专利名称：一种低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，属再生资源化学生物学领域。
背景技术：
低分子量壳聚糖和壳寡糖是甲壳素脱乙酰化后的降解产物，具有比大分子量壳聚糖更好的溶解性、生物相容性。不同分子量的壳聚糖具有不同的生物生理活性，所以制备不同分子量的壳聚糖对于壳聚糖应用于食品、医药等方面具有重要意义。目前制备低分子量壳聚糖和壳寡糖的方法主要有化学法和生物法，化学法反应过程剧烈，不容易获得低分子量壳聚糖而且产物结构被修饰。酶法降解只是打断壳聚糖的β(1-4)糖甙键，一般不改变壳聚糖分子的残基结构，而专一性酶价格昂贵、不易大量获得，不适合低分子量壳聚糖和壳寡糖的工业化生产；使用自由酶水解制备低分子量壳聚糖和壳寡糖，酶在反应后不能重复使用，不经济，反应条件苛刻，产物含有0.1％(w/w)糖与酶蛋白的复合物，这种产物由于可以导致热原反应而不能将其应用于食品、医药等领域。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种可连续制备几乎不含酶蛋白复合物的低分子量壳聚糖或壳寡糖的方法。该方法利用中性蛋白酶为非专一性酶，可以有效降解壳聚糖，可以工业化生产，价廉，品质稳定的优点，将中性蛋白酶用交联法固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上，提高了酶活力，扩大了酶对温度和pH的稳定性，避免了降解产物与酶蛋白复合物的产生，提高了产物产率，减小了产物的分子量分布。
本发明提供的技术方案是制备低分子量壳聚糖或壳寡糖时首先用N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球作为中性蛋白酶固定化的载体，以戊二醛作交联剂，制得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶，然后用制得的固定化酶水解壳聚糖，按需控制酶解反应时间，即可得到所需低分子量壳聚糖或壳寡糖。
无酶蛋白复合物的低分子量壳聚糖或壳寡糖制备方法的具体步骤如下
(1)将N-琥珀酰壳聚糖溶于水中，制得浓度为0.25-0.40g/ml的N-琥珀酰壳聚糖水溶液，在磁力搅拌下将此溶液逐滴挤入由0.1-0.3g/ml的氯化钙溶液和无水乙醇以体积比3∶7～7∶3混合形成的凝固液中获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，将N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球在凝固液体系中保持2-6小时，得到固定化载体N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。
(2)过滤除去凝固液，将N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球置于溶有戊二醛的0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH值为3.0-5.0的缓冲溶液中，溶液中戊二醛的体积百分比浓度为0.5-1.5％，N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球与交联剂戊二醛的质量(湿重)体积比为1∶3～1∶10，室温下连续振荡4-12小时，然后过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用水或0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收，得到交联固定化载体。
(3)将与固定化载体重量比为0.2-1.5的中性蛋白酶溶于0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH为3.0-5.0的缓冲溶液中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡2-6小时，过滤除去酶溶液，再用0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH为3.0-5.0的缓冲溶液中洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。
(4)将脱乙酰度范围在75％-95％的壳聚糖溶解于体积百分比浓度为0.5-1.5％醋酸溶液中，用0.05-1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.0-6.0，然后加入固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶，加入的酶为壳聚糖质量的3％-10％，在45-55℃连续振荡所需时间，过滤收集降解产物，得到低分子量壳聚糖或壳寡糖。
将降解产物真空浓缩后用1-5mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，用乙醇沉降、洗涤，真空干燥可获得重均分子量在2.35万～1900的自由氨基形式低分子量壳聚糖和壳寡糖。当酶催化水解反应时间为0.5-5小时之间时，获得低分子量壳聚糖，当酶催化水解反应时间大于等于5小时，获得壳寡糖。
如果将使用过的固定化酶用0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH值为3.0-5.0的缓冲溶液中洗涤，可除去固定化酶上吸附的降解产物，使固定化酶重复使用，若再加入新的壳聚糖溶液，就可实现连续制备不含酶蛋白复合物的低分子量壳聚糖和壳寡糖。
该方法中所用壳聚糖的分子量范围最好为12.8万-64.8万。
N-琥珀酰壳聚糖是壳聚糖的衍生物，可由壳聚糖和丁二酸酐反应制备(N-琥珀酰壳聚糖的制备方法可以参照有关文献制备)。由于丁二酸酐在取代一部分壳聚糖氨基的同时引入了羧基，阻止了壳聚糖的氨基和羟基形成氢键，从而提高了水溶性。同时，N-琥珀酰壳聚糖取代了一部分壳聚糖氨基，降低了交联剂戊二醛的用量，保持了固定化酶较高的酶活。此外，在固定化酶载体上引入羧基，增加了载体与酶的亲和力，提高了酶的固定化率。所以，N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球适合作为酶的固定化载体。本发明提供的N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球具有较好的机械性能，且此固定化酶在反复使用过程中酶活损失较小，连续降解壳聚糖40小时仍保持了其最初活力的82.5％。使用固定化酶降解壳聚糖，水解产物中几乎不含有糖/酶蛋白的复合物，所以，由此方法制得的低分子量壳聚糖和壳寡糖不会由于复合的酶蛋白而产生热原反应，所以尤其适用于医药、食品等领域。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明提供的制备无酶蛋白复合物的低分子量壳聚糖或壳寡糖的方法作详细说明。
