专利名称：：用于处理食物的乳酸细菌的制作方法用于处理食物的乳酸细菌本发明是提交于2004年6月18日的美国系列号10/870,032和作为提交于2003年6月20日的加拿大专利申请号2,432,907的继续申请的、提交于2004年6月18日的国际申请号PCT/CA2004/000909的部分继续申请；和提交于2003年6月27日的国际申请号PCT/CA03/00986的部分继续申请。I.发明领域本发明涉及产生具有抗微生物活性的细菌素分子的CamWacto^wma/toram如'cMm的新菌株。本发明的细菌和由所述细菌或其它细菌产生的细菌素可以用于处理食物并作为食物防腐剂。在本发明的具体应用中，将细菌素和产生所述细菌素的细菌菌株用于控制病原菌，而不会损害肉的贮存期限，所述病原菌包括但不限于肉产品中的单核细胞增生李斯特氏菌II.发明背景Camo^cfen'wwma/torama"cww是多种细菌中的一个种属，其被分类为乳酸细菌(LAB)。数个世纪以来，已经将LAB用在食物和产生发酵食物的奶制品工业中。在这种生产中重要的是它们产生提高芳香味和风味的化合物的能力(Stiles和Holzapfd，1997;Carr等.，2002)。由它们从发酵碳水化合物产生乳酸的多种异构体的能力对LAB迸行了表征。非典型的肉杆菌是独特的，因为尽管能够从葡萄糖产生实际上纯的L(+)-乳酸，它们不能在pH5.6时生长在乙酸盐琼脂上，并且因为它们能够发酵甘油和甘露醇，在乳酸细菌中独特的性质(Holzapfel和Gerber，1983;Shaw和Harding,1984)。C.m/torawflWc"m可以抑制可能的病原菌的一种方法是通过产生细菌素。细菌素是通过核糖体合成的能够杀死紧密相关的细菌的低分子量的抗菌蛋白质性的物质(Klaenhammer,1993)。细菌素已经从牛肉，腐败的火腿，以及从法式霉菌熟化的软奶酪中分离(Jack等，1996;Herbin等，1997)。因为细菌素从通常包含LAB的食物诸如肉和奶制品中分离，LAB和细菌素二者都己经被消费了数个世纪。从C.ww/tow仿a"CMm产生的细菌素已经显示对于蛋白水解酶是敏感的。来自C.w"/torawa"cMwLV17的细菌素在62"C热处理，煮沸30分钟过程中以及在121。C髙压灭菌15分钟后是稳定的。胰蛋白酶，I、IV、VIII、XIV型蛋白酶，a-胰凝乳蛋白酶，e-胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶使细菌素失活，而非蛋白水解酶则不会(Ahn和Stiles,1990b)。Piscicolin126，一种由C.ma/taTOma"cwwJG126产生的细菌素被a-和P-胰凝乳蛋白酶，蛋白酶(I,XIV，XXIII型和胰蛋白酶)失活，但是过氧化氢酶，脂肪酶或溶菌酶没有这种效果(Jack等，1996)。类似地，由Cw"/torow幼'cwwLV61产生的细菌素抗热(10(TC，20分钟)，但是被a-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶和蛋白酶K所钝化。用过氧化氢酶，a-淀粉酶，脂肪酶，磷脂酶C，DNaseI和溶菌酶处理没有影响抗菌活性(Schillinger等，1993)。该证据显示细菌素的摄入不会对有益的肠道微生物造成影响。已经显示胰蛋白酶使细菌素，乳链菌肽失活(Hara等，1962)。对于具有新的和有用特性的新的食物防腐剂存在持续的需要。此外，对于用有效的"天然"防腐剂，尤其是抑制病原微生物的那些取代常用的"化学"食物防腐剂存在越来越浓厚的兴趣。在这方面，已经对已知为细菌素的细菌蛋白质进行了相当多的研究，其通常具有热稳定性并具有抗微生物活性。近年来，在开发针对与食物相关的腐败和病原性微生物具有拮抗活性的微生物代谢物方面取得了很大进展。目前存在许多细菌素，但是仅有少数被充分表征并针对食物应用进行了评估。此外，消费者目前强调最低程度进行处理的食物，其是天然的并且无防腐剂。由此，对于应用化学添加剂作为食物防腐剂存在相当大的阻力。目前正在研究将由微生物产生的其它生物抑制剂用在食物中。特别感兴趣的是抗菌物质诸如由乳酸细菌("LAB")产生的细菌素。细菌素是由LAB作为它们代谢的正常副产物产生的抗菌肽和蛋白质，其可能是非常有吸引力的天然防腐剂。许多LAB是被充分了解的，在工业上重要的细菌，其包括乳球菌属(iLa"ococc"》，链球菌属(5^印tococcM),片球菌属(尸eAococcw),明串珠菌属(Z^Mco"otoc),乳杆菌属(丄actokzc/〃w力和肉杆菌属(CamM"cter/聽)。己经将它们用于在数千年间被安全消费的发酵食物的生产中。因为它们已经达到作为"安全"微生物的状态，它们是天然抗微生物物质，诸如细菌素的特别适合的来源，并且用于食物中。细菌素可以具有宽泛或窄小的抗菌活性谱，并且不会致死产生它们的细胞。细菌通过产生免疫蛋白质来保护它们免于它们本身的细菌素的致死效应。C.,"Wtoram如'cMm是革兰氏阳性，非运动性，非形成孢子的杆形细菌，最近已经将其由乳杆菌属重新定义到肉杆菌属。已经指出C.m"/tora/m^'cMw是大且多样的产乳酸细菌群的其中一种，其代谢葡萄糖产乳酸和抑制一些病原菌生长的其它酸。C.ma/torama"cww首先在鲑鱼上发现，但是自此在从肉类和鱼到水果和蔬菜的各种食品中发现，以超过lX107dU/g的水平通过目前的农业实践生产和贮存。已经将乳酸细菌用于食品(例如，酸奶，香肠，蔬菜，面包，酒，奶酪和牛奶)的发酵和防腐达数个世纪。在法国已经将C.wa/torom油'c用作香肠发酵中的起始细菌培养物的部分。尽管应用了上述天然防腐剂，仍旧存在对能够在特定食品中控制病原性和腐败菌的乳酸细菌和它们的细菌素的需要。III.发明概述本发明涉及产细菌素的Cm""o6acfen."mAM"/toramG!"ci/m("C.的新菌株，其以前已知为栖鱼肉杆菌(a^朋Z)a"en'Mmp^co/fl)("C./^d/a")，具有优越的抗微生物活性。本发明的新菌株CB1,CB2,和CB3产生多种细菌素，包括肉杆菌素(Camobacteriocin)BM1禾口piscicolin126。这些细菌素具有宽泛的抗李斯特菌属细菌的活性谱，并且生产菌株生长在冷冻温度并且不会导致与其它类似相关的腐败微生物相关的或在食物的典型贮存期限内的食物腐败。本发明的实施方案包括在即食(RTE)和新鲜冷装，加工的肉产品中，优选以1x104菌落形成单位(cfU)/g的最大接种浓度用作防腐剂的Ga^7zoZ)(3!cfen'Mmw7a/faroma/7'cww菌株CB1，CB2，CB3，LV17,UAL26，ATCC35586和ATCC43225。本发明的实施方案包括通过将Cwa/torawa"ciW7，其经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物，或其组合应用到食物中来处理新鲜食物的方法。在本发明的这些实施方案中，细菌和其经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物产生可预测的或受控制的贮藏期限。在本发明的优选的实施方案中，用天然细菌和其经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物，或由不同的细菌产生的一种或多种细菌素发酵物的组合处理食物。在本发明的最优选的实施方案中，用选定的天然细菌和选定的天然细菌培养物的经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物的组合来处理食物。本发明的实施方案包括使用本发明的组合物来进一步保护食品不会生长革兰氏阳性病原菌，其包括但不限于，单核细胞增生李斯特氏菌。本发明的组合物对于抵抗单核细胞增生李斯特氏菌血清型l/2a，1/2b,3a和4b的菌株是有效的。本发明的方法包括使用一种或多种天然细菌培养物，同源的经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物，异源的经过巴氏灭菌或未经巴氏灭菌的发酵物，或其组合。本发明的天然细菌培养物在上面进行了描述。同源发酵物指典型地根据标准制备技术制备的单一细菌培养物的培养物上清液。异源发酵物指来自典型地根据标准制备技术制备的不同的细菌培养物的培养物上清液。同源或异源发酵物可以是i)经过巴氏灭菌的或未经过巴氏灭菌的；ii)冻干的；或iii)以别的方式干燥的。两种或多种细菌培养物可以是混合的或单独添加的。两种或多种发酵物可以是混合的或单独添加的。与一种或多种发酵物组合的细菌培养物可以是混合的或顺序添加的。在另一个示范性实施方案中，本发明包括细菌菌株CB1的培养物。CB1于2003年7月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的登记号为PTA-5313。