专利名称：获自番茄的热诱导启动子的制作方法
技术领域：
该发明涉及一种获自番茄的热诱导启动子及其使用方法，尤其涉及真核基因表达调控和基因工程领域。
背景技术：
冷害、高温和干旱是常见的农业自然灾害，农业生产上抵抗自然灾害的方法很多，其中运用生物技术，特别是基因工程方法培育抗性品种是重要的生物学途径。利用基因工程进行抗性育种就是将抗性基因导入作物中，提高植物的抗逆能力。目前基因工程常用的启动子主要是组成型启动子，即启动子无环境特异性、无组织特异性、无时间特异性的恒定表达。利用组成型启动子表达抗性基因虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但在正常生长条件下，细胞内组成型表达的抗逆蛋白则是一种能量的浪费，还可能妨碍植物的正常代谢，造成转基因植物的发育异常，解决此矛盾的途径就是使用逆境胁迫专一启动子。
发明内容
本发明的目的旨在克服已有技术的不足，一是提供一种获自番茄的热诱导启动子，二是提供一种该启动子的重组载体，三是提供用该重组载体制备的转化子，四是提供该热诱导启动子、重组载体及转化子的应用。
本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现该热诱导启动子由(a)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA；或者(b)在严谨杂交条件下，能够杂交于SEQ ID NO.1所示序列、并具有热诱导启动子活性的DNA片段。
本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现该重组载体其中含有上述目的之一的获自番茄的热诱导启动子，包含用于胁迫耐受性的结构基因和/或调控基因、或者包含用于产生抗体或活性蛋白的结构基因和/或调控基因从而使其在热诱导启动子下发挥作用。
本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现该转化子是将权利要求2中所述载体导入宿主制得。
本发明的目的之三还可通过如下技术措施来实现所述的宿主为植物体。
本发明的目的之四可通过如下技术措施来实现该获自番茄的热诱导启动子、重组载体和转化子应用于植物基因工程的产业制备。它可以驱动外源基因在转基因植物中热激诱导表达，可以代替35S启动子应用于植物基因工程的研究和产业化。
本发明以番茄为例作进一步说明本发明获得了一种在双子叶植物如番茄中有效发挥作用的热诱导启动子，实现了该启动子驱动外源基因在番茄植株的热诱导表达，并且在番茄果实中也具高效热诱导表达。
通过将本发明的热诱导启动子与GUS报告基因融合并跟踪GUS酶在不同发育时期番茄果实热激处理后的表达，就可以确定该启动子在番茄果实中热诱导表达模式。
本发明的热诱导启动子是由以下方法获得的用位于番茄MT sHSP cDNA(注册号AB017134)下游的单一酶切位点EcoR I与能克隆入pBS II KS+的8种酶(BamH I、Bgl II、Kpn I、Pst I、Sac I、Spe I、Xba I、Xho I)分别双酶切番茄“中蔬四号”基因组DNA，以MT sHSP基因片段为探针做Southern杂交；根据Southern杂交结果，预测MT sHSP基因上游调控区物理图谱。结果显示，Kpn I与EcoR I双酶切的基因组DNA的杂交片段约3Kb，包括2Kb左右的上游调控序列，适合于构建质粒文库。因此，回收Kpn I与EcoR I双酶切的基因组DNA 3Kb左右的片段，连接入同样双酶切的pBS II KS+载体中，转化大肠杆菌感受态，复苏后摇菌，提取质粒，因而建成含有MT sHSP基因上游调控区2Kb左右的质粒文库。用巢式PCR方法对质粒文库进行扩增，得到的片段进行序列测定，从而克隆出MT sHSP基因起始密码子上游1915bp的上游调控序列，包括了MT sHSP基因起始密码子上游的5’UTR区。
将克隆的1.9Kb调控区构建入植物表达载体pBI 121中，得到由MT sHSP基因启动子驱动GUS基因表达的TMP-pBI重组表达载体。然后将TMP-pBI重组质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，利用叶圆盘法对番茄进行遗传转化。对热激处理的转基因植株进行GUS组织化学染色，证明该启动子为热诱导启动子；GUS荧光定量表明，热激的番茄果实中具高水平GUS表达量。
