P的制作方法

专利名称：P的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的经基因修饰的微生物以及通过培养经基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。
背景技术：
多种生物合成产物例如精细化学品，尤其例如氨基酸、维生素及蛋白质是通过天然代谢过程在细胞中产生的，并被用于包括食品、饲料、化妆品、饲料、食品及医药工业的许多工业领域中。这些物质统称为精细化学品/蛋白质，其尤其包含有机酸、生蛋白氨基酸(proteinogenic amino acid)和非生蛋白氨基酸(non-proteinogenic amino acid)、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素和辅因子以及蛋白质和酶。通过培养为了产生及分泌大量特定的目的物质而开发出的细菌，以工业规模上最有利的方式生产这些物质。特别适于此目的生物为棒杆菌，其为革兰氏阳性非病原茵。
已知通过棒杆菌菌株的发酵，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的发酵来制备氨基酸。由于其具有重大意义，所以在改良其生产方法上进行了不懈努力。方法的改良与下列有关发酵技术手段例如搅拌与供氧；或者营养培养基的组成例如发酵中的糖浓度；或者用于获得产物的处理例如通过离子交换层析或喷雾干燥；或者微生物自身的内在性能特性。
通过扩增个别基因及研究其对精细化学品/蛋白质生产的作用，重组DNA技术也已在产生精细化学品/蛋白质的棒杆菌菌株的菌株改良中应用了一些年。
用于发展生产精细化学品、氢基酸或蛋白质的方法，或用于增加或提高先前存在的生产精细化学品、氨基酸或蛋白质的方法的生产率的其它方式是增加或改变一种或多种基因的表达，和/或用适宜多核苷酸序列影响mRNA的翻译。就此而言，影响可包括基因表达的增加、减少或其它限制因素，例如时序表达模式(chronological expression pattern)。
细菌调节序列的各种组分是本领域技术人员已知的。对于以下结合位点已作出了区分调节物结合位点，也称为操纵基因；RNA聚合酶全酶结合位点，也称为-35与-10区及核糖体16S RNA结合位点，也称为核糖体结合位点或Shine-Dalgarno序列。
为了本发明的目的，核糖体结合位点序列(也称为Shine-Dalgarno序列)是指位于翻译起始密码子上游高达20个碱基处的多核苷酸序列。
据文献(E.coli和S.typhimurium，Neidhardt F.C.1995 ASM Press)报导，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列组成和碱基序列串及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距离均对翻译起始速率具有显著影响。
具有启动子活性的核酸序列可以各种方式影响mRNA的形成。其活性不依赖于生物的生理生长期的启动子称为组成型。而其它启动子响应外部的化学及物理刺激，例如氧、代谢物、热、pH等。而其它启动子在不同生长期中显示出其强的活性依赖性。例如，文献中描述的在微生物的指数生长期中或恰好在微生物生长的稳定期中显示出特别显著活性的启动子。根据代谢途径，启动子的两种特征可对精细化学品及蛋白质的生产率具有有益的作用。
例如，在生长过程中关闭基因表达，但在最佳生长之后又启动基因表达的启动子可用于调节控制代谢物产生的基因。于是，修饰的菌株显示与初始菌株相同的生长参数，但每个细胞产生更多产物。此种类型的修饰可增加滴度(每升的产物克数/)及C产率(每克C源的产物克数)。
已经可以从棒杆菌物种中分离出那些可用于增强或减弱基因表达的核苷酸序列。根据细胞内部和/或外部条件，这些受调节的启动子可提高或降低基因转录的速率。在某些情况下，被称为诱导物的特定因子的存在可刺激从启动子的转录速率。诱导物可直接或间接影响从启动子的转录作用。被称为抑制物的另一类因子能够降低或抑制从启动子的转录作用。与诱导物相类似，抑制物也可直接或间接地起作用。另一方面，温度调节型启动子也为已知的。因此，例如，可通过将生长温度增至高于细胞的正常生长温度来增强或减弱这类启动子的转录水平。
至今已描述了少量来自谷氨酸棒杆菌的启动子。DE 4440118中描述了来自谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶基因的启动子。将该启动子插入到编码蛋白质的结构基因的上游。这类构建体转化进入棒杆菌之后，对该启动子下游的结构基因的表达进行调节。一旦在培养基中添加适当的诱导物，就诱导结构基因的表达。
Reinscheid等人在Microbiology 145503(1999)中描述了来自谷氨酸棒杆菌的pta-ack启动子与报道基因(氯霉素乙酰转移酶)之间的转录融合。包含这种转录融合的谷氨酸棒杆菌细胞在含有乙酸的培养基上生长时，呈现出报道基因的表达增强。与此相比，在葡萄糖上生长的转化细胞未显示出该报道基因的表达增强。
Pa’tek等人在Microbiology 1421297(1996)中描述了能够增强谷氨酸棒杆菌细胞中报道基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的某些DNA序列。将这些序列在一起进行比较以便确定谷氨酸棒杆菌启动子的共有序列。
专利WO 02/40679中已经描述了可用于调节基因表达的来自谷氨酸棒杆菌的其它DNA序列。这些分离的多核苷酸表现为可用于增加抑或降低基因表达的源自谷氨酸棒杆菌的表达单元。该专利还另外描述了源自谷氨酸棒杆菌的表达单元与异源基因在其上连接在一起的重组质粒。本文所描述的将源自谷氨酸棒杆菌的启动子与异源基因融合的方法尤其可用于调节氨基酸生物合成的基因。

发明内容
本发明的一个目的是提供具有利特性的其它启动子和/或表达单元。
发明人已发现，通过使用具有启动子活性的核酸可实现此目的，所述核酸包含以下用于基因转录的序列A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段。
根据本发明，“转录”是指从DNA模板开始产生互补RNA分子的过程。此过程涉及蛋白质如RNA聚合酶、所谓的σ因子及转录调节蛋白质。接着，合成的RNA用作翻译过程中的模板，其随后产生生物合成活性蛋白质。
产生生物合成活性蛋白质的形成速率是转录速率与翻译速率的结果。根据本发明，两种速率均可受到影响，并且因此影响到微生物中产物形成速率。
根据本发明，“启动子”或“具有启动子活性的核酸”是指以与待转录核酸功能性连接的方式调节该核酸转录的核酸。
就此而言，“功能性连接”是指例如具有启动子活性的本发明的核酸之一与待转录核酸序列以及适当条件下的其它调节元件(例如确保核酸转录的核酸序列及终止子)以使得每一调节元件均能在该核酸序列转录中发挥其功能的方式进行的顺序排列。因此，化学意义上的直接连接并非绝对必要。例如增强子序列的遗传控制序列能够对较远位置，甚至其它DNA分子上的靶序列执行其功能。优选的是这样一种排列，即待转录的核酸序列位于本发明的启动子序列之后(即在3’末端)以致于两个序列共价连接在一起。就此而言，启动子序列与待进行转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。
