专利名称：使发射体的光谱发射特性产生改变的发射体结合肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及发射体结合肽(Emitter-bindende Peptide)，在其抗原结合口袋与发射体相互作用时其使发射体的光谱发射特性产生改变。本发明的发射体结合肽特别是抗体或抗体片段的组分。
背景技术：
为诊断检测某些物质及确定其浓度，现在很多情况下使用的是体外诊断测量方法，其基于对于要测定的物质具有高亲和力的生物分子，如例如肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸。为此，优选使用蛋白质和肽，特别优选使用抗体和抗体片段。
某些体外诊断方法，如例如电化学发光是基于针对要测定物质的不同抗体的组合，其中一种抗体用于从所研究的样品中分离要测定的物质，而另一种抗体携带诊断用的检测信号分子。在电化学发光的诊断方法中，标记的抗体被光学检测Grayeski，M.L.，Anal.Chem.1987，59，1243。
除了电化学发光，光诱导的磷光和荧光也可以作为分子的光学特性用于诊断测量方法。与电化学发光和磷光相比，特别是将荧光作为分子的光学特性在大的动态范围内具有测量信号的高检测灵敏性和高线性的优点。
为检测荧光团的荧光，发展了在荧光方法中应用不同原理的多种测量方法。已有的测量方法应用例如偏振光弱化(荧光偏振＝FP)，测量光子使用寿命(荧光使用寿命测量-FLM)，漂白特性(荧光光漂白恢复-FRR)和不同荧光团之间的能量转移(荧光-共振-能量转移-FRET)Williams，A.T.，et al，Methods Immunol.Anal.1993，1，446；Youn，H.J.et al，Anal.Biochem.1995 Oswald，B.et al，Anal.Biochem.2000，280，272；Szollosi，J.et al，Cytometry 1998，34，159。
其它检测方法基于偏振面或检测磷光的改变。
上述方法中，使用的抗物质抗体实现了不同的目的。一方面，它们用于从所述样品中分离要测定的物质，而另一方面，它们也可实现对应用于待检测物质上的不同信号递质进行定位的目的。为检测例如样品中的抗体，主要的光学和放射性测量方法已被建立，而且也已知声学(见例如Cooper，M.A.et al，Direct and Sensitive Detection of aHuman Virus By Rupture Event Scanning.Nat Biotechnol.2001 Sep；19(9)833-7)和磁学测量方法。光学测量方法获得了最广泛的应用Nakamura，R.M.，Dito，W.R.，Tucker，E.S.(Eds.).ImmunoassaysClinical Laboratory Techniques for the 1980s.A.R.Liss，NewYork.Edwards，R.(ed.).ImmunoassaysEssential Data，1996，WileyEurope。
在多数已有的测量方法中，抗物质抗体用一种荧光团标记。这个标记通过特异的和非特异的化学偶联完成。标记的抗体过量加入要研究的样品中。为了结合所有测定的物质分子，这是必需的。另外，这个方法通常基于一种抗物质抗体用于分离要测定的物质而在另一个结合位点检测要研究物质的另一种抗物质抗体用信号分子标记。这样，可以避免由于未结合的、但是产生信号的抗体造成的测量结果的歪曲。然而，由于存在分离步骤，这个方法需要较复杂的方法学和技术要求以及较高的花费。较复杂的技术要求阻止了这个方法用于高速诊断，被证明是特别不利的。
针对低分子量分子的抗体和肽是已知的。这些也包括针对染料分子的抗体和肽。Simeonov，A.et al.，Science 2000，290，307-313描述了针对芪的抗体(“蓝色荧光抗体”)。这些抗体催化特异的光化学异构化过程并导致UV-VIS光谱范围内的红移吸收和荧光最大值(吸收移动最大12nm，荧光移动22nm)。然而，对于在600-1200nm波长范围内保持花青染料的荧光量子产额时的红移，Simeonov，A.et al.没有提供任何有关的提示。
Watt，R.M.et al.(Immunochemistry 1977，14，533-541)描述了已知的抗荧光素抗体构建体的光谱特性。结合荧光素后，在可见光谱范围内抗体发生了吸收和荧光最大值的移动，但是只有12nm或5nm。另外，荧光量子产额急剧减少(大约90％)。
Rozinov，M.N.et al.(Chem.Biol.1998，5，713-728)描述了从噬菌体文库中选择12聚体(12-mer)肽，其结合染料德克萨斯红(TexasRed)、罗丹明红(Rhodamine Red)、Oregon Green 514和荧光素。对于德克萨斯红，观察到了吸收和荧光的红移，但只有2.8nm或1.4nm。
另外，针对不同染料的抗体已经可以商业获得，例如针对荧光素、四甲基罗丹明、德克萨斯红、Alexa fluorine 488、BODIPY FL、萤光黄(Lucifer Yellow)和Cascade Blue、Oregon Green的抗体(MolecularProbes Company，Inc.，USA)。然而，这些是用于生物分析目的的多克隆IgG抗体，其具有某种不可控程度的交叉反应性且其不是从严格的选择过程中生产的。
还需要适用于上述测量方法的改良的发射体结合肽，特别是特异性的抗体。此时，特别是那些在600-1200nm波长范围内，在保持花青染料的荧光量子产额时产生红移的发射体结合肽是有利的。
这个目标本发明是通过如下实现的，一种发射体结合肽，其特征在于所述肽在其抗原结合口袋与发射体相互作用时改变发射体的光谱发射特性，一种生产本发明的发射体结合肽的方法，包括用一种发射体免疫适当的生物体，包括一种选自选自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁(indotricarbocyanine)、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧杂菁染料及罗丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的染料以及相应应用本发明的发射体结合肽、核酸、宿主细胞或抗体或缀合物作为诊断试剂用于体外诊断。在从属权利要求中引用了适当的实施方案。
因此，本发明的第一方面涉及一种发射体结合肽，其特征在于所述肽在其抗原结合口袋与发射体相互作用时改变发射体的光谱发射特性。
