专利名称：用于t－a克隆的t载体制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中一种构建质粒载体的方法，特别是涉及采用独特的生物合成法制备用于T-A克隆的T载体的方法。
背景技术：
T-A克隆法(Clark，J.M.Novel non-templated nucleotide addition reactionscatalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases(新的原核或真核DNA聚合酶催化的非模板依赖型的核酸添加反应).Nucleic Acids Res.1988，16，9677-9686；Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.and Collins，F.S.Construction ofT-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR product(T载体的构建，一种快速通用的直接克隆原始PCR产物的系统).Nucleic Acids Res.1991，19，1154；Holton，T.A.and Graham，M.W.A simple and efficient method fordirect cloning of PCR products using ddT-tailed vectors(一种利用ddT突出端载体直接克隆PCR产物的简便有效的方法).Nucleic Acids Res.1991，19，1156；Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.and Smith，L.M.A universal method forthe direct cloning of PCR amplified nucleic acid(一种用于直接克隆PCR产物的通用方法).Biotechnology(N Y).1991，9，657-663)是伴随着PCR技术发展起来的一种克隆方法。所谓T-A克隆就是将3′端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3′端具有单个T尾巴的T载体上。T-A克隆的理论依据是在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3′端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸(A)，使得50％以上的PCR产物的3′末端具有单个脱氧腺苷酸，即3′端A尾巴。因此人们开发出一种3′端带一突出T的载体——T载体，以用于克隆taq酶扩增的PCR产物或其它以Taq酶做A-tailing操作的线性DNA片断。
目前，T载体的制备方法有三种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个ddTTP添加到线状载体的3′端(Holton，T.A.and Graham，M.W.A simple and efficient method for directcloning of PCR products using ddT-tailed vectors(一种利用ddT突出端载体直接克隆PCR产物的简便有效的方法).NucleicAcids Res.1991，19，1156)。第二种方法是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性将单个dTTP添加到线状载体的3′端(Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.and Collins，F.S.Construction ofT-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR product(T载体的构建，一种快速通用的直接克隆原始PCR产物的系统).Nucleic Acids Res.1991，19，1154)。第三种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3′端具有单个T突出的线性T载体。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括XcmI、AhdI/Eam11051/EclHKl/AspEI/NruG0/BspOVI、BfiI/BmrI、HphI/AsuHPI、MboII/NcuI、BfuI/BciVI、HpyAV/Hin4II等。其中XcmI和AhdI及其同裂酶在制备T载体中广泛应用。其它内切酶要么因为太昂贵，要么因为在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体中的应用受到限制。
前两种方法在制备T载体过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题(Shuman，S.Novel approach tomolecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase(一种利用牛痘病毒拓扑异构酶进行分子克隆及多核苷酸合成的新方法).J.Biol.Chem.1994，269，32678-32684)。现在由于生产厂商的严格质量控制，其效率也大大提高，可以满足常规的克隆操作，但由于其操作步骤较多，质量不容易控制，目前只应用于几种常见载体，而且须由专业的公司来生产，因此价格比较昂贵。第三种方法目前在制备T载体中也得到应用，但用内切酶构建T载体存在一个潜在的问题，部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高。另外，这种方法产生的T载体，看起来是天然的，但在实际中并没有被广泛使用，也没有被很多生物公司采用，除了因为内切酶太昂贵，或者在普通的克隆载体上有太多的识别位点之外，一个更重要的原因可能是这些酶切割DNA后用来连接比较困难，如Ahd I和Xcm I产生的DNA片段在3′端有一个碱基的突出，甚至比平末端更难连接(http//www.neb-china.com/cn)。现在随着生物技术的不断进步，制备T载体的方法也逐渐改善，制备高质量、稳定、价廉的T载体仍然是广大生物学研究者关心的问题，也是有效使用T-A克隆技术的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的构建T载体的方法，该方法采用独特的生物合成技术生产T载体，合成方便，克隆效率高，质量稳定，可以改进现有T载体生产成本高，操作步骤较多，质量不稳定等技术问题。
本发明技术的解决方案是用于T-A克隆的T载体制备方法，包括以下几个步骤(1)选用高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板，设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒。在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点较远的位置(＞200bp)，分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII；
(2)将两种突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pNTv1和pNTv2用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，形成两种线性质粒；(3)将酶切后的两种质粒纯化，然后混合、变性、复性杂交，产生四种分子，其中有两种为亲本分子，另两种为新的杂合分子。这两种杂合分子在原来BamHI和HindIII酶切位点处存在不配对区域，即BamHI和HindIII酶切位点被破坏，其中一种杂合分子在其3′端形成具有单个T突出的线性载体；(4)用BamHI和HindIII两种限制性内切酶切割混合质粒；(5)酶切后的混合物进行分离，去除两种亲本分子，分离出两种杂合分子，其中具有单个T突出的线性载体杂合分子是用于T-A克隆的T载体。
在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点大于200bp的位置，分别引入两个不同的酶切位点。