根据本发明，“启动子活性”是指在特定时间内由启动子形成的RNA量，即指转录速率。
根据本发明，“比启动子活性”(specific promoter activity)是指各启动子在特定时间内由启动子形成的RNA的量。
根据本发明，术语“野生型”是指合适的起始微生物。
视上下文而定，术语“微生物”是指起始微生物(野生型)或本发明的经遗传修饰的微生物或其两者。
优选并且尤其是在不能明确归类微生物或野生型的情状下，“野生型”是指为了改变或影响启动子活性或转录速率、为了改变或影响表达活性或表达速率及为了增加生物合成产物的含量的每个情况下的参考生物。
在一个优选实施方案中，此参考生物为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
在一个优选实施方案中，所用的起始微生物已能够产生所要精细化学品。就棒杆茵属细菌的特别优选微生物及特别优选的精细化学品L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸而言，特别优选那些已能够产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的起始微生物。特别优选的为其中例如编码天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去调节或反馈抑制作用已消除或降低的棒杆茵。这类细菌具有例如在ask基因中导致反馈抑制作用降低或消除的突变，例如T311I突变。
因此，在涉及与野生型相比的基因的“影响的启动子活性”或转录速率的情况下，与野生型相比RNA形成受到影响，其中在该方式下野生型中不存在所述RNA形成。
因此，在涉及与野生型相比的基因的“改变的启动子活性”或转录速率的情况下，与野生型相比特定时间内产生的RNA量受到改变。
就此而言，“改变的”优选指增加的或降低的。
例如，这可通过增加或降低本发明的内源启动子的比启动子活性(例如通过使该启动子突变或通过刺激或抑制该启动子)进行。
实现启动子活性或转录速率增加的另一种可能性是例如通过具有启动子活性的本发明的核酸或具有增加的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有增加的比启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节优选通过以下方式实现将一种或多种具有启动子活性于适当情况下具有改变的比启动子活性)的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性于适当情况下具有改变的比启动子活性)的本发明核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录；或将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性于适当情况下具有改变的比启动子活性)的本发明内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录；或将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有启动子活性于适当情况下具有改变的比启动子活性)的本发明的核酸和功能性连接的一种或多种待转录核酸。
具有启动子活性的本发明的核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表来自谷氨酸棒杆菌的ABC转运蛋白(P1-35)的启动子序列。SEQ.ID.NO.1对应于野生型的启动子序列。
本发明还涉及具有启动子活性的核酸，其包含通过核苷酸替代、插入或缺失从SEQ.ID.NO.1序列衍生并且在核酸水平上与SEQ.ID.NO.1序列具有至少90％同一性的序列。
对于本发明启动子的本发明其它天然实例可以通过将数据库中的核酸序列与上述序列SEQ ID NO1进行同一性比较容易地从例如基因组序列已知的多种生物中发现。
从序列SEQ ID NO1开始通过人工变异及突变(例如通过核苷酸替代、插入或缺失)可容易地得到本发明的人工启动子序列。
本说明书中的术语“替代”是指一个或多个核苷酸被一个或多个核苷酸的置换。“缺失”是指核苷酸被直接连接的置换。“插入”是指将核苷酸向核酸序列中的插入，伴随者直接连接被一个或多个核苷酸的形式置换。
两种核酸间的同一性是指在各情况下核酸完整长度上的核苷酸同一性，具体而言，同一性通过借助Informax(美国)的Vector NTI Suite 7.1软件，使用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月；5(2)151-1)进行比较计算出来，其中所参数设定如下多序列比对参数空位开放罚分10空位延伸罚分10空位分离罚分范围8空位分离罚分关比对延迟同一性％40残基特定空位关亲水性残基空位 关过渡权重0序列两两比对参数FAST算法开K-数组尺寸(tuplesize) 1空位罚分3窗口尺寸5最佳对角线数目(Number of best diagonal) 5因此，与序列SEQ ID NO1具有至少90％同一性的核酸序列是指当其与序列SEQ ID NO1比较(具体而言是按照具有上面参数设置的上述程序化算法进行)时显示至少90％同一性的核酸序列。
特别优选的启动子显示与核酸序列SEQ.ID.NO.1的同一性为91％，更加优选为92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，特别优选为99％。
此外，还可以通过本身已知的杂交技术从上述核酸序列开始、具体而言从序列SEQ.ID NO1开始容易地从基因组序列未知的多种生物中得到启动子的其它天然实例。
因此，本发明的另一方面涉及具有启动子活性的核酸，其包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.1杂交的核酸序列。此核酸序列包含至少10个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核苷酸。
根据本发明，在严格条件下进行杂交。此种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57页或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
严格杂交条件具体是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42℃孵育过夜，随后在65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
“功能等效片段”是指具有启动子活性片段的核酸序列，与起始序列相比其具有基本相同或较高的比启动子活性。
“基本上一致”是指表现出起始序列比启动子活性的至少50％、优选60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％、特别优选95％的比启动子活性。