在另一个示范性实施方案中，本发明包括细菌菌株CB2的培养物。CB2于2003年7月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的编号为PTA-5314。在另一个示范性实施方案中，本发明包括细菌菌株CB3的培养物。CB3于2003年7月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)，并且收到的编号为PTA-5315。在另一个示范性实施方案中，本发明包括使用CB1,CB2，和/或CB3，或其组合来处理食物，处理食物上的腐败菌，处理食物上的病原菌，禾口/或确定可预测的食物或食品的贮藏期限。菌株CB1，CB2，禾Q/或CB3可以单独或组合使用；可以与或不与它们各自的细菌素一起使用；可以与或不与包含它们各自的细菌素的发酵物一起使用；可以与包括、但不限于乳酸细菌的一种或多种产细菌素的细菌组合使用；和/或可以与由不同的细菌产生的一种或多种细菌素一起使用；和/或可以与或不与包含产生自不同的细菌素的一种或多种细菌素的发酵物一起使用。在另一个示范性实施方案中，本发明包括保存食物或饮料的方法，所述方法包括将有效量的本发明的细菌培养物，单独或与发酵物组合来加入食物或饮料。本发明人已经发现每克或每ct^中102或更少的菌落形成单位("cfo")的量典型地不足以与存在的外来微生物种群竞争。本发明人已经发现比开始的背景微生物区系IO倍大，典型地每克或每cr^约103cfli或更大足以克服现存的外来细菌(例如，背景微生物区系)种群的生长。本领域技术人员将认识到在食品中的外来细菌的量是可变的。根据本发明，所述组合物的量应该是外来腐败菌的量的约io倍或更大。在本发明的优选的实施方案中，所述方法包括处理新鲜的肉。在本发明的最优选的实施方案中，所述方法包括处理或保存新鲜的香肠或真空包装的维也纳香肠。本发明还涉及使用细菌组合物和/或由所述组合物产生的细菌素来处理李斯特氏菌属(Z^^^^;^.)以抑制肉类中李斯特氏菌属的生长。本发明还涉及包含由菌株CB1,CB2，禾Q/或CB3产生的一种或多种细菌素的发酵物。在本发明的优选的实施方案中，发酵物包括piscicolin126，肉杆菌素BM1，和可鉴定但是仍未进行表征的具有抗菌活性的蛋白质化合物。在包括细菌素的本发明的实施方案中，细菌素可以分离自天然来源，可以由一种或多种本发明的菌株产生，可以由另一个细菌菌株产生，或可以通过遗传修饰，例如使用重组表达载体产生。本发明的一个优点是从未发现的抗-李斯特氏菌的活性。这样宽泛的抗-李斯特氏菌谱是杰出的。本发明的另一个优点是杀菌和抑菌潜能。本发明的另一个优点是这些细菌在低至0"C的温度下生长，这说明它们在对于肉类防腐所必要的冷冻温度下生长和有效。本发明的另一个优点是这些菌株本身不导致肉类明显的腐败。附图显示本发明的例示性实施方案，通过它们，这些和其它目的，新的特征和优点将容易变得显而易见。IV.附图简述图1是本发明的组合物的抗李斯特氏菌活性的曲线图，图示了在以每克猪肉香肠样品接种103禾口104cfu的C.ma/toram油'cMmCB1的情况下，细菌数量的减少和对单核细胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述样品在5'C贮存超过香肠的预测的15天冷冻贮存期限。图2是三个重复试验的第一个的曲线图，图示了在真空包装的维也纳香肠的表面上，在每cm2存在104cfli的C.wa/toram加'cwwCB1或CB3的情况下，细菌数量的减少和对以每cm2102到10、fti接种的单核细胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述维也纳香肠在5'C贮存超过产品的12周的冷冻贮存期限。图3是三个重复试验的第二个的曲线图，图示了在真空包装的维也纳香肠的表面上，在每cm2存在104cfo的Cma/torama"cwmCB1或CB3的情况下，细菌数量的减少和对以每cm2102到10、fli接种的单核细胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述维也纳香肠在5T:贮存超过产品的12周的冷冻贮存期限。图4是是三个重复试验的第三个的曲线图，图示了在真空包装的维也纳香肠的表面上，在每cm2存在104cfo的C.ma/toram加'cMmCB1或CB3的情况下，细菌数量的减少和对以每cm2102到10、fii接种的单核细胞增生李斯特氏菌的四株菌株的混合物的抑制，所述维也纳香肠在5。C贮存超过产品的12周的冷冻贮存期限。V.本发明的具体描述本发明的组合物包括G3mo6a"en'wwwa/tora附"/cww的菌株，并且每个产生至少一种，典型地三种细菌素，C.ma/torom加'cMmCBl产生细菌素piscicolin126，肉杆菌素BM1，和另一种未鉴定的显示抗菌活性的细菌素。C.wfl//。"owa"ci/wCB2产生piscicolin126,肉杆菌素BM1，并且可以产生一种或多种另外的未鉴定的细菌素。Cma/toram加'cwwCB3产生piscicolin126,肉杆菌素BM1并且可以产生一种或多种另外的未鉴定的细菌素。本发明的组合物和方法包括使用一种或多种天然细菌培养物，同源的经过巴氏灭菌的或未经过巴氏灭菌的发酵物，异源的经过巴氏灭菌的或未经过巴氏灭菌的发酵物或其组合。上面描述了本发明的天然细菌培养物。同源的发酵物指根据标准制备技术制备的单一细菌培养物的培养物上清液。异源发酵物指根据标准制备技术制备的源自不同的细菌培养物的培养物上清液。同源的或异源的发酵物可以是i)经过巴氏灭菌的或未经过巴氏灭菌的；ii)冻干的；或iii)以别的方式干燥的。两种或多种细菌培养物可以进行混合或分别添加。两种或多种发酵物可以进行混合或分别添加。结合了一种或多种发酵物的细菌培养物可以混合，或连续添加。本发明的一个重要方面包括细菌发酵物在新鲜肉类的防腐和处理中的用途。根据本发明的教导，由菌株CB1，CB2，或CB3产生的细菌素似乎协同作用从而提供比单独使用单个细菌素更大的保护和效力。本文所用的新鲜肉产品指生肉或未烹煮过的肉(在冷冻条件下贮藏)，其可以包含或不包含另外的调味品混合物，并包括完整的或研磨过的肉。加工过的肉产品指这样的肉类，其已经i)调制和烹煮过的；ii)经腌制的;或iii)未经腌制以生产可市售产品。希望以本领域技术人员已知的普通意义来使用"新鲜的"和"加工过的"。典型的肉类包括，但不限于，维也纳香肠，香肠，鱼，和家禽。本发明的组合物和方法还可以用来处理其它食品，包括，但不限于，气调(modifiedatmosphere)包装的蔬菜，真空包装的意大利面和新鲜包装的产品。本文所用的预计的贮藏期指控制腐败持续一段单独时期的能力，到那时腐败变得明显。例如，可以将细菌应用于食品以达到大约10周或更长的贮藏期，到那时腐败可以检测出来。在10-周贮藏期内，本发明的组合物通过下列途径中的一种或多种来控制腐败i)通过应用具有已知腐败时间的细菌；ii)通过应用产生一种或多种蛋白质或细菌素的细菌，所述蛋白质或细菌素杀死或控制腐败菌；或iii)通过它们的组合。本文所用的提高的安全性指潜在病原菌生长的抑制和/或数目的减少，范围从杀菌到抑菌。本文所用的颜色保持指食品保持其所需着色的时间延长。这一概念是本领域技术人员公知的。实施例实施例1.Collins等(1987)报道丄./^c/co/a，丄.<i/vergera禾口丄.cwm's合成主要作为油酸的C18:1异构体(A9,10)，表明不同的不饱和脂肪酸合成酶途径。遗传同源性分类和化学以及物理特性也将Z.;^c/co/",和丄.A'v^ge"s置于相同的DNA同源性组中。此外，生化和化学数据表明丄.p&"'co/a禾m.cam"'应当被(并且已经被)简化成同一属Z.;^cz'co/a。随后L./^"'co/a,禾口丄.z'vergera，被重新分类至——个§]:属，G3r"o6a"en'wm(L.gen.N.carm's,属于肉；Gr.dim.n.6aAren》",小棒状；M.L.neut.W.Cotoen'wm,肉棒)，见Collins等(1987)。当16SrRNA序列分析表明肉杆菌属构成乳酸细菌内独特的系统发育进化枝4时，这一点得到进一步证实，并包括湖底肉杆菌(C./ww/"Mm),类湖底肉杆菌(C,ater>"Wmm),鸡肉杆菌(C.ga〃/"a/^w)和活动肉杆菌(C.moMe)(表1)，将La"o6a函sma/tarama"c^进一步定义为栖鱼肉杆菌的客观同义词(Miller等，1974;Collins等,1991;Lai和Manchester,2000;Lai等，2004)。此夕卜，尽管肉杆菌属最初分类成乳酸杆菌，但在系统进化上，该属相对于肠球菌属0E"&racoccwO和漫游球菌属(&gococci^)亲缘关系更近(Hiu等，1984)随后，麦芽香乳杆菌(Lacto6a"/MSma/toram/cw)菌株DSM20342T，DSM20344和JCM1154的表型和遗传表征确定了这些菌株也属于肉杆菌属。