采用识别TTTAAA序列的内切酶，如DraI、AhaIII、PauAII、SruI。
步骤(3)采用等摩尔量的两种质粒混合、变性、复性杂交。
对本发明的进一步叙述选择一个常用质粒，以此质粒为模板设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒，两种新质粒分别命名为pNTv1和pNTv2，pNTv1中引入一个新酶切位点及TTTTAAA序列盒，pNTv2中引入另一个新酶切位点及TTTAAAA序列盒。TTTTAAA及TTTAAAA序列盒分别构建在两种突变质粒的多克隆位点处，且在两种突变质粒中新引入两个不同的酶切位点，其位置在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点大于200bp。
将两种突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pNTv1和pNTv2用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，混合、变性、复性，复性杂交后会产生四种分子，其中有两种为亲本分子，另两种为新的杂合分子，用新引入的两种限制性内切酶切割，去除亲本分子，即可分离出用于T-A克隆的T载体pNTv。
本发明的特点是通过构建两种突变质粒，将质粒转化入细菌大量扩增，最后通过酶切分离得到目的载体。这种由生物合成的天然T载体，合成方便，生产成本低，克隆效率高，质量稳定、重组效率高。
图1是本发明流程示意图具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1介绍用于T-A克隆的T载体制备方法，如图1选择一个高拷贝数的常用质粒，如pBR322系列质粒，pUC系列质粒等。
本例选择pZErO-2质粒为模板。
一、以pZErO-2质粒为模板，根据其DNA序列，设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒，两种新质粒分别命名为pNTv1和pNTv2。其中pNTv1中引入一个新酶切位点BamHI及可被DraI内切酶识别的TTTTAAA序列盒，如图步骤1所示虚线段代表酶切位点BamHI，图中I和箭头符号代表TTTTAAA序列盒，可被DraI内切酶切割；pNTv2中引入一个新酶切位点HindIII及可被DraI内切酶识别的TTTAAAA序列盒，如图步骤1所示双线代表酶切位点HindIII，图中I和箭头符号代表TTTAAAA序列盒，可被DraI内切酶切割。
二、将两种突变质粒分别导入细菌扩增。将扩增的等量pNTv1和pNTv2用可识别TTTAAA序列的内切酶DraI切割，形成两种线性质粒，酶切位点处如图步骤2所示，也可采用识别TTTAAA序列的其它内切酶，如AhaIII、PauAII、SruI。
三、将酶切后的质粒pNTv1和pNTv2纯化，然后混合、变性、复性，复性杂交后会产生四种分子，其中有两种为亲本分子(pNTv1，pNTv2)，另两种为新的杂合分子(pNTv3，pNTv4)，如图步骤3所示其中两种杂合分子在原来BamHI和HindIII酶切位点处存在不配对区域，即BamHI和HindIII酶切位点被破坏。而pNTv3在其3′端形成具有单个T突出的线性载体。
四、用BamHI和HindIII两种限制性内切酶切割混合质粒。图中步骤4。
五、酶切后的混合物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过割胶回收即可去除两种亲本分子，分离出两种杂合分子，其中pNTv3是用于T-A克隆的T载体，命名为pNTv，它在产物中占一半的比例，pNTv4是杂合分子。图中步骤5。
用pBR322系列质粒、pUC系列质粒也可以得到同样结果。
实施例2T载体pNTv的性能检测一、回收的pNTv3和pNTv4混合物与带有3′dA的DNA以1∶3、1∶5、1∶7三个不同摩尔比例混合，加入T4DNA连接酶，于16℃连接。
二、连接后的产物电转化感受态细胞TOP 10。
三、转化产物涂LB平板，37℃培养。
四、菌落的PCR筛选和提取质粒进行酶切鉴定，结果表明其重组效率达到90％以上。
权利要求
1.用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于(1)选用高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板，设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒；在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点较远的位置，分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII；(2)将两种突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pNTv1和pNTv2用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，形成两种线性质粒；(3)将酶切后的两种质粒纯化，然后混合、变性、复性杂交，产生四种分子，其中有两种为亲本分子，另两种为新的杂合分子；这两种杂合分子在原来BamHI和HindIII酶切位点处存在不配对区域，即BamHI和HindIII酶切位点被破坏，其中一种杂合分子在其3′端形成具有单个T突出的线性载体；(4)用BamHI和HindIII两种限制性内切酶切割混合质粒；(5)酶切后的混合物进行分离，去除两种亲本分子，分离出两种杂合分子，其中具有单个T突出的线性载体杂合分子是用于T-A克隆的T载体。
2.根据权利要求1所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于选用高拷贝数的常用质粒。
3.根据权利要求1所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点大于200bp的位置，分别引入两个不同的酶切位点。
4.根据权利要求1所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于采用识别TTTAAA序列的内切酶。
5.根据权利要求1所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于步骤(3)采用等摩尔量的两种质粒混合、变性、复性杂交。
6.根据权利要求1所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于步骤(5)酶切后的混合物采用凝胶电泳分离。
7.根据权利要求2所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于选用质粒是pBR322系列质粒或pUC系列质粒。
8.根据权利要求4所述的用于T-A克隆的T载体制备方法，其特征在于采用识别TTTAAA序列的内切酶是DraI、AhaIII、PauAII或SruI。
全文摘要
本发明公开了用于T－A克隆的T载体制备方法，选择一个高拷贝数的常用质粒，以此质粒为模板设计四对引物，通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒；在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒，并分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII；将突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量质粒用可识别TTTAAA序列的内切酶切割，混合、变性、复性，反应后的混合物酶切，去除亲本分子，即可分离出T载体。本发明采用独特的生物合成技术生产T载体，这种由生物合成的天然T载体，具有合成方便，生产成本低，克隆效率高，质量稳定等特点，用本方法构建的T载体完成了多个基因的克隆，结果表明其重组效率达到了90％以上。
文档编号C12N15/66GK1800404SQ20051012311
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者田大成, 张远莉, 王强, 金欣庆, 丁静 申请人:南京大学