专利名称：高冰草液泡膜Na的制作方法
技术领域：
本发明涉及高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(TeNHX2)，属于生物技术领域。
背景技术：
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化。Na+吸收是一个复杂的过程。Na+的外排和区隔化是间接的主动运输过程，主要由Na+/H+逆向转运蛋白来调节。Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger，NHA or NHE)是细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上普遍存在的一种转运蛋白，参与细胞质内的pH、Na+浓度调节及细胞体积变化等生命活动。自1985年Blumwald和Plooe首先在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现Na+/H+逆向转运活性以来，人们相继发现在盐生植物如滨藜、兼性CAM植物冰叶日中花、甜菜等和较耐盐的甜土植物如大麦、海滨车前、长春花、棉花、向日葵等的液泡膜上普遍存在着Na+/H+逆向转运活性。Nass等在酵母的前液泡膜(prevacuole)上也发现了一种Na+/H+逆向转运蛋白。大量实验表明Na+/H+逆向转运活性的有无和高低与植物和酵母的耐盐性密切相关，在高盐浓度下植物和酵母可以分别通过质膜和液泡膜上的Na+/H+逆向转运将Na+运出细胞和将Na+区域化在液泡内，维持细胞质内Na+稳态和Na+/K+比相对稳定，以适应盐渍环境。耐盐植物能够通过Na+/H+逆向转运蛋白将大部分Na+区域化到液泡中，因而既能避免离子胁迫，又能进行渗透调节。因此Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性中的作用已越来越受到重视。目前人们已经从细菌、酵母、动物和高等植物中相继获得了编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因。
把编码液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白的基因(如拟南芥的AtNHX1与酵母的NHX1等)转化到盐敏感植物中，并使其在液泡膜上过量表达以提高植物耐盐性，是可行的植物基因工程策略。已在拟南芥、番茄、甜菜等植物获得高耐盐的转基因植株。
十倍体高冰草(Thinopyrum ponticum Podp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski))是一种盐生植物，高冰草最突出的特点就是能在其他高产作物不能生长的重盐碱土上种植。目前有关高冰草液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白2的基因及其在植物转基因工程育种中的应用还没有报道。
发明内容
针对目前还没有报道耐盐碱的十倍体高冰草(Thinopyrum ponticum Podp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski))NHX基因及其在植物转基因育种工程技术中得到应用的现状，本发明提供一种高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因、重组载体及植物转基因育种方法，将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因构建在植物表达的转化质粒上，转化小麦获得转基因植株。
本发明所提供的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(TeNHX2)，具有如SEQID NO.1所示的序列ATGGGGTACC AAGTGGTGGC GGCGCAGCTG GCGCGGCTGA GCGGCGCGCT GGGCACCTCG60GACCACGCGT CCGTGGTCTC CATCAACCTC TTCGTGGCGC TGCTCTGCGC CTGCATCGTC120CTCGGCCACC TCCTCGAGGA GAACCGCTGG CTCAACGAGT CCATCACCGC CCTCATCATC180GGGCTGTGCA CCGGCGTGGT GATCCTGATG ACCACCAAGG GGAAGAGCTC GCACGTGCTC240GTCTTCAGCG AGGACCTCTT CTTCATATAC CTCCTGCCTC CCATCATCTT CAACGCCGGT300
TTCCAGGTGA AGAAGAAGCA GTTCTTCCGG AATTTCATGA CAATCACACT ATTTGGTGCT360GTTGGGACGA TGATGTCGTT TTTCACAATA TCTCTTGCTG CCATTGCGAT ATTCAGCAGG420ATGAACATTG GGACACTGGA CGTATCAGAT TTTCTTGCAA TTGGAGCTAT CTTTTCCGCG490ACAGATTCCG TCTGCACTCT ACAGGTTCTC AATCAGGACG AGACGCCCTT TTTGTACAGT540CTGGTGTTCG GGGAAGGTGT TGTGAACGAT GCCACATCGG TCGTGCTTTT CAACGCGCTC600CAGAACTTCG ATCCTAACCA AATCGACGCG ATCGTCATTC TGAAGTTCTT GGGGAACTTC660TGCTACTTAT TCGTGTCAAG CACCTTCCTT GGAGTGTTTA CTGGATTGCT TAGTGCATAC720GTCATCAAGA AGTTATACAT AGGAAGGCAT TCTACTGACC GTGAGGTTGC ACTTGTGATG780CTCATGGCCT ACCTCTCATA TATGCTAGCT GAGCTGCTAG ATTTGAGTGG CATCCTCACT840GTATTCTTCT GTGGTATTGT GATGTCACAT TACACCTGGC ATAACGTGAC AGAGAGCTCA900AGAGTTACAA CAAAGCATGC GTTTGCAACC TTGTCCTTCA TCGCYGAGAC ATTTCTCTTC960CTTTATGTTG GGATGGATGC ACTGGATATT GAGAAGTGGA AATTTGCTAG TGACAGCCCT1020GGCAAATCCA TTGGAATAAG CTCAATTTTG CTCGGATTGG TTCTGGTTGG AAGAGCTGCT1080TTCGTCTTCC CACTCTCGTT CTTATCCAAC CTGACAAAGA AGACGGAGCT CGAAAAAATA1140AGCTGGAGGC AGCAAATCGT AATATGGTGG GCTGGGCTGA TGAGAGGAGC