细胞)在缓冲液中，该缓冲液含有50mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKC1、1.5mMMgCl2、0.5%Tween20和0.5%NP40,添加lOOug/ml蛋白酶K。在56"下温育2小时后，加热细胞到95。CIO分钟，灭活蛋白酶K，立即转移到湿冰上(速冷)。如果存在粗聚集物，需要在相同的缓冲液中进行另一个循环消化。将10Pl该提取物用于扩增。当从组织中提取DNA时，如从绒毛膜细胞或者汇合的培养细胞中提取，上述具有蛋白酶K的缓冲液的用量根据组织样品大小而变化。在50-60。C下温育提取物4-10小时，然后在95。C下温育10分钟，以灭活蛋白酶。在较长的温育时期内，在最初浓縮的约4小时后应当加入鲜新的蛋白酶K。当样品含有少数细胞时，通过Higuchi，"SimpleandRapidPreparationofSamplesforPCR"，PCT7fec/""o/ogK，Ehrlich，H.A.(编辑)，Stockton出版社，纽约中描述的方法来进行提取，其在此引入作为参考。采用PCR来扩增数量极少的细胞(1000-5000个)中的目标区域，这些细胞来源于骨髓和外周血培养物的单个菌落。样品中的细胞悬浮在20ul的PCR溶解缓冲液(10mMTris画HCl(pH8.3)、50mMKC1、2.5mMMgCl2、0.1mg/ml白明胶、0.45%NP40、0.45%Tween20)中，冷冻直到使用。将进行PCR时，将0.6ul蛋白酶K(2mg/ml)加入到PCR溶解缓冲液中的细胞中。然后将样品加热到约6(TC，温育1小时。将样品加热到95t:iO分钟，然后在冰上冷却，灭活蛋白酶K，终止消化。用PCR提取DNA的相对容易的方法是盐析，由Miller等人，M/c/e/cA^^/fe&16:1215(1988)描述的方法改进得到，该文献在此引入作为参考。在Ficoll-Hypaque梯度中分离单核细胞。将细胞重悬在3ml溶解缓冲液(lOmMTris-HC1、400mMNaCl、2mMNa2EDTA，pH8.2)中。将50u1的20mg/ml蛋白酶K溶液和150P1的20%SDS溶液加入到细胞中，在37"下温育过夜。温育过程中摇动试管，将增进样品的消化。如果在过夜温育后，蛋白酶K消化不完全(仍然可见碎片)，在溶液中再混合50ul20mg/ml蛋白酶K溶液，在37C下在摇床上再温育一个晚上。在充分消化后，将lml6MNaCl溶液加到样品中，用力混合。生成的溶液以3000rpm离心15分钟。沉淀含有沉淀的细胞蛋白，而上清液含有DNA。将上清液转移到含有4ml异丙醇的15ml试管中。轻轻混合试管中的内容物，直到水和醇相相互混合，生成白色的DNA沉淀。取出DNA沉淀，浸润在70%乙醇溶液中，轻轻混合。从乙醇中取出DNA沉淀，风干。将沉淀放到水中，溶解。用于提取高分子量的DNA的PCR试剂盒包括基因组分离试剂盒A.S.A.P.(BoehringerMannheim，印第安纳波利斯，印第安纳州)、基因组DNA分离系统(GIBCOBRL，Gakhersburg，马里兰州)、Elu-QuikDNA纯化试剂盒(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)、DNA提取试剂盒(Stmtagene，LaJolla，加利福尼亚州)、TurboGen分离试剂盒(Invitrogen，圣地亚哥，加利福尼亚州)等。在实施本发明的方法前，通常适合按照厂商的推荐，使用这些试剂盒来纯化DNA。在260nm和280mn下，分光光度分析稀释的等分试样的吸光率，可以确定所提取的DNA的浓度和纯度。在提取DNA后，进行PCR扩增。每个PCR循环的第一步包括通过引物延伸分离形成的核酸双链体。一旦链被分离，PCR中的下一个步骤包括使分离的链杂交与目标序列侧面连接的引物。然后延伸引物，形成互补的目标链拷贝。为了成功的进行PCR扩增，设计引物，使得由一条引物合成的延伸产物从模板(互补序列)上分离时，作为其他引物延伸的模板。重复变性、杂交和延伸的循环必需的次数，以获得期望数量的扩增核酸。在特别有用的PCR扩增实施方案中，通过将反应加热到足够高的温度和足够长时间，使二聚体变性而不会不可逆地变性聚合酶，实现链分离(参见美国专利4,965,188，在此引入作为参考)。典型的加热变性包括在80-105。C的范围内加热数秒到数分钟。但是，可以通过任何合适的变性方法，包括物理的、化学的、或者酶促的方法，来实现链分离。可以用解旋酶，如具有解旋酶活性的酶，诱导链分离。例如，存在ATP时，酶RecA具有解旋酶活性。适合用解旋酶进行链分离的反应条件在本领域是已知的(参见KuhnHoffman-Berling，1978，C57f-0/朋故加've所o/ogy，43:63-67;和Radding，1982，Tev.G^幼b16:405-436，这些文献的每一份在此引入作为参考)。在反应液中存在足量四种三磷酸脱氧核糖核酸(典型地为ATP、dGTP、dCTP和dTTP)时，PCR中模板依赖的引物扩增是由聚合试剂催化的，该反应液包含适当盐、金属阳离子和Ph缓冲体系。合适的聚合试剂是己知能够催化模板依赖的DNA合成的酶。在有些情形下，目标区域可能编码一部分由细胞表达的蛋白质。在这种情形下，用mRNA扩增目标区域。此外，用PCR从RNA生成cDNA文库，用于进一步扩增，用于引物延伸的起始模板是RNA。适合用于从RNA模板合成互补的、拷贝DNA(cDNA)序列的聚合试剂是逆转录酶(RT)，例如鸟成髓病毒(avianmyeloblastosisvims)RT、莫洛尼鼠白血病病毒RT或者Thermus嗜热菌(Tth)DNA聚合酶、PerkinElmerCetus公司销售的具有逆转录酶活性的热稳定DNA聚合酶。通常，在仅留下DNA模板的起始反转录步骤后，在第一个变性步骤中将基因组RNA模板加热降解。