进一步与栖鱼肉杆菌比较得出结论这两个属应当被认为相同。作为结果，丰西鱼肉杆菌韦皮重新分类成Cwwo^3"er/www7o//an^MO^cwmcomb.nov.(Collins等，1991;Mora等，2003)。所以，关于本发明的属将使用G(3rwo^3cen'Mwm"//aromaWcMm的通用名。表1.肉杆菌属，它们与先前描述的细菌的关系及其生境(Collins等,1987;Collins等，1991;Mora等，2003)。当前命名以往命名生境丄.c/z'ver^ra肉类，家禽，熟化霉菌干酪表面家禽家禽肉类，家禽或鲑鱼暴使南极湖氺提i义为C.附a/farawZcM^(Collins等,1991)禾卩C.mfl/torcw""'ci/w(Mora等20C.=肉杆菌；L.-乳杆菌。实施例2.天然存在的C.wfl/torama"③附在历史上属于LAB群，其异型发酵代谢葡萄糖以便由糖生产等摩尔量的乳酸，二氧化碳和乙醇或乙酸，其先前被包括在乳杆菌属a禱k^〃M)中(Stanier等，1957;Hiu等，1984)。尽管一些研究已经表明肉杆菌属对于L-乳酸盐是同型发酵的[产生醋酸盐、甲酸盐和co2作为丙酮酸盐的一些次级脱羧作用/异化反应的终产物(Hiu等，1984;DeBmyn等，1988)]，C.wa/toraw加'cwn的最近描述和表征指出L(+)-乳酸，乙醇和醋酸盐是异型发酵产生的(Mora等,2003)。所以，对于本实施例来说，C.wa/tora願"c應已被表征为具有异型发酵特征。经常在遭受某种形式的胁迫的鱼中发现C.wa/toram加'c騰，所述胁迫如发生在产卵时或伴随着运输而发生的胁迫(Hiu等，1984;Baya等，1991)。Ringo等(2000)还发现C.wa/torawa"cMm与大西洋鲑鱼(Sa/woL.)的消化道相关联。肉杆菌已经从冷冻的真空包装的鱼和未经加工的牛肉和羔羊肉中分离，在这些生境中它属于肉类上占优势的LAB(Ahn和Stiles,1990a;Baya等，1991;Bamkat等，2000;Carr等，2002;Paludan-Muller等，1998;Sakala等，2002;Yamazaki等，2003)。在这些研究中使用的方法并未富集或选择任何具体的细菌类别或属。在广布肉杆菌(C.AVergera)和C.ma/torawa"cww之间的生化和生理学比较于(表2)中给出。将C."w/toraw加'c顧菌株B270T描述了具有下列特性(Hiu等，1984;Collins等，1987):.革兰氏阳性，非运动型，非孢子形成型杆状，单独出现或以短链出现；.在许多标准实验室培养基上生长良好，所述培养基包括TSA(胰胨豆胨琼脂糖培养基)和脑心浸液琼脂糖培养基，和在deMan,Rogosa和Sharpe(MRS)肉汤以及巯基乙酸培养基中；.当于25"生长在TSA上24h时，克隆是细小的，凸起的，白色，圆形和无色素的；.生长的温度范围是6。C-4(TC;最佳温度是大约3(TC;.最佳pH范围是从6.0到7.0;.兼性厌氧。通过同型发酵产生D,L-乳酸盐，但该属在某些条件下可以呈现异型发酵特性；在厌氧生长条件下乳酸生产得以增加；.生长需要叶酸，核黄素，泛酸盐和烟酸；维生素B12,生物素，维生素Bl和吡哆醛并非必需；.不产生过氧化氢酶和氧化酶；.硝酸盐未还原成亚硝酸盐；.气体产生不定(取决于底物)并且经常是阴性的；由精氨酸-MRS肉汤中的葡萄糖产生气体；.由甘油，核糖，半乳糖，葡糖酸盐，葡萄糖，果糖，甘露糖，甘露醇，l乙酰基葡糖胺，苦杏仁苷，熊果苷，水杨苷，纤维二糖，蔗糖和海藻糖产生酸;由阿拉伯糖，木糖，山梨糖，鼠李糖，半乳糖醇，肌醇，甲基-D-甘露糖苷，菊粉或松三糖不产生酸；.精氨酸和七叶甙被水解；.在TSITripleSugarIron琼脂糖)斜面中未检测到H2S;.耐受0.4和0.6%阴离子去垢剂(Teepol);.细胞壁肽聚糖包含二氨基庚二酸；.DNAG+C含量为33.7-36.4mol%;.主要细胞脂肪酸是直链饱和和单不饱和型，其中肉豆蔻酸，棕榈酸，棕榈油酸和A9,10-油酸占优势；.典型菌株为B270T(ATCC35586),1970年分离自受胁迫的成年山鳟，其饲养于俄勒冈州Coos县的Bandon鳟鱼孵化所。表2.肉杆菌属的生化和生理学比较1特征广布肉杆菌C.附a/torawaWcww由下列物质产生酸3Amidon--苦杏仁苷++半乳糖-+13-龙胆二糖++葡糖酸盐+(-)4+菊粉-+甘露醇-+蜜二糖-+松三糖+(-)+(_)a-甲基-D-葡糖甙-+a-甲基-D-甘露糖甙-+D-塔格糖-+(-)D-松二糖--D-木糖--Voges-Proskauer5++运动性--△9,10-亚甲基十八烷酸6+-1改写自(Collins等，1987)。2以往命名为居鱼乳杆菌(丄acto6a"7/w;^cz'co/a)和栖鱼肉杆菌；3在七天进行的读取。4+(-)=偶发的菌株阴性；5在API10E系统上进行的葡萄糖代谢测试；二菌株都产生精氨酸二水解酶和e-半乳糖苷酶；二菌株对于赖氨酸脱羧酶，色氨酸脱酰胺酶，脲酶，鸟氨酸脱羧酶,吲哚和H2S都是阴性的；6大于15%的总细胞脂肪酸。碱性pH(高达pH9.5)促进肉杆菌菌落的生长，同时抑制其它乳杆菌属。可以通过改变生长底物来实现将Cma/torom加'cwm与其它细菌区分开来。Cm"/toram",/c"w与肠球菌的区分包括在显微镜下区分棒状和球状，并且生长在包含2%菊粉而非蔗糖的CresolRedThallousAcetateSucrose(CTAS)培养基上。肠球菌不能发酵菊粉，而当C.m"/torawa"cww发酵菊粉，形成带有金属铜光泽的浅黄色至粉红色的菌落，培养基的黄色改变并且沉淀清除。当在CTAS琼脂糖中以肌苷取代蔗糖时，C.ma/to/wwcm'cww形成凸起的或e型的菌落。肠球菌也产生培养基的黄化和沉淀的清除，但不具有金属光泽(Carr等，2002)。C.wa/torowo"c"w的不同菌株显示产生抑制乳杆菌属，李斯特氏菌属和其它肉杆菌属生长的细菌素(核糖体合成的，低分子量，抗菌性蛋白质物质，其能够抑制紧邻细菌的生长或杀死它们)(McMullen和Stiles，1996;Duffes等，1999c;Schillinger等，1993)。实施例3.已经对在此GRAS文献中列举的菌株(例如，Camo6acfen'"mma/taram加'cwm菌株CB1,CB2，CB3,LV17,UAL26,ATCC35586和ATCC43225)测试其对于27种抗生素的抗性(表3;GriffithsLabs，2004)。总体上，测试的C.ma/toroma&Mw菌株对羟氨苄青霉素+克拉维酸，氯霉素,环丙沙星，红霉素，庆大霉素，亚胺培南，萘替米星，利福平，四环素和妥布霉素敏感。参考抗生素抗性模式(表3),肉杆菌菌株对于与革兰氏阳性共生菌中的可转移遗传元件通常关联的那些主要抗生素；具体地，红霉素,氯霉素和四环素敏感。Borridlo等(2003)提议当用作益生菌剂时，选定的菌株应当对两种以上主要抗生素易感。由Baya等(1991)，Duffes等，(1999b)或Euzeby(2004)所用的抗生素比较表明C.wa/tow/7^^cww菌株(CB1,CB2，CB3，LV17，UAL26,ATCC35586禾BATCC43225)对各种抗生素的敏感性与在分离自天然鱼来源的C."w/tora附""'cww菌株中发现的抗生素抗性充分一致，如表3中所注。在此GRAS档案中列举的CWG/tonwrn/Zcwm菌株的抗生素抗性模式与己经添加到食物中的或在食物中天然发现的乳杆菌菌属的抗生素抗性模式充分一致。这表明将这些cw"/torowa"cwm菌株添加到食物中将不会添加任何新的或显著的抗生素抗性决定子，所述决定子在正常情况下于共生或益生菌剂乳酸细菌中未发现。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4.乳酸细菌在食物中的存在和使用利用直接接种的方法鉴定来自肉和肉产品，奶和奶制品，蔬菜，水果和海产品的产细菌素的LAB分离株，对来自72份食物样品(32份奶和奶制品，40份肉)的总共663,533个菌落检查了细菌素生产(Coventry等,1997)。这些食物样品许多被断定为已经超过了可接受的保存期。总共15%的肉和肉产品产生产细菌素的肉杆菌属。在被调査的72份食物样品中,44%产生产细菌素的细菌。从总共663，533个测试的菌落中，发现80,992个菌落(12.2%)为肉杆菌属，其中0.15%产细菌素。来自细菌素生产菌的选定菌株的滤器除菌的培养物上清液流体的抗细菌活性并不被过氧化氢酶，脂肪酶或溶菌酶所影响，但是却被至少一种蛋白水解酶所完全或部分灭活，提示抗细菌活性与蛋白质物质相关联。