该发明的优点在于获得了一种新型的热诱导启动子，该启动子可以驱动外源基因在转基因植物中热激诱导表达，而且番茄果实中表达更强，适合构建植物表达载体用于转基因研究、而且可以随时收获基因工程产品(热激的番茄果实)用于植物基因工程产业制备。
将该启动子构建入植物表达载体，即用该启动子替换掉植物表达载体pBI121中的35S启动子构建成TMP-pBI(参见图1)，转化番茄。经GUS酶活检测该启动子在热激条件下可使外源基因GUS基因较强表达，而且番茄果实中表达更强。证明该启动子是一个热激诱导强启动子。该启动子可以驱动外源基因在转基因植物中热激诱导表达，可以代替35S启动子应用于植物基因工程的研究和产业化，番茄果实可以作为热启动的生物反应器。
图1植物表达载体TMP-pBI构建图；图2热激条件下TMP-pBI转基因番茄植株中的GUS组织化学定位；图3、图4TMP-pBI转基因番茄果实在不同热激处理下的GUS酶活变化。
具体实施例方式
实施例1启动子片断的获得Southern杂交用位于番茄线粒体小分子热激蛋白(MT sHSP)cDNA下游的单一酶切位点EcoR I和能克隆入pBS II KS+的8种酶(BamH I、BglII、Kpn I、Pst I、Sac I、Spe I、Xba I、Xho I)分别双酶切番茄基因组DNA，同时EcoR I、HindIII分别单酶切DNA作为对照；以含有内含子的MT sHSP DNA片段为探针做Southern杂交。
预测MT sHSP基因上游调控序列的物理图谱根据杂交结果显示的杂交片段的大小，预测MT sHSP基因上游调控序列的物理图谱，由此可见，Kpn I与EcoR I双酶切的基因组DNA的杂交片段约3Kb，包括2Kb左右的上游调控序列，适合于构建质粒文库。
质粒文库的构建Kpn I与EcoR I双酶切番茄基因组DNA，回收3Kb左右的片段，连入同样酶切的pBS II KS+载体中，转化大肠杆菌感受态，复苏后摇菌，提取质粒，以MT sHSP基因内部引物进行PCR检测，证明目的基因在质粒文库中，建成含有MT sHSP基因上游调控区的质粒文库。
MT sHSP基因启动子片段的获得以pBS II KS+载体上引物M13/Rv与MT sHSP基因特异引物MT/R1 PCR扩增质粒文库；第一轮PCR产物稀释1000倍作为模板，以内部另一对引物T3、M1作第二轮PCR。巢式PCR的产物连入T载体中，命名为TMP，测序，获得MT sHSP基因起始密码子上游1915bp的上游调控序列(SEQ ID NO.1)。
实施例2植物表达载体的构建、番茄遗传转化及GUS活性检测a.植物表达载体的构建用TMP载体上含SalI酶切位点的引物T3Sal与MT sHSP基因ATG上游含BamHI酶切位点的反向引物M4，扩增TMP质粒，得到1915bp的上游调控区及5’UTR区，扩增产物用SalI、BamHI酶切后连入打掉35S组成型表达启动子的pBI121载体中，从而获得番茄MT sHSP基因启动子驱动GUS基因表达的植物表达载体TMP-pBI(载体构建图谱见附录)。
b.番茄的遗传转化及再生切取番茄子叶中段，用分别含有TMP-pBI质粒的根癌农杆菌液浸染10-15min，共培养2-3天，再移至恢复培养基中培养2-3天，随后于分化培养基进行筛选，愈伤生成约一周后，含50mg/l Kan的培养基上约95％的愈伤开始逐渐变黄，死亡，只有少数(约5％)保持绿色并继续生长；抗性愈伤每两周继代一次，直至出现抗性小苗，移至生根培养基中生根，炼苗移栽即可。
c.转基因番茄植株中的GUS组织化学定位将热激处理的转基因番茄器官(根、叶、不同发育时期的的花、果)浸在X-gluc染液中，抽真空后37℃温育4-16hr。之后将材料转入70％乙醇中脱色2-3次，至阴性材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点，拍照。结果表明转基因植株的根、叶、果实热激时有较强的表达；除花柱和花瓣外，花的其他部位在不同发育时期受热激时有不同的表达。而常温条件下除了根尖等顶端分生组织有微弱表达外，其他部位均无表达。因此该启动子可用于基因工程启动外源基因表达，又不影响转基因植株的正常发育。