TGTGTCGATC1200GCTCTTGCTT ACAATAAGTT TACAAGATCT GGTCACACGC AGCTACACGG CAACGCGATA1260ATGATCACCA GCACCATCAC TGTCGTTCTG TTTAGCACTA TGCTGTTTGG CATTTTGACA1320AAGCCTCTGA TCCGGTTCCT GCTGCCCGCG TCGAGCAACG GCGCCGCCTC GGATCCCGCG1380TCACCGAAGT CCCTGCACTC TCCTCTCCTC ACAAGCCAGC TAGGCTCGGA CCTGGAGGCG1440CCTCTCCCCA TCGTGAGGCC CTCCAGCCTC CGGATGCTCA TCACCAAGCC GACCCACACC1500ATCCACTACT ACTGGCGCAA GTTCGACGAC GCGCTGATGC GCCCGATGTT CGGAGGGCGC1560GGGTTCGTGC CCTACTCCCC AGGATCACCC ACCGATCCGA ACGTACTAGT GGAATGA 1617其中，包括与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(TeNHX2)氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE 538其中，包括与SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
上述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到原核表达载体中，通过本领域公知的研究方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入原核生物，通过诱导，大量表达出高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。其中，原核表达载体优选原核表达载体pET-24a。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2可用于研究高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2的结构、功能以及抗体制备。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因转入作物和牧草，培育出抗盐品质优良的品种/系。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到任何基于Ti-质粒双元载体中，通过本领域公知的研究方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入农杆菌中，进行农杆菌转化。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因作为目的基因，构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重复序列，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos，还有在真核生物中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中还有玉米泛素超强启动子Ubi和绿色荧光蛋白GFP基因；高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上，并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
本发明所提供的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的Ti-质粒双元载体转基因育种方法为1)构建的双元转化重组载体质粒pBIUbiGFPTeNHX2转化于农杆菌中，通过农杆菌苗端转化法侵染植物，从而获得转基因植株。优选双元转化重组载体pBIUbiGFPTeNHX2转化于农杆菌AGLl中，通过农杆菌苗端转化法侵染小麦，从而获得转基因小麦。其中，根癌土壤农杆菌AGL1是公知公用菌株。
2)转基因株系的检测方法用PCR和SOUTHERN印迹杂交法检测转基因植株叶片中TeNHX2基因。
本发明提供了一种高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及其应用，突破了TeNHX2基因还没有在植物转基因工程育种中得到应用的现状，首次将TeNHX2基因构建在植物表达的转化质粒，以Ti-质粒双元载体pBIUbiGFPTeNHX2转化小麦并且获得了转基因植株，经鉴定转基因植株的耐盐性明显的得到提高。TeNHX2基因转基因小麦的T1代植株表现出明显的抗盐性，不同株系的T1代植株在170mM NaCl上的成活率为66％-83％，高于对照中国春(44％)，在170mM NaCl上的成活率为27％-38％，高于对照中国春(0％)。
本方明的转基因重组载体可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物的抗盐性。
图1、高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因Ti-质粒双元载体构建2、高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因简并引物扩增结果其中，1，2分别是不同的模板浓度，M为入DNA的EcoRI+HindIII双切Maker图3、高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的3’RACE其中，M为100bp Lader，1，2，3代表不同的重复图4、高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的5’RACE其中，M为100bp Lader，1，2代表不同的重复图5、高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长cDNA扩增其中，M为100bp Lader，1，2代表不同的重复图6、转基因T1代的Southern杂交结果其中，MλDNA(HindIII+EcoRI)，B53，B59转基因植株，wt野生型中国春，+质粒pBIUbiGFPTeNHX具体实施方式
1.高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片断的克隆Trizol法提取萌发2周左右的高冰草幼苗的总RNA，PowerScriptTM逆转录酶反转录合成第一链cDNA，用兼并引物P15`-GAT TCT GTW TGC ACM YTR CAG GT-`3，P25`-CAT KAG MCC AGC CCA CCA WAT-`3进行PCR扩增，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA模板250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，59℃复性1min，72℃延伸1min。最后保持在72℃下延伸10min。