此研究还显示人类一直在接触肉杆菌属和其它食物滋生的产生细菌素的细菌。Amezquita和Brashears(2002)报道了从可商购的即食(RTE)肉产品中分离出49种LAB菌株。在琼脂糖斑点试验中对这些筛选其于5t:抑制单核细胞增生李斯特氏菌生长的能力。Pe^ococc^a"'&7ac"cz'，丄actokc/〃wscase/禾Q丄.paraca"/被鉴定为三种具有最高抑制活性的种属。当向RTE肉产品添力口户e(^'ococcw5ac/c/z7ac"cz'，￡acto6<3c/〃wscase/禾口丄.的三种选定菌株时，在所有被评估的RTE肉产品(五份商购的煮火腿样品和五份商购的法兰克福香肠样品)中都有对单核细胞增生李斯特氏菌生长的显著抑制(P<0.05)。此研究显示LAB的选定菌株能够分离自RTE肉产品并且这些菌株于5t:在28天贮藏过程中有效抑制法兰克福香肠和煮火腿中单核细胞增生李斯特氏菌的生长。在贮藏期间，LAB的数目仅增长大约1个对数周期并且在产品表面上无明显可见的腐败迹象(例如，涉及外观，如颜色变化，令人不快的香味和硬度或质地变化的对于一些影响感官的不利影响)。由Sakala等(2002)实施的研究，调査了在冰箱贝亡藏的，真空包装的牛肉上的嗜冷(能够在冷冻温度下生长，但在2(TC以上生长最佳的细菌)腐败微生物区系。此研究于7。C的温育温度下利用较低选择性的葡萄糖-血液-肝琼脂糖和胰胨豆胨琼脂糖培养基接种方法(允许最广泛的细菌生长)。在六周的时间里鉴定并量化了在冷冻温度下贮藏的真空包装牛肉上的各种嗜冷属，以测定细菌属或细菌数量的变化。利用五份新鲜牛肉切削样品(在屠宰后获得并真空包装大约48小时)以测定在真空包装牛肉中发现的各种细菌的类型和数量。总共1493细菌菌株被鉴定为热杀微杆菌(Sroc/zof/zn.xAermosp/z(3"a)(64),Cbn206ac/en'wmma/torom(3cww(27),广布肉杆菌(79),Z^cto^ci〃wa/g/^s(637)，乳杆菌属(4),鱼乳球菌(丄arfococcws/&"'MW)(270),7令^fe日月串珠菌(Zvewcomwtocge/z.<iww)(375)，不云力杆菌(Jc/打eto6acfer)(3),气单胞菌(Jewno"as)(l)，芽孢丰干菌(万"".〃ws)(10)，棒杆菌(Coo^eZacfehww)(3),肠细菌(Enterobacteriaceae)(1),假单胞菌0P^^omo"M)(13)和嗜冷杆菌(iVc/zTO^cteO(6)。冷生明串珠菌，鱼乳球菌和丄.a/g^w在贮藏的最初三周期间从大约5xl03cfti/g增长到大约lxl08cfo/g，并在六周研究的余下时间内保持稳定。C.ma/torow加'cwm被不一致地检测出来，但是当其存在时，在贮藏的最初三周期间增加到大约5xl07dWg，并在研究的最后三周保持于该水平上。真空或气调(C02)包装(C02-MAP)影响分离自肉的细菌属(Labadie,l的9)。在低温和限量氧气下，LAB包含大约lxl(fcfo/cn^的C02-MAP包装肉的优势细菌种群(Gi11和Newton，1978)。尚没有研究直接比较在COrMAP条件下新鲜包装肉上乳杆菌属、明串珠菌属(丄e"co"os/oc)禾BCa/7w&ten'ww的不同属的具体数量。Nilsson等(1999)分别在购买时和在温育32天后从冷熏鲑鱼中分离出2xl()4和5xl07cfU/gLAB。实施例5.Cam^acteW"附附a/to/wnfl"c"附在肉，鱼和干酪产品上的天然存在如表4中所总结的，已经从真空包装的肉，鱼和法国软酪中分离出肉杆菌属(Ahn和Stiles,1990a;Buchanan和Klawitter，1992b;Stoffels等，1992;Pilet等，1995;Milliere禾口Lefebvre,1994a;Milliere等，1994b)。Lewus等的研究(1991)从来自零售肉产品的不同部分的肉上鉴定了两种产细菌素的C.ma/tora/w""cww菌株。其它C.ma/farawadcww菌株分离自鱼，肉和干酪(Milliere等，1994b;Nissen等，1994;Pilet等，1995;Schillinger等,1993;Shaw禾口Harding,1984)。Leisner等(1994)发现最初分离自真空包装的大比目鱼，鲑鱼或鲭的80个细菌菌株中的18株是乳酸细菌。其中，28%被鉴定为C.wa/toraw^/c"w。Sakala等(2002)进行了一种研究来调査在冷藏真空包装牛肉上的嗜冷腐败微生物区系，并确定在分离自五份新鲜牛肉切削样品(每份都来自不同的肉店)的总共1493菌株中，27株被鉴定为C.ma/toroma"cwm。在贮藏的第0，1,3,5禾B6周对于两份C.w"/to;ww^/cMW阳性样品检测所述细菌，平均数目分别为2xl03,2xl04,2.5x106，lxl(^和2.5xl07cfU/g，并且在六周贮藏期的最后三周期间维持在大约5xl07cfli/g的水平。C.wa/toraw加'o/w在经发酵的肉中的生长已经由Montd(1999)记载过他记载"在发酵期结束时，乳酸细菌一般是优势细菌区系。以下菌属弯曲乳杆菌C^ctok^7/wcwrwm^)，清酒乳杆菌清酒亚种(Z^afe/)，植物乳杆菌(Z^/awto口m),绿色乳杆菌(Z.wW^feyce"力，广布乳杆菌，C.脂/toram加'c謂和明串珠菌属是天然存在的，但片球菌只在作为起始培养物接种时发现。它们的计数一般超过106cfu/g并且在整个熟化期间保持在这个水平上。Car"o6a"en'ww存在于发酵期间，但是3g后消失。"表4.从食品中分离C".mfl/^roma"cwm.<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*=给定的菌株，如果已知。冷熏鲑鱼(css)是极容易腐烂的食品并且特别易受单核细胞增生李斯特氏菌的污染。css腐败主要是由于在冷冻贮藏期间的微生物活性造成的(Duffes，1999a)。对于CSS,据估计在包装后即刻，细菌计数从lx103到lxlO4cfu/g，革兰氏阴性细菌占优势(64%),诸如腐败希瓦氏菌0S72ew3"e〃"/7"&ey^"'era)禾口气单胞菌属(Aeromonasspp)。发现存在LAB(32%),多数是肉杆菌属(Donald禾口Gibson,1992;Huss等，1995)。在8°C下，细菌区系的水平在三周内提高至lxlO7-lxlO8cfo/g,相关细菌种群有所变化，从而使得LAB占优势(60%)，主要为肉杆菌属(47%)和乳杆菌属(Z^cto6a"7/wwp.)(13%)。Paludan-Muller等(1998)报道了一系列研究，评估了Cwa/tora柳""cww在贮藏于5。C下真空和气调包装的冷熏鲑鱼腐败中的作用。通常在腐败CSS上发现LAB和革兰氏阴性细菌的混合物。细菌的起始数目低，总的嗜冷菌计数小于5xl03cfWg，具体地，LAB计数为10-lxl02cfu/g。此外，据测定(通过感官评估)真空包装的冷熏鲑鱼保存期于5'c下最高达四周。四周时的微生物区系由LAB(lxlO6-lxl07cfb/g)与不同水平的革兰氏阴性微生物区系(lxlO5-lxlO"cfti/g)组成。气调包装减少革兰氏阴性细菌的生长并特异性选择LAB，尽管LAB的生长在五周的贮藏期间低于3xl05dWg(Paludan-Muller等，1998)。LAB微生物区系占优势的是C.ma/toram油'CMm,在鉴定过的255个LAB分离株中占87%。通过在贮藏于5"C下的CSS中每克接种大约lxl06cfbC.wa/taro附af/cw柳来进一步石开究Cwa/toro附a"cww的腐败、潜为(Paludan-Muller等，1998)。在接种了C.ma/toram加'cww菌株的真空包装的鲑鱼中，仅仅一周的贮藏后LAB计数达到lxl07cfli/g，并且该水平在余下的贮藏期中高于lx108cfu/g。不过，在四周的贮藏后,鲑鱼未被感官体验组所排斥，而真空包装的对照则在四到五周后被排斥。在接种过的气调包装的鲑鱼中，两周后LAB计数达到最终水平lxlO6-lxl07cfu/g，但是直到贮藏四到五周后鲑鱼并未被感官排斥。据推断即使在高数目(lx107-lxl()ScfU/g)之下，C.ma/torom如'cww生长几周也不会加速包装的冷熏鲑鱼的腐败进程。对于由生牛奶制成的法式表面霉菌熟化的干软酪的嗜冷和嗜温微生物区系的细菌学研究发现，C.ma/toram加'cwm是五种Brie干酪样品上熟化结束时的优势细菌(Milliere禾卩Lefebvre,1994a)。C.ma/torama"c"w细菌还分离自Coulommiers,Camember,Pon-I、Eveue禾卩Munster干酪。在各种干酪样品中，分离自这些干酪的肉杆菌菌落的数目范围为5x105-8x108cfu/g。