实施例1将N-琥珀酰壳聚糖制成0.25g/ml水溶液，在磁力搅拌下用注射器(3#针头)逐滴挤入30ml 0.3g/ml氯化钙和70ml无水乙醇形成的混和溶液中，室温持续搅拌6小时，获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。称取此水凝胶球4g(湿重)，置于12ml溶有体积百分比为0.5％戊二醛的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.05M，pH 3.0)中，室温振荡12小时。过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用水反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收。将与固定化载体重量(湿重)比为0.2的中性蛋白酶溶于0.05M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 3.0)中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡6小时。然后，过滤除去酶溶液，用0.05M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 3.0)洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。将0.1g壳聚糖(重均分子量64.8万，脱乙酰度75％)溶解于10ml 0.5％(v/v)醋酸溶液中，用0.05mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.0，加入酶蛋白与壳聚糖质量比为3％的固定化酶，在45℃连续振荡0.5小时，过滤收集降解产物，真空浓缩后用1mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥获得重均分子量为2.35万，分子量分布5.31，产率91.4％的自由氨基形式低分子量壳聚糖。
实施例2将N-琥珀酰壳聚糖制成0.30g/ml水溶液，在磁力搅拌下用注射器(4#针头)逐滴挤入40ml 0.15g/ml氯化钙和60ml无水乙醇形成的混和溶液中，室温持续搅拌3小时，获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。称取此水凝胶球4g(湿重)，置于16ml溶有体积百分比为0.8％戊二醛的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.2M，pH 3.5)中，室温振荡10小时。过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用水反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收。将与固定化载体重量(湿重)比为0.45的中性蛋白酶溶于0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 3.5)中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡3小时。然后，过滤除去酶溶液，用0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 3.5)洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。将0.1g壳聚糖(重均分子量38.6万，脱乙酰度86％)溶解于10ml 0.8％(v/v)醋酸溶液中，用0.1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.4，加入酶蛋白与壳聚糖质量比为5％的固定化酶，在50℃连续振荡1小时，过滤收集降解产物，真空浓缩后用2mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥获得重均分子量为1.58万，分子量分布4.77，产率87.9％的自由氨基形式低分子量壳聚糖。
实施例3将N-琥珀酰壳聚糖制成0.30g/ml水溶液，在磁力搅拌下用注射器(5#针头)逐滴挤入50ml 0.2g/ml氯化钙和50ml无水乙醇形成的混和溶液中，室温持续搅拌4小时，获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。称取此水凝胶球4g(湿重)，置于20ml溶有体积百分比为1.0％戊二醛的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.3M，pH 4.0)中，室温振荡8小时。过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用0.3M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 4.0)反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收。将与固定化载体重量(湿重)比为0.6的中性蛋白酶溶于0.3M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 4.0)中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡4小时。然后，过滤除去酶溶液，用0.3M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 4.0)洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。将0.1g壳聚糖(重均分子量26.8万，脱乙酰度92％)溶解于10ml 1.0％(v/v)醋酸溶液中，用0.5mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.7，加入酶蛋白与壳聚糖质量比为5％的固定化酶，在55℃连续振荡2小时，过滤收集降解产物，真空浓缩后用3mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥获得重均分子量为1.08万，分子量分布4.18，产率81.3％的自由氨基形式低分子量壳聚糖。
实施例4将N-琥珀酰壳聚糖制成0.40g/ml水溶液，在磁力搅拌下用注射器(6#针头)逐滴挤入60ml 0.3g/ml氯化钙和40ml无水乙醇形成的混和溶液中，室温持续搅拌6小时，获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。称取此水凝胶球4g(湿重)，置于30ml溶有体积百分比为1.2％戊二醛的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.45M，pH 4.5)中，室温振荡6小时。过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用0.45M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 4.5)反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收。将与固定化载体重量(湿重)比为1.2的中性蛋白酶溶于0.45M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 4.5)中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡4小时。然后，过滤除去酶溶液，用0.45M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 4.5)洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。将0.1g壳聚糖(重均分子量12.8万，脱乙酰度95％)溶解于10ml 1.0％(v/v)醋酸溶液中，用0.8mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.4，加入酶蛋白与壳聚糖质量比为8％的固定化酶，在48℃连续振荡4小时，过滤收集降解产物，真空浓缩后用4mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥获得重均分子量为4500，分子量分布3.32，产率72.4％的自由氨基形式低分子量壳聚糖。
