专利名称：一种人角膜内皮细胞系的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种利用人角膜建立角膜内皮细胞系的构建方法。
背景技术：
高等动物的角膜内皮细胞层由单层六角形枝状细胞镶嵌而成，但这层细胞到成年后便失去分裂能力，受到轻度损伤时只有依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区。一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮细胞生理功能的临界密度，角膜将出现不可逆之病变。目前，我国约有近百万角膜内皮盲患者，尽管他们绝大多数可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的数量极其有限而致使全国每年完成的角膜移植手术仅有2000～2500例，绝大多数患者因得不到移植角膜而无法重见光明。近年来兴起的角膜组织工程，为人造眼角膜带来了新的希望，但如何在体外获得可用于人工角膜内皮构建的大量角膜内皮细胞，一直是该领域的研究热点和主攻方向之一。
对哺乳动物角膜内皮细胞的体外培养研究开始于20世纪60年代，Slick WC等首次利用酶消化法获得了家兔角膜内皮细胞并成功启动了其体外培养。随后，学者们先后对兔、小鼠、大鼠、牛、猪、猫和人角膜内皮细胞的体外培养进行了研究。后来，学者们又对不同哺乳动物角膜内皮细胞的体外培养条件进行了摸索，发现一些生长因子对角膜内皮细胞具有一定的促分裂作用，但离细胞系的建立还相距甚远。20世纪90年代，许多学者纷纷利用猿猴红疱疹病毒、淋巴瘤病毒、猿猴红疱疹病毒T抗原和不同癌基因等对人、兔和小鼠的角膜内皮细胞进行了转染研究，获得了可传代培养的角膜内皮细胞，甚至获得了几个不死的细胞系，但由于细胞携带肿瘤病毒基因或癌基因而具有潜在的致瘤性，而无法用于人工角膜的构建和临床角膜移植手术。因此，尽早建立起一种不经过病毒或癌基因转染的、可直接用于人工角膜构建和临床角膜移植手术的人角膜内皮细胞系，已成为全世界眼科专家和细胞生物学家的主攻目标，也是人工角膜构建成功、临床应用以及造福全世界角膜盲患者的关键之所在。
发明内容
本发明的目的就是利用人角膜，提供一种建立人角膜内皮细胞系的技术——一种人角膜内皮细胞系的构建方法。
从眼库中取出人角膜，分别用氯化汞溶液和庆大霉素消毒15～35分钟；于超净工作台中，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入胰蛋白酶溶液消化数分钟后；把角膜平均剪成4片角膜片，按内皮面朝下的方向贴入24孔培养板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5％二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养；再采用时间梯度连续揭膜培养法获得人角膜内皮细胞，收集所得细胞后集中于2个培养孔中，于培养箱中放置12～24小时，将每个培养孔中加入1毫升的人角膜内皮细胞专用培养液，置5％二氧化碳培养箱中于37℃培养；每间隔3～5天更换上述专用培养液1次，以去除未贴壁的死细胞。待人角膜内皮细胞长成单层后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬液，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以相同方法进行传代。
本发明采用的时间梯度连续揭膜培养法的具体操作为当角膜片培养18～48小时后，取出角膜片转贴于另一新培养孔中，加入同样培养液继续培养；于培养箱中12～24小时后，取出角膜片再转贴于另一新培养孔中，加入同样培养液继续培养；6～12小时后，取出角膜片，于倒置光学显微镜下挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。
所用人角膜内皮细胞专用培养液的配方为DMEM/F12培养液，20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸软骨素，0.05‰～0.15‰羧甲基壳多糖；为了促进人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖，本发明又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子；为了获得细胞的最佳增殖效果，本发明又在上述专用培养液的基础上添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
经这种方法所获得的传代细胞可传60代以上，本发明所构建的角膜内皮细胞系现已传至第106代。该细胞建系技术的主要特点是细胞系可以连续传代，能提供出大量的人角膜内皮细胞；细胞系细胞未经任何转染，没有致瘤性，可直接应用于人工角膜的研制和临床应用；应用于人工角膜生产和临床治疗的成本低。
具体实施例方式
1、角膜片贴板培养的启动从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10～30毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5～9分钟；吸出生理盐水后，加入10～30毫升的浓度为1/2000～1/6000的氯化汞溶液浸泡10～20分钟，进行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10～30毫升的浓度为20％～70％的庆大霉素，浸泡15～35分钟，于超净工作台中进行二次消毒；以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入0.2～0.5％胰蛋白酶0.5～1毫升消化3～6分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片，用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底，每孔贴入4块角膜片；向贴入角膜片的培养孔中加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养；2、然后以时间梯度连续揭膜培养贴板培养24～48小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；12～24小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，再6～12小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞，挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔；3、人角膜内皮细胞原代培养的启动用滴管轻轻吹下上述只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞，收集后集中放入2～4个培养孔中，于5％二氧化碳培养箱中、37℃放置12～24小时；4、人角膜内皮细胞专用培养液的配制取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，然后依次加入硫酸软骨素1～4毫克和羧甲基壳多糖0.2～0.6毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升，即为本发明的人角膜内皮细胞专用培养液。
为了促进人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖，在上述专用培养液的基础上又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子；为了建立人角膜内皮细胞的最佳增殖条件，本发明在上述专用培养液的基础上又添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
5、将每个培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3～5天，除去旧培养液，以去除未贴壁的死细胞，加入1毫升新鲜的人角膜内皮细胞专用培养液；6、人角膜内皮细胞的传代培养待人角膜内皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.1～0.5毫升浓度为0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，静置消化3～5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3～5分钟制成人角膜内皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例1从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5分钟；吸出生理盐水后，加入10毫升的浓度为1/6000的氯化汞溶液浸泡10分钟，进行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10毫升的浓度为20％的庆大霉素，浸泡15分钟，于超净工作台中进行二次消毒；以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入0.2％胰蛋白酶0.5毫升消化3分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片，用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底，每孔贴入4块角膜片；向贴入角膜片的培养孔中加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。贴板培养24小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；12小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；6小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞，挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞，收集后集中放入2个培养孔中，于5％二氧化碳培养箱中、37℃放置12小时。