“片段”是指由实施方案A)、B)或C)描述的具有启动子活性的核酸的部分序列。这种片段优选具有多于10个、但更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个的核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相连核苷酸。
特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作为启动子，即用于基因的转录。
Genbank条目AP005283已在未说明功能的情况下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本发明进一步涉及新的、具有启动子活性的本发明核酸序列。
本发明具体涉及具有启动子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述具有启动子活性的所有核酸，例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPress New York，笫896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段及连接反应将合成的寡核苷酸加入并将补平缺口以及常规克隆方法。
本发明进一步涉及表达单元的用途，所述表达单元包含一种具有启动子活性的本发明的核酸以及额外功能性连接的核酸序列，该核酸序列确保核糖核酸的翻译用便基因表达。
根据本发明，表达单元是指具有表达活性的核酸，即与待表达核酸或基因功能性连接以调节表达的核酸，其中所述表达即指此核酸或该基因的转录及翻译。
就此而言，“功能性连接”是指例如一种本发明表达单元与待进行转基因表达的核酸序列以及适当条件下的其它调节元件(如终止子)以每一调节元件在核酸序列的转基因表达中发挥其功能的方式进行的顺序排列。化学意义上的直接连接对此而言并非绝对必要。遗传控制序列例如增强子序列可以在较远位置、甚甚不同的DNA分子上对靶序列执行其功能。优选的是这样一种排列，即待进行转基因表达的核酸序列位于本发明表达单元序列之后(即在3’末端)以致于两个序列共价连接在一起。在这种情况下，表达单元序列与待进行转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。
根据本发明，“表达活性”是指在特定时间内由表达单元产生的蛋白质的量，即表达速率。
根据本发明，“比表达活性”是指对于每一表达单元在特定时间内由表达单元产生的蛋白质的量。
因此，在涉及与野生型相比的基因的“影响的表达活性”或表达速率的情况下，与野生型相比蛋白质的生产受到影响，其中在该方式下野生型中不存在所述蛋白质的生产。
因此，在涉及与野生型相比的基因的“改变的表达活性”或表达速率的情况下，与野生型相比在特定时间内生产的蛋白质量受到改变。
就此而言，“改变的”优选指增加的或降低的。
例如，这可通过增加或降低内源表达单元的特异活性(例如通过使该表达单元突变或通过刺激或抑制该表达单元)进行。
另外，例如通过本发明表达单元或具有增加比表达活性的表达单元来调节微生物中基因的表达可以实现表达活性或表达速率的增加，其中所述基因相对于表达单元而言为异源的。
通过本发明表达单元或具有增加比表达活性的本发明表达单元对微生物中基因表达的调节优选通过以下方式实现将一种或多种于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达；或将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达；或将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明表达单元包含具有启动子活性的上述本发明核酸和额外以功能性连接的确保核糖核酸翻译的核酸序列。
在一个优选实施方案中，本发明的表达单元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2代表来自谷氨酸棒杆菌的ABC转运蛋白(P1-35)的核酸序列。SEQ.ID.NO.2对应于野生型表达单元的序列。
本发明还涉及表达单元，其包含通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列。
对于本发明表达单元的本发明其它天然实例例如可通过对数据库中的核酸序列与上述序列SEQ ID NO2进行同一性比较容易地从基因组序列已知的多种生物中发现。
通过人工变异及突变(例如通过核苷酸替代、插入或缺失)从序列SEQID NO2开始可以容易地得到表达单元的本发明人工序列。
因此，与序列SEQ ID NO2具有至少90％同一性的核酸序列是指当其与序列SEQ ID NO2比较(具体而言是按照具有上面参数设置的上述程序化算法进行)时显示至少90％同一性的核酸序列。
特别优选的表达单元显示与核酸序列SEQ.ID.NO.2具有91％的同一性，更加优选为92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的同一性，特别优选为99％的同一性。
此外，还可以通过本身已知的杂交技术从上述核酸序列开始、具体而言从序列SEQ.ID NO2开始容易地从基因组序列未知的多种生物中得到表达单元的其它天然实例。
因此，本发明的另一方面涉及表达元件，其包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核酸序列。此核酸序列包含至少10个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核苷酸。
“杂交作用”是指在严格条件下多核苷酸或寡核苷酸与实际互补序列结合的能力，而在这些条件下非互补配偶体之间不进行非特异性结合。就此而言，序列应当优选为90-100％互补。能够彼此特异性结合的互补序列的特性可用于例如Northern或Southern印迹技术或PCR或RT-PCR中的引物结合。
根据本发明，在严格条件下进行杂交。此种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57页或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
严格杂交条件具体是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42℃孵育过夜，随后在65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
本发明的核苷酸序列还可以产生用于在其它细胞类型和微生物中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。这类探针和引物通常包含在严格条件下与本发明核酸序列的有义链或相应反义链上至少约12个、优选至少约25个、例如约45、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
根据本发明，还包含含有所谓沉默突变或者与明确提及的序列相比根据具体原始生物或宿主生物密码子选择进行修饰的核酸序列及其天然存在变体(如剪接变体或等位变体)。