优选的是本发明的发射体结合肽，其中发射体包含一种在700至1000nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和/或荧光最大值、优选在750至900nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和荧光最大值的染料。
更优选的是本发明的发射体结合肽，其中发射体部分的发射特性的改变选自偏振面改变、荧光强度改变、磷光强度改变、荧光使用寿命改变和吸收最大值和/或荧光最大值的红移。本发明不限于这些光谱现象，然而术语“发生特性改变”在本发明的范围内包括所有的物理现象或作用，其中发射体发生的高能辐射在其特性上改变并且此时这种改变定量性的依赖于物质-发射体缀合物或物质-检测试剂-发射体-缀合物与其发射体结合配偶体和物质的结合/非结合。在一个实施方案中，所述物质例如是肽、蛋白质、寡核苷酸以及特别是抗体或抗体片段。在本发明的范围内，所述抗体片段是那些包括至少含有所谓“互补性决定区”(CDR)的抗原结合区域的片段。此时，抗原结合区域最优选包括完整的可变链VL和VH。
在本发明发射体结合肽的一个特别优选的方面中，抗体或抗体片段选自多克隆或单克隆抗体、人源化抗体、Fab片段，特别是单体Fab片段、scFv片段、合成和重组抗体、scTCR链及其混合物。
在合成和重组抗体或抗体片段时特别优选的是来自HuCAL文库的那些(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 August 1；254(1-2)67-84)。这些可以是天然形式之一的完整的免疫球蛋白或抗体(IgA，IgD，IgE，IgG，IgM)或者是抗体片段，其中抗体片段包括至少VL氨基酸位置4至103和VH的5至109，优选VL的氨基酸位置3至107和VH的4至111及特别优选完整的可变链VL和VH(VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113)(编号根据WO 97/08320)。
在一个优选的实施方案中，抗体或抗体片段包括至少一个CDR区域，其包含在序列SEQ-ID No.1、2、5、6、9、10、13、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中(VLCDR1位置24-34，CDR2位置50-56，CDR3位置89-96；VHCDR1位置26-35，CDR2位置50-65，CDR3位置95-102)，特别是VL CDR3或VH CDR3。此时特别优选的是包括一个可变链VL的抗体，所述可变链包含在序列SEQ-ID No.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中或者包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13之一之中(或这种抗体的片段)。最优选的是包括包含在以下序列对中的一个VH/VL对的抗体，所述序列对为SEQ-ID No.1+2；SEQ-ID No.5+6；SEQ-ID No.9+10；SEQ-ID No.13+14；SEQ-ID No.5+17；SEQ-ID No.5+19；SEQ-ID No.5+37；SEQ-ID No.9+21；SEQ-ID No.9+23；SEQ-ID No.9+25；SEQ-ID No.9+27；SEQ-ID No.9+29；SEQ-ID No.9+31；SEQ-ID No.9+33；SEQ-ID No.9+39；SEQ-ID No.13+35(或这种抗体的片段)。此时特别优选的是Fab片段MOR02628、MOR02965、MOR02977、MOR02969、MOR03263、MOR03325、MOR03285、MOR03201、MOR03267、MOR03268、MOR03292、MOR03294、MOR03295、MOR03309、MOR03293和MOR03291。从本发明所述的抗体开始，获得示出本发明特性的新的修饰的抗体的多种可能性对于本领域技术人员是显而易见的。
本领域技术人员已知特别是重链和轻链的CDR区域负责亲和力以及选择性和特异性。此时，特别是VH的CDR3区域和VL的CDR3区域起作用，然后是VH的CDR2和VL的CDR1，而大多数情况下VH的CDR1和VL的CDR2起次要作用。因此，为最佳化抗体的亲和力以及选择性和特异性，特别提示了CDR区域(也参见例如Schieret al.，J.Mol.Biol.(1996)263，551)。此时，例如一或多个CDR区域可以被特异性地交换为例如其它已经示出本发明特性的其它抗体的CDR区域或者被相应的CDR序列的文库交换(为此见实施例1的优化)，所述文库产生了完全随机的变化或含有或多或少对特异氨基酸或其组合的强偏爱(趋势(Tendenz))。而且，本领域技术人员也能够将完整的可变链以相同方式交换为其它明确的抗体的相应链或这种链的多样性文库。另外，通过诱变特异性交换CDR中的一或多个氨基酸基的方法是本领域技术人员已知的。这种改变氨基酸残基的鉴定在此例如是基于对比不同抗体的序列和鉴定保守的或至少在相应位置高度同源的残基来进行的。在改变CDR时，此时本领域技术人员已知所谓的“规范结构(kanonischen Strukturen)”(Al-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.(2000)295，979)；Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57)，其影响CDR区域的三维排列，因此可以考虑设计的最佳策略。
而且，改变抗体或抗体片段的骨架区以获得更稳定或更可表达的分子的技术也是本领域技术人员熟知的(WO 92/01787；Nieba et al.(1997)Protein Eng.10，435；Ewert et al.(2003)Biochemistry 42，1517)。
除了用于修饰抗体或抗体片段的已经描述的策略，根据本发明抗体的知识和本申请描述的测量方法，本领域技术人员也能够对氨基酸序列或所述抗体的组合物进行额外的改变并且通过使用所述分析和测量方法确定是否产生了其特性符合本发明抗体的特性的修饰抗体。