Milliere等(1994b)继续鉴定分离自五种Brie干酪样品的C.wa/towm加'cwm菌株。干酪的pH值为6.8禾B7.6之间并且没有记录到异味(off-odors)或感观缺陷。肉杆菌属在所述干酪样品中占优势，在1x108和1x10VfU/g之间。DNA-DNA杂交的结果表明36种分离株中的33种是C.ma/toram加'c訓菌属，而余下的三种(都从相同的样品中挑取)为广布肉杆菌。总之，肉杆菌属是在真空包装的肉，家禽，鱼和干酪产品上微生物区系的常见组分，在一些情况下，它们可以代表产品诸如熏鱼、鸡肉、牛肉和干酪上的优势组成种群，达到lxl08cfWg或更高的水平，而不会引起可检测到的腐败。实施伊j6.CVi,""6ffcfer/"/w附ff/似AV附W/c"附培养物的生产将Cma/toram加'cwm菌株在4。C下以冻干形式维持，或在-8(TC下作为在20%(v/v)甘油中的冷冻培养物维持。进行API⑧条带分析(一种鉴定细菌至属水平的试剂盒)以确保存活力并且通过无细菌学污染和/或通过随机扩增多态性DNA(RAPD)和微生物分析来确认菌株纯度。对于每个菌株制备七个冻干的小瓶(主种)。由单瓶主种，在真空下制备15个冻干瓶，并贮藏于4r(次级种)。由每瓶次级种，制备足够的冷冻小瓶用于一年的生产需要，并贮藏于-8(TC。每10小瓶中取一瓶进行微生物测试以确认菌株纯度并且无细菌学污染。种子培养物和菌母培养物通过将一满环的冷冻主种或一小瓶冻干的培养物转移到10mlAPT(通用Tween)中来制备种子培养物。接着，使种子生长过夜。通过将种子培养物(生长过夜)转移到6LAPT培养基中并再次将其温育过夜来从种子培养物制备菌母培养物。发酵和浓縮将菌母培养物在无菌条件下转移到生产发酵器中，所述发酵器包含生长培养基并维持在25°C。通过分光光度计(650nm)并通过接种到APT琼脂上直到细胞密度达到大约10Vfu来监测发酵。接着收集发酵的生长培养基(包含C.ma/tora廳"c謂)并将其冻干。冻干将冻干的物质从碟中刮取，研磨并粉碎，在冷藏(4-8'C)之前将其置于聚乙烯袋中并装入双层袋内。实施例7微生物分析对冻干的物质进行总乳酸细菌，非乳酸细菌，酵母，霉菌，总的大肠菌类，金黄色葡萄球菌OStop/^/ococci^aw訓s)，大肠杆菌(Esc/7eWc/2/aco")，和沙门氏菌属GSa/wo"e〃aspp)的微生物分析(表5)。表5CVw7io6""m'M附附"/tora柳W/cM附冻干的细菌粉末的描述活性成分赋形剂麦芽糖糊精贮存期限>一年贮存条件室温(22。C)物理方面说明方法外观通过视觉观察APT平板并与标准的平板的照片和描述进行比较浓度介于3.2M0Vg禾口A.RH.A./USP3.2*107活细胞&之间残余湿气<5%O'H犯s微生物描述乳酸细菌介于3.2"0Vg和A,P.H.A./USP3.2*107cfti/g之间或介于1.3*109和1.4M0"cfu/包装之间非乳酸细菌<100/gA.RH.A./USP酵母<100/gA.P.H.A./USP毒菌<100/gA.P.H.A./USP厌氧孢子形成细菌<10/gA.P.H.A./USPClostridium每50g缺乏A.RH.A./USPbotulinum总大肠菌类<10/gA.P.H.A./USP金黄色葡萄球菌<100/gA.P.H.A./USP大肠杆菌每25g缺乏A.P.H.A/USP沙门氏菌属每g缺乏A.P.H.A/USPA.P.H.A^美国公共卫生协会；USP二美国药典实施例8起始培养物的重构将标准化的活细胞掺合物包装到塑料箔薄膜包装中，用氮气冲洗并且按最终产品应用的要求规定包装重量从而使每克最终产品达到103和104之间的活C.wfl/toww^/cwm细胞。接着将所述包装物贮存在室温。对包装的标准化活细胞掺合物进行总乳酸细菌，非乳酸细菌，酵母，霉菌，总的大肠菌类，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，和沙门氏菌属的微生物分析鉴定(表5)。在成分混合和进一步研磨并装入包装物之前，还可以将一定剂量的包含菌株CB1,CB2，CB3,LV17,UAL26,ATCC35586或ATCC43225(大约lxl()3到lxl04cfu/g最终产品)中的一种或多种的重构C.wa/torawa"cwn直接加入研磨的肉中。接着，将这些香肠在-5(TC快速冷冻直到在中心冷冻。接着，将这些香肠密封包装在塑料包裹中并保持在冷冻状态直到解冻进行零售销售。实施例9.真空包装的维也纳香肠上的Cfl/7l"flCteWw附附fl/to/WMfl"C"附的生长特性设计实验室规模的研究来在可与商业生产比较的条件下研究在真空包装上的C.wa/torama"cMm的生长特性，所述维也纳香肠用C.ma/組歸加'c謂接种。此外，研究对感官特性诸如芳香和风味模式的影响。该研究的方法和结果如下选择C.m^arawa"c調的两株菌株进行研究LV17(UAL8的同物异名)开始分离自真空包装的，冷冻的新鲜猪肉并由Shaw和Harding(1984)描述，和菌株UAL26，其分离自真空包装的牛肉(Stiles和Holzapfel，1997)。通过将洗涤的细菌细胞加入灭菌的0.85%的盐水以提供2.5x106cfu/ml的接种物水平来制备接种物。将单独的维也纳香肠浸入接种物混悬液中达一分钟，脱水干燥并以每袋5个一组的维也纳香肠进行真空包装(高屏障，低02传递，VP袋)。作为对照，将维也纳香肠在没有细菌接种物的情况下，浸入0.85%的灭菌盐水中。接着，将处理的和对照样品置于冷藏(4°C)贮藏多达12周。在0天和在贮藏的2,4,6,7,8,10和12周后对维也纳香肠取样进行微生物分析和感官评价。通过切下1.8cm长的维也纳香肠块(等价于10cn^的表面积)，将其置于灭菌的组织匀浆袋中并进行匀浆来制备样品进行微生物分析。细菌计数通过标准稀释和接种技术进行并且包括l)在25°C，好氧温育48小时的在平板计数琼脂上的总的好氧平板计数；2)在25。C，厌氧温育48小时的在APT琼脂上的乳酸细菌；3)在35。C温育18小时的在添加了1%的葡萄糖的VioletRedBileAgar上的肠道细菌。将细菌的浓度报道为每cr^产物的cfu(cfu/cm2)。将要进行感官特性评价的维也纳香肠在"刚沸腾"的水中蒸煮，并使其静止5分钟(内部维也纳香肠的温度大约为83。C)。将维也纳香肠切成块，并置于用编码的箔覆盖的容器中，在94。C的烘箱中加热15分钟，立即进行评估。感官评估由进行了三个月时期训练的一组9人的专门小组进行。使用15cm的非正式的线等级，对样品进行了总的芳香味强度，肉风味强度，调味(seasoned)风味，烟尘强度，酸味/酸度，臭味(off-flavor)和总的可接受度的评估，其中0=非常温和，15=非常强烈。在样品之间，舌用脆点心和1:1稀释的7-Up⑧净化。该研究报道了已经用C.ma/tomma"cwm菌株LV17或UAL26接种的样品维也纳香肠在经过7或8周冷藏后分别达到2.75xl()S和1.2xl05cfo/cm2的最大厌氧乳酸细菌(LAB)数量。在贮藏期间，C.ma/tor麵加'c廳以缓慢的速率在真空包装的维也纳香肠上生长并且生长伴随着表面pH的相当小的减少。LV17从0周的pH6.2变化到第10周的pH6.1，而UAL26在6-8周和12周期间从开始的pH6.2变化到大约5.9。得出结论为与其它乳酸细菌诸如冷生明串珠菌比较，当接种到冷藏(4°C)，真空包装的维也纳香肠上时，C.ma/towwa"cwm是缓慢生长的种类。C.wa/toraw如'cww的水平在12周的冷藏后达到最大5xl0、fWcn^。基于由训练的9个成员的专门小组在12周的贮藏期间进行的感官评估，用C.ma/torama/cMW进行的接种并未导致对芳香味，臭味，酸度或总的可接受度的明显的不利影响。实施例10.当接种到香肠中时，Ow朋6a"e""mm"/tofwmi"c"附的生长特性在香肠的生产期间，将Cma/taramar!'cwmCB1作为接种物在三次试验中，加入猪肉。以21点线等级来处理香肠(作为未加工的和蒸煮过的二者进行评价)的气味强度和新鲜度品质。接种水平范围从lx103到lx105cfu/g肉。在第0，5,10,15和20天来进行细菌学分析以评估C.wa/torama^cwn的生长和细菌素的产生。对冷冻的猪肉肩部和猪肉脂肪进行称重，粗研并将其分成4批，将2.76%的水和1.8%的调料加入其中。用多达105cfb/g的C.;^/torow加'cwm对测试产品进行接种。将研磨的肉和成分进行混合，精研并填到胶原蛋白肠衣(casing)(UniPac,Edmonton)中。将填充过的肠衣切成3.5-3.75英寸的环，以得到约为20.4一g/香肠的香肠。在-5(TC将单独的香肠环快速冷冻大约35分钟。将冷冻的香肠包装在Styrofoam碟上(每个包装大约10oz)，将其密封包裹并密封在塑料包装中。