产生琥珀酸的方法

专利名称：产生琥珀酸的方法
技术领域：
本发明涉及应用细菌，如棒状细菌来产生琥珀酸。
背景技术：
为了通过发酵产生包括琥珀酸的非氨基-有机酸，通常应用包括属于厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)或放线杆菌属(Actinobacillus)的那些厌氧细菌(美国专利5,142,834和美国专利5,504,004，和International Journal of SystematicBacteriology(1999)，49，207-216)。虽然通过应用上述厌氧细菌的产品产量高，但它们的增殖需要许多营养物，而由此必需将大量的有机氮源，如玉米浆(cornsteep liquor)(CSL)加入培养基。大量有机氮源的加入不仅导致培养成本的增加而且导致用于分离产品的纯化成本的增加，因而上述方法是不经济的。
此外，本领域已知在好氧条件下培养好氧细菌，如棒状杆菌的细菌以增殖细菌细胞，然后收获和洗涤细菌细胞以允许它们作为静息细菌在无需通气的条件下来产生非氨基有机酸而方法(JP11-113588A和JP11-196888A)。这些方法是经济的，因为细菌能在含有少量有机氮的简单培养基中充分地生长以增殖细菌细胞。然而，仍然有根据所需有机酸的产生量、其浓度和在每个细菌细胞的产生速率以及产生过程的简化等等进行改善的需要。而且，已经报道应用具有增加的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的细菌以发酵产生非氨基有机酸(例如，JP11-196887A)。然而，关于应用具有增加的延胡索酸还原酶活性的细菌来产生非氨基有机酸还没有报道。

发明内容
本发明的一个目的在于提供以更高的生产效率产生琥珀酸的方法本发明的发明者已经为解决上述问题进行了广泛的研究，并发现通过使经过修饰以增加延胡索酸还原酶活性的细菌或其细胞处理物与有机原料在含有碳酸根或碳酸氢根离子或二氧化碳气的反应溶液中进行反应，可实现有机原料的消耗速率、琥珀酸的产生速率或其产量的增加，并由此完成了本发明。
即，根据本发明，提供了如下描述的发明。
(1)产生琥珀酸的方法，其包括使经过修饰以增加延胡索酸还原酶活性的细菌或其细胞处理物与有机原料在含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气中反应溶液中进行反应以生成琥珀酸；和收集所述的琥珀酸。
(2)(1)的方法，其中所述的细菌选自棒状细菌(coryneform bacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌或根瘤菌属(Rhizobium)细菌。
(3)(1)或(2)的方法，其中所述细菌是经过修饰以通过应用来自棒状细菌的琥珀酸脱氢酶基因增加延胡索酸还原酶活性的细菌。
(4)(1)或(2)的方法，其中所述细菌是经过修饰以通过应用来自大肠杆菌的延胡索酸还原酶基因增加延胡索酸还原酶活性的细菌。
(5)(1)至(4)中任一项的方法，其中所述细菌被进一步修饰以将乳酸脱氢酶活性与未修饰的菌株相比减少到10％或更低。
(6)(1)至(5)中任一项的方法，其中所述细菌被进一步修饰以增加丙酮酸羧化酶活性。
(7)(1)至(6)中任一项的方法，其中所述细菌或其细胞处理物与所述有机原料在厌氧条件下进行反应。
(8)(1)至(7)中任一项的方法，其中所述有机原料为葡萄糖。
(9)产生含有琥珀酸的聚合物的方法，其包括通过(1)至(8)中任一项的方法产生琥珀酸，和将得到的琥珀酸进行聚合。


图1显示构建质粒pKMB 1的步骤及其限制性内切酶图谱。
图2显示构建质粒pKMB1/ΔLDH的步骤。
图3显示构建质粒pTZ4的步骤。
图4显示构建质粒pMJPC1的步骤。
图5显示构建质粒pFRPC1.1的步骤。
图6显示构建质粒pVKSDH的步骤。
图7显示构建质粒pHSGSDH的步骤。
图8显示构建质粒pSDHPC的步骤。
优选的
具体实施例方式
在下文中，将详细描述本发明的实施方案。
能用于本发明的产生方法的细菌是经过修饰以增加延胡索酸还原酶活性的那些。本文中，术语“延胡索酸还原酶活性”指催化反应的活性，在所述反应中延胡索酸通过还原反应转化为琥珀酸，而术语“延胡索酸还原酶活性增加”指与野生型或延胡索酸还原酶-未修饰的菌株相比延胡索酸还原酶活性增加。所述的延胡索酸还原酶活性可通过后面描述的测量K3Fe(CN)6水平下降的方法进行测定。大肠杆菌的延胡索酸还原酶是负责琥珀酸脱氢酶的逆反应的酶，所述的琥珀酸脱氢酶在TCA循环的顺时针方向旋转中起作用，而且所述的延胡索酸还原酶涉及在好氧条件下的延胡索酸呼吸。有报道所述基因的表达在好氧条件下在转录水平受到抑制(Jones，H.M.，Gunsalus，R.P.，J.Bacteriol.，1985，Vol.164，p1100-1109)。因此可以认为，当所述延胡索酸还原酶活性过量地增加时，细菌细胞的生长会变差。为此，在本发明中，优选在不发生细菌细胞的显著的生长抑制的范围内增加延胡索酸还原酶活性。
增加延胡索酸还原酶活性可通过修饰所述细菌的亲代菌株，例如应用延胡索酸还原酶基因通过基因重组技术来实施。此外，编码琥珀酸脱氢酶的基因可为编码蛋白的基因，所述的蛋白具有延胡索酸还原酶活性及琥珀酸脱氢酶活性。因此，可增加编码蛋白的基因的表达，所述蛋白具有延胡索酸还原酶活性和琥珀酸脱氢酶活性。例如，棒状细菌的琥珀酸脱氢酶能够催化由延胡索酸产生琥珀酸的反应，其为琥珀酸脱氢酶的逆反应。所述琥珀酸脱氢酶活性可通过Arkell B.A.C等的方法(Meth Enzymol，53，466-483)进行测定。
用于本发明的细菌的亲代菌株无具体的限制，只要它具有产生琥珀酸的能力。其中，棒状细菌、芽孢杆菌细菌或根瘤菌细菌是优选的，而且棒状细菌是更优选的。棒状细菌的实例包括属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物、属于短杆菌属(Brevibacterium)的微生物和属于节杆菌属(Arthrobacter)的微生物。当然，优选属于棒状杆菌属或短杆菌属的细菌。更优选属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)或乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的细菌。
所述细菌的优选的亲代菌株的具体实例包括黄色短杆菌MJ-233(FERMBP-1497)、黄色短杆菌MJ-233 AB-41(FERM BP-1498)、产氨短杆菌ATCC6872、谷氨酸棒状杆菌ATCC31831和乳发酵短杆菌ATCC13869。黄色短杆菌目前被归类于谷氨酸棒状杆菌(Lielbl，W.，Ehrmann，M.，Ludwig，W.和Schleifer，K.H.，International Journal of Systematic Bacteriology，1991，vol.41，p255-260)。因此，在本发明中，黄色短杆菌MJ-233菌株及其突变体MJ-233AB-41菌株定义为分别与谷氨酸棒状杆菌MJ-233菌株和谷氨酸棒状杆菌MJ-233 AB-41菌株同样的菌株。
黄色短杆菌MJ-233已经以登录号(accession number)FERM P-3068于1975年4月28日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(National Institute ofBioscience and Human Technology)，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(currently International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science和Technology at Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，Japan)，而且然后在1981年5月1日根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)转为国际保藏(international deposit)并具有登录号FERM BP-1497。
在本发明的方法中用作亲代菌株的上述细菌可为任意菌株，其包括通过用于突变的常规处理，如UV辐射和NTG处理得到的变体菌株，和通过遗传方法(genetic procedure)，如细胞融合和基因重组技术衍生的重组菌株，以及野生型菌株。此外，基因重组菌株的宿主可为相对于亲代菌株归于同一属和种的那些或归于不同属和种的那些，只要它是可转化的微生物，但优选所述宿主可为如上所述的好氧细菌。
在当进行所述的修饰以通过延胡索酸还原酶(FRD)基因增加延胡索酸还原酶活性的情况下，可以应用的基因无具体的限制，只要它编码具有延胡索酸还原酶活性的蛋白，而其实例包括大肠杆菌的基因，其具有SEQ ID NO19中显示的核苷酸序列。这些基因形成操纵子，其包含基因(SEQ ID NO19的核苷酸编号440-2245、2241-2975、2986-3381和3392-3751)，其每个编码构成延胡索酸还原酶的四个亚基(frdA、frddB、frdC和frdD；SEQ ID NOs20-23)。可将整个操纵子基因引入所述细菌，或者每个亚基基因可以分别地引入。只要每个亚基基因编码能够形成具有FRD活性的复合物的亚基蛋白，它可为与具有上述核苷酸序列的DNA在严紧性条件下杂交的DNA，或同源物如相对于具有上述核苷酸序列的DNA具有不低于90％同源性、优选不低于95％、更优选不低于99％的同源性的DNA。本文中，所述的严紧性条件包括允许在这样的盐浓度下进行杂交的条件，该盐浓度对应于常规Southern杂交的洗涤条件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS。另外，在这些FRD基因同源物中，优选编码这样的蛋白的基因，在所述蛋白中对应于FRD的B亚基(frdB)(SEQ ID NO21)中第17个氨基酸的氨基酸是赖氨酸。具有SEQ ID NO19中显示的核苷酸序列的基因或其同源物可通过PCR方法或杂交方法来获得。
如果需要，将对应于frdB的第17个氨基酸的氨基酸变为赖氨酸的突变也可通过已知方法导入。
此外，可应用编码蛋白的基因，所述蛋白具有琥珀酸脱氢酶和延胡索酸还原酶的活性。其实例包括棒状细菌的sdh基因，其具有SEQ ID NO28中显示的核苷酸序列。此基因是操纵子基因，其包含基因(SEQ ID NO28的核苷酸编号1153-3171、3174-3920和363-1133)，其分别编码构成琥珀酸脱氢酶的三个亚基(sdhA、sdhB和sdhC)。谷氨酸棒状杆菌的sdh操纵子在GeneBankAccession NOS.NCg10359(sdhC)、NCg10360(sdhA)和NCg10361(sdhB)中显示。
可将整个操纵子基因导入所述细菌，或可将每个亚基基因分别导入。只要每个亚基基因编码能够形成具有FRD活性的复合物的亚基蛋白，它可为与具有上述核苷酸序列的DNA在严紧性条件下杂交的DNA，或同源物如相对于具有上述核苷酸序列的DNA具有不低于90％同源性、优选不低于95％、更优选不低于99％的同源性的DNA。本文中，所述的严紧性条件包括允许在这样的盐浓度下进行杂交的条件，该盐浓度对应于常规Southern杂交的洗涤条件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS。
此外，它可为编码蛋白的基因，所述蛋白具有SEQ ID NOs20-23和29-31中显示的那些序列中的任意氨基酸序列，其中包括取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸，只要该蛋白具有延胡索酸还原酶活性。本文中，例如，术语“几个”指2至20，优选2至10，更优选2至5。
也可应用由除大肠杆菌或棒状细菌之外的任何细菌，或由其他微生物、动物和植物获得的FRD基因。例如，由任何微生物、动物或植物获得的FRD基因可为核苷酸序列已知的基因或基于同源性由细菌、动物或植物的染色体中分离编码蛋白的基因之后测定其核苷酸序列的基因，所述蛋白具有FRD活性。此外，测定所述核苷酸序列之后，也可以应用根据该序列合成的基因。这些基因可通过以杂交或PCR来扩增包含启动子和ORF的区域获得。
当应用棒状细菌时，例如，在棒状细菌中能够增加FRD基因表达的重组质粒，可通过将含有FRD基因的DNA片段插入合适的质粒，如含有至少负责棒状细菌中的质粒复制的基因的质粒载体来得到。能够将所述FRD基因导入棒状杆菌的细菌的质粒载体无具体的限制，只要它含有至少负责在棒状细菌中复制和扩增的基因。其具体实例包括JP03-210184A中描述的质粒pCRY30；JP02-72876A和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JP01-191686A中描述的质粒pCRY2和pCRY3；JP58-67679A中描述的pAM330；JP58-77895A中描述的pHM1519；JP58-192900A中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；JP57-134500A中描述的pCG1；JP58-35197A中描述的pCG2；JP57-183799A中描述的pCG4和pCG11和JP10-215883A中描述的pVK7。
如上所述，延胡索酸还原酶活性的过量增加可削弱细菌细胞的生长。因此，优选将所述FRD基因的表达水平通过选择适当的质粒拷贝数调节到细菌细胞的生长不被抑制的程度。而且，增加FRD活性可通过用常规的同源重组导入、取代或扩增染色体上的FRD基因来实施。
除了如上描述的方法之外，当所述FRD基因具有操纵子结构时，也可以通过在调控其表达的启动子区域导入突变来实现增加，如WO00/18935中所述。
在将上述并入重组质粒或染色体的过程中，FRD基因表达的启动子可为任何启动子，只要它在棒状细菌中发挥作用。可替换地，它可为所述FRD基因自身的启动子。可合适地选择所述启动子以调节FRD基因的表达水平。
到目前为止，描述了应用棒状细菌的实例。然而，同样方法可应用于其他细菌以实现FRD活性的增加。
另外，在本发明的反应中，更有效地应用细菌菌株，其被修饰除了增加延胡索酸还原酶活性外，还降低乳酸脱氢酶活性。本文中，术语“乳酸脱氢酶活性降低”是指与未修饰乳酸脱氢酶的菌株相比，乳酸脱氢酶活性降低。所述每个细菌细胞的乳酸脱氢酶活性与未修饰的菌株的乳酸脱氢酶相比，优选降低到10％或更低。此外，所述乳酸脱氢酶活性可完全消除。乳酸脱氢酶活性的降低可通过用已知的方法测定乳酸脱氢酶活性来确认(L.Kanarek和R.L.Hill，J.Biol.Chem.239，4202(1964))。作为制备乳酸脱氢酶活性降低的棒状细菌的突变体菌株的特异性方法，例如，可应用如JP 11-206385 A中所述的染色体上的同源重组方法或本说明书的实施例中所描述的采用SacB基因的方法(Schafer，A.等，Gene 145(1994)69-73)。例如，通过制备具有破坏的LDH基因的细菌并用含有FRD基因的重组载体转化该细菌，如下面实施例2中所述，可以获得本发明的棒状细菌，其具有增加的FRD基因表达和降低的乳酸脱氢酶活性。然而，用于降低LDH活性的修饰和用于增加FRD活性的修饰中的任何一种都可以首先实施。
此外，经过修饰以使除延胡索酸还原酶活性增加之外丙酮酸羧化酶活性增加的细菌可用于本发明的反应。术语“丙酮酸羧化酶活性增加”指与未修饰的菌株如野生型或亲代菌株相比，丙酮酸羧化酶活性增加。所述丙酮酸羧化酶活性可以，例如，通过测量如后面所述的NADH减少的方法进行测定。具有增加的延胡索酸还原酶和丙酮酸羧化酶表达的棒状细菌可以通过在棒状细菌中以与JP11-196888A中所述相似的方式高水平表达延胡索酸还原酶(FRD)基因和丙酮酸羧化酶(PC)基因来制备。
用于本发明的方法的PC基因可为其核苷酸序列已知的基因。可替换地，可应用通过从微生物、动物、植物等的染色体通过如下所述的方法分离编码具有PC活性的蛋白的DNA片段，并测定其核苷酸序列而得到的基因。而且，测定该核苷酸序列之后，也可以应用基于该序列合成的基因。
含有PC基因的DNA片段存在于来自微生物、动物和植物的染色体上。由这些供体微生物、动物和植物制备PC基因的基本方法可通过参考源自其序列已知的棒状细菌的基因来举例说明。
所述的PC基因存在于谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032，一种棒状细菌的染色体上(Peters-Wendisch，P.G et al.，Microbiology，vol.144(1998)p915-927)，而且其核苷酸序列在本领域中是已知的(GenBank DatabaseAccession No.AP005276)(SEQ ID NO15)，因此可以通过PCR分离并获得所述基因。
例如，大约3.7kb的PC基因可通过应用具有SEQ ID NOs13和14中显示的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并应用谷氨酸棒状杆菌的染色体作为模板实施PCR来进行扩增。在此情况中，可将适当的限制性内切酶识别位点添加到用于PCR的引物的5′-末端，以允许将所述基因插入如下所述的载体的合适的区域，而且所得的重组载体可用于将基因转移到棒状细菌中。
此外，即使未鉴定核苷酸序列，可根据PC活性纯化蛋白，然后根据该蛋白的N-末端氨基酸序列或部分-消化的片段的序列合成探针以通过常规的杂交方法分离基因片段。可替换地，可根据PC蛋白的保守区域中的氨基酸序列来合成探针或引物以通过杂交或PCR获得片段。所得片段的核苷酸序列可通过常规方法进行测定。
在本说明书中，可计算所消化的DNA片段和质粒的大小；当应用琼脂糖凝胶电泳时，基于相同琼脂糖凝胶上由具有已知分子量的DNA片段的迁移距离绘出的参考线，所述DNA片段是通过用限制性内切酶HindIII消化大肠杆菌λ噬菌体而得到的；或当应用聚丙烯酰胺凝胶电泳时，基于相同聚丙烯酰胺凝胶上由具有已知分子量的DNA片段的迁移距离绘出的参考线，所述DNA片段是通过用限制性内切酶HaeIII消化大肠杆菌X174噬菌体而得到的。为了测定每个DNA片段的大小，对于大小为1kb或更大的片段而言，应用1％琼脂糖凝胶电泳，而对于大小大约0.1kb或更大但小于1kb的片段而言，应用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在本发明中，含有上述用于增加PC活性的PC基因的DNA片段不仅从谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA分离，而且应用通常应用的DNA合成设备，例如由Applied Biosystems Inc制造的394 DNA/RNA合成仪来合成。此外，作为由如前所述的棒状细菌的染色体DNA中得到的PC基因，在SEQ ID NO15的核酸序列中一些核苷酸可被其他核苷酸取代，缺失，或插入附加的核苷酸，只要由该基因编码的PC的功能，即，二氧化碳固定(carbon dioxide fixation)的性质没有基本的缺损。此外，一些核苷酸序列可以倒位(inverted)。任何那些衍生物可用于本发明。也可以优选地应用在严紧性条件下与具有SEQ IDNO15的核酸序列的DNA，或者与SEQ ID NO15的核苷酸序列具有不低于90％，优选不低于95％，或更优选不低于99％同源性的DNA杂交的DNA，和编码具有PC活性的蛋白的DNA。本文中，所述的严紧性条件包括允许在这样的盐浓度下进行杂交的条件，该盐浓度对应于常规Southern杂交的洗涤条件，60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS。
也可以应用由除谷氨酸棒状杆菌外的任何细菌，或从任何微生物、动物和植物得到的PC基因。具体地，来自所述微生物、动物和植物的PC基因的核酸序列，如下面所述的那些，是已知的(参考文献在下面指示)。因此，可以用如前所述的相同方式通过杂交或PCR扩增ORF获得PC基因。
人类(Homo sapiens)[Biochem.Biophys.Res.Comm.，202，1009-1014，(1994)]小鼠(Mus musculus)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，90，1766-1779，(1993)]大鼠[GENE，165，331-332，(1995)]酵母；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[Mol.Gen.Genet.，229，307-315，(1991)]粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[DDBJ Accession No.；D78170]嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)[GENE，191，47-50，(1997)]Rhizobium etli[J.Bacteriol.，178，5960-5970，(1996)]含有所述PC基因的DNA片段可以通过将所述DNA片段插入合适的表达质粒，如pUC118(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)，然后通过导入合适的宿主微生物，如大肠杆菌JM109(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)来表达。表达的PC基因产物丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO16)，可以通过以Magasanik的方法[J.Bacteriol.，158，55-62，(1984)]应用由所述转化体制备的粗酶溶液直接测定PC活性，然后将该PC活性与由非-转化体制备的粗酶溶液的PC活性相比较来确认。将含有PC基因的DNA片段插入合适的质粒，如质粒载体，其至少含有负责在棒状杆菌的细菌中复制和扩增该质粒的基因，并由此获得能够在棒状杆菌的细菌中高表达PC的重组质粒。在重组质粒中，表达PC基因的启动子可源自棒状细菌。然而，不限于所述的启动子，并可应用任何启动子只要它是能启动PC基因转录的核苷酸序列。例如，可应用如在实施例3中描述的TZ4启动子。