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体或抗体片段之一的核酸分子。在一个优选实施方案中，此时这些是编码可变链VL之一或可变链VH的核酸分子，所述可变链VL之一包含在序列SEQ-IDNo.2、6、10、14、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39中，所述可变链VH包含在序列SEQ-ID No.1、5、9和13中。此时特别优选的是SEQ-ID No.3、4、7、8、11、12、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的序列。
本发明的发射体结合肽最理想展示小于50nm及优选小于10nm的结合亲和力。
另一个方面是本发明的发射体结合肽，其中所述发射体包含一种在700-1000nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和/或荧光最大值、优选在750-900nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和荧光最大值的染料。选择染料的红移，以便在与检测发射体的试剂相互作用后所述吸收最大值和/或荧光最大值移向较高的波长，移动值大于15nm，优选大于25nm及最优选大约30nm。此时，移动是染料的特性，没有必要以这种方式对移动加以考虑。通常，移动被测量为染料发射值的改变，即在某个单波长。为此，提供了本领域技术人员已知的用于测量的适当的光学试剂。这也应用于测量偏振面的改变、荧光强度的改变、磷光强度的改变、荧光使用寿命的改变和吸收最大值和/或荧光最大值的红移。
对于本发明的发射体结合肽，优选使用的发射体包含选自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧杂菁染料及罗丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料的一种染料。通常，本发明的物质-发射体-缀合物的发射体可以包含通式(I)的一种花青染料 其中D表示基团(II)或(III)
其中标有星号的位置表示与基团B连接的位点以及可以表示基团(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，分别独立地代表C1-C4-磺烷基链，饱和或不饱和的、支链或直链C1-C50-烷基链，其任选被0至15个氧原子和/或被0至3个羰基间隔和/或被0至5个羟基取代；R3和R4，分别独立地代表基团-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分别独立地代表氢原子，C1-C4-磺烷基链，饱和或不饱和的、支链或直链C1-C50-烷基链，其任选被0至15个氧原子和/或被0至3个羰基间隔和/或被0至5个羟基取代，R5代表氢原子、甲基、乙基或丙基或氟、氯、溴或碘原子，b表示数字2或3，及X和Y独立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及这些化合物的盐和溶剂合物。
可能令人惊奇地发现，在抗体与在近红外光谱范围内(＞750nm)具有吸收和荧光的花青染料高度亲和性结合后，吸收最大值和荧光最大值向较高波长移动了大约30nm(红移)。因此应用这个原理，可能例如在一个大的浓度范围内直接检测并且从全血样品中光谱分离信号，其中关于要被测定的物质的浓度的信号是线性的。
发射体可以和物质形成缀合物。在本发明的范围内，具有通式S-E的是物质-发射体缀合物，其中S代表要被检测的物质及E代表发射体，其包含一个与检测发射体的试剂相互作用时出现发射特性改变的部分。作为本发明的缀合物的组分，i.a.，在600-1200nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和荧光最大值的染料是适当的。此时，优选在700-1000nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和荧光最大值的染料。符合这些条件的染料例如是如下的那些聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、部花青和氧杂菁染料、罗丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料、四吡咯染料(tetrapyrrolfarbstoffe)，尤其是苯卟啉、氯、细菌氯(bacteriochlorine)、脱镁叶绿甲酯一酸、细菌脱镁叶绿甲酯一酸(bacteriopheophorbides)、红紫素(purpurines)和酞菁。
优选的染料是在750和900nm之间具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特别的优势。本发明缀合物的结构组分也是通过本发明的方法确定浓度的物质。
这些选自例如抗原，如蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、血液组分、血清组分、脂质、药物制剂和低分子量的化合物，特别是糖、染料或其它分子量低于500道尔顿的化合物。
优选的染料是在750和900nm之间具有吸收最大值的花青染料，且靛三羰菁具有特别的优势。
染料含有结构元件，通过其与物质结构进行共价偶联。这些是例如具有羧基、氨基和羟基的接头。
在光学测量时，这可以以不同方式进行，且取决于发射体(例如荧光团)光谱特性的特征性改变的类型。通常优选的是检测吸收波长和发射波长的移动或在大部分检测与抗体结合的荧光团的部分的波长下测量吸收和/或荧光强度。根据抗体结合荧光团的光谱特性的改变，其它特性，如例如光子使用寿命、偏振和漂白特性也可以用于光学测量。
荧光团在近红外光的光谱范围内的特别益处在于由血液组分产生的少的重叠(geringen berdeckung)。由此，可以进行深穿透(Tiefeneindringung ermglicht)，而不会使待检测的信号太强烈的改变。
而且，本领域技术人员已知在结合荧光团后能够改变其UV范围内光谱特性的针对荧光团的抗体。通过将荧光团结合在抗体的抗原结合口袋中，可以主要改变荧光强度、吸收最大值、发射最大值和光子使用寿命[Simeonov，A.，et al.，Science(2000)307-313]。这些已知的抗体针对发射体(荧光团)，然而其在光的可见光和UV范围内具有吸收和荧光发射。
本发明的另一方面涉及将本发明的发射体结合肽用于体外诊断的应用。
为此，本发明的发射体结合肽也可以存在于一个诊断试剂盒中，任选和其它佐剂一起。另外，所有本发明的这些试剂盒都可以含有特别的指导和文件(例如标准曲线、定量指导等)。
本发明现在基于实施例和所附附图和序列更详细地被描述，但是本发明不限与此。这里