2.高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因3末端的获得根据高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片段的序列，设计3’RACE基因特异引物P15’-GCA CCC TAC AGG TTC TC-3’，巢式引物P25’-CCG AGA CTT TTC TTTTCC-3’。先使用引物Pl和引物Olig(dT)18，以反转录的cDNA为模板扩增，产物稀释50倍，以巢式引物P2和Olig(dT)18经过巢式PCR，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，55℃复性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
3.高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因5末端的获得根据高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片段的序列设计5’RACE基因特异引物.P15’-ATC CTG GGG AGT AGG GCA CGA AC-3’，巢式引物P25’-GTC TCGGCG ATG AAG GAC AAG GT-3’。先使用引物P1和引物UMP，以反转录的cDNA为模板扩增，产物稀释50倍，以引物巢式引物P2和NUMP经过巢式PCR，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，55℃复性1min，72℃延伸3min。最后保持在72℃下延伸10min。
4.高冰草Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长cDNA的获得根据5`Race和3`Race的结果，设计了引物对P15’-ACC GGT ATG GGG TAC CAAGTG GTG-3’，P25’-CCA TGG ATT CCA CTA GTA CGT TCG-3’，扩增cDNA模板获得全长片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，51℃复性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
5.高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因测序用克隆载体构建将PCR扩增产物电泳后分离相应大小的条带回收后与pUCm-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过PCR法、酶切质粒法等进行验证克隆产物是否正确，然后进行测序证明此基因已经成功的以克隆质粒的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
6.高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的Ti-质粒双元载体构建用于构建双元转化-表达载体的质粒是由pBI121改造而来。首先将pBI121内的GUS基因用BamHI和SacI去除，然后与pIRES-EGFP质粒上用BamHI和SacI酶切的GFP基因连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIGFP)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
将载体pBIGFP内的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)，用HindIII和BamHI去除，然后与pAL76质粒上用HindIII和BamHI酶切的玉米泛素超强启动子Ubi连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIUbiGFP)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
作为目的基因使用的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2，使用的内切酶是AgeI和NcoI。将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIUbiGFPTeNHX2)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
7.高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因Ti-质粒双元载体的转基因育种取中国春的种子，升汞灭菌10min，蒸馏水洗涤3次，整齐置于9cm培养皿中，25℃下露白。在4℃，黑暗条件下春化1个月以上。用双面刀片切出生长点，并滴加1-2滴的含有pBIUbiGFPTeNHX2质粒的农杆菌AGL1菌液，继续在培养皿中培养至新叶长出，移栽。用PCR筛选出转基因植株，将转基因植株加代。
选取两个转基因株系的T1代，提取萌发长势旺盛时期叶片的总DNA，用高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长序列作为探针，进行Southern杂交，表明高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因在转基因株系B53和B59基因组中存在。
选取四个转基因株系的T1代幼苗分别在添加170mM和300mM的NaCl的MS营养液培养5天后，全部的转基因株系表现出比野生型中国春更高的成活率。其中两个转基因株系在300mM的成活率分别达到50％和38％，而野生型中国春全部萎蔫死亡。(见表1)表1转基因株系T1代在不同盐浓度下的成活率比较
序列表SEQ ID NO.1<110>山东大学<120>高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及应用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1617<212>DNA<213>高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因<400>
