专利名称：耐热菌的qc－pcr快速定量检测所用竞争模板的制备方法
技术领域：
本发明属于食品微生物检测领域，特别是涉及到耐热菌的QC-PCR快速定量检测所用竞争模板的制备方法。
背景技术：
苹果浓缩汁中含有的酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，是环状脂肪酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的一员，俗称耐热菌，是一种嗜热、嗜酸的细菌，其芽孢能经受酸性条件下的巴氏杀菌过程而存活，在适宜条件下，耐热菌在果汁中大量繁殖时，不产生气体，不改变果汁的pH值，但会产生特殊气味化合物，有时还使果汁产生轻微沉淀或雾状浑浊，对果汁感官品质有很大影响。尽管耐热菌并不致病，也不产生毒素，但其引起的果汁感官性状劣变，甚至引起果汁腐败，完全破坏了果汁的食用性和商品价值。所以，国际贸易中对苹果浓缩汁中的耐热菌含量要求很严，耐热菌是苹果浓缩汁产品的必检项目，也常常成为苹果浓缩汁贸易中的技术壁垒，从而为苹果浓缩汁的生产、贸易和商检提出了新的挑战。
我国苹果年产量位居世界第一，苹果浓缩汁生产发展迅速，生产量及出口量均居世界第一，2002年我国苹果浓缩汁加工能力为每小时处理鲜果量1500～2000吨，产品85％以上进入国际市场，年出口量30万吨左右，出口创汇1.5亿美元。然而我国苹果浓缩汁中耐热菌含量常常严重超标，在对外贸易中因耐热菌超标引起的经贸纠纷时有发生，严重影响了我国苹果浓缩汁的出口创汇，从而给苹果产业带来巨大的经济损失。耐热菌的超标成了我国苹果浓缩汁质量安全的一个瓶颈。解决这一问题的关键之一是要有快速、特异、灵敏的检测技术手段，以便及时反馈到生产线，实施有效的控制，以保证产品质量与安全。
目前国内外对苹果浓缩汁中耐热菌检测的通用方法是细菌平皿培养记数法，检测周期为4-5天，不能及时有效控制产品安全质量。关于PCR检测方法，目前有RT-PCR检测AJC中的耐热菌，及实时PCR检测AJC中的耐热菌。但前者只能定性，不能定量，况且，由于RNA的提取过程要求苛刻，反转录又使检测结果的不确定因素增多，后者除操作过程复杂外，对仪器设备要求也很高。
发明内容
本发明的目的是要公开一种耐热菌的QC-PCR(竞争定量PCR)快速定量检测所用竞争模板的制备方法。
本发明的操作步骤如下捕集目标菌进行DNA的提取→竞争模板引物设计→竞争模板的PCR扩增→凝胶电泳检测→回收竞争模板→测定回收的竞争模板浓度。
具体实施例方式
本发明按以下具体步骤进行a.捕集目标菌进行DNA的提取b.竞争模板引物设计采用构建竞争模板的原理，设计出扩增耐热菌竞争模板的引物1和引物3引物15′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′；引物35′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′；c.竞争模板的PCR扩增
c.1用引物1和引物3进行PCR扩增，获得比目标模板(298bp)中间少51bp外，其它部分相同的竞争模板(247bp)；c.2 50μL PCR扩增体系组成Taq DNA聚合酶2U， Mg2+浓度2.0mmol/L，dNTP浓度0.2mmol/L， 引物浓度0.2μmol/L，添加10％的甘油作促进剂，10×Buffer缓冲液5μL，提取的耐热菌DNA模板10μL，其余体积以无菌三蒸水补足；c.3热启动及降落PCRc.3.1在冰盒上将PCR反应体系各成分混匀c.3.2当PCR循环仪温度上升至70℃以上时，再将各扩增样品置于循环仪中扩增c.3.3退火温度由60℃降落到50℃；c.4循环程序94℃变性4min后进入PCR循环，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸补足5min；d.凝胶电泳检测d.1取10μL扩增产物及DNA Marker，加入2μL上样缓冲液(甘油-溴酚蓝溶液)，充分混匀后上样d.1.12.0％的琼脂糖凝胶d.1.280V电压d.1.3时间30-40min；d.2将电泳后的凝胶从电泳槽中取出，紫外检测仪观察电泳结果；e.回收竞争模板用DNA凝胶分离纯化试剂盒分离纯化回收竞争模板，f.测定回收的竞争模板浓度f.1核酸/蛋白质分析仪测定所回收竞争模板浓度；f.2根据竞争模板分子量计算竞争模板DNA含量；f.3将制备的竞争模板稀释成5×100～5×108个拷贝的竞争模板系列；f.4-4℃冰箱保存备用。