在细菌取样前，将样品解冻并贮藏于4。C。肉类的一般加工程序包括"急冷"肉以进行运输的程序，以及后来为销售或进一步加工进行的解冻。在己经解冻并贮藏于4。C0，5，10,15和20天的样品上进行细菌学取样。将一式两份的10g样品置于灭菌的细菌分离器袋(VWRInternational)中并与90ml灭菌的0.1%的蛋白胨水混合。将在0.1%蛋白胨水中的适合的系列稀释度在预倾注的APT琼脂和MRS琼脂平板上划线并将其在30°C温育48小时。在温育时期后，记录每个样品的一式两份计数(cfli/g肉)。在20天时期内，在MRS琼脂上的总的厌氧细菌计数从103-105cfu/g产品，增加到10、fWg产品。在测试产品中的背景微生物区系的生长并未不同于与未接种的样品相关的背景微生物区系的生长，如通过在APT琼脂上的生长所显示的。这说明用C.ma/toram如'c蘭接种香肠肉并未增加香肠中细菌生长的总的发生率。微生物测定指出在APT和MRS琼脂上的细菌生长的总数在未接种的对照和测试产品上是相似的。所以，加入的c.ma/torama"cww培养物并未增加在测试产品上发现的细菌的数量，也没有使所述肉比对照腐败得更快。在第0，5,10,15和20天通过直接和间接测定来测试在香肠样品中的细菌素产生，并对其进行检测，指示由添加的C.w"/to/ww油'cww进行的细菌素产生。到第io天通过间接测定[香肠的部分被热处理(杀死生产生物)]和直接包埋在用单核细胞增生李斯特氏菌CDC7762(血清型4b)]接种的APT琼脂中来观察对指示生物单核细胞增生李斯特氏菌的抑制，其中这种抑制维持到所述测定的第20天。在用C.ma/tonwa&ww接种的香肠中对细菌素产生的直接测定(将热处理的匀浆香肠的上清液直接加入用单核细胞增生李斯特氏菌指示生物覆盖的APT琼脂平板中)指示到香肠在4t:贮藏的第15天发生细菌素的产生并持续到贮藏的第20天。实施例11.CVw7KM"w/"附wtf/似/wfiflrt'c"附的添加在即食(RTE)和新鲜冷装的、加工的肉产品中的应用RTE肉和新鲜冷装，加工的肉产品需要抑制可能的病原菌生长的防腐技术。致命的单核细胞增生李斯特氏菌爆发最近席巻了美国东北部，导致美国食品与药物管理局和USDA's食品安全监察署(FSIS)在2003年9月发布健康警报(MorbidityandMortalityweeklyReport,2003)。建议作为减轻由人病原菌诸如单核细胞增生李斯特氏菌导致的污染的影响的手段，将C.wa/torow加'cwm加入气调包装的即食(RTE)肉产品和新鲜冷冻的，加工的肉产品中。在RTE肉产品诸如维也纳香肠的包装期间，建议每454g(1磅)包装应用一定剂量(大约1.5ml,或5xl06cfti)的重构C.在成分混合和进一步研磨并填充到肠衣中以前，将重构c.附Wtor函a&訓的等分部分(递送约1X1()3至1J1X104cfb/g)加入新鲜冷冻的，加工的肉产品中以产生新鲜冷冻的，加工的肉产品。新鲜冷冻的，加工的肉产品将在-5(TC被快速冷冻直到中心被冷冻，接着在塑料包装中被密封包裹并冷冻贮藏。对于RTE肉产品和新鲜冷冻，加工的肉产品的接种范围是大约lx103到lxl()4活的C.wa/toraw加'cwm细胞(cfti)/g产品。实施例12由Duffes等(2000)进行的对分离自商业，真空包装的冷-烟熏的鲑鱼(CSS)中的产细菌素菌株C.ma/toram如'c"m(菌株SF668)抑制在CSS上的单核细胞增生李斯特氏菌生长的潜能的检查，发现Cma/toroma"cwwSF668在贮藏在4'C的真空包装的的冷-烟熏鲑鱼上，在21天中能够从lxl()S增加到3xl07cfu/ml(表8)。与C.共培养的单核细胞增生李斯特氏菌在4。C三周后从lx103cfti/ml增加到3.5xl03cfu/ml。这种C.ma/toroma"c誰与单核细胞增生李斯特氏菌的共培养导致了对在冷-烟熏的鲑鱼上的单核细胞增生李斯特氏菌生长的明显的细菌抑制效应(在缺乏C.ma/toram加z'cwm时，单核细胞增生李斯特氏菌生长达到大约5xl04cfu/ml)。当针对21株的李斯特氏菌属进行筛选时，由C.wa/toraw""cLK5形成的独特的抑制圈对于17株菌株是明显的(Buchanan和Klawitter，1992a)。发现C.wa/toraw加'cwwLK5没有形成过氧化氢，但是产生细菌素。C.wa/taromfl//cMmLK5抑制李斯特氏菌属的能力是温度-依赖型的(在5°C和19。C测定)，与在19°C比较，在5'C对与C.mfl/toraw油'c"wLK5共培养的单核细胞增生李斯特氏菌发生显著更大的抑制。C.Wfl/tomma//a^LK5显示在冷冻温度上能够生长得比单核细胞增生李斯特氏菌明显更快，而在19。C生长速度大约是相同的。在19°C，对单核细胞增生李斯特氏菌(接种浓度保持在lxl0^fu/ml不变)的抑制依赖于接种比率，其中仅》l:1的LK5:单核细胞增生李斯特氏菌比率产生显著的抑制程度。在5"C，在温育的早期阶段期间，对于更高的接种比率，观察到增加水平的抗-李斯特氏菌活性，但是到温育的大约300小时，LK5接种大小对抑制活性没有影响；对于范围从0.01:1到1000:1(分别为10:lxl()3和lxlO6:lxl()3dWml)的比率)，抑制的程度是相同的。在冷冻温度，肉杆菌分离株非常具有竞争性，说明甚至小量的接种物在冷冻食品中可以用于控制单核细胞增生李斯特氏菌。此研究证实了Schillinger和Holzapfel(1990)的报道，其报道了在13株C.wa/toraw加'cww菌株中，有10株显著抑制单核细胞增生李斯特氏菌DSM20600的生长，如通过琼脂斑点测试所确定的。实施例13.7.2.对CVw"oA""e"w附附"/似rowifl"'cMm的背景暴露研究己经显示在有效期内通常在零售食品中发现乳酸细菌，具体地C.ma/toram加'cwm(气调包装和冷冻优先选择厌氧肉杆菌属)(Milliere和Lefebvre,1994a;Kelly等，1996;Schobitz等，1999;Amezquita禾口Brashears,2002;Sakala等，2002)。所以，对于精确评估可以最大程度消耗的C.ma/toroma^wm的数量，必须考虑可能己经存在于目标食物上的任何理论量白勺C.ma/^Toma^'CMW。对文献进行了广泛研究，结果发现两篇具体分析在商购食物上发现的C.wa/toraw如'cwm的量的参考文献。Sakala等(2002)测定了包含C.扁/tora扁&謂的两个牛肉样品。在贮藏(真空包装的并贮藏于2"C)的第0,1,3,5和6周检测到的平均数量分别为2xl03，2xl04，2.5x106,lx107，和2.5xl07cfti/g肉。Montel(2000)发现在香肠的发酵时期的末期，乳酸细菌通常是主要的微生物区系，其中C.ma/toram^/cwm在天然状态下，在发酵时期以大约5xl0VfWg香肠的水平存在，但是随后消失。在6"C贮藏2-3周后，发现以104-105cfli/g鲑鱼接种的无菌冷熏鲑鱼具有范围介于5x107到109cfti/g的最终计数(Stohr等，2001)。Nadon等(2001)显示在贮藏的最初6周，在真空包装的或二氧化碳气调(C02-CAP)包装处理的猪肉中，LAB(其包含肉杆菌)从最初的100cfo/cmn曾加到lx106cfti/cm2的平均水平，并且在13周研究的余下的时间里维持LAB的水平。在C02-CAP猪肉样品中，LAB直到贮藏的第11周才有明显的增加，其中LAB的最大水平在3.2xl05cfWcm2。由Nadon等(2001)进行的未公开的工作证实在缺氧的情况下，在-1.5。C贮藏期间，肉杆菌在LAB微生物区系中占据优势地位。实施例14C.ma/toram加'cww的菌株产生数种不同的肉杆菌素(Quadri等，1994)，其已经被鉴定为耐热的肽，在宽泛的pH范围内是稳定的并且能够作为杀菌剂起作用(Jack等，1996)。最近在一项研究中对C.ma/toram加'cwmL103的细菌素进行了测试从而测定该细菌素在真空包装的肉中控制单核细胞增生李斯特氏菌的生长的能力(Schobitz等，1999)。将部分纯化的细菌素以100AU/ml(AU/ml=活性的任意单位)的浓度来接种牛半腱肌肌肉条。将单核细胞增生李斯特氏菌加入肉中作为指示菌株，最终浓度为lx103dWcnA在确保与肉较好接触后，将所述肉条进行真空包装并贮藏于《C21天。每个取样日，都包含未接种的对照和仅包含指示菌株的肉。在第0天和每7天对一式两份的肉条进行取样来观察单核细胞增生李斯特氏菌的生长和LAB生长。在4'C贮藏7天后，观察到单核细胞增生李斯特氏菌计数的明显减少，计数从开始的2xl03cfo/cm2到4cfu/cm在贮藏的第14天完全抑制病原体(<1cfWcm2)。LAB在真空包装的肉类上成倍增加，在14天后，达到lx107cfu/cmH十数，其中起始水平为1.6xl02cfli/cm2。