图1CysDisplay-Screening载体pMORPH23(载体图和序列)，图2表达载体pMORPHX9MS(载体图和序列)，及图3实施例2的染料在PBS中在存在和不存在抗体MOR02965时的吸收光谱(左)和荧光光谱。
实施例
实施例1选择、生产和定性发射体结合抗体选择针对花青染料Fuji 6-4(ZK203468)[三钠-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺酰基-1-(2-磺酰乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亚基}-1-(2-磺酰乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸盐，内盐]([Trisodium-3，3-dimethyl-2-{4-methyl-7-[3，3-dimethyl-5-sulfonato-1-(2-sulfonatoethyl)-3H-indolium-2-yl]hepta-2，4，6-trien-1-ylidene}-1-(2-sulfonatoethyl)-2，3-dihydro-1H-indole-5-sulfonate，Inner Salt])的HuCAL GOLD Fab抗体片段HuCAL GOLD抗体文库抗体文库HuCAL GOLDHuCAL GOLD是完全合成的、Fab抗体片段形式的模块化人抗体文库。HuCAL GOLD基于HuCAL-scFv1文库描述的HuCAL-共有序列-抗体基因(WO 97/08320；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86；Krebs et al.J Immunol Methods.2001 Aug 1；254(1-2)67-84).在HuCAL GOLD中，所有相应于人抗体中这些区域组成的6个CDR区域通过使用所谓的三核苷酸诱变(trinukleotidmutagenese)被多样化(Virneks et al.(1994)NucleicAcids Res.1994Dec 25；22(25)5600-7)，而在较早的HuCAL文库中(HuCAL-scFv1和HuCAL-Fab1)，只有VH和VL中相应于天然组成的CDR3-区域被多样化(见Knappik et al.，2000)。而且，称为CysDisplay一种修饰的筛选方法(WO 01/05950)也发现于HuCALGOLD中。用于筛选方法的载体pMORPH23见于图1。
Vλ的1位and 2位.原始的HuCAL主基因用其可信的(authentischen)N-末端构建VLλ1QS(CAGAGC)，VLλ2QS(CAGAGC)和VLλ3SY(AGCTAT).这些序列见于WO 97/08320。生产HuCAL-scFv1-文库时，这两个氨基酸残基被改变为″DI″以促进克隆(EcoRI位点)。这些残基在生产HuCAL-Fab1和HuCAL GOLD时被保留了。因此，所有HuCAL文库都含有在5’-端具有EcoRV切割位点GATATC(DI)的VLλ基因。所有HuCAL kappa基因(主基因和文库中的所有基因)在任何情况下在5’-端都含有DI，因为这些代表了可信的N-末端(WO 97/08320)。
VH的1位.原始的HuCAL-主基因用其可信的N-末端生产VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6具有Q(＝CAG)作为第一个氨基酸基，VH3以及VH5具有E(＝GAA)。相应的序列见于WO 97/08320。在克隆HuCAL-Fab1以及HuCAL GOLD文库时，氨基酸Q(CAG)被掺入所有VH基因的这个1位中。
噬菌粒的生产大量的噬菌粒通过辅助噬菌体感染来自HuCAL GOLD抗体文库或来自成熟文库的大肠杆菌(E.coli)TOP10F′细胞生产和浓缩。最后，HuCAL GOLD或成熟文库(TOP10F′细胞中)在具有34μg/ml的氯霉素/10μg/ml的四环素/1％葡萄糖的2×YT培养基中在37℃培养至OD600为0.5。然后，用VCSM13辅助噬菌体在37℃进行感染。沉淀感染的细胞并重悬于2×YT/34μg/ml氯霉素/10μg/ml四环素/50μg/ml卡那霉素/0.25mmol IPTG中并且22℃培养过夜。用PEG从上清中沉淀噬菌体2x并通过离心收集(Ausubel(1998)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley Sons，Inc.，New York，USA)。将噬菌体重悬于PBS/20％甘油并储存于-80℃。
每个选择循环中噬菌粒的扩增如下进行对数期大肠杆菌TG1细胞用选择的噬菌体感染并铺板于具有1％葡萄糖/34μg/ml的氯霉素的LB-琼脂平板上。温育过夜后，刮下细菌菌落，重新培养并用VCSM13辅助噬菌体感染。
初步选择针对染料Fuji 6-4(ZK203468)的抗体HuCAL GOLD抗体文库纯化浓缩的噬菌粒用于标准选择方法。作为抗原，BSA-或运铁蛋白-偶联的ZK203468交替使用。将抗原加入PBS中并以50μg/ml的浓度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃温育过夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封闭后，将大约2E+13个HuCAL GOLD噬菌体加入到抗原荷载的(antigen-beladenen)、封闭的孔中并且在室温温育过夜或2小时。几个洗涤步骤之后(洗涤步骤随着渐进的选择循环而变得更严格)，结合的噬菌体用20mmol DTT或100μmol未缀合的ZK203468洗脱。总之，进行三次连续的选择循环，其中在选择循环之间进行噬菌体扩增，如上述。
亚克隆选择的Fab片段用于表达包含3个循环的抗体选择之后，分离的HuCAL克隆的Fab-编码插入物亚克隆至表达载体pMORPHX9_MS(见图2)以促进Fab片段随后的表达。最后，选择的HuCAL Fab克隆的纯化的质粒-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。纯化Fab-编码插入物并连接到相应消化的载体pMORPHX9_MS中。这个克隆步骤产生了Fab-表达载体pMORPHX9_Fab_MS。这个载体表达的Fab片段携带2个C-末端标记(Myc标记和Strep标记II)用于纯化和检测。