其中可导入PC基因的质粒载体无具体的限制，只要它至少包含负责在棒状杆菌的细菌中复制的基因。所述具体实施例包括JP03-210184A中描述的质粒pCRY30；JP02-72876A和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JP01-191686A中描述的质粒pCRY2和pCRY3；JP58-67679A中描述的pAM330；JP58-77895A中描述的pHM1519；JP58-192900A中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；JP57-134500A中描述的pCG1；JP58-35197A中描述的pCG2；和JP57-183799A中描述的pCG4和pCG11。
那些之中，包含在棒状细菌中负责复制的基因和负责稳定所述质粒的基因的质粒优选用作棒状细菌中宿主-载体系统的质粒载体。例如，可优选应用质粒pCRY30、pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX。
具有增加的PC基因表达以用于本发明的棒状细菌可通过用重组载体转化棒状杆菌的细菌，例如黄色短杆菌MJ-233(FERM BP-1497)来获得，所述重组载体通过将所述的PC基因插入质粒载体的适合位点来制备，所述质粒载体如上所述可在好氧的棒状杆菌的细菌中复制。此外，PC活性的增加也可以通过常规的同源重组导入、取代或扩增所述基因以在染色体上使PC基因高表达化。用含有所述FRD基因的重组载体来转化所得的细菌以获得具有增加的PC和FRD基因表达的棒状细菌。FRD和PC基因中的任一个可以首先导入。所述的转化可通过，例如，电脉冲方法(Res.Microbiol.，Vol.144，p.181-185，1993)来进行。
此外，在本发明中，经过修饰以增加延胡索酸还原酶和丙酮酸羧化酶的活性并降低乳酸脱氢酶活性的细菌特别优选地用于产生琥珀酸。上述细菌可通过用分别含有PC基因和FRD基因的重组载体转化具有破坏的LDH基因的棒状细菌而得到。任何应用这些基因的修饰步骤可首先实施。
当上述细菌用于产生琥珀酸的反应时，可直接应用在固体培养基，如琼脂培养基上经过斜面培养的细菌。并优选在应用前上述的细菌可在液体培养基中预-培养(种子培养(seed culture))。可能通过将由种子-培养的细菌与有机物质进行反应，同时在含有有机原料的培养基中生长所述的细菌来产生琥珀酸。另外，琥珀酸可以通过将增殖的细菌细胞与有机原料在含有所述有机原料的反应溶液中进行反应来产生。当好氧的棒状细菌用于本发明的方法时，优选应用在正常的好氧条件下培养之后的细菌。用于培养的培养基可为任何通常用于微生物培养的那些培养基。例如，可以应用常规培养基，其通过将天然营养源，如肉膏、酵母提取物或蛋白胨加入由无机盐如硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁组成的组合物来制备。培养之后通过离心、膜分离等收集所述细菌细胞，然后用于反应。
在本发明中，也可以应用细菌的细胞处理物。例如，所述细菌细胞处理物包括在丙烯酰胺、鹿角菜胶(carageenan)等上固定的细菌细胞；裂解的细菌细胞，其离心上清，或通过用硫酸铵处理等部分纯化所述上清而得到的级分。
用于本发明的产生方法的有机原料是没有局限的，只要它是所述微生物能同化以产生琥珀酸的碳源。通常，可发酵的糖类物质如半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油(glycerin)、蔗糖(sucrose)、蔗糖(saccharose)、淀粉和纤维素；或多元醇如甘油、甘露醇、木糖醇和核醣醇可用作碳源。其中，葡萄糖、果糖和甘油是优选的，而且葡萄糖是特别优选的。
此外，也可以应用糖化的淀粉溶液、糖蜜(molasses)等，其包含上述可发酵的糖类物质。那些可发酵的碳水化合物可以单独地或组合地应用。上述有机原料的浓度无具体的限制，但是，在产生琥珀酸不受抑制的范围内尽可能高地增加浓度是有利的。所述有机原料的浓度通常在5至30％(w/v)的范围内，优选10至20％(w/v)的范围内。此外，随着反应进行，当上述有机原料减少时也可补加所述的有机原料。
含有所述有机原料的反应溶液无具体的限制，而且例如，可为细菌培养的任何培养基或包括磷酸盐缓冲液的任何缓冲液。该反应溶液优选含有氮源、无机盐等的水溶液。本文中，所述氮源无具体限制，只要它被所述微生物同化以产生琥珀酸。具体地，所述氮源包括各种有机的和无机的氮化合物，如铵盐、硝酸盐、脲(urea)、大豆水解物、酪蛋白水解物、蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)和玉米浆(corn steep liquor)。所述的无机盐包括各种类型的磷酸盐、硫酸盐和金属盐类(metal salts)如镁盐、钾盐、锰盐、铁盐、锌盐等。此外，如果需要，可以加入促进细菌细胞生长的任何组分，其包括维生素如生物素(biotin)、泛酸(pantothenic acid)、肌醇(inositol)和烟酸(nicotinicacid)、核苷酸和氨基酸。此外，优选将最佳量的商业上可得到的消泡剂(anti-foaming agent)加入所述的培养基以在反应的时候抑制发泡。
所述反应溶液的pH可通过加入碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等来调节。所述反应的pH通常为5至10的pH，优选6至9.5的pH，并由此，如果需要的话，在所述反应过程中该反应溶液的pH可用碱性物质、碳酸盐、脲等在上述范围内调节。
用于本发明的反应溶液可为水、缓冲液、培养基等，但优选培养基。例如，将碳酸盐或碳酸氢根离子，或二氧化碳气以及上述的有机原料加入所述培养基，然后在厌氧条件下进行反应。所述碳酸盐或碳酸氢根离子可由碳酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾供给，上述物质也可用作中和剂。然而，如果需要的话，所述碳酸盐或碳酸氢根离子可由碳酸或重碳酸或其盐或二氧化碳气供给。碳酸盐或碳酸氢盐的具体实例包括碳酸镁、碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢铵、碳酸氢钠和碳酸氢钾。此外，将碳酸根离子或碳酸氢根离子以0.001至5M的浓度加入，优选0.1至3M，更优选1至2M。当加入二氧化碳气时，所述溶液中二氧化碳气的量为50mg/l至25g/l，优选100mg/l至15g/l，更优选150mg/l至10g/l。
用于本反应的细菌的生长的最适温度通常在25至35℃的范围内。所述反应的温度通常在25至40℃的范围内，优选在30至37℃的范围内。用于本反应的细菌细胞的量为，但不限于1至700g/L，优选10至500g/L，更优选20至400g/L。反应时间优选1至168小时，更优选3至72小时。
为了培养所述细菌，需要通过通气和搅拌供给氧气。在另一方面，琥珀酸可以通气和搅拌产生，或也可以在无通气或氧气供应的厌氧气氛下产生。本文中应用的术语“厌氧条件”(anaerobic condition)指在将溶液中的溶氧保持在低水平的同时进行反应。在此情况中，优选在0至2ppm的溶氧水平进行反应，优选0至1ppm，更优选0至0.5ppm。为了那个目的，可以在无通气的密封容器进行反应；可在供给惰性气体如氮气的同时进行反应；或供给含有二氧化碳气的惰性气体的同时进行反应。
在反应溶液(培养基)中累积的琥珀酸可根据常规方法来收集并从该反应溶液中纯化。具体地，通过离心、过滤等除去固体组分如细菌细胞等，并用离子-交换树脂等将得到的溶液脱盐，然后通过结晶或柱色谱(columnchromatography)来收集并从所述溶液中纯化琥珀酸。
在本发明中，通过本发明如前所述的方法产生琥珀酸之后，应用得到的琥珀酸作为原料可进行聚合反应以产生含有琥珀酸的聚合物。近年来，环境-友好的工业产品的数量增加，而且由植物来源的原料制备的聚合物引起注意。本发明中产生的琥珀酸可以加工成聚合物，如聚酯(polyester)和聚酰胺(polyamide)。此外，由本发明的产生方法得到的琥珀酸或含有所述琥珀酸的组合物可用于食物添加剂、药剂、化妆品等。
实施例在下文中，参考实施例对本发明进行更详细地描述。然而，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1构建基因破坏载体(A)提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA在10mL的LB培养基[组成10g胰蛋白胨(tryptone)，5g酵母提取物和5g NaCl溶于1L蒸馏水]中培养枯草芽孢杆菌ISW1214，直到对数生长后期(late logarithmic growth phase)，并收集所述的细菌细胞。得到的细菌细胞在0.15mL含有10mg/mL溶菌酶的10mM NaCl/20mM Tris缓冲液(pH 8.0)/1mM EDTA·2Na中重悬。
然后，将蛋白酶K以100μg/mL的终浓度加入所述悬浮液，并在37℃保持1个小时。然后，又将十二烷基硫酸钠溶液以0.5％的终浓度加入，并在50℃保持6小时用于裂解。向此裂解物中，加入等量的酚/氯仿溶液，并在室温慢慢振荡10分钟。然后，将总的悬浮液进行离心(5,000×g，20分钟，10至12℃)，并取出上清级分。将乙酸钠溶液以0.3M的浓度加入所述的上清级分，然后加入两倍量的乙醇并混合。通过离心(15,000×g，2分钟)除去沉淀物，然后用70％乙醇洗涤并风干。将5mL的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)/1mMEDTA·2Na加入得到的DNA。将所得的溶液在4℃静置过夜，并用作PCR的模板DNA。
(B)通过PCR扩增和克隆SacB基因通过应用前面(A)部分中制备的DNA作为模板；并应用基于报道的所述基因的核苷酸序列(GenBank Database登记号X02730)设计而合成的DNA(SEQ ID NOs1和2)实施PCR来获得枯草芽孢杆菌SacB基因。
所述反应溶液的组成如下。将1μL的模板DNA、0.2μL的PfxDNA聚合酶(可从Invitrogen得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.3μM相应的引物，1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并将所述反应溶液的总体积调节至20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪(Thermal Cycler)PTC-2000，并将94℃、20秒和68℃、2分钟的循环重复35次。对于第一个循环，在94℃保温(heat-retention)进行1分20秒。对于最后的循环，在68℃保温进行5分钟。
扩增的产物通过在0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约2kb的片段。应用QIAQuick凝胶Extraction Kit(可由QIAGEN得到)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。
回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)插入大肠杆菌载体(pBluescript II可由STRATEGENE得到)的EcoRV位点，并应用得到的质粒DNA以转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得到的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素(ampicillin)和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上(10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g琼脂溶于1L蒸馏水)。
将此培养基上每个形成白色菌落的克隆转移到含有50μg/mL氨苄青霉素和10％蔗糖的LB琼脂培养基，并在37℃培养24小时。这些克隆中，将在含有蔗糖的培养基上不能生长的克隆通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。SacB基因被功能性表达的大肠杆菌菌株必不能在含有蔗糖的培养基中生长。得到的质粒DNA用限制性内切酶Sal I和Pst I进行消化。确认所述质粒DNA具有大约2kb的插入片段并将该质粒命名为pBS/SacB。
(C)构建氯霉素-抗性的SacB载体500ng大肠杆菌质粒载体pHSG396(氯霉素抗性标记，可由Takara ShuzoCo.，Ltd.得到)与10单位的限制性内切酶PshBI在37℃反应1小时，并通过酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收。将得到的DNA的两个末端每个用Klenow片段(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)平末端化，并将MluI接头(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上以形成环状质粒，并且应用得到的质粒以转化所述的大肠杆菌(DH5α菌株)。将得到的重组大肠杆菌铺在含有34μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上。通过常规方法将质粒DNA从所得到的克隆中分离。选择具有限制性内切酶MluI的切割位点的克隆并命名为pHSG396Mlu。
同时，在前面(B)部分构建的pBS/SacB用限制性内切酶SalI和PstI消化，并将得到的DNA的两个末端每个用Klenow片段平末端化。将MluI接头通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上。然后，含有SacB基因大约2.0kb的DNA片段在0.75％琼脂糖凝胶电泳中分离并回收。将此SacB基因片段连接于通过用限制性内切酶MluI消化pHSG396Mlu而得到的片段上，并用小牛小肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase Calfintestine)(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)脱磷酸，通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)，所得到的DNA用于转化所述大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得的重组大肠杆菌铺于含有34μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上。
将得到的菌落转移到含有34μg/mL氯霉素和10％蔗糖的LB琼脂培养基上，并在37℃培养24小时。这些克隆中，从在含有蔗糖的培养基上不能生长的克隆中通过常规方法分离质粒DNA。将得到的质粒DNA进行MluI消化和分析。结果，确认所述质粒DNA具有大约2kb的插入片段并命名为pCMB1。
(D)获得卡那霉素-抗性基因应用大肠杆菌质粒载体pHSG299(卡那霉素抗性标记，Takara Shuzo Co.，Ltd.)的DNA作为模板，并应用合成的DNA(在SEQ ID NOs3和4中显示)作为引物，通过实施PCR获得卡那霉素-抗性基因。反应溶液的组成如下1ng模板DNA、0.1μL的Pyrobest DNA聚合酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.5μM相应的引物和0.25μM dNTPs混合，并将所述反应溶液的总体积调节至20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪PTC-2000，并将94℃、20秒，62℃、15秒和72℃、1分20秒的循环重复20次。对于第一个循环，在94℃保温进行1分20秒。对于最后的循环，在72℃保温进行5分钟。
扩增的产物通过在0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约1.1kb的片段。应用QIAQuick凝胶Extraction Kit(可由QIAGEN得到)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化。
(E)构建卡那霉素-抗性的SacB载体通过用限制性内切酶Van91I和ScaI消化在前面(C)部分中构建的pCMB1而获得的大约3.5kb的DNA片段，在0.75％琼脂糖凝胶电泳中分离并回收。将得到的DNA与前面(D)部分中制备的卡那霉素抗性基因混合，并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而且所得的质粒DNA用于转化所述大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。
确认在含有卡那霉素的培养基上生长的菌株不能在含有蔗糖的培养基上生长。此外，由相同菌株制备的质粒DNA通过限制性内切酶HindIII消化显示354、473、1,807和1,997bp的片段。因此断定，所述质粒具有图1所示的结构，并将所述质粒命名为pKMB1。
实施例2构建LDH基因-破坏的菌株(A)从黄色短杆菌MJ233-ES菌株中提取基因组DNA在10mLA培养基(2g脲、7g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、6mg FeSO4·7H2O、6mg MnSO4·4-5H2O、200μg生物素、100μg硫胺素、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸(casamino aid)和20g葡萄糖溶于1L蒸馏水)中培养黄色短杆菌MJ-233菌株直到对数生长后期。所得的细菌细胞用于通过在实施例1的(A)部分中描述的方法制备基因组DNA。
(B)克隆乳酸脱氢酶基因通过应用在前面(A)部分中制备的DNA作为模板；并应用基于JP11-206385A中描述的基因的核酸序列设计而合成的DNA((SEQ ID NOs5和6)实施PCR获得MJ233菌株的乳酸脱氢酶基因。所述反应溶液的组成如下将1μL模板DNA、0.2μL TaqDNA聚合酶(可从Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.2μM相应的引物和0.25μM dNTPs混合，并将所述反应溶液的总体积调节至20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪PTC-2000，并将94℃、20秒，55℃、15秒和72℃、1分钟的循环重复30次。对于第一个循环，在94℃保温进行1分20秒。对于最后的循环，在72℃保温进行5分钟。
扩增的产物通过在0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约0.95kb的片段。应用QIAQuick凝胶Extraction Kit(可由QIAGEN得到)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。
将回收的DNA片段与PCR产物-克隆载体pGEM-T Easy(可由PromegaCorporation得到)混合，并应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而且得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。
将此培养基上每个形成白色菌落的克隆通过常规方法进行液体培养，然后纯化所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶SacI和SphI切割。确认所述质粒DNA具有大约1.0kb的插入并命名为pGEMT/CgLDH。
(C)破坏乳酸脱氢酶基因质粒的构建在前面(B)部分制备的pGEMT/CgLDH用限制性内切酶EcoRV和XbaI消化以去除乳酸脱氢酶大约0.25kb的编码区。残留的大约3.7kb的DNA片段的每个末端通过Klenow片段平末端化并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)自身环化，而且所得的质粒用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。
在此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶SacI和SphI消化。选择具有大约0.75kb插入的克隆并命名为pGEMT/ΔLDH。
接着，通过用限制性内切酶SacI和SphI消化pGEMT/ΔLDH而得到的大约0.75kb的DNA片段在0.75％琼脂糖凝胶电泳中分离并回收，以制备乳酸脱氢酶基因片段，其中其区域的一部分缺失。将此DNA片段与用限制性内切酶SacI和SphI消化的实施例1中构建的pKMB1混合，并应用Ligation Kitver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将得到的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。
将此培养基上每个形成白色菌落的克隆通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶SacI和SphI消化。选择具有大约0.75kb插入片段的克隆并命名为pKMB1/ΔLDH(图2)。