适合与DNA模板一起使用的聚合酶包括，例如大肠杆菌DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶、Tth聚合酶和Taq聚合酶、分离自栖热水生菌(T7z^附^a，加'c附)并且可以从PerkinElmerCetus公司购买得到的热稳定的DNA聚合酶。后面这种酶被广泛用于核酸的扩增和测序。使用Taq聚合酶的反应条件在本领域是已知的，描述在Gelfand，1989，T^c/z"o/ogy，同上文o等位基因特异性PCR等位基因特异性PCR显示在变体或多态性上存在差别的目标区域之间的差异。选择PCR扩增引物，该引物仅结合目标序列的某些等位基因。Gibbs，A^c/e/c爿cWiey.l7:12427-2448(1989)中描述了该方法。等位基因特异性寡核苷酸筛选方法其他诊断性的筛选方法采用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)筛选方法，如Saiki等人，Atowe324:163-166(1986)所描述。对于任何特定的等位基因，生成具有一个或多个碱基对错配的寡核苷酸。ASO筛选方法检测不同目标基因组的或者PCR扩增的DNA与未突变的寡核苷酸之间的错配，显示相对于突变寡核苷酸，该寡核苷酸的结合能力下降。设计寡核苷酸探针，使得在低严格性条件下，这些探针能够结合到两种多态性形式的等位基因上，但是在高严格性条件下，结合到其所对应的等位基因上。此外，设计严格性条件，以产生实质上的双元反应，即对应于不同形式的目标基因的ASO将会杂交到该等位基因上，而不结合到野生型的等位基因上(连接酶介导的等位基因检测方法通过连接酶介导的等位基因检测，将测试对象的DNA的目标区域与未受影响的和受影响的家族成员中的目标区域比较。参见Landegren等人，Sc/wce241:107-1080(1988)。还可以用连接酶，在Wu等人，Ge"om/cs4:560-569(1989)描述的连接扩增反应中检测点突变。连接扩增反应(LAR)采用如Wu，同上文，和Barany，户rac.Ato.A^/.88:189-193(1990)中描述的模板依赖的连接，扩增特异性DNA序列。变性梯度凝胶电泳用聚合酶链式反应生成的扩增产物用变性梯度凝胶电泳分析。根据不同的序列依赖性解链特性和溶液中的DNA的电泳迁移，鉴定不同的等位基因。在温度升高或者变性的条件下，DNA分子成段解链，该片段称作为解链结构域。在不同的碱基特异性解链温度(Tm)下，各个解链结构域共同解链。解链结构域至少长20个碱基对，而且长达数百个碱基对。可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳，如Erlich编辑的户Cirec/mo/ogy的第7章，"PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification",W.H.FreemanandCo.,纽约(1992)中所描述，其内容在此引入作为参考，来评价等位基因间基于序列特异性解链结构域差别的差异。通常，通过变性梯度凝胶电泳分析的目标区域用与目标区域侧面连接的PCR引物来扩增。将所扩增的PCR产物应用于具有线性的变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶，如Myers等人，Me//z.￡:"w"7o/.155:501-527(1986)，禾口Myers等人，GW20附/cy^a/，》，APracticalApproach,K.Davies编辑，IRL出版有限公司，牛津，95-139(1988)，其内容在此引入作为参考。将电泳系统维持的略微低于目标序列的解链结构域的Tm的温度下。在可替代的变性梯度凝胶电泳方法中，首先将目标序列连接到一条称作为GC夹的GC核苷酸链上，这种GC核苷酸链在Eriich，同上文的第7章中有描述。优选地，GC夹中的核苷酸至少80%为鸟嘌呤或胞嘧啶。优选地，GC夹至少长30个碱基。这种方法特别适合于具有高Tm的目标序列。通常，用如上所述的聚合酶链式反应来扩增目标区域。寡核苷酸PCR引物之一在其5'端具有GC夹区域，至少30个碱基的富含GC的序列，其在扩增过程中结合到目标区域的5'端上。在如上描述的变性梯度条件下，对所生成的扩增目标区域进行电泳。单个碱基改变而不同的DNA片段将通过凝胶迁移到不同位置上，通过溴乙啶染色来显示。温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳(TGGE)基于与变性梯度凝胶电泳相同的潜在原理，不过变性梯度是由温度不同而不是化学变性剂的浓度不同产生。标准TGGE采用一种电泳设备，在泳道上形成温度梯度。由于样品是在具有相同浓度的化学变性剂的凝胶上迁移，遭遇逐步升高的温度。一种可替代的TGGE方法，瞬时温度梯度凝胶电泳(TTGE或tTGGE)采用稳定升高的整个电泳凝胶的温度，获得相同结果。当样品沿着凝胶迁移，整个凝胶的温度升高，使得样品在凝胶上迁移时遭遇逐步升高的温度。样品的制备，包括结合GC夹的PCR扩增和产物显示，与变性梯度凝胶电泳相同。单链构象多态性分析在所选择的公猪膻味位点上的目标序列或等位基因用单链构象多态性分析来区分，该分析通过单链PCR产物在电泳迁移中的变化鉴定碱基差异，如Orita等人，尸rac.淑A^5W.85:2766-2770(1989)所描述。如上所述生成所扩增的PCR产物，加热或变性，生成单链的扩增产物。单链核酸可能再折叠或者形成部分地依赖于碱基序列的二级结构。因此，单链扩增产物的电泳迁移率能够检测等位基因或者目标序列之间的碱基序列差异。错配的化学或酶促断裂通过如Grompe等人，^肌j:/^m.Ge"".48:212-222(1991)描述的错配碱基对的示差性化学断裂，检测目标序列之间的差异。