筛选和定性ZK203468-结合Fab片段选择后分离了几千个克隆并亚克隆及通过ELISA在384孔板中对于淘选中使用的抗原ZK203468-BSA和-运铁蛋白的特异性检测进行了测试。在此鉴定的克隆在抑制性-ELISA(inhibitions-ELISA)中研究了其对未缀合染料的有效结合。
这产生了肠胃外Fab片段MOR02628(蛋白质序列SEQ-ID NO1(VH-CH)和SEQ-ID NO2(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO3(VH-CH)和SEQ-ID NO4(VL-CL))、MOR02965(蛋白质序列SEQ-ID NO5(VH-CH)和SEQ-ID NO6(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO7(VH-CH)和SEQ-ID NO8(VL-CL))和MOR02977(蛋白质序列SEQ-IDNO9(VH-CH)和SEQ-ID NO10(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO11(VH-CH)和SEQ-ID NO12(VL-CL))和MOR02969(蛋白质序列SEQ-ID NO13(VH-CH)和SEQ-ID NO14(VL-CL)；DNA序列SEQ-ID NO15(VH-CH)和SEQ-ID NO16(VL-CL))，其有效地结合未缀合的染料ZK203468。
实施例2通过交换LCDR3区域最佳化肠胃外抗体片段克隆LCDR3文库4个肠胃外(parenteralen)克隆MOR02628、MOR02965、MOR02969和MOR02977的质粒-DNA用限制性酶EcoRI和XbaI消化，并将产生的来自表达载体pMORPHX9_MS的完整的Fab-插入物亚克隆至相应酶切的展示载体(display vektor)pMORPH23中。这个步骤对于制备用于在噬菌体表面呈递Fab片段的基因III(GenIII)是必需的。在另一步骤中，4个胃肠外克隆(现pMORPH23中)用BpiI和SphI消化。在此，LCDR3区和Clambda恒定区从载体骨架中去除。分离纯化相应的载体-DNA片段。同时，从HuCAL-Fab 2文库分离互补BpiI/SphI片段，其含有多样化的LCDR3区域(具有大约3E+8的可变性)和Clambda恒定区(＝插入物-DNA)。几μg的载体-DNA和相容的插入物-DNA以1∶2的摩尔比用T4-DNA-连接酶连接并在纯化后转化进电感受态(elektrokompetente)TOP10F′细胞中。此时，每个胃肠外抗体获得了5E+8至大约1E+9个克隆大小的文库。
组合克隆MOR02628、MOR02969和MOR02977基于的文库(″Pool″)。个别处理MOR02965文库(″Lead″)。如所述，通过这些TOP10F′-成熟文库用VCSM13辅助噬菌体感染生产相应的噬菌粒。
MaxisorpTM微量滴定板的抗体选择“lead”和“pool”文库的纯化和浓缩的噬菌粒用于在严格条件下的成熟选择方法(长洗涤时间、被纯化的、胃肠外的Fab蛋白置换)。作为抗原，BSA-或运铁蛋白-偶联的ZK203468交替使用。这些抗原加入PBS中并以100-250ng/ml的低浓度加入MaxisorpTM微量滴定板F96(Nunc)中。Maxisorp平板在4℃温育过夜(″包被″)。在Maxisorp平板用含有5％奶粉的PBS封闭后，将大约2E+13个HuCAL GOLD噬菌体加入到抗原荷载的、封闭的孔中并且在室温温育过夜或2小时。为提高严格性，在温育过程中加入额外的100nm或500nm的、胃肠外克隆的纯化Fab片段。几次充分(ausgedehnten)洗涤步骤之后，结合的噬菌体用20mmol的DTT洗脱。总之，进行两个连续的选择循环，其中在选择循环之间进行噬菌体扩增，如上述。
在Neutavidin Strip上的抗体选择“lead”和“pool”文库的纯化的和浓缩的噬菌粒另外用于严格条件下的第二种成熟选择方法(长洗涤时间，被纯化的、胃肠外的Fab蛋白或游离染料置换)。作为抗原，使用生物素缀合的ZK203468(或者具有烷基或醚接头)。这些抗原加入PBS中并以60或12ng/ml的低浓度和大约2E+11个噬菌体混合。抗原-噬菌体溶液在室温温育过夜或2小时。为提高严格性，在温育过程中加入额外的0.5μg/ml胃肠外克隆的纯化Fab片段或40nm/ml的ZK203468。然后将含有抗原-结合噬菌体的溶液加入封闭的neutravidin strip上并温育30分钟以使得通过抗原的生物素基结合可能固相。几次洗涤步骤后，结合的噬菌体用20mmol的DTT洗脱。总之，进行两个连续的选择循环，其中在选择循环之间进行噬菌体扩增，如上述。
亚克隆选择的Fab片段用于表达选择(“成熟”)之后，分离的HuCAL克隆的Fab-编码插入物亚克隆进表达载体pMORPHX9_MS以促进随后的表达。最后，选择的HuCAL Fab克隆的纯化治疗-DNA用限制性酶XbaI和EcoRI消化。纯化Fab-编码插入物并连接入被相应消化的载体pMORPHX9_MS中。这个克隆步骤产生了Fab-表达载体pMORPHX9_Fab_MS。这个载体表达的Fab片段携带2个C-末端标记(Myc标记和Strep标记II)用于纯化和检测。
鉴定最佳化的抗体片段为鉴定对染料Fuji 6-4具有改良的亲和力的抗体，从选择中分离克隆并在384-孔板中通过ELISA筛选。最后，将ZK203468-BSA加入ELISA-微量滴定板中。要被检测的Fab片段作为未纯化的细菌裂解物加入。为研究除了与抗原缀合物的结合之外的与游离染料的结合，将具有细菌裂解物和额外的游离染料的相同的筛选平板以两种不同浓度进行混合。由于未缀合的染料导致的Fab结合固相的抑制表明抗体不特异性检测染料缀合物，而是游离染料。在此，在溶液抑制测试和ELISA形式以及Luminex装置中精确定性了分离的克隆，而且测定了其对Fuji 6-4的亲和力。
如下克隆相比于胃肠外抗体示出了改良的亲和力
总之，胃肠外MOR02977的亲和力相比于MOR03267可能提高了140倍。所有其它鉴定的克隆相比于分别的胃肠外Fab示出了提高2-70倍。