肉的颜色和气味在14天的贮藏期间仍旧是可接受的。此研究的结果说明来自C."w/tora/77^/cww的细菌素能够在多达14天的时间里抑制在真空包装的肉上的单核细胞增生李斯特氏菌，而仍旧保持肉的食用特性(Schobitz等,1999)。C.ma/torama"cwwLV61产生这样的细菌素，其X寸C.ma/tarama"cwm2762和单核细胞增生李斯特氏菌(菌株R2,Lud1033，Brl246,Lud905和T)具有活性，但是被链霉蛋白酶E，蛋白酶K和胰蛋白酶所灭活(Pilet等,1995)。其它研究已经说明来自C.ma/taram加'c画LV61的纯化的细菌素抑制肉杆菌和肠球菌的数个菌株，但是不抑制李斯特氏菌的数个菌株(Holck等，1994)。所以推论，C.ma/toram^/cwmLV61除了产生piscicolin61之夕卜，产生涉及抗李斯特氏菌活性的另一种因素。实施例15肉杆菌属是嗜冷的，在8-9的高pH值上生长并且发酵菊粉。在存在菊粉的培养条件下，C.wa/tomm加'c謂形成具有金属铜光泽的黄色到粉红色的菌落，培养基的黄色改变和沉淀物的消失。各种C.ma/torama"cwm菌株已经显示产生细菌素，具有抑制其它肉杆菌，乳杆菌和李斯特氏菌属生长的能力的蛋白质化合物。推荐将C./^/toraw加'cwm以lx103至Ulx104cfU/g的范围接种到各种即食和新鲜冷冻，加工的肉产品中从而提高防腐并减少病原菌生长。基于这些接种范围，以及细菌将在贮藏的延长时期生长的理论设想，添加到选定的RTE食品中的C.ma/toraw加'cwm平均每人消耗估计为对于60kg人的4.3x1()9cfU/天或7.2x107cfb/kg/天。当在鲑鱼，鸡肉，猪肉，牛肉和其它商购的肉产品中评估时，C.ma/toram加'c蘭对病原体，单核细胞增生李斯特氏菌的抑制发生。C.ma/toram^/cMW与单核细胞增生李斯特氏菌的共培养导致单核细胞增生李斯特氏菌生长的对数减少。在低温，与单核细胞增生李斯特氏菌生长比较时，C.ma/torama&"w对单核细胞增生李斯特氏菌生长的抑制作用在低温得到提高。单核细胞增生李斯特氏菌抑制可以通过乳酸的产生，营养物的竞争以及细菌素的产生进行调节。细菌素的产生与单核细胞增生李斯特氏菌生长的增加的抑制相关。当受到模拟胃酸或蛋白水解酶作用时，由C.顧/toram加'c騰产生的细菌素的活性快速减少，指示为非毒性和非变应性蛋白质。C.ma/toram加'c"m增加RTE和真空-包装的肉产品的贮藏时间，同时减少病原菌的生长。已经发现C.腦/toram加'c謂的生长是自限的，其中在RTE肉产品和真空包装的，冷熏的鲑鱼上的C.ma/toram加'cww的水平稳定在约lxl09cfti/g。将C.wa/torawa"c"w以介于1乂103和lxl()4cfli/g之间的水平添加到目标RTE和新鲜冷冻，加工的肉产品中将不会明显增加来自这些食品的LAB的总的人类消耗(确定理论上的自然消耗为4.3X109dW天)。已纟圣显示C.ma/toraw(3"cwm本身的生长是自限；C.ma/torama〃cww生长将在大约lxl()S和lxl09cfo/g肉之间停止。推测这是由于限制更高细菌密度的特异性细菌素的释放导致的。实施例16来自肉产品的乳酸细菌(LAB)的分离和筛选冷藏的或冷冻的，生的和即食加工的肉类的样品是A)购买自零售市场的样品；带到实验室进行微生物分析B)来自生猪肉香肠的中试车间生产的冷冻样品，解冻并进行微生物分析C)购买自零售市场的即食加工的肉类的样品，其在实验室中贮存于4。C直到它们的"最佳日期结束"，进行微生物分析。将一式三份的10g样品在无菌条件下从每个包装中切下，稀释在90ml的灭菌的0.1。/。胨水中并在细菌分离器Lab-Blender400(Seward,England)中匀浆2分钟。将匀浆物的系列稀释物在0.1%的胨水中进行制备并铺在预灌注的APT(通用吐温；Difco)琼脂(1.5。/。)平板上。将平板在25°C(A,B)或15°C(C)厌氧(A,B)和好氧(C)温育48小时。从APT平板用灭菌的牙签挑取随机选择的单菌落，并将其划线到需要量的预灌注的APT平板组上(对于用于筛选的每种指示菌株一组)。将平板在25"C厌氧(A)和好氧(B，C)温育24小时。用以1%接种在软APT琼脂(0.75%)上的单核细胞增生李斯特氏菌指示菌株或通用的指示菌株广布肉杆菌LV13的菌苔涂在每组平板上。将涂布过的平板在37t:温育24小时。将在涂布层中观察为透明圈的抑制区域记录为产生抗菌物质的生物。针对链霉蛋白酶E(Sigma)的敏感性和对于热的敏感性来筛选显示此活性的生物。选择对于链霉蛋白酶敏感的并且在6(TC稳定30分钟的那些来进行进一步的鉴定。实施例17.许多细菌产生抗细菌肽或蛋白质(例如，细菌素)，其通常针对其它细菌、典型地紧密相关的细菌具有活性。细菌和它们的细菌素的示范性列表显示在表6中。表6菌株我们实验室收集的LAB1.CaA77o6ac/eWww觸tow應dcCB1未知的2.C.画/rara應"'c薩CB2+未知的3.C.ma/^3romaZ/cwwCB34.C.應toram加'cUAL265.C.ma/(aromaf/cMmLV176.C.Twa/farowaricMWUAL26/8A7.广布肉杆菌LV138.冷生明串珠菌UAL1879.清酒乳杆菌清酒亚种UAL18510.明串珠菌属UAL280细菌素肉杆菌素BMl，piscicolin126+肉杆菌素BMl,piscicolin126肉杆菌素BMl,piscicolin126piscicolin126肉杆菌素A，BM1和B2piscicolin126,肉杆菌素AdivergicinAleucocinA未知的未知的抑制李斯特氏菌属的非LAB11.野油菜索丝菌(5rac^oA/7'xc纖pe欲/s)brochocinCATCC4375412.金黄色葡萄球菌A5313.*广展矢豆丰干菌(Brevibacteriumlinens)ATCC917514.扩展短杆菌0C215.双歧双歧杆菌NCFB1454金霉素(aureocin)A53未知的linenscinOC2bifidocinB肉来源的抑制李斯特氏菌的LAB16.C.画/tora麵"'c調LV61肉杆菌素A17.Cma/torow""cwwVI肉杆菌素BMl，piscicolin12618.C.wtftorowWc,CP5肉杆菌素BM1和B219.C.顧/Zaraw油'c画JG126piscicolin12620.肉杆菌属377camocinH21.C.ma/tora聽Z/cU149carnocinU14922.广布肉杆菌750divergicin75023.乳酸片球菌(尸.a"'A7ac""')PACl.O片球菌素PA-124.乳酸片球菌E片球菌素PA-125.乳酸片球菌F片球菌素PA-126.乳酸片球菌H片球菌素PA-127.乳酸片球菌JDl-23片球菌素PA-128.乳酸片球菌M片球菌素PA-129.戊糖片球菌(尸.peWc^aceM)Z102片球菌素PA-130.植物乳杆菌WHE92片球菌素PA-131.植物乳杆菌ALC01片球菌素PA-132.清酒乳杆菌清酒亚种Lb706sakacinAB.清酒乳杆菌清酒亚种CTC494sakacinA34.弯曲乳杆菌(Z.cwrv"/wj)LTH1174sakacinA35.清酒乳杆菌清酒亚种LTH673sakacinP36.清酒乳杆菌清酒亚种674sakacinP37.巴伐利亚乳杆菌CZ^"o6ac///^sakacinP&ava"'cws)Ml40138.清酒乳杆菌清酒亚种MNbavaricinMN39.屎肠球菌CTC492肠道菌素A和B40.屎肠球菌T136肠道菌素A和B41.屎肠球菌WHE81肠道菌素A和B42.屎肠球菌BFE900肠道菌素A和B43.屎肠球菌L50肠道菌素L50A和L50B,P,Q44.屎肠球菌DPC114645.屎肠球菌EK1346.屎肠球菌P1347.屎肠球菌AA1348.屎肠球菌G1649.屎肠球菌JCM5804T50.铅黄肠球c磁e/y/a窗)IM416K151.肉色明c"r"ay膽)401052.植物乳杆菌UG153.屎肠球菌CRL3554.干酪乳杆菌(Za"o6ac///^c^we/)CRL70555.清酒乳杆菌清酒亚种CTC49456.肉色明串珠菌57.肉色明串珠菌58.短乳杆菌(丄a"o6ac/〃M6rcWOVB28659.植物乳杆菌CTC30560.植物乳杆菌CTC30661.清酒乳杆菌清酒亚种CTC372肠道菌素A肠道菌素A和P肠道菌素P肠道菌素P肠道菌素P肠道菌素A,B,P肠道菌素416K1串珠菌(丄ewconoWocleucocin禾卩ACplantaricinUG1肠道菌素CRL35lactocinCRL705sakacinKleucocinF10leucocinB-Tallabrevicin286未知的未知的未知的抑制李斯特氏菌的LAB62.C.