“功能等效片段”是指具有与起始序列基本相同或较高比表达活性的表达单元片段。
“基本上一致”是指呈现出起始序列比表达活性的至少50％、优选60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％、特别优选95％的比表达活性。
“片段”是指由实施方案E)、F)或G)描述的表达单元的部分序列。这些片段优选具有多于10个、但更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核酸序列SEQ.ID.NO.1的相连核苷酸。
特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作为表达单元，即用于基因的表达。
本发明进一步涉及本发明的新表达单元。
具体而言，本发明涉及包含具有启动子活性的本发明核酸以及另外以功能性连接的确保核糖核酸翻译的核酸序列的表达单元。
本发明特别优选涉及表达单元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本发明表达单元包含一种或多种以下遗传元件负10(“-10”)序列、负35(“-35”)序列、转录序列起点、增强子区域及操纵基因区域。
这些遗传元件优选是棒杆菌物种特异的，尤其是谷氨酸棒杆菌特异的。
另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述表达元件，例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，第896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段及连接反应将合成的寡核苷酸加入并将补平缺口以及常规克隆方法。
用于本专利发明的方法及技术是受过微生物技术及重组DNA技术训练的技术人员所已知的。用于培养细菌细胞、将分离的DNA分子插入宿主细胞中以及将所分离核酸分子进行分离、克隆和测序等的方法与技术是此类技术和方法的实例。许多标准文献来源描述了这些方法Davis等人，Basic Methods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course inBacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1992)；M.Singer与P.Berg，Genes&Genomes，University Science Books，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等人，Handbook of Molecular and Cellular Methodsin Biology and Medicine，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)；Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick和J.E.Thompson编著，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)和P.F.Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本发明所有的核酸分子优选为分离的核酸分子的形式。“分离的”核酸分子是从核酸天然来源所存在的其它核酸分子中分离的，并且其还基本上没有其它细胞材料和培养基(如果其是通过重组技术制备的)或者基本上没有化学前体或其它化学品(如果其是化学合成的)。
另外，本发明包括与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其部分。
例如，如下所述，本发明的启动子和/或表达单元可特别有利地用于通过发酵来制备生物合成产物的改进方法中。
具体地，本发明的启动子和/或表达单元的优点在于其在微生物中通过胁迫诱导。可以通过适当控制发酵过程来特别控制该胁迫诱导以增加所希望的基因的转录/表达速率。具体地，在L-赖氨酸的产生中，该胁迫相非常早地达到，从而在该情况中，可以非常早地实现所希望的基因的增加的转录/表达速率。具有启动子活性的本发明核酸可用于改变(即提高或降低)或影响与野生型相比的微生物中基因的转录速率。
本发明表达单元可用于改变(即提高或降低)或影响与野生型相比的微生物中基因的表达速率。
具有启动子活性的本发明核酸及本发明表达单元也可用于调节及增强微生物中(尤其是在棒杆菌物种中)多种生物合成产物例如精细化学品、蛋白质、特别为氨基酸的生产。
因此，本发明涉及通过以下方式改变或影响与野生型相比的微生物中基因转录速率的方法a)与野生型相比，改变微生物中具有启动子活性的本发明内源核酸的比启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b)通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
按照实施方案a)，可通过改变(即增加或降低)微生物中的比启动子活性来改变或影响与野生型相比的微生物中的基因转录速率。例如，这可通过具有启动子活性的本发明核酸序列定向突变(即通过核苷酸的定向替代、缺失或插入)来进行。可通过置换RNA聚合酶全酶结合位点(本领域的技术人员也称其为-10区与-35区)中的核苷酸来实现启动子活性的增加或降低。此外，还可通过缩小或扩大所述RNA聚合酶全酶结合位点彼此之间的距离(通过缺失核苷酸或插入核苷酸)实现。另外，还可通过将调节蛋白质(本领域的技术人员也称其为阻抑蛋白及激活蛋白)的结合位点(本领域的技术人员也称其为操纵基因)放置在RNA聚合酶全酶结合位点的空间相邻区域(以致于在结合到启动子序列之后，这些调节物减弱或增强RNA聚合酶全酶的结合及转录活性)或者将其放置在处于新的调节影响下来实现。
比表达活性关于“比启动子活性”，与野生型相比的增加或降低是指与野生型的具有启动子活性的本发明核酸相比(即例如与SEQ.ID.NO.1相比)特异活性的增加或降低。
按照实施方案b)，与野生型相比微生物中基因转录速率的改变或影响，可以通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的比启动子活性的核酸来调节微生物中的基因转录来进行，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
这可以优选通过以下方式实现b1)将具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的一种或多种本发明核酸导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录；或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