在另一种方法中，通过Nelson等人，Atowre4:11-18(1993)描述的酶促断裂错配碱基对，检测目标序列间的差别。简而言之，来自动物和受影响的家族成员的遗传物质用于生成无错配的异种杂合(heterohybrid)DNA二聚体。如在此所用，"异种杂合体"是指包含一条来自一种动物的DNA链和第二条来自另一种动物的DNA链的DNA二聚体，通常动物在感兴趣特性的表型是不同。阳性选择无错配的异种杂合体，可以确定小的插入、缺失或者其他与多态性相关的多态现象。非凝胶系统其他可能技术包括非凝胶系统，如TAQMANTM(PerkinElmer)。在该系统中，设计寡核苷酸PCR引物，与所研究的突变侧面连接，以PCR扩增该区域。然后设计第三种寡核苷酸探针，与含有在基因的不同等位基因间发生变化的碱基的区域杂交。该探针的5'和3'端用荧光染料标记。选择染料，使得在它们相互接近时，它们之一的荧光性被另一个淬灭而不被检测到。通过TaqDNA聚合酶，由相对于探针位于模板5'端上的PCR引物进行延伸，导致由TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性，将连接到退火探针的5'端上的染料断裂。这去除了淬灭作用，使得可以检测来自探针的3'端的染料的荧光性。如果探针与模板分子结合不完全，即存在某些形式的错配，不发生染料断裂，出现不同DNA序列间的差别。因此，仅当寡核苷酸探针的核苷酸序列与其所结合的模板分子完全互补时，才避免淬灭。反应混合物含有不同探针序列，各种探针序列被设计来结合可能存在的不同等位基因，从而可以在一个反应中检测两种等位基因。还有另一种技术包括侵略者分析(InvaderAssay),包括依赖于催化释放荧光性的等温性扩增。参见www.twt.com的ThirdWaveTechnology。非基于PCR的DNA诊断学对于连接到编码与粪臭素代谢相关的酶的序列上的DNA序列的鉴定，可以不用扩增步骤来进行，而基于多态性，包括动物和家族成员中的限制性片段长度多态性。杂交探针通常是寡核苷酸，其通过互补碱基配对结合到目标核酸的全部或部分上。探针通常结合到缺乏探针序列的完全互补性的目标序列上，这取决于杂交条件的严格性。优选地直接或间距地标记探针，使得通过分析探针的存在与否，可以检测目标序列的存在与否。直接标记方法包括放射性同位素标记，例如用P"或S35。间接标记方法包括荧光标记、结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素的生物素复合物，或者肽或蛋白质标记。视察方法包括冷光剂(photoluminescent)、德克萨斯红(Texasred)、罗丹明及其衍生物、红色的无色染料和3,3',5,5'-四甲基对二氨基联苯(TMB)，荧光素及衍生物、丹磺酰、7-羟基香豆素等等，或用辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。杂交探针包括任何能够杂交到猪染色体上的核苷酸序列，其中CYP2A6基因或其他与粪臭素代谢相关基因存在于该染色体上，从而定义连接到该基因上的遗传学标记，包括限制性片段长度的多态性、超变区、重复元件或者变化的串联重复。杂交探针可以是任何基因或合适的类似物。其他的合适探针包括外显子片段或者己知会作图到染色体的相关区域上的cDNA或基因的部分。按照本发明使用的优选串联重复杂交探针是那些在高严格性条件下识别特定基因座上的少量片段的探针，或者在严格性条件降低时识别该基因座上的较多片段的探针。可以使用一种或多种其他限制性酶和减探针和减引物。其他酶、构造的探针和弓I物可由本领域普通技术人员通过常规试验来确定，落入本发明的保护范围内。按照本发明，已经鉴定了编码与粪臭素代谢相关的酶的基因中的多态性，该多态性与公猪膻味相关。在一个实施方案中，通过PCR-RFLP分析检测是否存在这些标记，使用限制性核酸内切酶，由于多态性周围的区域高度同源，用类似的人、猪或其他序列设计扩增引物，或者用在GenBank中列举的已知基因序列数据设计扩增引物，甚至根据在此描述的技术和参考文献，根据从来自紧密环绕基因的连接数据获得的序列来设计扩增引物。环绕多态性的序列将便于开发可替代的PCR检测方法，在该方法中，从紧邻多态性的序列中获得的约4-30个连续碱基的引物与聚合酶链式反应连同使用，在用期望的限制性酶处理前极大地扩增该区域。引物不必是完全互补的；基本上相当的序列是可接受的。设计用于PCR扩增的引物是本领域技术人员已知的，被详细地公开在Ausubel(编车葺)，ShortProtocolsinMolecularBiology,第4版，JohnWiley禾卩Sons(1999)。如下简单描述引物的设计。引物设计策略聚合酶链式反应(PCR)方法使用的增加，促进许多辅助设计或选择用作PCR引物的寡核苷酸的程序开发。四个可以通过因特网免费获得的这种程序的例子是由怀特黑德学院的MarkDaiy和SteveLincoln开发的PRIMER(UNIX、VMS、DOS和Macintosh)、圣路易斯的华盛顿大学的PhilGreen和LaDeanaHiller开发的寡核苷酸选择程序(OSP)(LTNIX、VMS、DOS和Macintosh)、Yoshi开发的PGEN(仅在DOS下操作)和威斯康星大学的BillEngels开发的Amplify(仅在Macintosh下操作)。通常，这些程序通过搜索已知重复序列元件的比特数，然后通过分析假定引物的长度和GC含量来优化Tm，辅助PCR引物设计。还可以购买得到商业软件，引物选择操作被包括在大多数的序列分析软件包中。测序和PCR的引物设计用作测序或PCR的引物的寡核苷酸，需要选择特异性地识别目标的合适序列，然后检测该序列，排出该寡核苷酸具有稳定的二级结构的可能性。用上面描述的那些重复鉴定或RNA再折叠程序，确定序列中的反向重复。如果观察到一种可能的茎结构，在任何方向上改变引物序列的少数核苷酸，使预期的二级结构最小化。