atggggtacc aagtggtggc ggcgcagctg gcgcggctga gcggcgcgct gggcacctcg60gaccacgcgt ccgtggtctc catcaacctc ttcgtggcgc tgctctgcgc ctgcatcgtc120ctcggccacc tcctcgagga gaaccgctgg ctcaacgagt ccatcaccgc cctcatcatc180gggctgtgca ccggcgtggt gatcctgatg accaccaagg ggaagagctc gcacgtgctc240gtcttcagcg aggacctctt cttcatatac ctcctgcctc ccatcatctt caacgccggt300ttccaggtga agaagaagca gttcttccgg aatttcatga caatcacact atttggtgct360gttgggacga tgatgtcgtt tttcacaata tctcttgctg ccattgcgat attcagcagg420atgaacattg ggacactgga cgtatcagat tttcttgcaa ttggagctat cttttccgcg490acagattccg tctgcactct acaggttctc aatcaggacg agacgccctt tttgtacagt540ctggtgttcg gggaaggtgt tgtgaacgat gccacatcgg tcgtgctttt caacgcgctc600cagaacttcg atcctaacca aatcgacgcg atcgtcattc tgaagttctt ggggaacttc660tgctacttat tcgtgtcaag caccttcctt ggagtgttta ctggattgct tagtgcatac720gtcatcaaga agttatacat aggaaggcat tctactgacc gtgaggttgc acttgtgatg780ctcatggcct acctctcata tatgctagct gagctgctag atttgagtgg catcctcact840gtattcttct gtggtattgt gatgtcacat tacacctggc ataacgtgac agagagctca900agagttacaa caaagcatgc gtttgcaacc ttgtccttca tcgcygagac atttctcttc960ctttatgttg ggatggatgc actggatatt gagaagtgga aatttgctag tgacagccct1020ggcaaatcca ttggaataag ctcaattttg ctcggattgg ttctggttgg aagagctgct1080ttcgtcttcc cactctcgtt cttatccaac ctgacaaaga agacggagct cgaaaaaata1140agctggaggc agcaaatcgt aatatggtgg gctgggctga tgagaggagc tgtgtcgatc1200gctcttgctt acaataagtt tacaagatct ggtcacacgc agctacacgg caacgcgata1260atgatcacca gcaccatcac tgtcgttctg tttagcacta tgctgtttgg cattttgaca1320aagcctctga tccggttcct gctgcccgcg tcgagcaacg gcgccgcctc ggatcccgcg1380tcaccgaagt ccctgcactc tcctctcctc acaagccagc taggctcgga cctggaggcg1440cctctcccca tcgtgaggcc ctccagcctc cggatgctca tcaccaagcc gacccacacc1500atccactact actggcgcaa gttcgacgac gcgctgatgc gcccgatgtt cggagggcgc1560gggttcgtgc cctactcccc aggatcaccc gccgatccga acgtactagt ggaatga 1617
SEQ ID NO.2<110>山东大学<120>高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及应用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>2<211>538<212>PRT<213>高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因氨基酸序列<400>
MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE 538
权利要求
1.高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的序列ATGGGGTACC AAGTGGTGGC GGCGCAGCTG GCGCGGCTGA GCGGCGCGCT GGGCACCTCG 60GACCACGCGT CCGTGGTCTC CATCAACCTC TTCGTGGCGC TGCTCTGCGC CTGCATCGTC 120CTCGGCCACC TCCTCGAGGA GAACCGCTGG CTCAACGAGT CCATCACCGC CCTCATCATC 180GGGCTGTGCA CCGGCGTGGT GATCCTGATG ACCACCAAGG GGAAGAGCTC GCACGTGCTC 240GTCTTCAGCG AGGACCTCTT CTTCATATAC CTCCTGCCTC CCATCATCTT CAACGCCGGT 300TTCCAGGTGA AGAAGAAGCA GTTCTTCCGG AATTTCATGA CAATCACACT ATTTGGTGCT 360GTTGGGACGA TGATGTCGTT TTTCACAATA TCTCTTGCTG CCATTGCGAT ATTCAGCAGG 420ATGAACATTG GGACACTGGA CGTATCAGAT TTTCTTGCAA TTGGAGCTAT CTTTTCCGCG 490ACAGATTCCG TCTGCACTCT ACAGGTTCTC AATCAGGACG AGACGCCCTT TTTGTACAGT 540CTGGTGTTCG GGGAAGGTGT TGTGAACGAT GCCACATCGG TCGTGCTTTT CAACGCGCTC 600CAGAACTTCG ATCCTAACCA AATCGACGCG ATCGTCATTC TGAAGTTCTT GGGGAACTTC 660TGCTACTTAT TCGTGTCAAG CACCTTCCTT GGAGTGTTTA CTGGATTGCT TAGTGCATAC 720GTCATCAAGA AGTTATACAT AGGAAGGCAT TCTACTGACC GTGAGGTTGC ACTTGTGATG 780CTCATGGCCT ACCTCTCATA TATGCTAGCT GAGCTGCTAG ATTTGAGTGG CATCCTCACT 