因此，可能通过以下方式改变(即提高或降低)野生型内源基因的转录速率按照实施方案b1)，将具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的一种或多种本发明核酸导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或按照实施方案b2)，将一种或多种外源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入内源基因的转录；或按照实施方案b3)，将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录内源核酸。
因此，也可以通过以下方式影响与野生型相比的外源基因的转录速率按照实施方案b2)，将一种或多种内源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入内源基因的转录；或按照实施方案b3)，将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录内源核酸。
此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行按照实施方案b2)的基因插入。优选插入至非编码区中。
此外，可在染色体上或染色体外进行按照实施方案b3)的核酸构建体的插入。优选将核酸构建体进行染色体插入。“染色体”整合是将外源DNA片段插入至宿主细胞的染色体中。此术语也用于外源DNA片段与宿主细胞染色体上适当区域之间的同源重组。
在实施方案b)中，优选也使用具有按照实施方案a)的改变的比启动子活性的本发明的核酸。在实施方案b)中，如实施方案a)中所述这些核酸可在微生物中存在或制备或者将其以分离的形式导入微生物中。
“内源”是指已存在于野生型基因组中的遗传信息，如基因。
“外源”是指不存在于野生型基因组中的遗传信息，如基因。
涉及通过具有启动子活性的本发明核酸进行的转录调节的术语“基因”，优选是指包含待转录区域(即例如调节翻译的区域)和编码区以及于适当情况下的其它调节元件(例如终止子)的核酸。
涉及如下所述通过本发明表达单元进行的表达调节的术语“基因”，优选是指包含编码区以及于适当情况下的其它调节元件(例如终止子)的核酸。
“编码区”是指编码蛋白质的核酸序列。
涉及具有启动子活性的核酸和基因的“异源性”，是指所使用基因在具有启动子活性的本发明核酸的调节下在野生型中不转录，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接并且在野生型中不存在具有启动活性的本发明核酸与特定基因的功能组合。
涉及表达单元和基因的“异源性”，是指所使用基因在具有启动子活性的本发明表达单元的调节下在野生型中不表达，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接并且在野生型中不存在本发明表达单元与特定基因的功能组合。
在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式提高或影响微生物中基因的转录速率的方法ah)与野生型相比，增加具有启动子活性的本发明内源核酸在微生物中的比启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案a)的增加的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
通过具有启动子活性的本发明核酸或者通过具有按照实施方案ah)的增加的比启动子活性的本发明核酸对微生物中基因转录进行的调节优选通过以下方式实现bh1)将具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的一种或多种本发明核酸导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的所导入核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录；或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的本发明内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录；或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，其中所述核酸构建体包含具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的本发明核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式降低微生物中基因转录速率的方法ar)与野生型相比，降低具有启动子活性的本发明内源核酸在微生物中的比启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有按照实施方案a)的降低的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行内源基因的转录。
本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式改变或影响微生物中基因表达速率的方法c)与野生型相比，改变本发明内源表达单元在微生物中的比表达活性，所述内源表达单元调节内源基因表达，或d)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的改变的比表达活性的本发明表达单元对微生物中的基因表达进行调节，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
按照实施方案c)，可通过改变(即增加或降低)微生物中的比表达活性来与野生型相比改变或影响微生物中基因的表达速率。例如，这可以通过具有启动子活性的本发明核酸序列的定向突变(即通过核苷酸的定向替代、缺失或插入)来进行。例如，延长Shine-Dalgarno序列与翻译起始密码子之间的距离通常导致比表达活性的变化，比表达活性减弱否则增强。比表达活性的改变也可以通过核苷酸缺失或插入而缩短或延长Shine-Dalgarno区(核糖体结合位点)序列到翻译起始密码子的距离来实现。而且还可以通过以使得与互补的3′端16S rRNA的同源性增强或减弱的方式改变Shine-Dalgarno区序列来实现。
就“比表达活性”而言，与野生型相比增加或降低是指与野生型的本发明表达单元相比(即例如与SEQ.ID.NO.2相比)特异活性的增加或降低。
按照实施方案d)，可以通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的改变的比表达活性的本发明表达单元对微生物中基因表达的调节，从而与野生型相比改变或影响微生物中基因的表达速率，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
这可以优选通过以下方式实现d1)将于适当情况下具有改变的比表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