还将寡核苷酸的序列与适当的载体和插入DNA的链的序列比较。显然，测序引物与目标DNA仅具有单一配对。去除与不期望的目标DNA序列仅有单个错配的也是明智的。对于用于扩增基因组DNA的PCR引物，应当将引物序列与GenBank数据库中的序列比较，确定是否发生任何显著配对。如果寡核苷酸序列存在于任何已知的DNA序列中，或者更重要的是存在于任何未知的重复元件中时，应当更换该引物序列。本发明的方法和材料更通常用于评价猪的DNA、对个体猪进行遗传分析和检测猪间的遗传差异。特别地，参照一个或多个多种，评价猪基因组DNA样品，确定特定基因中的多态性是否存在。优选地，对猪基因进行RFLP分析，将结果与对照比较。对照是RFLP分析不同猪的基因，其中猪基因的多态性是已知的。类似地，通过获得其基因组DNA，RFLP分析DNA中的基因，将结果与对照比较，可以确定猪的基因型。此外，对照是RFLP分析不同猪的基因的结果。通过划分基因中的多态性，该结果可对猪进行遗传分型。最后，可以通过从至少两头猪获得基因组DNA样品，鉴定基因中是否存在多态性，比较该结果，可以检测猪之间的遗传差异。这些分析可用于鉴定与公猪膻味相关的遗传学标记，如上所讨论，用于鉴定编码与粪臭素代谢相关的酶的基因中的其他多态性，和用于常规分析猪的基因型和表型。在此的实施例和方法公开某些基因，其被鉴定具有一种与一种有益特性正相关或负相关的多态性，该特性对肉品质、大量增肌(heavymuscling)和/或具有这种多态性的动物中的骨骼肌痉挛产生影响。确定在基因中存在多态性通常通过单碱基改变来进行，该单碱基改变在某些等位基因形式中产生限制性位点。但是，如在此所证明和讨论，某些等位基因具有与之相关的大量碱基变化，其只是相同的多态性(等位基因)，也可以被分析。此外，其他的遗传学标记或基因也与在此公开的多态性相关，使得分析包括鉴定其他基因或基因片段，但是其最终依赖于动物对相同多态性的遗传特征。任何根据在此公开的等位基因差异来挑选和鉴定动物的检测方法包括在本发明的保护范围内。一旦鉴定了多态性和与所确立的特定特性的相关性，本领域的技术人员将会理解，存在多种途径来对该动物的多态性进行基因分型。这种可替代检测的设计仅仅代表对本领域技术人员已知的参数的优化，旨在包含在本文充分公开的本发明的保护范围内。实施例5:来自猪肝脏的细胞色素P4502A6基因的克隆、表达和功能表征在养猪行业中，未阉割的公猪具有更好的饲料转化率、屠宰后畜体的瘦弱率高和容易进行动物护理(addressedanimalwelfare),被用于肉品生产。因此，饲养公猪可能提高多达30%的猪肉生产收益率(Babol等人，1995)。但是，来自未阉割公猪的肉品煮熟后，常常产生令人不适的气味，通常称作为"公猪膻味"，是最令顾客反感的。粪臭素是公猪膻味的主要原因之一(Gonzalo等人，2000)。粪臭素在肠道被吸收，然后主要在肝脏代谢。已经发现在猪体内，细胞色素P450酶显著影响粪臭素的代谢。已经证明，CYP2A6是粪臭素代谢中的主要酶之一(Gonzalo等人，2000)。已经发现在猪体内，CYP2A6与脂肪中的粪臭素沉积成高度负相关(Babol等人，1998;Gonzalo等人，2000)。因此，在猪体内，CYP2A6对粪臭素的代谢和清除起重要作用。细胞色素P450血红蛋白的一个超家族(Ingelman-Sundberg等人，1999)。在人体内，CYP2A6主要在肝脏中表达(Koskela等人，1999;Oscarson，2001)。CYP2A6是该家族的主要肝脏成员，代谢药物(Miles等人，1990)和许多其他药品和环境化学物质(Yamazaki等人，1992)。在人体内，CYP2A6最早被鉴定为香豆素-7羟化酶(Yamano等人，1990)，由于其在烟碱的C-氧化中起主要作用和包括与吸烟行为和肺癌易感性相关，从此受到大量关注(Xu等人，2002;Oscarson，2001)。与人体内的CYP2A6相关的知识已经得到充分发展。但是，关于CYP2A6基因、表达和CYP2A6遗传变体如何影响猪体内的粪臭素水平的信息仍然是空白。在本研究中，本发明人通过快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，从猪肝脏构建cDNA文库，报道了猪CYP2A6cDNA的序列。本发明人通过Northern分析，检查了CYP2A6mRNA种类在不同猪组织中的表达模式。用聚合酶链式反应技术结合单链构象多态性(PCR-SSCP)，扫描和鉴定来自猪肝脏的CYP2A6编码区的任何遗传多态性，该多态性可能会改变该酶的代谢能力。此外，对CYP2A6的遗传多态性进行功能研究。组织样品从公猪获取肝脏样品，用于构建cDNA文库。为了鉴定CYP2A6中的任何遗传多态性，来自各种品种的69头猪，包括约克夏猪、杜洛克猪、长白猪和皮特兰猪，以及长白猪和杜洛克猪的杂种、大白猪和杜洛克猪的杂种、大白猪和皮特兰猪的杂种，在144kg(144kg±33)的平均活体重时，在畜禽科学学院(DepartmentofAnimalandPoultryScience)的屠宰场屠宰。在放血后，立即摘取肝脏样品，在液氮中冷冻并存储在々(TC下，直到使用。总RKA的分离在1mlTri-Reagent(Sigma)中匀桨100mg组织样品，在室温下温育10分钟。温育后，加入0.2ml氯仿并涡旋。4。C下以12，000xg离心样品IO分钟，将液相转移到无菌试管中。将液相与0.5ml异丙醇混合，在室温下温育10分钟以沉淀RNA。通过离心(4。C下以12，000xg离心10分钟)获取沉淀。用75%乙醇洗涤沉淀，然后悬浮在50ul的DEPC水中。猪cDNARACE文库的构建和筛选用SmartRACEDNA扩增试剂盒(Clontech)从肝脏分离的总RNA，用5'和3'快速扩增从1yg总RNA构建cDNA(RACE)，用作随后PCR筛选猪CYP2A6的模板。