(D)构建源自黄色短杆菌MJ233-ES菌株的乳酸脱氢酶基因-破坏的菌株用于转化黄色短杆菌MJ-233菌株的质粒DNA从通过氯化钙方法以pKMB1/ΔLDH转化的大肠杆菌JM110菌株中(Journal of Molecular Biology，53，159，1970)来分离。
从黄色短杆菌MJ233菌株(FERM BP-1497)(消除(curing))根据常规步骤(WolfH等，J.Bacteriol.1983，156(3)1165-1170，Kumsu Y等，Agric Biol Chem.1990，54(2)443-7)去除内源质粒，然后，得到的质粒-消除(plasmid-cured)菌株黄色短杆菌MJ233-ES用于后续的转化。
转化黄色短杆菌MJ233-ES菌株通过电脉冲方法(Res.Microbiolo.，Vol.144，p.181-185，1993)进行，并将得到的转化体铺于含有50μg/mL卡那霉素的LBG琼脂培养基(10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl、20g葡萄糖和15g琼脂溶于1L蒸馏水)。
因为pKMB1/ΔLDH是在黄色短杆菌MJ233-ES菌株中不能复制的质粒，在此培养基上生长的菌株必须具有源自其基因组上的质粒的SacB基因和卡那霉素-抗性基因，这是所述质粒上的乳酸脱氢酶基因和黄色短杆菌MJ-233菌株的基因组上的相同基因之间同源重组的结果。
接着，通过同源重组得到的菌株在含50μg/mL卡那霉素的LBG培养基上进行液体培养。将假定包含大约1,000,000个细菌细胞的培养溶液铺在含10％蔗糖的LBG培养基上。结果，得到大约10个蔗糖-不敏感的菌株，其中所述的SacB基因通过第二次同源重组去除。
所得到的菌株包括乳酸脱氢酶基因被源自pKMB1/ΔLDH的缺失型替代的菌株；和乳酸脱氢酶基因回复(revert)为野生型的菌株。该乳酸脱氢酶基因是变异型还是野生型可通过将由在LBG培养基中液体培养得到的细菌菌株进行直接PCR并检测所述的乳酸脱氢酶基因来容易地确认。通过应用PCR扩增的引物(SEQ ID NOs7和8)分析乳酸脱氢酶基因得到野生型720bp的DNA片段和具有缺失的变异型471bp的DNA片段。
作为通过上述方法分析蔗糖-不敏感菌株的结果，选择只具有变异型基因的菌株并命名为黄色短杆菌MJ233/ΔLDH。
(E)测定乳酸脱氢酶活性将由上述(D)制备的黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株接种到培养基A中，然后在30℃好氧地振荡培养15小时。将得到的培养物离心(3,000×g，4℃，20分钟)，并收集细菌细胞，然后用钠-磷酸(sodium-phosphate)缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.3))洗涤。
随后，将0.5g(湿重)洗涤的细菌细胞悬于2ml上述磷酸钠缓冲液，然后用超声仪(由Branson，Ltd.制造)在冰上处理以得到细菌细胞的裂解产物。将该裂解产物离心(10,000×g，4℃，30分钟)，并得到所述上清作为粗酶溶液(crudeenzyme solution)。类似地，制备黄色短杆菌MJ233-ES菌株的粗酶溶液作为对照，然后进行如下的活性测定。
对于两个粗酶溶液，通过测定辅酶NADH到NAD+的氧化作为340nm吸光度的变化，连同由作为底物的丙酮酸产生乳酸来测定乳酸脱氢酶活性(L.Kanarek和R.L.Hill，J.Biol.Chem.239，4202(1964))。该反应在37℃、存在10mM丙酮酸和0.4mM NADH的条件下，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中进行。因此，由黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株制备的粗酶溶液的乳酸脱氢酶活性为由黄色短杆菌MJ233-ES菌株制备的粗酶溶液的乳酸脱氢酶活性的十分之一或更少。
实施例3构建棒状杆菌的细菌的表达载体(A)制备棒状杆菌的细菌的启动子片段应用显示于JP07-95891A中的SEQ ID NO4并报道为在棒状杆菌的细菌中具有高启动子活性的DNA片段(在下文中，称为TZ4启动子)。通过应用实施例2的(A)部分中制备的黄色短杆菌MJ233基因组DNA作为模板；并应用基于JP07-95891A中SEQ ID NO4描述的序列设计而合成的DNAs(SEQ IDNOs9和10)作为引物，实施PCR可得到所述的启动子片段。
所述反应溶液的组成如下将1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Japan K.K.得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.3μM相应的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并将所述反应溶液的总体积调节至20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪PTC-2000，并将94℃、20秒，60℃、20秒和72℃、30秒的循环重复35次。对于第一个循环，在94℃保温进行1分20秒。对于最后的循环，在72℃保温进行2分钟。
扩增的产物通过在2.0％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约0.25kb的片段。应用QIAQuick凝胶Extraction Kit(可由QIAGEN得到)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。
回收的DNA片段的5′-末端用T4多核苷酸激酶(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)磷酸化并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接到大肠杆菌载体pUC19(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的SmaI位点，而且得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得到的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。
将此培养基上形成白色菌落的六个克隆通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA，并测定核苷酸序列。从中选择TZ4启动子以具有相对于pUC19上的lac启动子反方向的转录活性的方式插入的克隆并命名为pUC/TZ4。
接着，将由合成的DNAs(SEQ ID NOs11和12)组成的DNA接头添加到通过用限制性内切酶BamHI和PstI消化pUC/TZ4制备的DNA片段并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)相互连接，所述合成的DNAs每个具有磷酸化的5′-末端并具有对应于BamHI和PstI每个的粘性末端，所得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。此DNA接头包括核糖体结合序列(AGGAGG)和所述核糖体结合序列下游排列的克隆位点(从上游PacI、NotI和ApaI的顺序)。
将此培养基上形成白色菌落的克隆通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。在得到的质粒DNA中，选择能用限制性内切酶NotI切割的质粒DNA并命名为pUC/TZ4-SD。
通过用限制性内切酶PstI消化pUC/TZ4-SD，用Klenow片段使其末端平末端化和用限制性内切酶KpnI切割所得DNA得到大约0.3kb的启动子片段，并在2.0％琼脂糖凝胶电泳中分离和回收。
(B)构建棒状杆菌的细菌的表达载体JP 12-93183A中描述的pHSG298par-rep用作在棒状杆菌的细菌中能稳定且自主复制的质粒。此质粒包括来自停滞短杆菌(Brevibacterium stationis)IFO12144菌株的天然质粒pBYS03的复制区(replicating region)和稳定功能的区域，源自大肠杆菌载体pHSG298(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的卡那霉素抗性基因和大肠杆菌的复制区。通过用限制性内切酶SseI消化pHSG298par-rep，用Klenow片段使其末端平末端化，并用限制性内切酶KpnI消化所得的DNA来制备DNA，并且将该DNA与前面(A)部分中制备的TZ4启动子片段混合并应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而且所得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将得到的重组大肠杆菌铺于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。
将此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后纯化所述的质粒DNA。在得到的质粒DNA中，选择能用限制性内切酶NotI消化的质粒DNA并命名为pTZ4(图3显示构建步骤)。
实施例4构建丙酮酸羧化酶活性-增加的菌株(A)获取丙酮酸羧化酶基因源自黄色短杆菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因通过应用实施例2的(A)部分中制备的DNA作为模板；并应用基于其全部基因组序列已报道的(GenBank Database登记号AP005276)谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株的丙酮酸羧化酶基因序列设计而合成的DNAs(SEQ ID NOs13和14)作为引物，实施PCR而得到。所述反应溶液的组成如下将1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Japan K.K.得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.3μM相应的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并将所述反应液的总体积调节至20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪PTC-2000，并将94℃、20秒和68℃、4分钟的循环重复35次。对于第一个循环，在94℃保温进行1分20秒。对于最后的循环，在68℃保温进行10分钟。完成PCR之后，加入0.1M的Takara Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)并在72℃保持30分钟。
扩增的产物通过在0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约3.7kb的片段。应用QIAQuick凝胶提取试剂盒(可由QIAGEN得到)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。
将回收的DNA片段与PCR产物-克隆载体pGEM-TEasy(可由PromegaCorporation得到)混合，并通过应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而且得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得到的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。
将此培养基上每个形成白色菌落的克隆通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶PacI和ApaI消化，确认所述的质粒DNA具有大约3.7kb的插入片段并命名为pGEM/MJPC。
通过应用核苷酸测序设备(model 377XL，由Applied Biosystems制造)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3(由Applied Biosystems制造)测定pGEM/MJPC中插入片段的核苷酸序列。SEQ ID NO15显示测定的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。所述氨基酸序列与源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株的序列非常高度地同源(99.4％)，可断定所述的pGEM/MJPC插入片段是源自黄色短杆菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因。
(B)增加丙酮酸羧化酶活性的质粒构建接着，前面(A)部分中通过用限制性内切酶PacI和ApaI消化pGEM/MJPC得到的大约3.7kb的丙酮酸羧化酶基因片段在0.75％琼脂糖凝胶电泳中分离并回收。
将此DNA片段与实施例3中用限制性内切酶PacI和ApaI消化的pTZ4混合并应用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.，Ltd.得到)连接于其上，而且得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得的重组大肠杆菌铺于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。
将此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后纯化所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶PacI和ApaI消化，选择具有大约3.7kb的插入片段的克隆并命名为pMJPC1(图4)。
(C)转化黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株从前面(B)部分中转化的大肠杆菌(DH5α菌株)中分离能在黄色短杆菌MJ233菌株中复制的质粒DNA pMJPC1。
转化黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株通过电脉冲方法进行(Res.Microbiolo.，Vol.144，p.181-185，1993)，并将得到的转化体铺于含有50μg/mL卡那霉素的LBG琼脂培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，20g葡萄糖和15g琼脂溶于1L蒸馏水)。
将此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后提取所述的质粒DNA并以限制性内切酶消化来分析。此结果证实所述菌株保留pMJPC1，并将该菌株命名为黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株。
(D)丙酮酸羧化酶活性将上面(C)部分中得到的转化体菌株黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH在含有2％葡萄糖和25mg/l卡那霉素的100ml培养基A中过夜培养。收获所得的细菌细胞然后用50ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)洗涤，然后在20ml具有如上述同样的组成的缓冲液中重悬。将上述悬浮液用SONIFIER 350(由Branson制造)进行超声处理，然后提供离心的上清作为无-细胞提取物。应用得到的无-细胞提取物测定丙酮酸羧化酶活性。通过使所述的酶在25℃在含有100mMTris/HCl缓冲液(pH 7.5)、0.1mg/10ml生物素、5mM氯化镁、50mM碳酸氢钠、50mM丙酮酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(adenosine triphosphate disodium)、0.32mM NADH、20单位/1.5ml苹果酸脱氢酶(由WAKO制造，来源于酵母)和酶的反应溶液中进行反应来测量酶活性。一单位(1U)定义为每分钟催化减少1μmol NADH的酶量。用丙酮酸羧化酶基因转化的菌株的无-细胞提取物中的比活性为0.2U/mg蛋白。在另一方面，在通过相似地应用培养基A培育亲代MJ233/ΔLDH菌株制备的细菌细胞中，通过所述活性测定方法没有检测到丙酮酸羧化酶活性。
实施例5克隆大肠杆菌延胡索酸还原酶基因(A)提取大肠杆菌DNA在10ml LB培养基中培育大肠杆菌JM109菌株直到对数生长末期，然后将得到的细菌细胞经过实施例1的(A)部分中描述的方法制备基因组DNA。
(B)克隆大肠杆菌延胡索酸还原酶基因所述的大肠杆菌延胡索酸还原酶基因通过应用前面(A)部分中制备的DNA作为模板，和基于其全部基因组序列已报道的(GenBank Database登记号U00096)大肠杆菌K12-MG1655菌株的基因序列设计而合成的DNAs(SEQID NOs17和18)，进行PCR而得到。
所述反应溶液的组成如下将1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可由Invitrogen Co.，Ltd.得到)、1-倍浓度的提供的缓冲液、0.3μM各自的引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并将总体积调节到20μL。
反应温度条件如下应用由MJ Research Co.，Ltd.制造的DNA热循环仪PTC-2000，并将94℃、20秒和68℃、4分钟的循环重复35次。对于第一个循环，在94℃保温进行1分20秒。对于最后的循环，在68℃保温进行10分钟。完成PCR之后，加入0.1μl的Takara Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)并在72℃保持30分钟。
扩增的产物通过在0.75％琼脂糖(SeaKem GTG琼脂糖，可从FMCBioProducts得到)凝胶电泳中分离然后用溴化乙锭染色显现来分析，以由此检测大约3.8kb的片段。应用QIAQuick凝胶提取试剂盒(由QIAGEN制造)从所述的凝胶中回收目标DNA片段。
将回收的DNA片段与PCR产物-克隆载体pT7 Blue T-载体(由Novagen制造)混合，并通过应用Ligation Kit ver.2(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)连接于其上，而且得到的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将所得到的重组大肠杆菌铺在含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL X-Gal的LB琼脂培养基上。
将此培养基上形成白色菌落的克隆根据常规方法在液体培养物中进行培育，然后纯化所述的质粒DNA。将得到的质粒DNA用限制性内切酶HindIII和KpnI消化，由此确认大约3.9kb的插入片段，并命名为pFRD6.0。
pFRD6.0的插入片段的核苷酸序列应用由Applied Biosystems，Inc.制造的核苷酸测序设备(377XL型)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3进行测定。得到的核苷酸序列和预测的氨基酸序列在SEQ ID NOs19和20-23中描述。
实施例6构建丙酮酸羧化酶/延胡索酸还原酶活性增加的菌株(A)修饰pMJPC1的限制性内切酶识别位点将实施例3中构建的pMJPC1用限制性内切酶KpnI完全消化，而且其5′-末端通过与小牛小肠(Calfintestine)碱性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)反应脱磷酸。由具有磷酸化的5′-末端的合成的DNAs(SEQ ID NOs24和25)组成的DNA接头与得到的片段混合，并应用Ligation Kit ver.2(可由TakaraShuzo Co.，Ltd.得到)连接与其上，而且所得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将得到的重组大肠杆菌铺于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基。
将此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。在得到的质粒DNA中，选择能用限制性内切酶NdeI消化的质粒DNA，并命名为pMJPC1.1。
(B)增加丙酮酸羧化酶和延胡索酸还原酶活性的质粒构建通过用限制性内切酶HindIII消化实施例5中制备的pFRD6.0，用Klenow片段使其末端平末端化，并用限制性内切酶KpnI消化得到大约3.9kb的DNA片段。该DNA片段在0.75％琼脂糖凝胶电泳中分离并回收。将含有大肠杆菌延胡索酸还原酶基因的制备的片段混合并应用Ligation Kit ver.2(可由TakaraShuzo Co.，Ltd.得到)连接到DNA，所述DNA用限制性内切酶NdeI消化上述(A)部分中制备的pMJPC1.1，用Klenow片段使其末端平末端化，然后用限制性内切酶KpnI消化得到。所得的质粒DNA用于转化大肠杆菌(DH5α菌株)。将得到的重组大肠杆菌铺于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基。
将此培养基上生长的菌株通过常规方法进行液体培养，然后分离所述的质粒DNA。在限制性内切酶HindIII消化之后，所得的质粒DNA显示505、2,132、2,675、3,775和4,193bp。因此，可断定所述的DNA具有图5所示的结构，并将此质粒命名为pFRPC1.1.