因此，可通过以下方式改变(即提高或降低)野生型内源基因的表达速率按照实施方案d1)，将于适当情况下具有改变的比表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或按照实施方案d2)，将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或按照实施方案d3)，将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
因此，还可以与野生型相比通过以下方式影响内源基因的表达速率按照实施方案d2)，将一种或多种内源基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或按照实施方案d3)，将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达外源核酸。
此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行按照实施方案d2)的基因插入。优选插入至非编码区中。
此外，可在染色体上或染色体外进行按照实施方案d3)的核酸构建体的插入。优选核酸构建体的染色体插入。
在下文中，核酸构建体也称作表达盒。
在实施方案d)中，优选也使用具有按照实施方案c)的改变的比表达活性的本发明表达单元。在实施方案d)中，如实施方案c)中所述这些表达单元可在微生物中存在或制备或者将其以分离的形式导入微生物中。
在一个优选实施方案中，本发明进一步涉及与野生型相比通过以下方式提高或影响微生物中基因表达速率的方法ch)与野生型相比，增加本发明内源表达单元在微生物中的比表达活性，所述表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的增加的比表达活性的表达单元对微生物中基因的表达进行调节，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案c)的增加的比表达活性的表达单元对微生物中基因表达进行的调节优选通过以下方式实现dh1)将于适当情况下具有增加的比表达活性的一种或多种本发明表达单元导入微生物的基因组中，以便在于适当情况下具有增加的比表达活性的所导入表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明内源表达单元的控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有提高的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明进一步涉及通过以下方式与野生型相比降低微生物中基因表达速率的方法cr)与野生型相比，降低本发明内源表达单元在微生物中的比表达活性，所述表达单元调节内源基因的表达，或dr)将具有按照实施方案cr)的降低的比表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行内源基因的表达。
在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的一个优选实施方案中，这些基因选自编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸，其中这些基因(如果合适)进一步包含调节元件。
在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的特别优选实施方案中，这些基因选自以下核酸编码来自生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸以及编码来自酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中这些基因(如果合适)进一步包含调节元件。
在一个特别优选的实施方案中，来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体(exporter carrier)、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白质(efflux protein)、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
来自氨基酸生物合成途径的上述蛋白质的优选蛋白质以及编码这些蛋白质的核酸分别为微生物来源的蛋白质序列及核酸序列，优选来自棒杆菌属或短杆菌属细菌，优选来自棒杆菌，特别优选来自谷氨酸棒杆菌。
来自氨基酸生物合成途径的这些蛋白质的特别优选蛋白质序列及编码这些蛋白质的相应核酸序列的实例、其参考文献及其在参考文献中的名称列于表1中
表1




特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列及编码该蛋白质的相应核酸序列的其它实例为果糖-1，6-二磷酸酶2(也称作fbr2)序列(SEQ.ID.NO.8)及编码果糖-1，6-二磷酸酶2的相应核酸序列(SEQ.ID.NO.7)。
特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列及编码该蛋白质的相应核酸序列的其它实例为硫酸盐还原作用中的蛋白质(也称作RXA077)序列(SEQ.ID.NO.10)及编码硫酸盐还原作用中的蛋白质的相应核酸序列(SEQ.ID.NO.9)。
其它特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列在每一情况下具有表1所示的对于该蛋白质的氨基酸序列，其中各个蛋白质在表2/第2列所示对于该氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一个位置上具有与表2/第3列同一行中所示的各个氨基酸不同的生蛋白氨基酸。在另一个优选实施方案中，蛋白质在表2/第2列所示对于该氢基酸序列的氨基酸位置中的至少一个位置上具有表2/第4列同一行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白质是氨基酸生物合成途径的突变的蛋白质，其具有特别有益的特性并因此特别适合通过本发明的启动子表达相应的核酸，并产生氨基酸。例如，T311I突变导致ask的反馈抑制被切断。
编码表2中上述突变的蛋白质的相应核酸可以通过常规方法制备。
例如，用于制备编码突变的蛋白质的核酸序列的适合起始点是谷氨酸棒杆菌菌株基因组或表1所提到的核酸序列，所述谷氨酸棒杆菌菌株可以从美国典型培养物保藏中心获得，保藏好为ATCC 13032。为了将突变的蛋白质的氨基酸序列逆翻译成编码这些蛋白质的核酸序列，有利地使用该核酸序列将被导入的或者该核酸序列存在于其中的生物的密码子选择。例如，就谷氨酸棒杆菌而言，使用谷氨酸棒杆菌的密码子选择是有利的。可以本身已知的方式从描述目的生物中至少一种蛋白质及一种编码该蛋白质的基因的数据库或专利申请中确定具体生物的密码子选择。
以如下方式理解表2中的信息在第1列“标识”中，对于表1所涉及的每一序列所指定的明确名称。
在第2列“AA位置”中，各个数字指来对应于表1中多肽序列的氨基酸位置。因此，“AA位置”列中“26”是指相应所示多肽序列的氨基酸第26位。位置的编号是由N末端+1起始。