实施例3光物理学定性染料-抗体复合物和测定光谱移动/荧光量子产额检测了基于与靛三羰菁染料三钠-3，3-二甲基-2-{4-甲基-7-[3，3-二甲基-5-磺酰基-1-(2-磺酰乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]七-2，4，6-三烯-1-基亚基}-1-(2-磺酰乙基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸盐，内盐结合的抗体的染料-抗体复合物(见实施例1和2)。制备于PBS中浓度为1μmol/l的上述染料和2.4μmol/l的各自抗体的溶液并在室温温育2小时。用分光测光仪(Perkin-Elmer，Lambda2)测定吸收最大值。用SPEX fluorolog(通过灯和探测器对依赖波长的灵敏性进行校准，wellenlngenabhngigeEmpfindlichkeit von Lampe und Detektor kalibriert)测定相对于靛青绿(DMSO中Q＝0.13，J Chem Eng Data 1977，22，379，Bioconjugate Chem2001，12，44)的荧光最大值和荧光量子产额。根据吸收和荧光最大值，计算在没有于PBS中的抗体(1μmol/l)时相对于上述染料溶液的光谱移动(吸收最大值754nm，荧光最大值783nm，荧光量子产额10％)。
结果总结在下表中
实施例4构建用于表达HuCAL免疫球蛋白的表达载体克隆重链去除载体pCDNA3.1+(Invitrogen)的″多克隆位点″(NheI/ApaI)，并且与HuCAL设计的限制性切割位点相容的platzhalter用于连接前导序列(NheI/EcoRI)、Fab片段的VH结构域(MunI/)和免疫球蛋白恒定区(BlpI/ApaI)。前导序列(EMBL 83133)具有一个Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清-IgA1(EMBL J00220)的恒定区被分为具有长度为例如70个碱基的重叠寡核苷酸。将″沉默突变″导入以去除与HuCAL设计不相容的限制性切割位点。寡核苷酸通过″重叠延伸-PCR″连接。
在亚克隆Fab片段到IgG分子的过程中，Fab片段的重链通过MfeI/BlpI切割并连接到用EcoRI/BlpI开口的载体中。EcoRI(g/aattc)和MfeI(c/aattg)具有两个相容的粘性末端(aatt)，而且Fab片段中的原始MfeI切割位点的序列在连接到IgG表达载体中时从c/aattg改变为g/aattg，由此，一方面MfeI切割位点和EcoRI切割位点都被破坏，而另一方面，发生了氨基酸从Q(密码子caa)到E(密码子gaa)的改变。
克隆轻链.通过两个不同的platzhalter取代pCDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的″多克隆位点″。k-platzhalter含有用于掺入k-前导序列(NheI/EcoRV)、HuCAL Fab Vk结构域(EcoRV/BsiWI)和k-链的恒定区(BsiWI/ApaI)的限制性切割位点。1-platzhalter中相应的切割位点是NheI/EcoRV(1-前导序列)、EcoRV/HpaI(V1-结构域)和HpaI/ApaI(恒定区1-链)。k-前导序列(EMBL Z00022)以及1-前导序列(EMBL J00241)都由Kozak序列提供。人k-(EMBL L00241)和1-链(EMBL M18645)的恒定区都通过″重叠延伸(overlap extension)-PCR″组装，如上述。
产生IgG-表达CHO细胞.CHO-K1细胞用重和轻IgG链表达载体的等摩尔混合物共转染。用600mg/ml的G418和300mg/ml的Zeocin(Invitrogen)选择双重抗性转染子。通过“捕获ELISA(capture-ELISA)”检测各个克隆上清中的IgG表达。阳性克隆在具有10％″ultra-low IgG-FCS″(Life Technologies)的RPMI-1640培养基中培养。在上清的pH为8.0之后及无菌过滤之后，对溶液进行标准的A蛋白-柱层析(Standard-Protein A-Sulenchromatographie)(Poros 20A，PEBiosystems)。
序列表<110>舍林股份公司莫弗西斯股份公司<120>使发射体的光谱发射特性产生改变的发射体结合肽<130>
<150>DE 103 31 054.1<151>2003-07-09<150>US 60/487,234<151>2003-07-16<160>40<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>252<212>PRT<213>Artificial<220>
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR02628 VH-CH<400>3caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttggtc ttggattcgc120cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat180aacgattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac240cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg300cgtacttctt tttatcagaa gctttttttt attgcttttg atcattgggg ccaaggcacc360
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03295 VL-CL<400>32gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240
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<223>Fab fragment MOR03309 VL-CL<400>33Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp His Gly85 90 95Phe Thr His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03309 VL-CL<400>34gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagacttggg atcatggttt tactcatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 654<210>35<211>213<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Fab fragment MOR03291 VL-CL