(B)转化黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株用pFRPC1.1转化黄色短杆菌MJ233/ΔLDH菌株通过实施例4的(C)部分中描述的方法来进行，以由此得到具有质粒pFRPC1.1的菌株。将此菌株命名为黄色短杆菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株。
(C)FRD酶活性测定将由上面(B)部分制备的转化体，黄色短杆菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株，在100ml含有2％葡萄糖和25mg/L卡那霉素的培养基A中过夜培养。收集所得的细菌细胞并用50ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)来洗涤，然后在20ml具有如上述同样的组成的缓冲液中重悬。将上述悬浮液用SONIFIER 350(由Branson制造)进行超声处理，并将离心的上清用作无-细胞提取物。应用上述无-细胞提取物测定延胡索酸还原酶活性。通过使所述的提取物在25℃在含有33mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.5)、0.1mM EDTA、20mM琥珀酸钠、2mMK3Fe(CN)6和酶的反应溶液中进行反应来测量酶活性。一单位(1U)定义为每分钟催化减少2μmol K3Fe(CN)6的酶量。表达所述质粒pFRRC1.1的菌株的无-细胞提取物中延胡索酸还原酶的比活性为0.02U/mg-蛋白。在另一方面，通过在培养基A中相似地培养亲代MJ233/ΔLDH菌株制备的细菌细胞中，所述比活性为0.01U/mg-蛋白。
实施例7克隆棒状细菌的琥珀酸脱氢酶基因黄色短杆菌MJ233菌株的琥珀酸脱氢酶(SDH)基因(在下文中，称作sdhC、sdhA和sdhB)应用基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因的核苷酸序列(GenBank Database Accession NO.NC_003450)设计而合成的DNA作为引物通过PCR来获得。具体地，含有形成包含sdhC-sdhA-sdhB的操纵子所述基因的DNA片段(SEQ ID NO28)应用具有SEQ ID NOs26和27的合成的DNA作为引物并应用黄色短杆菌MJ233的染色体DNA作为模板通过PCR获得。所述的PCR应用KOD-PLUS-(由TOYOBO Co.，Ltd.制造)根据如下条件来实施，一步在94℃进行保温5分钟，然后将在94℃变性15秒，在56℃退火30秒，和在72℃延伸4分钟的循环重复25次。所得的PCR产物通过常规方法纯化然后用SmaI消化。将所述DNA片段混合并应用Ligation Kit ver.2(由Takara Bio Inc.制造)连接到通过用SalI消化pVK7(JP10-215883A)然后用DNA-Blunting Kit(由Takara Bio Inc.制造)平末端化而制备的DNA片段。此质粒用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(由Takara Bio Inc.制造)，然后将所述的转化体铺于含有25μg/ml卡那霉素(在下文中，简称为Km)的LB培养基上，然后过夜培养。随后，挑取形成的菌落并分离单菌落，并由此得到转化体。从该转化体提取质粒，并将其中插入PCR产物的该质粒命名为pVKSDH。构建pVKSDH的步骤显示于图6。
实施例8增加丙酮酸羧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的质粒的构建将通过用XbaI和Sse837I消化实施例7中构建的pVKSDH得到的含有三个基因sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段混合并通过DNALigation Kit ver.2(由Takara Bio Inc.制造)连接于通过用XbaI和Sse8387I消化pHSG399(由TakaraBio Inc.制造)制备的片段。此DNA用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(由Takara Bio Inc.制造)，然后将所述转化体铺于含有25μg/ml氯霉素(在下文中，简称为Cm)、50μg/ml X-Gal和1mM IPTG的LB培养基，然后过夜培养。随后，挑取呈现白色的菌落并分离单菌落，由此得到转化体。从该转化体中提取质粒，并将其中插入含有sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段的质粒命名为pHSGSDH(图7)。
在另一方面，通过用KpnI和NdeI消化携带实施例6中描述的大肠杆菌的延胡索酸还原酶基因和来自黄色短杆菌的pyc基因的质粒pFRPC1.1，能回收含有除去来自大肠杆菌的延胡索酸还原酶基因之外的残留区域的片段。因此，用KpnI和NdeI消化pFRPC1.1和末端平末端化，和除去延胡索酸还原酶(furmarate reductase)基因，并回收残余的DNA片段。将通过用XbaI和Sse8387I消化pHSGSDH得到的含有sdhC、sdhA和sdhB的DNA片段进行末端-平末端化，然后连接于回收的DNA片段。此DNA用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(由Takara Bio Inc.制造)，并将该转化体铺于含有25μg/mlKm的LB培养基上，然后过夜培养。随后，挑取呈现白色的菌落并分离单菌落，由此得到转化体。从该转化体中提取质粒，并将其中插入含有sdhC、sdhA和sdhB同时去除frdA、frdB、frdC和frdD基因的DNA片段的质粒命名为pSDHPC(图8)。
实施例9构建其中丙酮酸羧化酶和琥珀酸脱氢酶增加的菌株实施例7和实施例8中分别得到的pVKSDH和pSDHPC都能在棒状细菌的细胞中自主复制。因此，每个所述质粒用于转化棒状细菌，并由此得到转化体。用pVKSDH和pSDHPC中的每个通过电脉冲的方法转化实施例2中构建的MJ233/ΔLDH菌株，然后铺于含有25-μg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨(polypeptone)、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、3g/L脲、1.2g/L大豆水解物(soybean hydrolysate)、pH 7.5(KOH)和15g/L琼脂)，然后在31.5℃培养大约24小时。
在此培养基上生长的菌株是其中导入所述质粒的菌株。所得的转化体分别命名为MJ233/SDH/ΔLDH和MJ233/SDH/PC/ΔLDH。此外，为了制备对照菌株，将实施例4中构造的质粒pVK7和质粒pMJPC1通过上面的方法导入MJ233/ΔLDH菌株。所得的转化体分别命名为MJ233/ΔLDH/pVK7和MJ233/PC/ΔLDH。
实施例10细菌细胞反应(碳酸铵中和，半-好氧反应)将100ml培养基(其中包含4g脲、14g硫酸铵、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、0.5g七水合硫酸镁(magnesium sulfate 7hydrate)、20mg七水合硫酸亚铁、20mg水合硫酸锰、200μg D-生物素、200μg盐酸硫胺素、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸和1000ml的蒸馏水)倾倒入500-mL锥形瓶，然后在120℃热-灭菌20分钟。将其冷却到室温，然后加入4mL预先灭菌的50％葡萄糖水溶液和50μL已经通过过滤除菌的5％卡那霉素溶液，并用于实施例6(B)中制备的黄色短杆菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株在30℃进行24小时种子培养。将含有12g脲、42g硫酸铵、1.5g磷酸二氢钾、1.5g磷酸氢二钾、1.5g七水合硫酸镁、60mg七水合硫酸亚铁、60mg水合硫酸锰、600μgD-生物素、600μg盐酸硫胺素、3g酵母提取物、3g酪蛋白氨基酸、1ml消泡剂(Adecanol LG294由Asahi Denka Kogyo K.K.制造)和2,500ml蒸馏水的培养基倾倒入5-L发酵罐，然后在120℃热-灭菌20分钟。将其冷却到室温，然后加入500mL预先灭菌的12％葡萄糖水性(aqueous)溶液，然后将所述种子培养物的总量加入该培养基并在30℃培养。在500mL每分钟的通气速率和500rpm的搅拌速率的条件下进行主要的培养。12小时后，葡萄糖几乎全部被消耗。
将含有0.2g七水合硫酸镁、8mg七水合硫酸亚铁、8mg水合硫酸锰、80μg D-生物素、80μg盐酸硫胺素、1mL消泡剂(Adecanol LG294由AsahiDenka Kogyo K.K.制造)和200mL蒸馏水的培养基倾倒入500-mL锥形瓶，然后在120℃热-灭菌20分钟。所述培养基冷却到室温后，将其加入从如上所述通过主要培养得到的培养溶液中通过在8,000rpm离心5分钟收获的细菌细胞，以使所述细菌细胞以60的O.D.(660nm)重悬。在1-L发酵罐中，加入200mL悬浮液和200mL预先-灭菌的20％葡萄糖溶液，并保温在35℃。用2M碳酸铵将pH保持在7.6，并在100mL每分钟的通气速率和400rpm的搅拌速率的条件下进行所述反应。
在所述反应开始后大约20小时，葡萄糖几乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率为5.00g/L/h，所述琥珀酸产生速率为2.66g/L/h且其收率为70.1％。相比之下，当实施例4(C)中制备的黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同样的方式进行反应时，所述葡萄糖消耗速率为4.74g/L/h，所述琥珀酸产生速率为2.13g/L/h且其收率为58.7％。
实施例11细菌细胞反应(碳酸铵中和，厌氧反应)以如前面实施例10所述同样的方式制备反应悬浮液，并用2M碳酸铵将所述pH保持在7.6，在200rpm搅拌无通气的条件下进行反应。所述反应开始后大约40小时，葡萄糖几乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率为2.50g/L/h，所述琥珀酸产生速率为1.35g/L/h且其收率为78.4％。相比之下，当实施例4(c)中制备的黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同样的方式进行反应时，所述葡萄糖消耗速率为2.38g/L/h，所述琥珀酸产生速率为1.21g/L/h且其收率为74.4％。
实施例12细菌细胞反应(碳酸钠中和，半-好氧反应)以如前面实施例10所述同样的方式制备反应悬浮液，并用2M碳酸钠将所述pH保持在7.6，并类似地实施反应。所述反应开始后大约28小时，葡萄糖几乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率为3.60g/L/h，所述琥珀酸产生速率为2.27g/L/h且其收率为82.8％。相比之下，当实施例4(C)中制备的黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同样的方式进行反应时，所述葡萄糖消耗速率为2.97g/L/h，所述琥珀酸产生速率为1.97g/L/h且其收率为88.0％。
实施例13细菌细胞反应(碳酸钠中和，厌氧反应)以如前面实施例10所述同样的方式制备反应悬浮液，并用2M碳酸钠将所述pH保持在7.6，在200rpm搅拌无通气的条件下进行反应。所述反应开始后大约32小时，葡萄糖几乎全部被消耗。所述葡萄糖消耗速率为3.13g/L/h，所述琥珀酸产生速率为1.80g/L/h且其收率为97.1％。相比之下，当实施例4(c)中制备的黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株以如上所述同样的方式进行反应时，所述葡萄糖消耗速率为2.70g/L/h，所述琥珀酸产生速率为1.57g/L/h且其收率为88.6％。
表1

实施例14细菌细胞反应(碳酸镁中和，厌氧培养)如下培养黄色短杆菌MJ233/ΔLDH/pVK7菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株由于产生琥珀酸。将在CM-Dex平板(含有25μg/ml卡那霉素)上培养的MJ233/ΔLDH/pVK7菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株的细菌细胞接种到3ml种子培养基(10g/L葡萄糖、2.5g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.25g/LMgSO4·7H2O、2g/L脲、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、50μg/L生物素、100μg/L VB1·HCl、15mg/L原儿茶酸(protocatechuic acid)、0.02mg/LCuSO4和10mg/L CaCl2及pH 7.0(KOH))。在好氧条件下，将这些菌株在31.5℃振荡培养大约15小时。
然后，加入3ml的主要培养基(100g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2SO4、2g/LKH2PO4、3g/L脲、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、200μg/L生物素、200μg/L VB1·HCl和71.4g/L MgCO3，每个浓度是加入后的终浓度，pH 6.8(NaOH))，并进行琥珀酸产生培养，同时将所述的管用硅盖子密封以防止通气。所述培育在31.5℃进行大约48小时，并在所述培养基中糖消失之前终止。
所述培养完成后，在将所述培养基合适地稀释之后通过液相色谱分析琥珀酸和副产物乙酸在培养基中的累积量。两个Shim-packSCR-102H(Simadzu)柱子串联连接并用作柱子，并用5mM对-甲苯磺酸(p-toluene sulfonic acid)在40℃洗脱样品。所述洗脱物应用含有5mM对-甲苯磺酸和100μM EDTA的20mM Bis-Tris水溶液来中和。所述琥珀酸和乙酸通过用CDD-10AD(Simadzu)测定电导率来测量。所述结果显示于表2中。
发现与通过将载体质粒导入相同宿主得到的MJ233/ALDH/pVK7菌株琥珀酸相比，MJ233/SDH/ΔLDH菌株的收率增加大约4％。此外，苹果酸的积累减少3.6g/L且延胡索酸的积累减少0.5g/L。
表2由SDH-扩增的菌株产生琥珀酸、苹果酸和延胡索酸

(B)SDH和PC同时扩增的菌株的培养评价如下培养黄色短杆菌MJ233/PC/ΔLDH菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株用于琥珀酸生产。在CM-Dex平板上培养的MJ233/PC/ΔLDH菌株和MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株的细菌细胞接种于3ml的培养基A(20g/L葡萄糖、14g/L(NH4)2SO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、4g/L脲、0.02g/L FeSO4·7H2O、0.02g/L MnSO4·7H2O、200μg/L生物素、200μg/LVB1·HCl，1g/L酪蛋白氨基酸和1g/L酵母提取物)中。在好氧条件下，这些菌株在管中振荡的同时在31.5℃培育大约15小时。
其后，加入3ml主要溶液(200g/L葡萄糖、30g/L亚硫酸钠和142.8g/LMgCO3)，并进行琥珀酸产生培养，同时将所述的管用硅盖子密封以防止通气。所述培育在31.5℃进行大约48小时，并在所述培养基中糖消失之前终止。
所述培养完成后，在将所述培养基合适地稀释之后通过液相色谱分析琥珀酸和副产物乙酸在培养基中的累积量。两个Shim-packSCR-102H(Simadzu)柱子串联连接并用作柱子，并用5mM对-甲苯磺酸在40℃洗脱样品。所述洗脱物应用含有5mM对-甲苯磺酸和100μM EDTA的20mM Bis-Tris水溶液来中和。所述琥珀酸和副产物乙酸通过用CDD-10AD(Simadzu)测定电导率来测量。所述结果显示于表3中。
通过SDH和PC的组合扩增的菌株产生琥珀酸、苹果酸和延胡索酸

在MJ233/SDH/PC/ΔLDH菌株中，与其中只有PC增加的MJ233/PC/ΔLDH菌株相比，琥珀酸的收率增加大约3％，同时苹果酸的积累减少3.2g/L而延胡索酸的积累减少0.2g/L。
考虑到这些结果和上面(A)部分的结果，发现扩增SDH基因可有效地增加琥珀酸的收率又降低作为产生琥珀酸的副产物的苹果酸和延胡索酸的量。
工业实用性根据本发明的产生方法，能高效快速地产生琥珀酸。产生的琥珀酸可用作食物添加剂、药物、化妆品等。此外，可应用所产生琥珀酸作为原料通过实施聚合反应来产生含有琥珀酸的聚合物。
序列表<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation)味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>产生琥珀酸的方法<130>A4050<150>JP2003-304443<151>2003-08-28<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1cctttttaac ccatcacata tacctgccgt tcac34<210>2<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2aaaggttagg aatacggtta gccatttgcc tg 32<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3gaggtctgcc tcgtgaagaa g 21<210>4<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>4ctcattagaa aaactcatcg agcatca27<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5cgatgaaaga aaccgtcggc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6cgtcagaaga actgcttctg20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7agttgcatac gcatacgcac tga23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8gagactggga ctgcaacgtc ttg23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9gatctttcag ctgctcacac gtga 24<210>10<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10gatcttaggt cactaaaact aattcag27<210>11<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gatccaggag gcattaatta agcggccgcg ggccctgca 39<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12gggcccgcgg ccgcttaatt aatgcctcct g 31<210>13<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13accttaatta atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gca 43<210>14<211>44<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>14gttgggccca ggtttaggaa acgacgacga tcaagtcgcc acct 44<210>15<211>3423<212>DNA<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(3420)<223>
<400>15atg tcg act cac aca tct tca acg ctt cca gca ttc aaa aag atc ttg48Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1 5 10 15gta gca aac cgc ggc gaa atc gcg gtc cgt gct ttc cgt gca gca ctc96Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu20 25 30gaa acc ggt gca gcc acg gta gct att tac ccc cgt gaa gat cgg gga144Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly35 40 45tca ttc cac cgc tct ttt gct tct gaa gct gtc cgc att ggt act gaa192Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu50 55 60ggc tca cca gtc aag gcg tac ctg gac atc gat gaa att atc ggt gca240Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65 70 75 80gct aaa aaa gtt aaa gca gat gct att tac ccg gga tat ggc ttc ctg288Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu85 90 95tct gaa aat gcc cag ctt gcc cgc gag tgc gcg gaa aac ggc att act336Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr100 105 110ttt att ggc cca acc cca gag gtt ctt gat ctc acc ggt gat aag tct384Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser115 120 125cgt gcg gta acc gcc gcg aag aag gct ggt ctg cca gtt ttg gcg gaa432Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu130 135 140tcc acc ccg agc aaa aac atc gat gac atc gtt aaa agc gct gaa ggc480Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Asp Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145 150 155 160cag act tac ccc atc ttt gta aag gca gtt gcc ggt ggt ggc gga cgc528Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175ggt atg cgc ttt gtt tct tca cct gat gag ctt cgc aaa ttg gca aca576Gly Met Arg Phe Val Ser Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr180 185 190gaa gca tct cgt gaa gct gaa gcg gca ttc ggc gac ggt tcg gta tat624Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ser Val Tyr195 200 205gtc gag cgt gct gtg att aac ccc cag cac att gaa gtg cag atc ctt672
Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220ggc gat cgc act gga gaa gtt gta cac ctt tat gaa cgt gac tgc tca720Gly Asp Arg Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240ctg cag cgt cgt cac caa aaa gtt gtc gaa att gcg cca gca cag cat768Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255ttg gat cca gaa ctg cgt gat cgc att tgt gcg gat gca gta aag ttc816Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270tgc cgc tcc att ggt tac cag ggc gcg gga act gtg gaa ttc ttg gtc864Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285gat gaa aag ggc aac cac gtt ttc atc gaa atg aac cca cgt atc cag912Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300gtt gag cac acc gtg act gaa gaa gtc acc gag gtg gac ctg gtg aag960Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320gcg cag atg cgc ttg gct gct ggt gca acc ttg aag gaa ttg ggt ctg1008Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335acc caa gat aag atc aag acc cac ggt gcg gca ctg cag tgc cgc atc1056Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350acc acg gaa gat cca aac aac ggc ttc cgc cca gat acc gga act atc1104Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365acc gcg tac cgc tca cca ggc gga gct ggc gtt cgt ctt gac ggt gca1152Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380gct cag ctc ggt ggc gaa atc acc gca cac ttt gac tcc atg ctg gtg1200Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400aaa atg acc tgc cgt ggt tcc gat ttt gaa act gct gtt gct cgt gca1248Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala405 410 415cag cgc gcg ttg gct gag ttc acc gtg tct ggt gtt gca acc aac att1296Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile420 425 430ggt ttc ttg cgt gcg ttg ctg cgt gaa gag gac ttt act tcc aag cgc1344Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg435 440 445atc gcc acc gga ttt atc ggc gat cac cca cac ctc ctt cag gct cca1392Ile Ala Thr Gly Phe Ile Gly Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro450 455 460cct gcg gat gat gag cag gga cgc atc ctg gat tac ttg gca gat gtc1440Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465 470 475 480acc gtg aac aag cct cat ggt gtg cgt cca aag gat gtt gca gca cca1488Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro485 490 495atc gat aag ctg ccc aac atc aag gat ctg cca ctg cca cgc ggt tcc1536Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser500 505 510cgt gac cgc ctg aag cag ctt gga cca gca gcg ttt gcc cgc gat ctc1584Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu515 520 525
cgt gag cag gac gca ctg gca gtt act gat acc acc ttc cgc gat gca1632Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala530 535 540cac cag tct ttg ctt gcg acc cga gtc cgc tca ttc gca ctg aag cct1680His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545 550 555 560gcg gca gag gcc gtc gca aag ctg act cct gag ctt ttg tcc gtg gag1728Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu565 570 575gcc tgg ggc ggt gcg acc tac gat gtg gcg atg cgt ttc ctc ttt gag1776Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu580 585 590gat ccg tgg gac agg ctc gac gag ctg cgc gag gcg atg ccg aat gtg1824Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val595 600 605aac att cag atg ctg ctt cgc ggc cgc aac acc gtg gga tac acc cca1872Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro610 615 620tac cca gac tcc gtc tgt cgc gcg ttt gtt aag gaa gct gcc acc tcc1920Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Thr Ser625 630 635 640ggc gtg gac atc ttc cgc atc ttc gac gcg ctt aac gac gtc tcc cag1968Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln645 650 655atg cgt cca gca atc gac gca gtc ctg gag acc aac acc gcg gtc gct2016Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala660 665 670gaa gtg gct atg gct tat tct ggt gat ctt tcc gat ccg aat gaa aag2064Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys675 680 685ctc tac acc ctg gat tac tac ctg aag atg gca gag gag atc gtc aag2112Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys690 695 700tct ggc gct cac att ctg gct att aag gat atg gct ggt ctg ctt cgc2160Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705 710 715 720cca gct gca gcc acc aag ctg gtc acc gca ctg cgc cgt gaa ttt gat2208Pro Ala Ala Ala Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp725 730 735ctg cca gtg cac gtg cac acc cac gac act gcg ggt ggc cag ctg gca2256Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala740 745 750acc tac ttt gct gca gct caa gct ggt gca gat gct gtt gac ggt gct2304Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765tcc gca cca ctg tct ggc acc acc tcc cag cca tcc ctg tct gcc att2352Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile770 775 780gtt gct gca ttc gcg cac acc cgt cgc gat acc ggt ttg agc ctc gag2400Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800gct gtt tct gac ctc gag cca tac tgg gaa gca gtg cgc gga ctg tac2448Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815ctg cca ttt gag tct gga acc cca ggc cca acc ggt cgc gtc tac cgc2496Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830cac gaa atc cca ggc gga cag ctg tcc aac ctg cgt gca cag gcc acc2544His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
835 840 845gca ctg ggc ctt gcg gat cgt ttc gaa ctc atc gaa gac aac tac gcg2592Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860gca gtt aat gag atg ctg gga cgc cca acc aag gtc acc cca tcc tcc2640Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880aag gtt gtt ggc gac ctc gca ctc cac ctc gtt ggt gcg ggt gtg gat2688Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895cca gca gac ttt gct gca gat cca caa aag tac gac atc cca gac tct2736Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910gtc atc gcg ttc ctg cgc ggc gag ctt ggt aac cct cca ggt ggc tgg2784Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925cca gag cca ctg cgc acc cgc gca ctg gaa ggc cgc tcc gaa ggc aag2832Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940gca cct ctg acg gaa gtt cct gag gaa gag cag gcg cac ctc gac gct2880Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960gat gat tcc aag gaa cgt cgc aac agc ctc aac cgc ctg ctg ttc ccg2928Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975aag cca acc gaa gag ttc ctc gag cac cgt cgc cgc ttc ggc aac acc2976Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990tct gcg ctg gat gat cgt gaa ttc ttc tac ggc ctg gtc gaa ggc cgc 3024Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg995 1000 1005gag act ttg atc cgc ctg cca gat gtg cgc acc cca ctg ctt gtt 3069Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val1010 1015 1020cgc ctg gat gcg atc tcc gag cca gac gat aag ggt atg cgc aat 3114Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn1025 1030 1035gtt gtg gcc aac gtc aac ggc cag atc cgc cca atg cgt gtg cgt 3159Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg1040 1045 1050gac cgc tcc gtt gag tct gtc acc gca acc gca gaa aag gca gat 3204Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp1055 1060 1065tcc tcc aac aag ggc cat gtt gct gca cca ttc gct ggt gtt gtc 3249Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val1070 1075 1080act gtg act gtt gct gaa ggt gat gag gtc aag gct gga gat gca 3294Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala1085 1090 1095gtc gca atc atc gag gct atg aag atg gaa gca aca atc act gct 3339Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala1100 1105 1110tct gtt gac ggc aaa atc gat cgc gtt gtg gtt cct gct gca acg 3384Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr1115 1120 1125aag gtg gaa ggt ggc gac ttg atc gtc gtc gtt tcc taa 3423Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser1130 1135 1140
<210>16<211>1140<212>PRT<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<400>16Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1 5 10 15Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu20 25 30Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly35 40 45Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu50 55 60Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65 70 75 80Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu85 90 95Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr100 105 110Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser115 120 125Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu130 135 140Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Asp Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145 150 155 160Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg165 170 175Gly Met Arg Phe Val Ser Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr180 185 190Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ser Val Tyr195 200 205Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu210 215 220Gly Asp Arg Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225 230 235 240Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His245 250 255Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe260 265 270Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val275 280 285Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln290 295 300Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305 310 315 320Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu325 330 335Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile340 345 350Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile355 360 365Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala370 375 380Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385 390 395 400Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile420 425 430Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg435 440 445Ile Ala Thr Gly Phe Ile Gly Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro450 455 460Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465 470 475 480Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro485 490 495Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser500 505 510Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu515 520 525Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala530 535 540His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545 550 555 560Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu565 570 575Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu580 585 590Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val595 600 605Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro610 615 620Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Thr Ser625 630 635 640Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln645 650 655Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala660 665 670Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys675 680 685Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys690 695 700Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705 710 715 720Pro Ala Ala Ala Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp725 730 735Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala740 745 750Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala755 760 765Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile770 775 780Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785 790 795 800Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr805 810 815Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg820 825 830His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr835 840 845Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala850 855 860Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp885 890 895Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser900 905 910Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp915 920 925Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys930 935 940Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945 950 955 960Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro965 970 975Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr980 985 990Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg995 1000 1005Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val1010 1015 1020Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn1025 1030 1035Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg1040 1045 1050Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp1055 1060 1065Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val1070 1075 1080Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala1085 1090 1095Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala1100 1105 1110Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr1115 1120 1125Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser1130 1135 1140<210>17<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17ccacctgcag gactccacga tcggcaaaga aacga35<210>18<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>18ggtatttaaa aaggcgcaga gcgtcgtttt gaacatagg39
<210>19<211>3847<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220>
<221>CDS<222>(440)..(2239)<223>
<220>
<221>CDS<222>(2241)..(2975)<223>
<220>
<221>CDS<222>(2986)..(3381)<223>
<220>
<221>CDS<222>(3392)..(3751)<223>