在第3列“AA野生型”中，各个字母表示表1中相应野生型菌株序列上在第2列所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。
在第4列“AA变体”中，各个字母表示相应变体菌株中在第2列所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。
在第5列“功能”中，指明相应多肽序列的生理功能。
就具有特定功能(第5列)及特定起始氨基酸序列(表1)的突变的蛋白质而言，第2、3及4列描述了至少一个突变及某些序列的多个突变。该多个突变始终是指在每一情况下最接近的上述起始氨基酸序列(表1)。术语特定氨基酸序列的“至少一个氨基酸位置”优选是指第2、3及4列中对于该氨基酸序列所述的至少一个突变。
生白氨基酸的单字母代码A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H组氨酸I异亮氨酸K赖氨酸L亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S丝氨酸T苏氨酸V缬氨酸W色氨酸Y酪氨酸表2




在用于改变或影响微生物中基因转录速率和/或表达速率的上述本发明方法及用于产生基因修饰微生物(下面称为基因修饰微生物)的下述方法及用于产生生物合成产物的下述方法中，优选以SacB方法将具有启动子活性的本发明的核酸、本发明表达单元、上述基因及上述核酸构建体或表达盒导入微生物中，具体而言将它们导入棒杆菌中。
SacB方法是本领域技术人员所已知的，且描述于例如Sch_fer A，TauchA，J_ger W，Kalinowski J，Thierbach G，Pühler A.；Small mobilizablemulti-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmidspK18 and pK19selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutamicum，Gene.1994年7月22日；145(1)69-73及Blomfield IC，Vaughn V，Rest RF，Eisenstein BI.；Allelic exchange inEscherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and atemperature-sensitive pSC101 replicon；Mol Microbiol.1991年6月；5(6)1447-57。
在上述本发明方法的一个优选实施方案中，通过将具有启动子活性的本发明的核酸或本发明表达单元导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率。
在上述本发明方法的另一个优选实施方案中，通过将上述核酸构建体或表达盒导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率。
因此，本发明也涉及表达盒，其包含
至少一种本发明表达单元，至少一种其它的待表达核酸序列，即待表达基因，及于适当情况下的另外的遗传控制元件，例如终止子，其中至少一种表达单元与另一种待表达核酸序列功能性连接在一起，且所述的另一种待表达核酸序列相对于该表达单元而言是异源的。
待表达核酸序列优选为至少一种编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸。
待表达核酸序列特别优选地选自下列核酸编码来自生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶生物合成途径的蛋白质的核酸。
来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质描述如上，且其实例描述于表1与2中。
对表达单元在本发明表达盒中相对于待表达基因的物理位置进行选择，以便表达单元调节待表达基因转录且优选也调节待表达基因的翻译，且因此能够产生一种或多种蛋白质。就此而言，“能够产生”包括生产的组成型增加、在特定条件下生产的减少或阻断和/或在特定条件下生产的增加。就此而言，“条件”包含(1)向培养基中添加组分，(2)从培养基移除组分，(3)以另一种组分替换培养基中的一种成份，(4)提高培养基的温度，(5)降低培养基的温度，及(6)调节大气条件，例如培养基所保持的氧或氮浓度。
本发明进一步涉及包含上述本发明表达盒的表达载体。
载体为本领域的技术人员熟知，且可在“Cloning Vectors”(PouwelsP.H.等人，编者，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。除质粒以外，载体也是指本领域技术人员已知的所有其它载体，例如噬茵体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒及线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物自主复制或者进行染色体复制。
适合且特别优选的质粒为那些在棒杆菌中复制的质粒。众多已知质粒载体例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))基于隐秘质粒pHM1519、pBL1或pGA1。可以相同方式使用其它质粒载体，例如pCLiK5MCS或基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMS MicrobiologyLetters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的那些质粒载体。
同样也适用的是如下那些质粒载体，即借助于这些质粒载体可使用染色体整合的基因扩增方法来复制及扩增hom-thrB操纵子，如Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60，126-132(1994))所述。在该方法中，完整基因被克隆至在宿主(通常为E.coli)中能够复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。适宜载体的实例为pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Sch_fer等人，Gene 145，69-73(1994)，Bernard等人，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology 1734510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene 41337-342)。随后通过转化，将包含待扩增基因的质粒载体转移进入目的谷氨酸棒杆菌菌株中。用于转化的方法例如描述于Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))以及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中的方法。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中该基因修饰作用导致与野生型相比改变或影响至少一种基因的转录速率，且其取决于a)改变至少一种具有按照第1项的启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b)通过具有按照第1项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的比启动子活性的、带有按照第1项的启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的所述核酸而言是异源的。