<400>35Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Arg Ser Lys Tyr Val20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Arg Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Asp Tyr Lys Ser Lys Asn85 90 95Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys100 105 110Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln115 120 125Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly130 135 140Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly145 150 155 160Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala165 170 175Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser180 185 190Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val195 200 205Ala Pro Thr Glu Ala210<210>36
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<223>Fab fragment MOR03285 VL-CL<400>37Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr20 25 30Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln65 70 75 80
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03285 VL-CL<400>38gatatcgtgc tgacccagcc gccttcagtg agtggcgcac caggtcagcg tgtgaccatc 60tcgtgtagcg gcagcagcag caacattggt tcttattatg tgtattggta ccagcagttg120cccgggacgg cgccgaaact tctgatttat ggtaattctc agcgtccctc aggcgtgccg180gatcgtttta gcggatccaa aagcggcacc agcgcgagcc ttgcgattac gggcctgcaa240agcgaagacg aagcggatta ttattgccag gcttggactg gttcttatgc tactgtgttt300ggcggcggca cgaagttaac cgttcttggc cagccgaaag ccgcaccgag tgtgacgctg360tttccgccga gcagcgaaga attgcaggcg aacaaagcga ccctggtgtg cctgattagc420
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<223>Fab fragment MOR03293 VL-CL<400>39Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Asn20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Gly Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Thr Thr Ile85 90 95Tyr Arg Asn Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu115 120 125Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe130 135 140Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val145 150 155 160Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
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<223>DNA coding for Fab fragment MOR03293 VL-CL<400>40gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt tctaataatt atgtgtcttg gtaccagcag120catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatggtggtt ctaatcgtcc ctcaggcgtg180agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg240caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttgga ctactattta tcgtaatcgt300gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccagc cgaaagccgc accgagtgtg360acgctgtttc cgccgagcag cgaagaattg caggcgaaca aagcgaccct ggtgtgcctg420attagcgact tttatccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc480aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc540agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc600acgcatgagg ggagcaccgt ggaaaaaacc gttgcgccga ctgaggcctg ataa 65权利要求