<400>19ccacctgcag gactccacga tcggcaaaga aacgacggat ctccgccata atcgccgcgc 60gttttaataa gttaggaatg gatgcgctcg gctgccagga tgccgtttcg ctcatagtta 120aatctccagt ttttgacaag ggcacgaagt ctactcgcaa cgcgacggcg agacaaattt 180tacgcaggaa tcaaacagcg gtgggcagtg actaaaaaaa gcacgatctg atggtttagt 240aattaaatta atcatcttca gtgataattt agccctcttg cgcactaaaa aaatcgatct 300cgtcaaattt cagacttatc catcagacta tactgttgta cctataaagg agcagtggaa 360tagcgttcgc agaccgtaac tttcaggtac ttaccctgaa gtacgtggct gtgggataaa 420aacaatctgg aggaatgtc gtg caa acc ttt caa gcc gat ctt gcc att gta 472Val Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val1 5 10ggc gcc ggt ggc gcg gga tta cgt gct gca att gct gcc gcg cag gca520Gly Ala Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala15 20 25aat ccg aat gca aaa atc gca cta atc tca aaa gta tac ccg atg cgt568Asn Pro Asn Ala Lys Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg30 35 40agc cat acc gtt gct gca gaa ggg ggc tcc gcc gct gtc gcg cag gat616Ser His Thr Val Ala Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp45 50 55cat gac agc ttc gaa tat cac ttt cac gat aca gta gcg ggt ggc gac664His Asp Ser Phe Glu Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp60 65 70 75tgg ttg tgt gag cag gat gtc gtg gat tat ttc gtc cac cac tgc cca712Trp Leu Cys Glu Gln Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro80 85 90acc gaa atg acc caa ctg gaa ctg tgg gga tgc cca tgg agc cgt cgc760Thr Glu Met Thr Gln Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg95 100 105ccg gat ggt agc gtc aac gta cgt cgc ttc ggc ggc atg aaa atc gag808Pro Asp Gly Ser Val Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu110 115 120cgc acc tgg ttc gcc gcc gat aag acc ggc ttc cat atg ctg cac acg856
Arg Thr Trp Phe Ala Ala Asp Lys Thr Gly Phe His Met Leu His Thr125 130 135ctg ttc cag acc tct ctg caa ttc ccg cag atc cag cgt ttt gac gaa904Leu Phe Gln Thr Ser Leu Gln Phe Pro Gln Ile Gln Arg Phe Asp Glu140 145 150 155cat ttc gtg ctg gat att ctg gtt gat gat ggt cat gtt cgc ggc ctg952His Phe Val Leu Asp Ile Leu Val Asp Asp Gly His Val Arg Gly Leu160 165 170gta gca atg aac atg atg gaa ggc acg ctg gtg cag atc cgt gct aac1000Val Ala Met Asn Met Met Glu Gly Thr Leu Val Gln Ile Arg Ala Asn175 180 185gcg gtc gtt atg gct act ggc ggt gcg ggt cgc gtt tat cgt tac aac1048Ala Val Val Met Ala Thr Gly Gly Ala Gly Arg Val Tyr Arg Tyr Asn190 195 200acc aac ggc ggc atc gtt acc ggt gac ggt atg ggt atg gcg cta agc1096Thr Asn Gly Gly Ile Val Thr Gly Asp Gly Met Gly Met Ala Leu Ser205 210 215cac ggc gtt ccg ctg cgt gac atg gaa ttc gtt cag tat cac cca acc1144His Gly Val Pro Leu Arg Asp Met Glu Phe Val Gln Tyr His Pro Thr220 225 230 235ggt ctg cca ggt tcc ggt atc ctg atg acc gaa ggt tgc cgc ggt gaa1192Gly Leu Pro Gly Ser Gly Ile Leu Met Thr Glu Gly Cys Arg Gly Glu240 245 250ggc ggt att ctg gtc aac aaa aat ggc tac cgt tat ctg caa gat tac1240Gly Gly Ile Leu Val Asn Lys Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Gln Asp Tyr255 260 265ggc atg ggc ccg gaa act ccg ctg ggc gag ccg aaa aac aaa tat atg1288Gly Met Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Glu Pro Lys Asn Lys Tyr Met270 275 280gaa ctg ggt cca cgc gac aaa gtc tct cag gcc ttc tgg cac gaa tgg1336Glu Leu Gly Pro Arg Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe Trp His Glu Trp285 290 295cgt aaa ggc aac acc atc tcc acg ccg cgt ggc gat gtg gtt tat ctc1384Arg Lys Gly Asn Thr Ile Ser Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Tyr Leu300 305 310 315gac ttg cgt cac ctc ggc gag aaa aaa ctg cat gaa cgt ctg ccg ttc1432Asp Leu Arg His Leu Gly Glu Lys Lys Leu His Glu Arg Leu Pro Phe320 325 330atc tgc gaa ctg gcg aaa gcg tac gtt ggc gtc gat ccg gtt aaa gaa1480Ile Cys Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Gly Val Asp Pro Val Lys Glu335 340 345ccg att ccg gta cgt ccg acc gca cac tac acc atg ggc ggt atc gaa1528Pro Ile Pro Val Arg Pro Thr Ala His Tyr Thr Met Gly Gly Ile Glu350 355 360acc gat cag aac tgt gaa acc cgc att aaa ggt ctg ttc gcc gtg ggt1576Thr Asp Gln Asn Cys Glu Thr Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ala Val Gly365 370 375gaa tgt tcc tct gtt ggt ctg cac ggt gca aac cgt ctg ggt tct aac1624Glu Cys Ser Ser Val Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ser Asn380 385 390 395tcc ctg gcg gaa ctg gtg gtc ttc ggc cgt ctg gcc ggt gaa caa gcg1672Ser Leu Ala Glu Leu Val Val Phe Gly Arg Leu Ala Gly Glu Gln Ala400 405 410aca gag cgt gca gca act gcc ggt aat ggc aac gaa gcg gca att gaa1720Thr Glu Arg Ala Ala Thr Ala Gly Asn Gly Asn Glu Ala Ala Ile Glu415 420 425gcg cag gca gct ggc gtt gaa caa cgt ctg aaa gat ctg gtt aac cag1768Ala Gln Ala Ala Gly Val Glu Gln Arg Leu Lys Asp Leu Val Asn Gln430 435 440
gat ggc ggc gaa aac tgg gcg aag atc cgc gac gaa atg ggc ctg gct1816Asp Gly Gly Glu Asn Trp Ala Lys Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ala445 450 455atg gaa gaa ggc tgc ggt atc tac cgt acg ccg gaa ctg atg cag aaa1864Met Glu Glu Gly Cys Gly Ile Tyr Arg Thr Pro Glu Leu Met Gln Lys460 465 470 475acc atc gac aag ctg gca gag ctg cag gaa cgc ttc aag cgc gtg cgc1912Thr Ile Asp Lys Leu Ala Glu Leu Gln Glu Arg Phe Lys Arg Val Arg480 485 490atc acc gac act tcc agc gtg ttc aac acc gac ctg ctc tac acc att1960Ile Thr Asp Thr Ser Ser Val Phe Asn Thr Asp Leu Leu Tyr Thr Ile495 500 505gaa ctg ggc cac ggt ctg aac gtt gct gaa tgt atg gcg cac tcc gca2008Glu Leu Gly His Gly Leu Asn Val Ala Glu Cys Met Ala His Ser Ala510 515 520atg gca cgt aaa gag tcc cgc ggc gcg cac cag cgt ctg gac gaa ggt2056Met Ala Arg Lys Glu Ser Arg Gly Ala His Gln Arg Leu Asp Glu Gly525 530 535tgc acc gag cgt gac gac gtc aac ttc ctc aaa cac acc ctc gcc ttc2104Cys Thr Glu Arg Asp Asp Val Asn Phe Leu Lys His Thr Leu Ala Phe540 545 550 555cgc gat gct gat ggc acg act cgc ctg gag tac agc gac gtg aag att2152Arg Asp Ala Asp Gly Thr Thr Arg Leu Glu Tyr Ser Asp Val Lys Ile560 565 570act acg ctg ccg cca gct aaa cgc gtt tac ggt ggc gaa gcg gat gca2200Thr Thr Leu Pro Pro Ala Lys Arg Val Tyr Gly Gly Glu Ala Asp Ala575 580 585gcc gat aag gcg gaa gca gcc aat aag aag gag aag gcg a atg gct gag 2249Ala Asp Lys Ala Glu Ala Ala Asn Lys Lys Glu Lys Ala Met Ala Glu590 595 600atg aaa aac ctg aaa att gag gtg gtg cgc tat aac ccg aaa gtc gat2297Met Lys Asn Leu Lys Ile Glu Val Val Arg Tyr Asn Pro Lys Val Asp605 610 615acc gca ccg cat agc gca ttc tat gaa gtg cct tat gac gca act acc2345Thr Ala Pro His Ser Ala Phe Tyr Glu Val Pro Tyr Asp Ala Thr Thr620 625 630 635tca tta ctg gat gcg ctg ggc tac atc aaa gac aac ctg gca ccg gac2393Ser Leu Leu Asp Ala Leu Gly Tyr Ile Lys Asp Asn Leu Ala Pro Asp640 645 650ctg agc tac cgc tgg tcc tgc cgt atg gcg att tgt ggt tcc tgc ggc2441Leu Ser Tyr Arg Trp Ser Cys Arg Met Ala Ile Cys Gly Ser Cys Gly655 660 665atg atg gtt aac aac gtg cca aaa ctg gca tgt aaa acc ttc ctg cgt2489Met Met Val Asn Asn Val Pro Lys Leu Ala Cys Lys Thr Phe Leu Arg670 675 680gat tac acc gac ggt atg aag gtt gaa gcg tta gct aac ttc ccg att2537Asp Tyr Thr Asp Gly Met Lys Val Glu Ala Leu Ala Asn Phe Pro Ile685 690 695gaa cgc gat ctg gtg gtc gat atg acc cac ttc atc gaa agt ctg gaa2585Glu Arg Asp Leu Val Val Asp Met Thr His Phe Ile Glu Ser Leu Glu700 705 710 715gcg atc aaa ccg tac atc atc ggc aac tcc cgc acc gcg gat cag ggt2633Ala Ile Lys Pro Tyr Ile Ile Gly Asn Ser Arg Thr Ala Asp Gln Gly720 725 730act aac atc cag acc ccg gcg cag atg gcg aag tat cac cag ttc tcc2681Thr Asn Ile Gln Thr Pro Ala Gln Met Ala Lys Tyr His Gln Phe Ser735 740 745ggt tgc atc aac tgt ggt ttg tgc tac gcc gcg tgc ccg cag ttt ggc2729Gly Cys Ile Asn Cys Gly Leu Cys Tyr Ala Ala Cys Pro Gln Phe Gly
750 755 760ctg aac cca gag ttc atc ggt ccg gct gcc att acg ctg gcg cat cgt2777Leu Asn Pro Glu Phe Ile Gly Pro Ala Ala Ile Thr Leu Ala His Arg765 770 775tat aac gaa gat agc cgc gac cac ggt aag aag gag cgt atg gcg cag2825Tyr Asn Glu Asp Ser Arg Asp His Gly Lys Lys Glu Arg Met Ala Gln780 785 790 795ttg aac agc cag aac ggc gta tgg agc tgt act ttc gtg ggc tac tgc2873Leu Asn Ser Gln Asn Gly Val Trp Ser Cys Thr Phe Val Gly Tyr Cys800 805 810tcc gaa gtc tgc ccg aaa cac gtc gat ccg gct gcg gcc att cag cag2921Ser Glu Val Cys Pro Lys His Val Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gln Gln815 820 825ggc aaa gta gaa agt tcg aaa gac ttt ctt atc gcg acc ctg aaa cca2969Gly Lys Val Glu Ser Ser Lys Asp Phe Leu Ile Ala Thr Leu Lys Pro830 835 840cgc taa ggagtgcaac atg acg act aaa cgt aaa ccg tat gta cgg cca 3018ArgMet Thr Thr Lys Arg Lys Pro Tyr Val Arg Pro845 850 855atg acg tcc acc tgg tgg aaa aaa ttg ccg ttt tat cgc ttt tac atg3066Met Thr Ser Thr Trp Trp Lys Lys Leu Pro Phe Tyr Arg Phe Tyr Met860 865 870ctg cgc gaa ggc acg gcg gtt ccg gct gtg tgg ttc agc att gaa ctg3114Leu Arg Glu Gly Thr Ala Val Pro Ala Val Trp Phe Ser Ile Glu Leu875 880 885att ttc ggg ctg ttt gcc ctg aaa aat ggc ccg gaa gcc tgg gcg gga3162Ile Phe Gly Leu Phe Ala Leu Lys Asn Gly Pro Glu Ala Trp Ala Gly890 895 900ttc gtc gac ttt tta caa aac ccg gtt atc gtg atc att aac ctg atc3210Phe Val Asp Phe Leu Gln Asn Pro Val Ile Val Ile Ile Asn Leu Ile905 910 915act ctg gcg gca gct ctg ctg cac acc aaa acc tgg ttt gaa ctg gca3258Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu His Thr Lys Thr Trp Phe Glu Leu Ala920 925 930 935ccg aaa gcg gcc aat atc att gta aaa gac gaa aaa atg gga cca gag3306Pro Lys Ala Ala Asn Ile Ile Val Lys Asp Glu Lys Met Gly Pro Glu940 945 950cca att atc aaa agt ctc tgg gcg gta act gtg gtt gcc acc atc gta3354Pro Ile Ile Lys Ser Leu Trp Ala Val Thr Val Val Ala Thr Ile Val955 960 965atc ctg ttt gtt gcc ctg tac tgg taa ggagcctgag atg att aat cca 3403Ile Leu Phe Val Ala Leu Tyr TrpMet Ile Asn Pro970 975aat cca aag cgt tct gac gaa ccg gta ttc tgg ggc ctc ttc ggg gcc3451Asn Pro Lys Arg Ser Asp Glu Pro Val Phe Trp Gly Leu Phe Gly Ala980 985 990 995ggt ggt atg tgg agc gcc atc att gcg ccg gtg atg atc ctg ctg 3496Gly Gly Met Trp Ser Ala Ile Ile Ala Pro Val Met Ile Leu Leu1000 1005 1010gtg ggt att ctg ctg cca ctg ggg ttg ttt ccg ggt gat gcg ctg 3541Val Gly Ile Leu Leu Pro Leu Gly Leu Phe Pro Gly Asp Ala Leu1015 1020 1025agc tac gag cgc gtt ctg gcg ttc gcg cag agc ttc att ggt cgc 3586Ser Tyr Glu Arg Val Leu Ala Phe Ala Gln Ser Phe Ile Gly Arg1030 1035 1040gta ttc ctg ttc ctg atg atc gtt ctg ccg ctg tgg tgt ggt tta 3631Val Phe Leu Phe Leu Met Ile Val Leu Pro Leu Trp Cys Gly Leu1045 1050 1055cac cgt atg cac cac gcg atg cac gat ctg aaa atc cac gta cct 3676
His Arg Met His His Ala Met His Asp Leu Lys Ile His Val Pro1060 1065 1070gcg ggc aaa tgg gtt ttc tac ggt ctg gct gct atc ctg aca gtt 3721Ala Gly Lys Trp Val Phe Tyr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Thr Val1075 1080 1085gtc acg ctg att ggt gtc gtt aca atc taa cgcatcgcca atgtaaatcc 3771Val Thr Leu Ile Gly Val Val Thr Ile1090ggcccgccta tggcgggccg ttttgtatgg aaaccagacc ctatgttcaa aacgacgctc 3831tgcgcctttt aatacc 3847<210>20<211>600<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>20Val Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Ala Gly Gly Ala1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala Asn Pro Asn Ala Lys20 25 30Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg Ser His Thr Val Ala35 40 45Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp His Asp Ser Phe Glu50 55 60Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp Trp Leu Cys Glu Gln65 70 75 80Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro Thr Glu Met Thr Gln85 90 95Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg Pro Asp Gly Ser Val100 105 110Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu Arg Thr Trp Phe Ala115 120 125Ala Asp Lys Thr Gly Phe His Met Leu His Thr Leu Phe Gln Thr Ser130 135 140Leu Gln Phe Pro Gln Ile Gln Arg Phe Asp Glu His Phe Val Leu Asp145 150 155 160Ile Leu Val Asp Asp Gly His Val Arg Gly Leu Val Ala Met Asn Met165 170 175Met Glu Gly Thr Leu Val Gln Ile Arg Ala Asn Ala Val Val Met Ala180 185 190Thr Gly Gly Ala Gly Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Thr Asn Gly Gly Ile195 200 205Val Thr Gly Asp Gly Met Gly Met Ala Leu Ser His Gly Val Pro Leu210 215 220Arg Asp Met Glu Phe Val Gln Tyr His Pro Thr Gly Leu Pro Gly Ser225 230 235 240Gly Ile Leu Met Thr Glu Gly Cys Arg Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val245 250 255Asn Lys Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Gln Asp Tyr Gly Met Gly Pro Glu260 265 270Thr Pro Leu Gly Glu Pro Lys Asn Lys Tyr Met Glu Leu Gly Pro Arg275 280 285Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe Trp His Glu Trp Arg Lys Gly Asn Thr290 295 300Ile Ser Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Tyr Leu Asp Leu Arg His Leu305 310 315 320Gly Glu Lys Lys Leu His Glu Arg Leu Pro Phe Ile Cys Glu Leu Ala