通过用改进的锁定引入(lock-docking)oligo(dT)引物合成第一条链cDNA，然后通过末端转移酶在产物的5'端添加5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3'(SEQIDNO:9)(锚定引物)，进行5'RACE。用oligo(dT)引物进行3'RACE，包括与5'RACE相同的锁定引入(lock-docking)核苷酸位置。用引物扩增第一个CYP2A6片段，该引物根据人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3cDNA序列的保守区域设计。正向引物为5'AGGACAAAGAGTTCCTGTCACTG3'，(SEQIDNO:10)，反向引物为5'CAATCTCCTCATGGACCTTGG3'(SEQIDNO:11)。为了获得全长的猪CYP2A6，在随后的PCR筛选中使用如下引物5'ATGAGCAGCAGGAAGCCGTAG3'(SEQIDNO:12)和具有5'Race的锚定引物作为模板；5'CTACGGCTTCCTGCTGCTCAT3'(SEQIDNO:13)和具有3'Race的锚定引物作为模板；具有3'或5'Race的5'CACAACGATGCGCTACGGCT3'(SEQIDNO:14)禾口5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAG3'(SEQIDNO:15)作为模板。PCR包括35个循环的94。C下变性1分钟C，最佳退火1分钟，和延伸1分钟，最后在72。C下延伸10分钟。在1%琼脂糖凝胶上电泳分析10ii1的PCR产物。克隆杂交当从3'和5'Race模板上扩增出多个条带时，将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体系统(Promega)中，然后在DNA测序前进行克隆杂交，验证扩增片段的特异性。该克隆上移到正电荷尼龙膜(Roche)上，然后在0.5MNaCl中溶解和固定5分钟，在5xSSC中洗涤1分钟，风干；用ECL核苷DNA标记和检测试剂盒(AmershamLifeScience)进行克隆杂交。用于杂交的探针是由从人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3cDNA保守区设计的引物最先扩增的片段。在42i:下杂交过夜，用0.15xSSC洗涤20分钟2次，曝光到x射线底片(Kodak)上。产生最强信号的克隆进行测序。分离全长的猪CYP2A6cDNA为了获得全长的猪CYP2A6序列，根据从5'和3'RACE获得的序列，设计正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，用于扩增全长的猪CYP2A6，用5'或3'RACEcDNA作为模板。PCR扩增为94'C下3分钟，接着进行35个循环的94"C下1分钟、64'C下1.5分钟、72t:下2分钟和最后在72'C下延伸IO分钟，加入两滴矿物油。将PCR片段克隆到T-Easy载体(Promega)中，进行序列分析。Northern印迹分析用Tri-Reagent(Sigma),从猪脾脏、胸腺、肝脏、肺、肌肉、卵巢、肾脏、小肠、心脏和睾丸组织中分离RNA。在含有2.0M甲醛的l。/。琼脂糖凝胶中对20ng来自各种组织的总RNA进行电泳，借助向下虹吸转移到尼龙膜上(AmershamPharmaciaBiotech)。用正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，从本发明人构建的猪肝脏cDNA文库中构建全长的猪CYP2A6(M兆bp)。用具有地高辛-dUTP(RocheMolecularBiochemicals)的随机引物标记CYP2A6cDNA，在50r下杂交过夜。在用含有0.1%SDS的2xSSC预先洗涤后，67。C下用含有0.1%SDS的0.2xSSC洗涤膜15分钟，两次。用抗地高辛的碱性磷酸酶偶联物免疫检测被杂交的探针，用比色底物(DIG,Roche)检测，室温下对KodakScientific成像底片(Kodak)曝光1小时。序列分析将PCR片段连接到pGEM-TEasy载体系统(Promega)中，然后转化给感受态DH5cx细胞。纯化DNA，用AppliedBiosystemsABI377型DNA测序仪进行测序。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula>为了扫描来自个体的CYP2A6的遗传多态性，扩增包括整个编码区的RT-PCR产物，然后进行SSCP分析。用Superscript逆转录酶(Invitrogen)和oligo(dT)引物(Sigma),从1-5ug来自肝脏样品的总RNA合成第一条cDNA链。反转录后，将2.5lU的第一条cDNA链用作PCR的模板。PCR混合物(50u1)含有1XPCR缓冲液(100mMTris-HCI，pH8.3;500mMKCl、llmMMgCl2、0.1%白明胶)、0.2mMdNTP、0.4mM弓l物(正向引物和反向引物)以及2.5URedTaq聚合酶(Sigma)。根据本发明人分离的CYP2A6(GenBank登录号AY091516)，设计引物对(正向引物，5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'，(SEQIDNO:16)和反向序列，5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3')(SEQIDNO:17)，扩增全长的猪CYP2A6编码区。PCR扩增为94"下3分钟，接着进行35个循环的9fC下1分钟、65。C下1分钟、72°CT1分钟和最后在72"C下延伸10分钟。单链构象多态性分析首先用Bstxl酶将PCR产物剪切成片段，然后进行SSCP分析(，37。