腿/tor麵""'c画CS52663.唾液链球菌嗜热亚种(5V，Zococctw//jevnopW/w力Sfil364.粪肠球菌(E/aecato)EJ9765.粪肠球菌BFE107166.粪肠球菌FAIR-E30967.粪肠球菌Y171768.粪肠球菌LMG233369.粪肠球菌DPC528070.粪肠球菌S-4871.粪肠球菌INIA472.植物乳杆菌ALC0173.Lb.Sake251274.植物乳杆菌423未知的耐热革裥菌素13肠道菌素EJ97肠道菌素1071肠道菌素1071细菌素31enterolysinAenterolysinA肠道菌素AS-48肠道菌素AS-48片球菌素PA-1sakacinGplantaricin42375.蒙氏肠球菌CE她racocc"5腿"必')AT06mundticin76.蒙氏肠球菌NFR17393mundticinKS77.布氏孚L杆菌(丄a"o6a"7/zw16wc/we")buchnericin-LB78.德氏乳杆菌乳亚种(丄./acto)MMFII乳球菌素MMFII79.德氏乳杆菌乳亚种UL720diacetinB80.鸡乳杆-菌Cfiy^racoccwi"g"〃/"arww)012肠道菌素01281.植物乳杆菌plantaricinNA82.肠膜明串珠菌(￡ewco"oWocmsscnterocin52A應s加era/(ie力FR5283.肠膜明串珠菌Y105mesentericinY105抑制李斯特氏菌的羊毛硫抗生素84.德氏乳杆菌乳亚种乳链菌肽85.德氏乳杆菌乳亚种乳链菌肽z86.德氏乳杆菌乳亚种61-14乳链菌肽Q87.德氏乳杆菌乳亚种DPC3147乳链球菌素3147其它产生细菌素的细菌88.德氏乳杆菌乳亚种乳球菌素A,B，M89.德氏乳杆菌乳亚种LMG280乳球菌素G90.德氏乳杆菌乳亚种IPLA972乳球菌素97291.德氏乳杆菌乳亚种DPC5552乳链球菌素48192.德氏乳杆菌乳亚种BGMN1-5LsbA,LsbB93.约氏乳杆菌(丄a"o6ac/〃ws乂o/m犯m7)VPI莴苣苦素(lactacin)F謹894.嗜酸孚L杆菌(丄a"o6ac/〃wsac/t/op/W"i1)acidocinBM4695.嗜酸乳杆菌N2莴苣苦素B96.加氏乳杆菌LA39gassericinA97.唾液乳杆菌UCC118ABP-11898.植物乳杆菌CllplantaricnE/F,J/K99.植物乳杆菌NC8plantaricinNC8100.詹氏丙酸丰干菌CPrap/o"/6acfehww丙酸菌素SM1ye"sem'〖)DF1101.大肠杆菌(五ir/2e"'c/zz'aco//)大肠菌素v102大肠杆菌大肠菌素Y101103.大肠杆菌104.表皮葡萄球菌(51fa;/iy/oco"wj，V;fe,加X)105.枯草芽孢杆菌CSac!7/w^wWfc)168106.加氏乳杆菌107.肺炎克雷伯氏菌(K/e6w'e&108.酪丁酸梭菌(C7oWavW/ww0^。6"0^'cz/附)ADRIAT932109.手早氏梭菌(C/ay/r/(i'ww6e々'en'"cfe7)ATCC25752110.食淀粉乳杆菌(Z^cto6ac///ja，/ovori")DCE471111.植物乳干菌SA6112.清酒乳杆菌清酒亚种L45微生物素H47subtilosinAgassericinK7B微生物素E492Closticin574circularinA胞外多糖L471plantaricinSA6lactocinS将下面的生物素称为由革兰氏阴性细菌产生的微生物素-1.肺炎克雷伯氏菌RYC492微生物素E492(与107相同)2.大肠杆菌微生物素V(与101相同，旧称大肠菌3.大肠杆菌4.大肠杆菌5.大肠杆菌6.大肠杆菌微生物素Y101(与102相同)微生物素H47微生物素L微生物素2411.参考文献Aguirre,M.andCollins,M.D.(1993)Lacticacidbacteriaandhumanclinicalinfection.Jot/ma/oMpp//'eafSacfen'ofogy75:95-107.Ahn，C.andStiles,M.E.(1990a)Antibacterialactivityoflacticacidbacteriaisolatedfromvacuum-packagedmeats.Jowma/ofApp/)'edSacterio/ogry69:302-310.Ahn，C.andStiles,M.E.(1990b)Plasmid-associatedbacteriocinproductionbyastrainofCamojbacterit/mp/sc'.co/afrommeat./App//ec(andBrWronmenfa/MCo/ogy56:2503-2510.Ajdic，D.;McShan,W.M.;McLaughlin,R.E.;Savic,G.;Chang,丄；Carson,M.B.;Primeaux,C.;Tian,R.;Kenton,S.;Jia,H.;Lin，S.;Qian,Y.;Li,S.;Zhu,H.;Najar，F.;Lai,H,;White,丄；Roe,B.A.andFerretti,丄丄(2002)GenomesequenceofSfreptococcus/77t/fansUA159,acariogenicdentalpathogen.Proceetf/ngsof〖SeA/af/ona/AcademyofSc/encesofL/n/tec/SfatesofAmen'ca99:14434-14439.AmericanTypeCultureGollecfioh(^TCC):CollectionsandRepository(2004a).BiosafetyLevelsUR":''"\_fittp:〃www.atcc.oraTechnica!linfo/BiosafetvLevels.cfmAmericanTypeCultureCollection(ATCC):.CollectionsandRepository(2004b).Bacteria.ATCCNumbers:43225&35586(jRL:http:〃www.atcc.org/SearchCatalogs/AtccNumber.cfmfonrrte>ct=emptyAmezquita,A.andBrashears，M.M.(2002)Competitiveinhibitionof/isfe广/amonocytogenesinready-toeatmeatproductsbylacticacidbacteria.Jo,a/ofFooc/Protecf/on65:315~325.AntibiogramCommitteeoftheFrenchSocietyforMicrobiology(1998)1998Statement.ExfrarfctePafho/og/eS/'o/og/e46:1-16(translatedfromFrench).Barakat，R.K.;Griffiths,M.W.andHarris,L.丄(2000)IsolationandcharacterizationofCamo￡>acte/7'um,Lactococc"s,andEnte厂ococct;sspp.fromcooked,modifiedatmospherepackaged,refrigerated,poultrymeat,/ntemaf/ona/Jouma/ofFoodMcrab/.o/ogy62:83-94.Baya,A.M.;Toranzo,A.E.;Lupiani,B.;Li,T.;Roberson，B.S.andHetrick,F.M.(1991JBiochemicalandserologicalcharacterizationofCamobacterfumspp.isolatedfromfarmedandnaturalpopulationsofstripedbassandcatfish.App/,'ec/and&7v/ronmenfa/M/crob/o/ogy57:3114-3120.Biocca'E.andSeppilli,A.(1946)HumaninfectionscausedbyLactobacilli,Lactobac/〃,'112-115.Borriello,S,P.;Hammes,W.P.;Ho!zapfel,W,;Marteau,P.;Schrezenmeir，丄；Vaara,M.andValtonen,V.(2003)Safetyofprobioticsthatcontainlactobacilliorbifidobacteria.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