325 330 335Lys Ala Tyr Val Gly Val Asp Pro Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Arg340 345 350Pro Thr Ala His Tyr Thr Met Gly Gly Ile Glu Thr Asp Gln Asn Cys355 360 365Glu Thr Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ala Val Gly Glu Cys Ser Ser Val370 375 380Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ser Asn Ser Leu Ala Glu Leu385 390 395 400Val Val Phe Gly Arg Leu Ala Gly Glu Gln Ala Thr Glu Arg Ala Ala405 410 415Thr Ala Gly Asn Gly Asn Glu Ala Ala Ile Glu Ala Gln Ala Ala Gly420 425 430Val Glu Gln Arg Leu Lys Asp Leu Val Asn Gln Asp Gly Gly Glu Asn435 440 445Trp Ala Lys Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ala Met Glu Glu Gly Cys450 455 460Gly Ile Tyr Arg Thr Pro Glu Leu Met Gln Lys Thr Ile Asp Lys Leu465 470 475 480Ala Glu Leu Gln Glu Arg Phe Lys Arg Val Arg Ile Thr Asp Thr Ser485 490 495Ser Val Phe Asn Thr Asp Leu Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Gly His Gly500 505 510Leu Asn Val Ala Glu Cys Met Ala His Ser Ala Met Ala Arg Lys Glu515 520 525Ser Arg Gly Ala His Gln Arg Leu Asp Glu Gly Cys Thr Glu Arg Asp530 535 540Asp Val Asn Phe Leu Lys His Thr Leu Ala Phe Arg Asp Ala Asp Gly545 550 555 560Thr Thr Arg Leu Glu Tyr Ser Asp Val Lys Ile Thr Thr Leu Pro Pro565 570 575Ala Lys Arg Val Tyr Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ala Asp Lys Ala Glu580 585 590Ala Ala Asn Lys Lys Glu Lys Ala595 600<210>21<211>244<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>21Met Ala Glu Met Lys Asn Leu Lys Ile Glu Val Val Arg Tyr Asn Pro1 5 10 15Lys Val Asp Thr Ala Pro His Ser Ala Phe Tyr Glu Val Pro Tyr Asp20 25 30Ala Thr Thr Ser Leu Leu Asp Ala Leu Gly Tyr Ile Lys Asp Asn Leu35 40 45Ala Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Trp Ser Cys Arg Met Ala Ile Cys Gly50 55 60Ser Cys Gly Met Met Val Asn Asn Val Pro Lys Leu Ala Cys Lys Thr65 70 75 80Phe Leu Arg Asp Tyr Thr Asp Gly Met Lys Val Glu Ala Leu Ala Asn85 90 95Phe Pro Ile Glu Arg Asp Leu Val Val Asp Met Thr His Phe Ile Glu100 105 110Ser Leu Glu Ala Ile Lys Pro Tyr Ile Ile Gly Asn Ser Arg Thr Ala115 120 125
Asp Gln Gly Thr Asn Ile Gln Thr Pro Ala Gln Met Ala Lys Tyr His130 135 140Gln Phe Ser Gly Cys Ile Asn Cys Gly Leu Cys Tyr Ala Ala Cys Pro145 150 155 160Gln Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ile Gly Pro Ala Ala Ile Thr Leu165 170 175Ala His Arg Tyr Asn Glu Asp Ser Arg Asp His Gly Lys Lys Glu Arg180 185 190Met Ala Gln Leu Asn Ser Gln Asn Gly Val Trp Ser Cys Thr Phe Val195 200 205Gly Tyr Cys Ser Glu Val Cys Pro Lys His Val Asp Pro Ala Ala Ala210 215 220Ile Gln Gln Gly Lys Val Glu Ser Ser Lys Asp Phe Leu Ile Ala Thr225 230 235 240Leu Lys Pro Arg<210>22<211>131<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>22Met Thr Thr Lys Arg Lys Pro Tyr Val Arg Pro Met Thr Ser Thr Trp1 5 10 15Trp Lys Lys Leu Pro Phe Tyr Arg Phe Tyr Met Leu Arg Glu Gly Thr20 25 30Ala Val Pro Ala Val Trp Phe Ser Ile Glu Leu Ile Phe Gly Leu Phe35 40 45Ala Leu Lys Asn Gly Pro Glu Ala Trp Ala Gly Phe Val Asp Phe Leu50 55 60Gln Asn Pro Val Ile Val Ile Ile Asn Leu Ile Thr Leu Ala Ala Ala65 70 75 80Leu Leu His Thr Lys Thr Trp Phe Glu Leu Ala Pro Lys Ala Ala Asn85 90 95Ile Ile Val Lys Asp Glu Lys Met Gly Pro Glu Pro Ile Ile Lys Ser100 105 110Leu Trp Ala Val Thr Val Val Ala Thr Ile Val Ile Leu Phe Val Ala115 120 125Leu Tyr Trp130<210>23<211>119<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>23Met Ile Asn Pro Asn Pro Lys Arg Ser Asp Glu Pro Val Phe Trp Gly1 5 10 15Leu Phe Gly Ala Gly Gly Met Trp Ser Ala Ile Ile Ala Pro Val Met20 25 30Ile Leu Leu Val Gly Ile Leu Leu Pro Leu Gly Leu Phe Pro Gly Asp35 40 45Ala Leu Ser Tyr Glu Arg Val Leu Ala Phe Ala Gln Ser Phe Ile Gly50 55 60Arg Val Phe Leu Phe Leu Met Ile Val Leu Pro Leu Trp Cys Gly Leu
65 70 75 80His Arg Met His His Ala Met His Asp Leu Lys Ile His Val Pro Ala85 90 95Gly Lys Trp Val Phe Tyr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Thr Val Val Thr100 105 110Leu Ile Gly Val Val Thr Ile115<210>24<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>24atatgaaacc cggtac16<210>25<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>25cgggtttcat atgtac16<210>26<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>26ggttcccggg gaggaggaat cccatgccca acc 33<210>27<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>27ggttcccggg ggcacctacg gtgcaacagt tg 32<210>28<211>4123
<212>DNA<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<220>
<221>CDS<222>(363)..(1133)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1153)..(3171)<223>
<220>
<221>CDS<222>(3174)..(3920)<223>
<400>28ggttcccggg ggcacctacg gtgcaacagt tgcgaaaatt gtgtcacctg cgcaaagcct 60tgcttcgatt cggggaattc gggtgtctaa actttttgat tgataccaaa cggggttaga 120aactgttcgg atcggtatcc tgtgaggaag ctcaccttgg ttttagaatg ttgaaaaagc 180ctcaggtttc cgcaggtaga gcacactcaa ttaaatgagc gtcaaacgac aataaagtaa 240ggctacccta ataagtgggg ttttatgcct ctaaatagcc agttgggggc ggtaggggag 300cgtcccatga ctggttaatg cctcgatctg ggacgtacag taacaacgac actggaggtg 360cc atg act gtt aga aat ccc gac cgt gag gca atc cgt cac gga aaa 407Met Thr Val Arg Asn Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg His Gly Lys1 5 10 15att acg acg gag gcg ctg cgt gag cgt ccc gca tac ccg acc tgg gca455Ile Thr Thr Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Tyr Pro Thr Trp Ala20 25 30atg aag ctg acc atg gcc atc act ggc cta atc ttc ggt ggc ttc gtt503Met Lys Leu Thr Met Ala Ile Thr Gly Leu Ile Phe Gly Gly Phe Val35 40 45ctt gtt cac atg atc gga aac ctg aaa atc ttc atg ccg gac tac gca551Leu Val His Met Ile Gly Asn Leu Lys Ile Phe Met Pro Asp Tyr Ala50 55 60gcc gat tct gcg cat ccg ggt gaa gca caa gta gat gtc tac ggc gag599Ala Asp Ser Ala His Pro Gly Glu Ala Gln Val Asp Val Tyr Gly Glu65 70 75ttc ctg cgc gag atc gga tcc ccg atc ctc cca cac ggc tca gtc ctc647Phe Leu Arg Glu Ile Gly Ser Pro Ile Leu Pro His Gly Ser Val Leu80 85 90 95tgg atc cta cgt att atc ctg ctg gtc gca ttg gtt ctg cac atc tac695Trp Ile Leu Arg Ile Ile Leu Leu Val Ala Leu Val Leu His Ile Tyr100 105 110tgt gca ttc gca ttg acc ggc cgt tct cac cag tct cgc gga aag ttc743Cys Ala Phe Ala Leu Thr Gly Arg Ser His Gln Ser Arg Gly Lys Phe115 120 125cgc cgt acc aac ctc gtt ggc ggc ttc aac tcc ttc gcg acc cgc tcc791Arg Arg Thr Asn Leu Val Gly Gly Phe Asn Ser Phe Ala Thr Arg Ser130 135 140atg ctg gtg acc gga atc gtt ctc ctt gcg ttc att atc ttc cac atc839Met Leu Val Thr Gly Ile Val Leu Leu Ala Phe Ile Ile Phe His Ile145 150 155ctc gac ctg acc atg ggt gtt gct cca gca gcc cca acc tca ttc gag887Leu Asp Leu Thr Met Gly Val Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Phe Glu160 165 170 175cac ggc gaa gta tac gca aac atg gtg gct tcc ttt agc cgc tgg cct935
His Gly Glu Val Tyr Ala Asn Met Val Ala Ser Phe Ser Arg Trp Pro180 185 190gta gca att tgg tac atc att gcc aac ctg gtc ctg ttc gtc cac ctg983Val Ala Ile Trp Tyr Ile Ile Ala Asn Leu Val Leu Phe Val His Leu195 200 205tct cac ggc atc tgg ctt gca gtc tct gac ctg gga atc acc gga cgt1031Ser His Gly Ile Trp Leu Ala Val Ser Asp Leu Gly Ile Thr Gly Arg210 215 220cgc tgg agg gca atc ctc ctc gca gtt gcg tac atc gtt cct gca ctg1079Arg Trp Arg Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Tyr Ile Val Pro Ala Leu225 230 235gtc ctg atc ggc aac atc acc att ccg ttc gcc atc gct gtt ggc tgg1127Val Leu Ile Gly Asn Ile Thr Ile Pro Phe Ala Ile Ala Val Gly Trp240 245 250 255att gcg taaaggttag gaagaattt atg agc act cac tct gaa acc acc cgc 1179Ile Ala Met Ser Thr His Ser Glu Thr Thr Arg260 265cca gag ttc atc cac cca gtc tcc gtc ctc cca gag gtc tca gct ggt1227Pro Glu Phe Ile His Pro Val Ser Val Leu Pro Glu Val Ser Ala Gly270 275 280acg gtc ctt gac gct gca gag cca gct ggt gtt ccc acc aaa gac atg1275Thr Val Leu Asp Ala Ala Glu Pro Ala Gly Val Pro Thr Lys Asp Met285 290 295tgg gaa tac caa aaa gac cac atg aac ctg gtc tcc cca ctg aac cga1323Trp Glu Tyr Gln Lys Asp His Met Asn Leu Val Ser Pro Leu Asn Arg300 305 310cgc aag ttc cgc gtc ctc gtc gtc ggc acc ggc ctg tcc ggt ggc gct1371Arg Lys Phe Arg Val Leu Val Val Gly Thr Gly Leu Ser Gly Gly Ala315 320 325 330gca gca gca gcc ctc ggc gaa ctc gga tac gac gtc aag gcg ttc acc1419Ala Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Asp Val Lys Ala Phe Thr335 340 345tac cac gac gca cct cgc cgt gcg cac tcc att gct gcg cag ggt ggc1467Tyr His Asp Ala Pro Arg Arg Ala His Ser Ile Ala Ala Gln Gly Gly350 355 360gtt aac tcc gcc cgc ggc aag aag gta gac aac gac ggc gca tac cgc1515Val Asn Ser Ala Arg Gly Lys Lys Val Asp Asn Asp Gly Ala Tyr Arg365 370 375cac gtc aag gac acc gtc aag ggc ggc gac tac cgt ggc cgc gag tcc1563His Val Lys Asp Thr Val Lys Gly Gly Asp Tyr Arg Gly Arg Glu Ser380 385 390gac tgc tgg cgt ctc gcc gtc gag tcc gtc cgc gtc atc gac cac atg1611Asp Cys Trp Arg Leu Ala Val Glu Ser Val Arg Val Ile Asp His Met395 400 405 410aat gcc atc ggt gcg cca ttc gcc cgc gaa tac ggt ggc gcc ttg gca1659Asn Ala Ile Gly Ala Pro Phe Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Ala Leu Ala415 420 425acc cgt tcc ttc ggt ggt gtg cag gtc tcc cgt acc tac tac acc cgt1707Thr Arg Ser Phe Gly Gly Val Gln Val Ser Arg Thr Tyr Tyr Thr Arg430 435 440gga caa acc gga cag cag ctg cag ctc tcc acc gca tcc gca cta cag1755Gly Gln Thr Gly Gln Gln Leu Gln Leu Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gln445 450 455cgc cag atc cac ctc ggc tcc gta gag atc ttc acc cac aac gaa atg1803Arg Gln Ile His Leu Gly Ser Val Glu Ile Phe Thr His Asn Glu Met460 465 470gtt gac gtc att gtc acc gaa cgt aat ggt gaa aag cgc tgc gaa ggc1851Val Asp Val Ile Val Thr Glu Arg Asn Gly Glu Lys Arg Cys Glu Gly475 480 485 490
ctg atc atg cgc aac ctg atc acc ggc gag ctc acc gca cac acc ggc1899Leu Ile Met Arg Asn Leu Ile Thr Gly Glu Leu Thr Ala His Thr Gly495 500 505cat gcc gtt atc ctg gca acc ggt ggt tac ggc aac gtg tac cac atg1947His Ala Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Tyr Gly Asn Val Tyr His Met510 515 520tcc acc ctg gcg aag aac tcc aac gcc tcg gcc atc atg cgt gca tac1995Ser Thr Leu Ala Lys Asn Ser Asn Ala Ser Ala Ile Met Arg Ala Tyr525 530 535gaa gcc ggc gca tac ttc gcg tcc cca tcg ttc atc cag ttc cac cca2043Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Ala Ser Pro Ser Phe Ile Gln Phe His Pro540 545 550acc ggc ctg cct gtg aac tcc acc tgg cag tcc aag acc att ctg atg2091Thr Gly Leu Pro Val Asn Ser Thr Trp Gln Ser Lys Thr Ile Leu Met555 560 565 570tcc gag tcg ctg cgt aac gac ggc cgc atc tgg tcc cct aag gaa ccg2139Ser Glu Ser Leu Arg Asn Asp Gly Arg Ile Trp Ser Pro Lys Glu Pro575 580 585aac gat aac cgc gat cca aac acc atc cct gag gat gag cgc gac tac2187Asn Asp Asn Arg Asp Pro Asn Thr Ile Pro Glu Asp Glu Arg Asp Tyr590 595 600ttc ctg gag cgc cgc tac cca gca ttc ggt aac ctc gtc cca cgt gac2235Phe Leu Glu Arg Arg Tyr Pro Ala Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Asp605 610 615gtt gct tcc cgt gcg atc tcc cag cag atc aac gct ggt ctc ggt gtt2283Val Ala Ser Arg Ala Ile Ser Gln Gln Ile Asn Ala Gly Leu Gly Val620 625 630gga cct ctg aac aac gct gca tac ctg gac ttc cgc gac gcc acc gag2331Gly Pro Leu Asn Asn Ala Ala Tyr Leu Asp Phe Arg Asp Ala Thr Glu635 640 645 650cgt ctc gga cag gac acc atc cgc gag cgt tac tcc aac ctc ttc acc2379Arg Leu Gly Gln Asp Thr Ile Arg Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Phe Thr655 660 665atg tac gaa gag gcc att ggc gag gac cca tac tcc agc cca atg cgt2427Met Tyr Glu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Pro Met Arg670 675 680att gca ccg acc tgc cac ttc acc atg ggt ggc ctc tgg act gac ttc2475Ile Ala Pro Thr Cys His Phe Thr Met Gly Gly Leu Trp Thr Asp Phe685 690 695aac gaa atg acg tca ctc cca ggt ctg ttc tgt gca ggc gaa gca tcc2523Asn Glu Met Thr Ser Leu Pro Gly Leu Phe Cys Ala Gly Glu Ala Ser700 705 710tgg acc tac cac ggt gca aac cgt ctg ggc gca aac tcc ctg ctc tcc2571Trp Thr Tyr His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ala Asn Ser Leu Leu Ser715 720 725 730gct tcc gtc gat ggc tgg ttc acc ctg cca ttc acc gtc cct aac tac2619Ala Ser Val Asp Gly Trp Phe Thr Leu Pro Phe Thr Val Pro Asn Tyr735 740 745ctc ggc cca ttg ctt ggc gcc gag cgt ctg gca gag gac gca cca gaa2667Leu Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Arg Leu Ala Glu Asp Ala Pro Glu750 755 760gcg cag gcg gcg att gag cgt gca cag gct cgc atc gac cgc ctc atg2715Ala Gln Ala Ala Ile Glu Arg Ala Gln Ala Arg Ile Asp Arg Leu Met765 770 775ggc aac cgc cca gag tgg atc ggc gac aac cca cac ggc cct gag tac2763Gly Asn Arg Pro Glu Trp Ile Gly Asp Asn Pro His Gly Pro Glu Tyr780 785 790tac cac cgc cag ctt ggc gat atc ctg tac ttc tcc tgt ggc gtt tct2811Tyr His Arg Gln Leu Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Cys Gly Val Ser