C下，用20u1反应物中的Bstxl消化5li1的PCR扩增产物3小时。然后，用13ul加载缓冲液(10%蔗糖、0.01%溴苯酚兰和0.01%二甲苯苯胺FF)稀释7iU的消化片段。每个消化反应在IO(TC下变性5分钟，在冰上冷却，溶解在10%聚丙烯酰胺凝胶中。在垂直单元中(Bio..RadLaboratories,130X160X1.0mm)进行电泳，15。C禾口160V下，在0.6XTBE缓冲液中进行17小时。然后银染凝胶。CYP2A6活性通过测量猪肝脏微粒体学样品中的香豆素7-羟化酶活性，分析CYP2A6活性。将20u1含有0.4mg微粒体蛋白的微粒体悬浮液与200y1香豆素羟化酶反应混合物(0.05MTris缓冲液pH7.4，5mMMgCl2和0.2mM香豆素)混合。加入15lU25mMNADPH来起始反应。在37°C下温育15分钟后，加入50lU的20%四氯乙酸来终止反应，接着以10,000g离心2分钟。用2ml的0.1MTris缓冲液(pH9.0)稀释200ul上清液，在390nm的激发波长和440nm发射波长下确定荧光性。测量脂肪中的粪臭素水平在第11根肋骨的中线点采集背部脂肪样品，在-2(TC下冷冻，直到用于粪臭素的分析。按照Gonzalo等人(2000)描述的方法，用比色分析测量粪臭素含量。Western分析在5ml样品缓冲液(1%胆酸、0.1%SDS溶于PBS缓冲液)中匀桨肝脏组织(lg)，用BCA试剂盒(Pierce)，确定匀浆中的蛋白质浓度。采用12%聚丙烯酰胺凝胶，对40Ug总蛋白进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳。将蛋白质转移到硝基纤维素滤膜(BioRad)上，用小鼠抗人单克隆2A6-抗体MAB-2A6(Gentest)温育，接着用在山羊中产生的抗小鼠的IGG过氧化酶偶联物(Sigma)进行温育。用化学发光方法(ECL，AmershamLifeScience)对免疫反应性条带进行染色，通过射线自显迹法显示。CYP2A6cDNA序列和序列表征通过PCR筛选由RACE构建的肝脏cDNA文库来分离猪CYP2A6cDNA。CYP2A6cDNA的核苷酸序列长度为1519bp，含有长1485bp的开放阅读框(ORF),其编码497个氨基酸(图12)。猪CYP2A6cDNA序列提交给Genbank数据库，登录号为AY091516。人CYP2A6、小鼠CYP2A5、大鼠CYP2A3被确定为香豆素-7羟化酶。本发明人将猪CYP2A6ORF与上述基因比较，显示出与人CYP2A687%同源，与小鼠CYP2A585%同源，和与大鼠2A386%同源。推导的猪CYP2A6氨基酸序列与人2A687%同源，与小鼠2A590%同源，和与大鼠2A389。/。同源(图13)。在人CYP2A6中，Glnl04、Phe209和His477被报道是CYP2A6香豆素7-羟化酶活性的活性位点，该酶的活性为氧化代谢烟碱和可铁宁(Lewis等人，1999)。R128代表了人CYP2A6的关键结合残基之一(Kiragawa等人，2001;Lewis等人，1999)。所有上述活性位点保留在推导的猪CYP2A6中。CYP2A6mRNA种类在各种组织中的表达用猪CYP2A6cDNA作为探针，通过Northern印迹，研究CYP2A6mRNA在各种组织中的表达模式，包括来自猪的脾脏、胸腺、肝脏、月市、肌肉、卵巢、肾脏、小肠、心脏和睾丸。结果表明，CYP2A6仅在肝脏和肾脏组织中表达(图14)。在肝脏中观察到较高水平的CYP2A6mRNA，而较低水平的CYP2A6mRNA在肾脏中表达。该结果表明，CYP2A6主要在猪肝脏组织中表达。这说明肝脏是猪体内在CYP2A6代谢中起重要作用的主要器官。CYP2A6遗传多态性为了鉴定CYP2A6的任何遗传多态性，该多态性可能改变该酶的代谢能力，用聚合酶链式反应技术结合单链构象多态性(PCR-SSCP)扫描来自猪肝脏组织的CYP2A6编码区。用引物对正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，通过PCR从肝脏组织中扩增猪CYP2A6的全长cDNA。生成的PCR产物大小为1500bp。采用本发明人的优化系统，对用Bstxl消化的PCR产物进行SSCP分析。本发明人发现，在CYP2A6编码区中存在数种不同的多态性(数据未显示)。其中，一个导致编码区移码的突变引起本发明人的最大关注。由于缺失一个G，CYP2A6的ORF区的长度由1485bp变为612bp。这还引起其编码基因产物的长度由495个氨基酸变为204个氨基酸。这表明，缺失可能会导致CYP2A6活性失活或者生成含有该缺失的个体。已经证明，CYP2A6是粪臭素代谢中的主要酶之一(Gonzalo等人，2000)。CYP2A6与脂肪中的粪臭素沉积成负相关(Babol等人，1998)。因此，本发明人推断，由于CYP2A6基因的编码区移码，存在这种缺失的样品中的CYP2A6的香豆素7-羟化酶活性为零，由于缺乏从机体中清除粪臭素的酶活性，粪臭素水平较高。为了评价上述假设，研究CYP2A6的这种遗传多态性与粪臭素水平的相关性，进一步进行用粪臭素水平测量值进行表型分型、香豆素7-羟化酶活性分析和用单克隆抗人CYP2A6的抗体(Gentest)进行免疫印迹。结果表明，具有缺失突变的样品中粪臭素水平高于野生型样品。香豆素7-羟化酶分析和免疫印迹分析也说明，具有缺失突变的样品的香豆素7-羟化酶活性和阴性免疫反应条带未零，而野生型样品保留较低的粪臭素水平、较高的活性和会检测的免疫反应条带(图15)。结果有力地本发明人的观点，即CYP2A6缺失导致完全丧失酶促活性，从而在猪体内产生较高水平的粪臭素含量。在人方面，CPY2A6基因已经被广泛地研究；但是，关于CYP2A6基因、其表达以及CYP2A6的遗传变体如何影响猪体内的粪臭素水平的信息仍然是空白的。