840GTATTCTTCT GTGGTATTGT GATGTCACAT TACACCTGGC ATAACGTGAC AGAGAGCTCA 900AGAGTTACAA CAAAGCATGC GTTTGCAACC TTGTCCTTCA TCGCYGAGAC ATTTCTCTTC 960CTTTATGTTG GGATGGATGC ACTGGATATT GAGAAGTGGA AATTTGCTAG TGACAGCCCT 1020GGCAAATCCA TTGGAATAAG CTCAATTTTG CTCGGATTGG TTCTGGTTGG AAGAGCTGCT 1080TTCGTCTTCC CACTCTCGTT CTTATCCAAC CTGACAAAGA AGACGGAGCT CGAAAAAATA 1140AGCTGGAGGC AGCAAATCGT AATATGGTGG GCTGGGCTGA TGAGAGGAGC TGTGTCGATC 1200GCTCTTGCTT ACAATAAGTT TACAAGATCT GGTCACACGC AGCTACACGG CAACGCGATA 1260ATGATCACCA GCACCATCAC TGTCGTTCTG TTTAGCACTA TGCTGTTTGG CATTTTGACA 1320AAGCCTCTGA TCCGGTTCCT GCTGCCCGCG TCGAGCAACG GCGCCGCCTC GGATCCCGCG 1380TCACCGAAGT CCCTGCACTC TCCTCTCCTC ACAAGCCAGC TAGGCTCGGA CCTGGAGGCG 1440CCTCTCCCCA TCGTGAGGCC CTCCAGCCTC CGGATGCTCA TCACCAAGCC GACCCACACC 1500ATCCACTACT ACTGGCGCAA GTTCGACGAC GCGCTGATGC GCCCGATGTT CGGAGGGCGC 1560GGGTTCGTGC CCTACTCCCC AGGATCACCC ACCGATCCGA ACGTACTAGT GGAATGA 1617其中，包括与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
2.高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2，其特征在于具有如序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII 60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA 120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS 180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY 240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS 300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA 360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI 420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA 480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE538其中，包括与SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
3.根据权利要求1所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到原核表达载体中，通过本领域公知的研究方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入原核生物，通过诱导，大量表达出高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
4.根据权利要求1或3所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2可用于研究高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2的结构、功能以及抗体制备。
5.根据权利要求1所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因转入作物和牧草，培育出抗盐品质优良的品种/系。
6.根据权利要求1或5所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到任何基于Ti-质粒双元载体中，通过本领域公知的研究方法将高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入农杆菌中，进行农杆菌转化。
7.根据权利要求6所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，将所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因作为目的基因，构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重复序列，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos，还有在真核生物中作为选择标记使用的npt II，用于选择的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中还有玉米泛素超强启动子Ubi和绿色荧光蛋白GFP基因；高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上，并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
8.根据权利要求7所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述的双元转化重组载体pBIUbiGFP:TeNHX2可转化于农杆菌AGL1中，通过农杆菌苗端转化法侵染小麦，从而获得转基因小麦。
全文摘要
本发明公开了一种高冰草(Thinopyrum ponticumPodp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski)液泡膜Na
文档编号C12N15/29GK1699569SQ200510043510
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月13日 优先权日2005年5月13日
发明者夏光敏, 刘恒, 薛哲勇 申请人:山东大学