1.发射体结合肽，其特征在于所述肽在其抗原结合口袋和发射体相互作用时改变所述发射体的光谱发射特性。
2.权利要求1的发射体结合肽，其中所述发射体包含一种染料，该染料在700至1000nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和/或荧光最大值，优选在750至900nm的光谱范围内具有至少一个吸收最大值和/或荧光最大值。
3.权利要求1或2的发射体结合肽，其选自抗体或抗体片段，如Fab抗体、scFv片段、scTCR链、单链抗体或其混合物。
4.权利要求3的发射体结合肽，其包括一种VH/VL对，其包含在如下序列对之一之中SEQ ID No1+2、SEQ ID No5+6、SEQID No9+10、SEQ ID No13+14、SEQ ID No5+17、SEQ ID No5+19、SEQ ID No5+37、SEQ ID No9+21、SEQ ID No9+23、SEQ ID No9+25、SEQ ID No9+27、SEQ ID No9+29、SEQ IDNo9+31、SEQ ID No9+33、SEQ ID No9+39和SEQ ID No13+35。
5.权利要求1-4任一项的发射体结合肽，其对所述发射体的结合亲和力小于50nm并优选小于10nm。
6.权利要求1-5任一项的发射体结合肽，其中所述发射体的发射特性的改变选自偏振面改变、荧光强度改变、磷光改变，特别是磷光强度的改变、荧光使用寿命改变和吸收最大值和/或荧光最大值的红移。
7.权利要求1-6任一项的发射体结合肽，其中在与检测发射体的试剂相互作用之后吸收和/或荧光最大值向较高波长移动值大于15nm，优选大于25nm，及最优选大约30nm。
8.权利要求2-7任一项的发射体结合肽，其中染料选自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧杂菁染料及罗丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
9.权利要求2-8任一项的发射体结合肽，其中染料包括通式(I)的花青染料 其中D代表基团(II)或(III) 其中星号标明的位置是和基团B连接的位点，其表示基团(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII) 其中R1和R2，各自独立地代表C1-C4磺烷基链，饱和或不饱和的、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0至15个氧原子和/或被0至3个羰基间隔和/或被0至5个羟基取代；R3和R4，各自独立地代表基团-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2分别独立地代表氢原子，C1-C4磺烷基链，饱和或不饱和的、支链或直链C1-C50烷基链，其任选被0至15个氧原子和/或被0至3个羰基间隔和/或被0至5个羟基取代，R5代表氢原子或氟、氯、溴或碘原子、Me、Et或Prop，b表示数字2或3，及X和Y独立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-，以及这些化合物的盐和溶剂合物。
10.多核苷酸，特别是DNA、RNA或PNA，其包括编码权利要求1-9任一项的发射体结合肽或其功能性变体的序列。
11.DNA-或RNA-载体分子，其含有至少一种或多种权利要求10的多核苷酸且其可以在细胞中表达。
12.含有权利要求10的多核苷酸或权利要求11的载体分子的宿主细胞。
13.包含权利要求1-9任一项的至少一种发射体结合肽的抗体，特别是多克隆或单克隆抗体、人抗体或人源化抗体、合成或重组抗体。
14.生产权利要求1-9任一项的发射体结合肽的方法，包括用一种发射体免疫适当的生物体，所述发射体包含一种染料，其选自聚次甲基染料，如二羰菁、三羰菁、靛三羰菁、部花青、苯乙烯基、squarilium和氧杂菁染料及罗丹明染料、吩噁嗪或吩噻嗪染料。
15.生产权利要求1-9任一项的发射体结合肽的方法，包括所述肽的重组和/或合成生产。
16.权利要求1-9任一项的发射体结合肽、权利要求10或11的核酸、权利要求12的宿主细胞或权利要求13的抗体作为用于体外诊断的诊断试剂的应用。
17.用于体外诊断的诊断试剂盒，包括选自权利要求1-9任一项的发射体结合肽、权利要求10或11的核酸、权利要求12的宿主细胞或权利要求13的抗体的至少一种试剂，任选在共同的或另一个容器中还具有其它佐剂和/或指导。
18.体外定量测定在样品中含有的一种物质的方法，包括如下步骤a)将权利要求1-9任一项的发射体结合肽与一种发射体接触，从而所述缀合物的发射体与发射体结合肽的相互作用在发射体的光谱发射特性中产生了一个改变，及b)测量发射体的光谱发射特性的改变。
19.权利要求18的直接体外定量测定样品中含有的物质或样品中存在的抗原检测试剂的方法，其还额外包括如下步骤，d)通过测量发射体的发射特性的改变定量样品中含有的物质。
20.权利要求18或19的方法，其中发射体部分的光谱发射特性的改变选自偏振面改变、磷光改变，特别是磷光强度的改变、荧光使用寿命改变和吸收最大值和/或荧光最大值的红移。
21.权利要求18-20任一项的方法，其中发射体结合肽、抗体片段，如Fab片段、scFv片段、scTCR链、单链抗体或其混合物与样品接触。
22.权利要求18-21任一项的方法，其中发射体结合肽包含权利要求1-9任一项的序列。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中发射体结合肽对发射体具有小于50nm及优选小于10nm的结合亲和力。
全文摘要
本发明涉及发射体结合肽，在其抗原结合口袋与发射体相互作用时其能够改变发射体的光谱发射特性。本发明的发射体结合肽特别是抗体和抗体片段的组分。
文档编号C12N15/13GK1820027SQ200480019621
公开日2006年8月16日 申请日期2004年7月9日 优先权日2003年7月9日
发明者米夏尔多·席尔纳, 凯·利哈, 安德烈亚斯·门拉德, 斯特凡尼·乌尔林格, 科尼莉亚·哈内尔, 博多·布罗克斯 申请人:舍林股份公司, 莫弗西斯股份公司