在本研究中，本发明人报道了猪的CYP2A6基因的分子克隆、功能表征。本发明人根据人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3的cDNA序列设计引物。在人和小鼠中，香豆素7-羟基化由高亲合性的CYP2A6和CYP2A5酶催化(Miles等人，1990;Donato等人，2000)，而在大鼠中由CYP2A3催化。7-羟基香豆素的形成已经被用作人CYP2A6、小鼠CYP2A5和大鼠2A3的体内外探针(Rodrigues等人，1994;Rautio等人，1992;Femandez-Salguero等人，1995)。因此，用所设计的引物，本发明人筛选出了第一个片段，接着筛选出全长的猪CYP2A6cDNA。对人CYP2A6、小鼠CYP2A5和CYP2A3进行测序(登录号人的为U22027，小鼠的为BC046605和大鼠的为M33190)，分别作图到染色体19ql3.2(b:Femandez-Salguero等人，1995)、染色体7(Kent等人，1987)和染色体1(STS:DlMgh28)上。如结果在所表明，当将猪CYP2A6序列与其直向同源基因人CYP2A6、小鼠2A5和大鼠CYP2A3的序列比较时，本发明人发现，猪CYP2A6在cDNA序列和氨基酸序列上，与其直向同源基因具有高度同源性。在人CYP2A6中的所有重要氨基酸序列活性位点也保留在本发明人推导的猪CYP2A6序列中。此外，本发明人用猪CYP2A6cDNA，对人、小鼠和大鼠基因组数据库进行检索，仅命中来自染色体19ql3.2的人基因组克隆(NT011109)、来自染色体7的小鼠基因组克隆(NT—039410)和来自染色体lq21的大鼠基因组克隆(NW一043361)。命中值表明，猪CYP2A6cDNA序列与人染色体19ql3.2上的人CYP2A6基因组克隆(91%)、小鼠染色体7的小鼠2A5基因组克隆(89%)和大鼠染色体lq21的大鼠CYP2A3基因组克隆(88%)具有最高相同性。将所有这些结果综合在一起，使本发明人得出推断的CYP2A6就是真正的猪CYP2A6的结论。在本研究中，本发明人对猪CYP2A6mRNA在不同组织中的分别进行northern印迹分析，结果表明，CYP2A6主要在肝脏中表达，在肝脏中具有较高水平，在肾脏在具有较低水平。这表明肝脏是猪体内用于从机体中清除粪臭素的最重要的组织。尽管猪CYP2A6与其直向同源基因具有高度相似性，这些酶在组织分布上存在差别。已经报道，对于人2A6，主要在肝脏中观察到其mRNA表达(Koskela等人，1999;Oscarson,2001)，而小鼠2A5的mRNA表达存在于肝脏、肾脏和小肠(Su等人，1998)，而大鼠2A3的mRNA表达存在于嗅粘膜和肺(Su，等人，1996;Kimura等人，1989)。在本研究中，本发明人发现，CYP2A6不在猪的小肠和肺中表达。CYP2A6mRNA及其直向同源基因在各种组织中的表达差异说明，它们的启动子区域可能存在差异，这种差异可用于研究组织特异性基因表达的调控。在人方面，由于CYP2A6在烟碱代谢中的重要性，和可能与吸烟行为和肺癌易感性有关，CYP2A6是烟碱C-氧化中最重要的酶之一(Xu等人，2002;Oscarson，2001)。因此，人CYP2A6基因的多态性可能影响吸烟行为和肺癌的易感性。因此，人们在检测其遗传多态性及其结果中己经投入巨大努力(Paschke等人，2001;Kamataki等人，1999;Oscarson等人，2001;Kitagawa等人，2001)。在人方面，由于遗传变化主要位于开放阅读框内，已经发现在CYP2A6酶水平上存在大的个体间差异(Nakajima等人，2002)。已经检测到人CYP2A6的大量遗传多态性，包括编码区内导致失活的SNP，例如Gly479Val(Oscarson等人，2001)和Argl28Gln(Kitagawa等人，2001)。这些研究中的进展将推动分子研究，以阐明CYP2A6多态性在引起遗传差异和其结果中的重要性。细胞色素P450酶包括CYP2A6在粪臭素代谢中的作用，己经在人、小鼠和兔子进行了研究(Thornton-Manning等人，1996)。在猪方面，已经报道CYP2A6是肝脏代谢粪臭素中的关键酶之一(Gonzalo等人，2000)，而CYP2A6与脂肪中的粪臭素沉积成负相关(Babol等人，1998)。因此，具有高水平的这些酶包括CYP2A6的猪在脂肪中具有较低水平的粪臭素，这是由于粪臭素被快速代谢，并从机体中清除，这些酶的水平低的猪在脂肪中具有较高水平的粪臭素。因此，一旦CYP2A6的遗传变体及其对粪臭素的作用被研究，CYP2A6可用作一种遗传学标记，选择来抵抗粪臭素。由于没有关于CYP2A6基因的信息，本发明人用RACE方法，首次从肝脏样品中分离猪CYP2A6，然后根据本发明人的优化基因分析系统，进行PCR-SSCP分析来筛选猪CYP2A6编码区。在本研究中，本发明人致力于评价CYP2A6的功能区及其遗传多态性。本发明人已经鉴定一种遗传多态性，导致在编码区内发生移码，灭活酶的活性。由于CYP2A6的缺失，香豆素7-羟基化和CYP2A6基因产物是不是可检测的。还不知晓在哪个阶段发生CYP2A6的不可调控。在本发明的使用香豆素的CYP2A6表型划分研究中，用小鼠抗人的单克隆2A6-抗体进行western分析，和测量猪中的粪臭素，本发明人还分析，在编码区外存在其他等位基因，其调节或灭活CYP2A6的活性(数据未显示)。因此，在将来的研究中，研究CYP2A6的启动子区域，结合具有香豆素的表型个体、作为体内和体外CYP2A6活性的指示剂的免疫检测条带将会有用的，由于可能存在还未知的其他CYP2A6的等位基因。在该研究中，本发明人从肝脏中分离猪CYP2A6cDNA，发现ORF区域中的CYP2A6缺失，该缺失会引起酶促活性的完全丧失。还没有发表研究CYP2A6中遗传多态性对猪体内清除的粪臭素的影响的研究。