d.转基因番茄果实在不同热激处理下的GUS活性分析将不同发育时期的T0代转基因番茄的果实(绿果、白果、微红果、红果)在不同温度下热激处理不同时间，取果皮300mg，加入300μl提取缓冲液，8000g离心10分钟，取20μl上清液加入预热的200μl反应缓冲液(含有1mmol/l MUG)，混匀，37℃反应1小时后取100μl加入900μl终止液终止反应，用荧光分光光度计测定各样品Ex365/Em455值。结果表明，不同温度热激处理3小时条件下，果实中的GUS表达曲线与叶片中不同。番茄果实39℃长时间热激处理(如两天)能累积较高的GUS蛋白。证明该启动子可用于基因工程生产抗体或活性蛋白，番茄果实可以作为热启动的生物反应器。
本发明下面是一种获自番茄的热诱导启动子，具有SEQ ID NO.1所示的序列序列表1、SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征长度2041bp核苷酸类型双链型拓扑结构线性(b)分子类型DNA(基因组)(c)来源
生物名番茄(Lycopersicon escμllentum)品种中蔬四号(d)序列描述SEQ ID NO.1GGTACCAAAA CTTCCTCATT TCCTTTCTTG TAGAATGAGG GCAATGACCA GTTGGCCTTC CTCTTTTACT TCCCCTTTTT-1915ACCCTAAAAC TCAAATTAGT GTGCATATTA GTGCACCTTT TTGGTCCTAT TTTGGGTAGG TGGCTGCTAG ATTTGTACTA-1835CCATCTCACT TCTCTTATAC ATTTTACTCC TTTTTCAAAA CCAAAAAAGG TGAAATACCT GACTTAACTA CAGGATGTAA-1755ATTTAAAAAT GTTTTGGTGT ATGAGGCAGT GATACTGGTG TCTTAGTTGA CATAGCGCTA GCCAGGTTAT TTTCACCTTT-1675TGCTTTGTTA AAAAGTTAAT GAACAAAGCA GTCATGTATG TGTTTGTCGG TTAAGCATCA GTCAGACGAA AGCACTTCTT-1595AAGGTTTGTG GTTGCATTAT GTTATGTCTA CTAAGAACAA ATTAGAGAAG GAAACGTAAG GATTAAAATT CCCGATTGGC-1515TTTCCAATTG GATTACTTGC TTCAACTATG TTCCCCCTTC TTCAGCAAAA GCTTTTCTGT TTCCGGTTTC CTAATTTTCC-1435CACTTCTGGA AATGGACACC TACTATTTAT CATCTAGTTA CTCTGGTTTT ATGACCTTCT AGATTCCTTT GATCTTTTGA-1355TGCTTAGAGT TACAGACTCG ATCTATAAAT ATGTCCAAAA GGATATATAG GCCTGCTTTC TTATTGCAGT TGATATGACT-1275AAACAGAACT TTGTAAATTT CAGGCAAAAT CGGTTATTTC CAGATTGGTG GCTGAAAAGG CTGCTGCCCT TCAGCAGAGC-1195AACAAACTTC GTCAAGAGCT GGTGAGCTTT TATCTTTGTT TCTTTGATTT CTTTTTCATG TAGCCTAAAA TTCCAACGCT-1115TTTCTGTCAT TCTTTCCCAT CTTTGGTTTT GTTTTTCTTT TCTCCTGATT AGTCCAGGTC TCATTCTTGT GGTTAAAACT-1035TTAAACAATG TCTGTCTCTC AACAGTTTGG GTCTGACTGT TTGTTATCCT TTAGTCACAA