本发明的使用效果以50μL PCR体系，使用引物1、引物3，PCR得到除比目标模板(298bp)中间少51bp外，其它部分相同的竞争模板(247bp)，再用DNA分离纯化试剂盒可分离纯化获得所需竞争模板。经竞争模板与目标模板共扩增，当竞争模板与目标模板浓度相近时，二者具有相近的扩增效率，且两者扩增产物能够在凝胶电泳上清楚的分开。本法所制备的竞争模板可成功的用于QC-PCR对耐热菌的快速定量检测。
权利要求
1.耐热菌的QC-PCR快速定量检测所用竞争模板的制备方法，其特征是操作步骤如下捕集目标菌进行DNA的提取→竞争模板引物设计→竞争模板的PCR扩增→凝胶电泳检测→回收竞争模板→测定回收的竞争模板浓度。
2.根据权利要求1所述的耐热菌的QC-PCR快速定量检测所用竞争模板的制备方法，其特征是按以下具体步骤进行2.a捕集目标菌进行DNA的提取2.b竞争模板引物设计采用构建竞争模板的原理，设计出扩增耐热菌竞争模板的引物1和引物3引物15′-ACGGGTAGGCATCTACTTGT-3′；引物35′-AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGTGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTT-3′；2.c竞争模板的PCR扩增2.c.1用引物1和引物3进行PCR扩增，获得比目标模板(298bp)中间少51bp外，其它部分相同的竞争模板(247bp)；2.c.250μL PCR扩增体系组成Taq DNA聚合酶2U， Mg2+浓度2.0mmol/L，dNTP浓度0.2mmol/L， 引物浓度0.2μmol/L，添加10％的甘油作促进剂，10×Buffer缓冲液5μL，提取的耐热菌DNA模板10μL，其余体积以无菌三蒸水补足；2.c.3热启动及降落PCR2.c.3.1在冰盒上将PCR反应体系各成分混匀2.c.3.2当PCR循环仪温度上升至70℃以上时，再将各扩增样品置于循环仪中扩增2.c.3.3退火温度由60℃降落到50℃；2.c.4循环程序94℃变性4min后进入PCR循环，94℃30S、60℃降落到50℃30S、72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸补足5min；2.d 凝胶电泳检测2.d.1取10μL扩增产物及DNA Marker，加入2μL上样缓冲液(甘油-溴酚蓝溶液)，充分混匀后上样2.d.1.12.0％的琼脂糖凝胶2.d.1.280V电压2.d.1.3时间30-40min；2.d.2将电泳后的凝胶从电泳槽中取出，紫外检测仪观察电泳结果；2.e回收竞争模板用DNA凝胶分离纯化试剂盒分离纯化回收竞争模板，2.f测定回收的竞争模板浓度2.f.1核酸/蛋白质分析仪测定所回收竞争模板浓度；2.f.2根据竞争模板分子量计算竞争模板DNA含量；2.f.3将制备的竞争模板稀释成5×100～5×108个拷贝的竞争模板系列；2.f.4-4℃冰箱保存备用。
全文摘要
本发明公开了一种耐热菌的QC－PCR快速定量检测所用竞争模板的制备方法，其特征是按以下步骤进行捕集目标菌进行DNA的提取→竞争模板引物设计→竞争模板的PCR扩增→凝胶电泳检测→回收竞争模板→测定回收的竞争模板浓度。本发明以50μLPCR体系，使用引物1、引物3，PCR得到除比目标模板(298bp)中间少51bp外，其它部分相同的竞争模板(247bp)，再用DNA分离纯化试剂盒可分离纯化获得所需竞争模板，经竞争模板与目标模板共扩增，当竞争模板与目标模板浓度相近时，二者具有相近的扩增效率，且两者扩增产物能够在凝胶电泳上清楚地分开，本法所制备的竞争模板可成功地用于QC－PCR对耐热菌的快速定量检测。
文档编号C12Q1/68GK1900307SQ200510042978
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者李建科, 冯再平, 仇农学, 常玉华 申请人:陕西师范大学