795 800 805 810cga aac gta aag gac ctc cag gac ggt atc gac aag atc cgt gcg ctc2859Arg Asn Val Lys Asp Leu Gln Asp Gly Ile Asp Lys Ile Arg Ala Leu815 820 825cgc gag gac ttc tgg aag aac atg cgc atc acc ggc agc acc gat gag2907Arg Glu Asp Phe Trp Lys Asn Met Arg Ile Thr Gly Ser Thr Asp Glu830 835 840atg aac cag gtt ctc gaa tac gca gca cgc gtt gct gat tac atc gac2955Met Asn Gln Val Leu Glu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Asp Tyr Ile Asp845 850 855ctc ggc gaa ctc atg tgc gtc gac gcc ctc gac cgc gac gag tcc tgt3003Leu Gly Glu Leu Met Cys Val Asp Ala Leu Asp Arg Asp Glu Ser Cys860 865 870ggc gcc cac ttc cgt gac gac cac ctc tcc gaa gac ggc gaa gca gaa3051Gly Ala His Phe Arg Asp Asp His Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Glu875 880 885 890cgt gac gac gaa aac tgg tgc ttc gtc tcc gca tgg gaa cca ggc aag3099Arg Asp Asp Glu Asn Trp Cys Phe Val Ser Ala Trp Glu Pro Gly Lys895 900 905aac gga acc ttc gtc cgc cac gca gaa cca ctg ttc ttc gaa tcc gtc3147Asn Gly Thr Phe Val Arg His Ala Glu Pro Leu Phe Phe Glu Ser Val910 915 920cca ctg cag aca agg aac tac aag ta atg aaa ctt aca ctt gag atc 3194Pro Leu Gln Thr Arg Asn Tyr LysMet Lys Leu Thr Leu Glu Ile925 930935tgg cgt cag gca ggc cca act gca gaa ggc aag ttc gaa acc gta cgg3242Trp Arg Gln Ala Gly Pro Thr Ala Glu Gly Lys Phe Glu Thr Val Arg940 945 950gtt gac gac gcc gtc gcg cag atg tct atc ctg gaa ctg cta gac cac3290Val Asp Asp Ala Val Ala Gln Met Ser Ile Leu Glu Leu Leu Asp His955 960 965gta aac aac aag ttc atc gaa gaa ggc aag gaa cca ttc gcg ttc gcc3338Val Asn Asn Lys Phe Ile Glu Glu Gly Lys Glu Pro Phe Ala Phe Ala970 975 980 985tct gac tgc cgc gaa ggc atc tgt ggt acc tgt ggt ctc ctc gtg aac 3386Ser Asp Cys Arg Glu Gly Ile Cys Gly Thr Cys Gly Leu Leu Val Asn990 995 1000ggt cgc cct cac ggc gcc gac cag aac aag cct gcc tgt gcg cag 3431Gly Arg Pro His Gly Ala Asp Gln Asn Lys Pro Ala Cys Ala Gln1005 1010 1015cgc ctg gtc agc tac aag gaa ggc gac acc ctt aag att gag cca 3476Arg Leu Val Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Thr Leu Lys Ile Glu Pro1020 1025 1030ctg cgc tcc gcc gca tac cca gtg atc aag gac atg gtc gtc gac 3521Leu Arg Ser Ala Ala Tyr Pro Val Ile Lys Asp Met Val Val Asp1035 1040 1045cgc tcc gca ctg gac cgc gtc atg gaa cag ggt ggc tac gtg acc 3566Arg Ser Ala Leu Asp Arg Val Met Glu Gln Gly Gly Tyr Val Thr1050 1055 1060atc aac gca ggt acc gca cct gac gct gat acc ctc cac gtc aac 3611Ile Asn Ala Gly Thr Ala Pro Asp Ala Asp Thr Leu His Val Asn1065 1070 1075cac gaa acc gca gaa ctc gca ctt gac cac gca gcc tgc atc ggc 3656His Glu Thr Ala Glu Leu Ala Leu Asp His Ala Ala Cys Ile Gly1080 1085 1090tgt ggt gca tgt gtc gct gcc tgc cct aac ggc gca gca cac ctg 3701Cys Gly Ala Cys Val Ala Ala Cys Pro Asn Gly Ala Ala His Leu1095 1100 1105ttc acc ggc gca aag ctt gtt cac ctc tcc ctc ctc cca cta ggt 3746
Phe Thr Gly Ala Lys Leu Val His Leu Ser Leu Leu Pro Leu Gly1110 1115 1120aag gaa gag cgc gga ctg cgt gca cgt aag atg gtt gat gaa atg 3791Lys Glu Glu Arg Gly Leu Arg Ala Arg Lys Met Val Asp Glu Met1125 1130 1135gaa acc aac ttc gga cac tgc tcc ctc tac ggc gag tgc gca gac 3836Glu Thr Asn Phe Gly His Cys Ser Leu Tyr Gly Glu Cys Ala Asp1140 1145 1150gtt tgc ccc gca ggc atc cca ctg acc gct gtg gca gct gtc acc 3881Val Cys Pro Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Val Ala Ala Val Thr1155 1160 1165aaa gaa cgt gcg cgt gca gct ttc cga ggc aaa gac gac tagtctttaa 3930Lys Glu Arg Ala Arg Ala Ala Phe Arg Gly Lys Asp Asp1170 1175tccaagtaag taccggttca gacagttaaa ccagaaagac gagtgaacac catgtcctcc 3990gcgaaaaaga aacccgcacc ggagcgtatg cactacatca agggctatgt acctgtggcg 4050tatagctctc cacactcatc cctcgagcgc agcgcaacct ggttgggcat gggattcctc 4110ctccccggga acc 4123<210>29<211>257<212>PRT<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<400>29Met Thr Val Arg Asn Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg His Gly Lys Ile1 5 10 15Thr Thr Glu Ala Leu Arg Glu Arg Pro Ala Tyr Pro Thr Trp Ala Met20 25 30Lys Leu Thr Met Ala Ile Thr Gly Leu Ile Phe Gly Gly Phe Val Leu35 40 45Val His Met Ile Gly Asn Leu Lys Ile Phe Met Pro Asp Tyr Ala Ala50 55 60Asp Ser Ala His Pro Gly Glu Ala Gln Val Asp Val Tyr Gly Glu Phe65 70 75 80Leu Arg Glu Ile Gly Ser Pro Ile Leu Pro His Gly Ser Val Leu Trp85 90 95Ile Leu Arg Ile Ile Leu Leu Val Ala Leu Val Leu His Ile Tyr Cys100 105 110Ala Phe Ala Leu Thr Gly Arg Ser His Gln Ser Arg Gly Lys Phe Arg115 120 125Arg Thr Asn Leu Val Gly Gly Phe Asn Ser Phe Ala Thr Arg Ser Met130 135 140Leu Val Thr Gly Ile Val Leu Leu Ala Phe Ile Ile Phe His Ile Leu145 150 155 160Asp Leu Thr Met Gly Val Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Phe Glu His165 170 175Gly Glu Val Tyr Ala Asn Met Val Ala Ser Phe Ser Arg Trp Pro Val180 185 190Ala Ile Trp Tyr Ile Ile Ala Asn Leu Val Leu Phe Val His Leu Ser195 200 205His Gly Ile Trp Leu Ala Val Ser Asp Leu Gly Ile Thr Gly Arg Arg210 215 220Trp Arg Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Tyr Ile Val Pro Ala Leu Val225 230 235 240Leu Ile Gly Asn Ile Thr Ile Pro Phe Ala Ile Ala Val Gly Trp Ile245 250 255Ala
<210>30<211>673<212>PRT<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<400>30Met Ser Thr His Ser Glu Thr Thr Arg Pro Glu Phe Ile His Pro Val1 5 10 15Ser Val Leu Pro Glu Val Ser Ala Gly Thr Val Leu Asp Ala Ala Glu20 25 30Pro Ala Gly Val Pro Thr Lys Asp Met Trp Glu Tyr Gln Lys Asp His35 40 45Met Asn Leu Val Ser Pro Leu Asn Arg Arg Lys Phe Arg Val Leu Val50 55 60Val Gly Thr Gly Leu Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Glu65 70 75 80Leu Gly Tyr Asp Val Lys Ala Phe Thr Tyr His Asp Ala Pro Arg Arg85 90 95Ala His Ser Ile Ala Ala Gln Gly Gly Val Asn Ser Ala Arg Gly Lys100 105 110Lys Val Asp Asn Asp Gly Ala Tyr Arg His Val Lys Asp Thr Val Lys115 120 125Gly Gly Asp Tyr Arg Gly Arg Glu Ser Asp Cys Trp Arg Leu Ala Val130 135 140Glu Ser Val Arg Val Ile Asp His Met Asn Ala Ile Gly Ala Pro Phe145 150 155 160Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Ala Leu Ala Thr Arg Ser Phe Gly Gly Val165 170 175Gln Val Ser Arg Thr Tyr Tyr Thr Arg Gly Gln Thr Gly Gln Gln Leu180 185 190Gln Leu Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gln Arg Gln Ile His Leu Gly Ser195 200 205Val Glu Ile Phe Thr His Asn Glu Met Val Asp Val Ile Val Thr Glu210 215 220Arg Asn Gly Glu Lys Arg Cys Glu Gly Leu Ile Met Arg Asn Leu Ile225 230 235 240Thr Gly Glu Leu Thr Ala His Thr Gly His Ala Val Ile Leu Ala Thr245 250 255Gly Gly Tyr Gly Asn Val Tyr His Met Ser Thr Leu Ala Lys Asn Ser260 265 270Asn Ala Ser Ala Ile Met Arg Ala Tyr Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Ala275 280 285Ser Pro Ser Phe Ile Gln Phe His Pro Thr Gly Leu Pro Val Asn Ser290 295 300Thr Trp Gln Ser Lys Thr Ile Leu Met Ser Glu Ser Leu Arg Asn Asp305 310 315 320Gly Arg Ile Trp Ser Pro Lys Glu Pro Asn Asp Asn Arg Asp Pro Asn325 330 335Thr Ile Pro Glu Asp Glu Arg Asp Tyr Phe Leu Glu Arg Arg Tyr Pro340 345 350Ala Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Asp Val Ala Ser Arg Ala Ile Ser355 360 365Gln Gln Ile Asn Ala Gly Leu Gly Val Gly Pro Leu Asn Asn Ala Ala370 375 380Tyr Leu Asp Phe Arg Asp Ala Thr Glu Arg Leu Gly Gln Asp Thr Ile
385 390 395 400Arg Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Phe Thr Met Tyr Glu Glu Ala Ile Gly405 410 415Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Pro Met Arg Ile Ala Pro Thr Cys His Phe420 425 430Thr Met Gly Gly Leu Trp Thr Asp Phe Asn Glu Met Thr Ser Leu Pro435 440 445Gly Leu Phe Cys Ala Gly Glu Ala Ser Trp Thr Tyr His Gly Ala Asn450 455 460Arg Leu Gly Ala Asn Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Asp Gly Trp Phe465 470 475 480Thr Leu Pro Phe Thr Val Pro Asn Tyr Leu Gly Pro Leu Leu Gly Ala485 490 495Glu Arg Leu Ala Glu Asp Ala Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ile Glu Arg500 505 510Ala Gln Ala Arg Ile Asp Arg Leu Met Gly Asn Arg Pro Glu Trp Ile515 520 525Gly Asp Asn Pro His Gly Pro Glu Tyr Tyr His Arg Gln Leu Gly Asp530 535 540Ile Leu Tyr Phe Ser Cys Gly Val Ser Arg Asn Val Lys Asp Leu Gln545 550 555 560Asp Gly Ile Asp Lys Ile Arg Ala Leu Arg Glu Asp Phe Trp Lys Asn565 570 575Met Arg Ile Thr Gly Ser Thr Asp Glu Met Asn Gln Val Leu Glu Tyr580 585 590Ala Ala Arg Val Ala Asp Tyr Ile Asp Leu Gly Glu Leu Met Cys Val595 600 605Asp Ala Leu Asp Arg Asp Glu Ser Cys Gly Ala His Phe Arg Asp Asp610 615 620His Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Glu Arg Asp Asp Glu Asn Trp Cys625 630 635 640Phe Val Ser Ala Trp Glu Pro Gly Lys Asn Gly Thr Phe Val Arg His645 650 655Ala Glu Pro Leu Phe Phe Glu Ser Val Pro Leu Gln Thr Arg Asn Tyr660 665 670Lys<210>31<211>249<212>PRT<213>黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)<400>31Met Lys Leu Thr Leu Glu Ile Trp Arg Gln Ala Gly Pro Thr Ala Glu1 5 10 15Gly Lys Phe Glu Thr Val Arg Val Asp Asp Ala Val Ala Gln Met Ser20 25 30Ile Leu Glu Leu Leu Asp His Val Asn Asn Lys Phe Ile Glu Glu Gly35 40 45Lys Glu Pro Phe Ala Phe Ala Ser Asp Cys Arg Glu Gly Ile Cys Gly50 55 60Thr Cys Gly Leu Leu Val Asn Gly Arg Pro His Gly Ala Asp Gln Asn65 70 75 80Lys Pro Ala Cys Ala Gln Arg Leu Val Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Thr85 90 95Leu Lys Ile Glu Pro Leu Arg Ser Ala Ala Tyr Pro Val Ile Lys Asp
100 105 110Met Val Val Asp Arg Ser Ala Leu Asp Arg Val Met Glu Gln Gly Gly115 120 125Tyr Val Thr Ile Asn Ala Gly Thr Ala Pro Asp Ala Asp Thr Leu His130 135 140Val Asn His Glu Thr Ala Glu Leu Ala Leu Asp His Ala Ala Cys Ile145 150 155 160Gly Cys Gly Ala Cys Val Ala Ala Cys Pro Asn Gly Ala Ala His Leu165 170 175Phe Thr Gly Ala Lys Leu Val His Leu Ser Leu Leu Pro Leu Gly Lys180 185 190Glu Glu Arg Gly Leu Arg Ala Arg Lys Met Val Asp Glu Met Glu Thr195 200 205Asn Phe Gly His Cys Ser Leu Tyr Gly Glu Cys Ala Asp Val Cys Pro210 215 220Ala Gly Ile Pro Leu Thr Ala Val Ala Ala Val Thr Lys Glu Arg Ala225 230 235 240Arg Ala Ala Phe Arg Gly Lys Asp Asp24权利要求
1.产生琥珀酸的方法，其包括使经过修饰以增加延胡索酸还原酶活性的细菌或其细胞处理物与有机原料在含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气中的反应溶液中进行反应以生成琥珀酸；和收集所述的琥珀酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的细菌选自棒状细菌、芽孢杆菌属细菌或根瘤菌属细菌。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细菌是经过修饰以通过应用来自棒状细菌的琥珀酸脱氢酶基因增加延胡索酸还原酶活性的细菌。
4.权利要求1或2的方法，其中所述细菌是经过修饰以通过应用来自大肠杆菌的延胡索酸还原酶基因增加延胡索酸还原酶活性的细菌。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述细菌被进一步修饰以将乳酸脱氢酶活性与未修饰的菌株相比减少到10％或更低。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述细菌被进一步修饰以增加丙酮酸羧化酶活性。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述细菌或其细胞处理物与所述有机原料在厌氧条件下进行反应。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述有机原料为葡萄糖。
9.产生含有琥珀酸的聚合物的方法，其包括通过权利要求1至8中任一项的方法产生琥珀酸，和将得到的琥珀酸进行聚合。
全文摘要
通过使经过修饰以增加延胡索酸还原酶活性的细菌或其处理物与有机原料在含有碳酸根离子、碳酸氢根离子和二氧化碳气中的反应溶液中进行反应以生成琥珀酸来产生琥珀酸。更优选地，通过使经过修饰以增加延胡索酸还原酶和丙酮酸羧化酶活性并降低乳酸脱氢酶活性的细菌或其处理物与有机原料在含有碳酸根离子、碳酸氢根离子和二氧化碳气中的反应溶液中进行反应以生成琥珀酸来产生琥珀酸。琥珀酸通过收集所产生的琥珀酸来获得。
文档编号C12N15/09GK1875108SQ20048003202
公开日2006年12月6日 申请日期2004年8月27日 优先权日2003年8月28日
发明者村瀬诚, 青山龙介, 生田美树, 山岸兼治, 守屋美加, 中村纯, 児岛宏之 申请人:三菱化学株式会社, 味之素株式会社