TGCTCTACTT CATGAATCAT-955GAATCCTTTT TGTAGGAACT TGTAAAACGT GATATGACTA GAAGTCGCAG AGGTGGCGTT TCCTTCATCC CTGTCGTCGT-875GGTTGGCTTG CTGGGAATAC TTTTGGGATA CATTCTCAAA AGGTCATGAG CATTCATCAT TTTACATCTG TATCTCAACT-795CAACAGAATT GATCAGTGAA AGAAAAGAGA TTGTAGCCGG TGATAGCAGC AATTCTCACA TTGTCTTAGT TAGCTGCAGC-715CTTTAGTAGG AAAAAATTGT GCAGCTAGAA CCTTTCAATT GGCCTATATT ATAATTTTAT ATAACTTGTA GTTTCTCGTG-635TTGGATCGTA AATTGACTTT TTGTTTCTAC TTTCTGTAAA TATGAACGAG CTTTTTCGAA TATTTCAAAT ATAATGGTTC-555AAAATCGTAG TTAATCGAAG CATTTGATAA TGCTAGGTAG AATAAAATCT AAAAAGTCAA TTATCGTAAA GGGCGAAAGA-475AGAATGACTA TTTTTTGCTG TAGTTAAGGG ACAAGTTAGA TTTAAATTTT TAAGACGTAT CGACATCTTG TTCACGTTAA-395GTTTCACTTA TTTGATAAAA AATAATTGAA TAAAAGTTAA GGACATAATA GTAATTTGAA AAACCCAGAA GCGTTATGTA-315TATTGTCTAC TAGCTTCTAG AAGCGTCTTC ACGCATCCTC ACGCCACAAT TCTGGAACAT TCTACATGAT GCTTCTAAAA-235GTTTCTCGAG TCTTTTTTTC CCCTTCTCCA AGTCACTAAC GAAATATAAA ACCCAAGCAT CACATTCTCA TTTTCCATTC-155TTATCCAACA AAAAAAATCA CAACGTGAAG CTTTACTCAA TCGGCAAGTT ATTCAGAAAT CTTTTGGTAT CAGAAATGGC-75AACTCTTGCT CTAAGGAGGG CCACCGCCTC ATCACTATTC AACAGGCTCG TCAATCCTGT TCGTTCTGCA TCTGCTTTCC+6GTTCATTCAA TACTAACACT CAGATGACAG CTTATGACCA G+8权利要求
1.获自番茄的热诱导启动子，其特征在于(a)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA；或者(b)在严谨杂交条件下，能够杂交于SEQ ID NO.1所示序列、并具有热诱导启动子活性的DNA片段。
2.一种重组载体，其中含有权利要求1所述的启动子，包含用于胁迫耐受性的结构基因和/或调控基因、或者包含用于产生抗体或活性蛋白的结构基因和/或调控基因从而使其在热诱导启动子下发挥作用。
3.一种转化子，该转化子是将权利要求2中所述载体导入宿主制得。
4.根据权利要求3所述的转化子，其特征在于所述的宿主为植物体。
5.权利要求1、2、3、4描述的获自番茄的热诱导启动子、重组载体和转化子应用于植物基因工程的产业制备。
全文摘要
本发明提供一种热诱导表达启动子，由(a)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA；或者(b)在严谨杂交条件下，能够杂交于SEQ ID NO.1所示序列，并具有热诱导启动子活性的DNA片段。该启动子可以驱动外源基因在转基因植物中热激诱导表达，可以代替35S启动子应用于植物基因工程的研究和产业化。
文档编号C12N15/82GK1721538SQ20051004357
公开日2006年1月18日 申请日期2005年5月23日 优先权日2005年5月23日
发明者刘箭, 伊淑莹 申请人:山东师范大学