实施例5将N-琥珀酰壳聚糖制成0.40g/ml水溶液，在磁力搅拌下用注射器(7#针头)逐滴挤入70ml 0.1g/ml氯化钙和30ml无水乙醇形成的混和溶液中，室温持续搅拌2小时，获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。称取此水凝胶球4g(湿重)，置于40ml溶有体积百分比为1.5％戊二醛的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(0.5M，pH 5.0)中，室温振荡4小时。过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用用0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 5.0)反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收。将与固定化载体重量(湿重)比为1.5的中性蛋白酶溶于0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 5.0)中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡2小时。然后，过滤除去酶溶液，用0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中(pH 5.0)洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。将0.1g壳聚糖(重均分子量50.8万，脱乙酰度81％)溶解于10ml 1.5％(v/v)醋酸溶液中，用1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到6.0，加入酶蛋白与壳聚糖质量比为10％的固定化酶，在50℃连续振荡5小时，过滤收集降解产物，真空浓缩后用5mol/l的氢氧化钠调pH 8-9，乙醇沉淀，乙醇洗涤，真空干燥获得重均分子量为1900，分子量分布1.28，产率61.4％的自由氨基形式壳寡糖。
权利要求
1.一种低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于制备低分子量壳聚糖或壳寡糖时首先用N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球作为中性蛋白酶固定化的载体，以戊二醛作交联剂，制得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶，然后用制得的固定化酶水解壳聚糖，按需控制酶解反应时间，即可得到所需低分子量壳聚糖或壳寡糖。
2.根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于采用的具体步骤如下(1)将N-琥珀酰壳聚糖溶于水中，制得浓度为0.25-0.40g/ml的N-琥珀酰壳聚糖水溶液，在磁力搅拌下将此溶液逐滴挤入由0.1-0.3g/ml的氯化钙溶液和无水乙醇以体积比3∶7～7∶3混合形成的凝固液中获得N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，将N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球在凝固液体系中保持2-6小时，得到固定化载体N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球。(2)过滤除去凝固液，将N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球置于溶有戊二醛的0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH值为3.0-5.0的缓冲溶液中，溶液中戊二醛的体积百分比浓度为0.5-1.5％，N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球与交联剂戊二醛的质量(湿重)体积比为1∶3～1∶10，室温下连续振荡4-12小时，然后过滤收集交联N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球，用水或0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液反复洗涤，直至洗涤液在245nm处无吸收，得到交联固定化载体。(3)将与固定化载体重量比为0.2-1.5的中性蛋白酶溶于0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH为3.0-5.0的缓冲溶液中，在此酶溶液中加入交联固定化载体，室温连续振荡2-6小时，过滤除去酶溶液，再用0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH为3.0-5.0的缓冲溶液中洗涤固定化酶，直至洗涤液在280nm处无吸收，获得固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶。(4)将脱乙酰度范围在75％-95％的壳聚糖溶解于体积百分比浓度为0.5-1.5％醋酸溶液中，用0.05-1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液pH值到5.0-6.0，然后加入固定在N-琥珀酰壳聚糖水凝胶球上的中性蛋白酶，加入的酶为壳聚糖质量的3％-10％，在45-55℃连续振荡所需时间，过滤收集降解产物，得到低分子量壳聚糖或壳寡糖。
3.根据权利要求2所述的低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于将过滤收集的降解产物真空浓缩后用1-5mol/l的氢氧化钠调节pH值到8-9，用乙醇沉淀、洗涤，真空干燥获得重均分子量在2.35万～1900的自由氨基形式的低分子量壳聚糖或壳寡糖。
4.根据权利要求2所述的低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于当酶催化水解反应时间为0.5-5小时之间时，获得低分子量壳聚糖，当酶催化水解反应时间大于等于5小时，获得壳寡糖。
5.根据权利要求2所述的低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于最后将用过的固定化酶用0.05-0.5M柠檬酸-磷酸氢二钠、pH为3.0-5.0的缓冲溶液洗涤，除去固定化酶上吸附的降解产物，使其能重复使用。
6.根据权利要求1或2所述的低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法，其特征在于所用壳聚糖的分子量范围在12.8万-64.8万。
全文摘要
本发明公开了一种制备低分子量壳聚糖或壳寡糖的方法，该方法将中性蛋白酶用交联法固定在N－琥珀酰壳聚糖水凝胶球上，然后用固定化酶降解壳聚糖，控制酶解反应时间，降解产物用氢氧化钠调节pH到8－9，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥获得自由氨基形式的低分子量壳聚糖和壳寡糖。与自由酶水解壳聚糖相比，固定化酶提高了低分子量壳聚糖或壳寡糖的产率，减小了分子量分布。这种固定化酶水解壳聚糖制得的低分子量壳聚糖或壳寡糖几乎不含有糖/酶蛋白的复合物，从而更加适合应用于医药、食品等领域的低分子量壳聚糖和壳寡糖的生产。而且此固定化酶水解壳聚糖重复使用40h仍然保持其最初酶活力的82.5％以上，可以适用于工业连续生产。
文档编号C12P19/04GK1746193SQ200510019438
公开日2006年3月15日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者杜予民, 李瑾 申请人:武汉大学