本研究中提供的数据表明，CYP2A6基因缺失可能会在开发粪臭素的遗传学标记中起重要作用。参考文献Diaz，G丄禾llSquires,E丄(2000).Metabolismof3-MethylindolebyPorcineLiverMicrosomes:ResponsibleCytochromeP450Enzyme.7bx/co/og/c"/5Wewce55，284-292.Babol，J.，Squires,E丄禾口Lundstr6m，K.(1998)RelationshipbetweenOxidation禾PConjugationMetabolismofSkatoleinPigLiverandConcentrationsofSkatoleinFat.Jowwa/o/Jm'膽/5We"ce76，829-838.Donato，M.T.，Viitala，P.，Rodriguez-Antona，C.，Lindfors，A.，Castell，J.V.，Raunio，H.，G6mez画Lech6n，M丄和Pelkonen，O.(2000)CYP2A5/CYP2A6expressioninmouseandhumanhepatocytestreatedwithvariousinvivoinduces.Drwg她to6o/z'纖_D—cw'ow28，1321-1326Fernandez-Salguero,P.禾卩Gonzalez,F丄(1995)TheCYP2Agenesubfamily:speciesdifferences,regulation,catalyticactivitiesandroleinchemicalcarcinogenesis./VwrwacogewWcs5，123-128Fernandez-Salguero,P.，Hoffman，S.M.，Cholerton，S.，Mohrenweiser，H.，Raunio，H.，Rautio，A.，Pelkonen，J.D.，Humang，W.E.，Eeans，J.R.禾口Idle.(1995)Ageneticpolymorphismincoumarin7-hydroxylation:sequenceofthehumanCYP2AgenesandidentificationofvariantCYP2A6alleles.772e^附en.cawJ"oi^"o/o///wma"57，651-660Ingelman-Sundberg，M.，Oscarson，M.禾口Mclellan，R.A(1999)PolymorphichumancytochromeP450enzymes:anopportunityforindividualizeddrugtreatment,r7'e"(is1〖w/Vzarmaco/ogz.ca/5bz'ewce20，342-349Kamataki，T.，Nimoya，K丄，Sakai，Y.，Kushida，H.禾卩Fujita，K.I.(1999)GeneticpolymorphismofCYP2A6inrelationtocancer.h離c/z428，125-130Kent,R.B.，Fallows,D.A.，Geissler，E.，Glaser，T.，Emanuel,J.R.，Lalley,RA.，Levenson，R.禾口Housman，D.E.(1987)GenesencodingalphaandbetasubunitsofNa，K-ATPasearelocatedonthreedifferentchromosomesinthemouse.o/iV加'o""/o/&/e"ce，USA84，5369-5373Kimura，S.，Kozak，C.A.禾卩Gonzalez,F.J.(1989)IdentificationofanovelP450expressioninratlung:cDNAcloningandsequence,chromosomemapping，andinductionby3-mtehylcholanthrene.5/0cAemZW/728，3798-3803Kitagawa，K.,Kunugita，N.，Kitagawa，M.禾卩Kawamoto,T.(2001)CYP2A6*6，anovelpolymorphismincytochromeP4502A6，hasasingleaminoacidsubstitution(R128Q)thatinactivatesenzymes.TTjeJbwma/o/C/zem^/zj276，17830-17835Koskela，S.，Hakkola，J.，Hukkanen，J.，Pdkonen,O.，Sorri，M.禾卩Saranen，A.(1999)ExpressionofCYP2Ageneinhumanliverandextrahepatictissue./7za/7woco/ogy57，1407-1413Lewis,D.F.V.，Dickins，M.,Lake,B.G.，Eddershaw，P丄，Tarbit，M.H.禾口Goldfarb,P.S.(1999)MolecularmodelingofthehumancytochromeP450isoformCYP2A6andinvestigationsofCYP2Asubstrateselectivity.7bx/co/ogy133，1-33Miles,J.S.，Mclaren，S.W，Forrester,LM.，Glancey，M.J.，Lang，M.A.禾口Wolf，C.R.(1990)Identificationofthe人livercytochromeP-450responsibleforcoumarin7-hydroxy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