取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，然后依次加入硫酸软骨素1毫克和羧甲基壳多糖0.2毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F 12培养液至4.0毫升，即为人角膜内皮细胞专用培养液。将每个培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3天，除去旧培养液，以去除未贴壁的死细胞，加入1毫升新鲜的人角膜内皮细胞专用培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.1毫升浓度为0.2％的胰蛋白酶溶液，静置消化3分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3分钟制成人角膜内皮细胞悬液；从每个培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例2从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入30毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗9分钟；吸出生理盐水后，加入30毫升的浓度为1/2000的氯化汞溶液浸泡20分钟，进行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入30毫升的浓度为70％的庆大霉素，浸泡35分钟，于超净工作台中进行二次消毒；以下操作均均为无菌状态；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入0.5％胰蛋白酶1毫升消化6分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片，用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底，每孔贴入4块角膜片；向贴入角膜片的培养孔中加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。贴板培养48小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；24小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；12小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞，挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞，收集后集中放入4个培养孔中，于5％二氧化碳培养箱中、37℃放置24小时。在人角膜内皮细胞专用培养液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子，更有利于人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖。将每个培养孔中加入1毫升的上述培养液，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔5天，除去旧培养液，以去除未贴壁的死细胞，加入1毫升新鲜的上述培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.5％的胰蛋白酶溶液，静置消化5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述培养液，用滴管吹打培养孔底5分钟制成人角膜内皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例3从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入20毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗7分钟；吸出生理盐水后，加入20毫升的浓度为1/4000的氯化汞溶液浸泡15分钟，进行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入20毫升的浓度为50％的庆大霉素，浸泡20分钟，于超净工作台中进行二次消毒；以下操作均为无菌状态；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入0.4％胰蛋白酶0.7毫升消化5分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片，用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底，每孔贴入4块角膜片；向贴入角膜片的培养孔中加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。贴板培养36小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；18小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，于同样条件下继续培养；9小时后，用眼科镊取出培养孔中的角膜片，于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞，挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞，收集后集中放入3个培养孔中，于5％二氧化碳培养箱中、37℃放置18小时。在上述人角膜内皮细胞专用培养液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.02‰的人表皮细胞生长因子、0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子和0.005‰的牛眼生素，以满足人角膜内皮细胞的最佳增殖条件。将每个培养孔中加入1毫升的上述培养液，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔4天，除去旧培养液，以去除未贴壁的死细胞，加入1毫升新鲜的上述培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.3毫升浓度为0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，静置消化4分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述培养液，用滴管吹打培养孔底4分钟制成人角膜内皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
权利要求
1.一种人角膜内皮细胞系的构建方法，首先从眼库中取出人角膜，分别用氯化汞溶液和庆大霉素消毒后置于超净工作台中，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入胰蛋白酶溶液消化数分钟后；再把角膜平均剪成4片，按内皮面朝下的方向贴入24孔培养板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5％二氧化碳培养箱中、37℃进行贴板培养，并以时间梯度连续揭膜的培养方法将获得的人角膜内皮细胞，于培养箱中放置12～24小时，在每个培养孔中加入1毫升的人角膜内皮细胞专用培养液，然后置5％二氧化碳培养箱中于37℃培养；每间隔3～5天更换人角膜内皮细胞专用培养液1次，待人角膜内皮细胞长成单层后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬液，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以相同方法进行传代。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是上述时间梯度连续揭膜的培养方法是将角膜片培养24～48小时后，取出角膜片转贴于另一新培养孔中，加入同样培养液继续培养；于培养箱中12～24小时后，取出角膜片再转贴于另一新培养孔中，再加入同样培养液继续培养；6～12小时后，取出角膜片，于倒置光学显微镜下挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔中的角膜内皮细胞。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述人内皮细胞专用培养液配方为DMEM/F12培养液，以及20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸软骨素和0.05‰～0.15‰羧甲基壳多糖。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征是上述人内皮细胞专用培养液中又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征是在4中所述内皮细胞培养液中还添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
全文摘要
一种人角膜内皮细胞系的构建方法，它是以角膜内皮为材料，先将角膜内皮面朝下进行贴板培养，采用时间梯度连续贴膜法获得纯净角膜内皮细胞，在含20％胎牛血清、硫酸软骨素氧化降解物、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛眼生素的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。该技术工艺科学合理，经这种方法所获得的传代细胞目前已传至第106代。本发明的角膜内皮细胞未经任何病毒或癌基因转染，因此获得的人角膜内皮细胞没有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生产和临床应用。
文档编号C12N5/08GK1749393SQ20051004414
公开日2006年3月22日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者樊廷俊, 付永锋, 丛日山, 汤志宏, 孙文杰, 于秋涛, 王晶, 赵君 申请人:中国海洋大学