就上述方法而言，通过具有按照第1项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的改变的比启动子活性的、带有按照第1项的启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节是通过以下方式实现b1)将一种或多种具有按照第1项的启动子活性、于适当情况下具有改变的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有按照第1项的具有启动子活性、于适当情况下具有改变的比启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有按照第1项的启动子活性、于适当情况下具有改变的比启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有按照第1项的启动子活性、于适当情况下具有改变的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的转录速率已提高或影响的基因修饰微生物，其中ah)与野生型相比，具有按照第1项的启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性是增加的，其中所述内源核酸调节内源基因转录，或bh)通过具有按照第1项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案ah)的增加的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
就上述方法而言，通过具有按照第1项的启动子活性的核酸或者通过具有按照实施方案a)的增加的比启动子活性、具有按照第1项的启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现bh1)将一种或多种具有按照第1项的启动子活性、适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有按照第1项的启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含具有按照第1项的启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的转录速率已降低的基因修饰微生物，其中ar)与野生型相比，至少一种具有按照第1项的启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性是降低的，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种具有按照实施方案a)的已降低启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有已降低启动子活性的核酸控制下进行至少一种内源基因的转录。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中基因修饰导致与野生型相比至少一种基因的表达速率的改变或影响，且其取决于c)与野生型相比，改变至少一种按照第2或3项的内源表达单元在微生物中的比表达活性，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或d)通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的改变的比表达活性的按照第2或3项的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
就上述方法而言，通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的改变的比表达活性的按照第2或3项的表达单元进行对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现d1)将一种或多种于适当条件下具有改变的比表达活性的按照第2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有改变的比表达活性的按照第2或3项的表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的按照第2或3项的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的按照第2或3项的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或受影响的基因修饰微生物，其中ch)与野生型相比，至少一种按照第2或3项的内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因表达，或dh)通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加比表达活性的按照第2或3项的表达单元来调节微生物中的基因表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
就上述方法而言，通过按照第2或3项的表达单元或者通过具有按照实施方案a)的增加的比表达活性的按照第2或3项的表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的按照第2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的按照第2或3项的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的按照第2或3项的内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的按照笫2或3项的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比至少一种基因的表达速率已降低的基因修饰微生物，其中cr)与野生型相比，至少一种按照第2或3项的内源表达单元在微生物中的比表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有已降低表达活性的按照第2或3项的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有已降低表达活性的按照第2或3项的表达单元控制下进行至少一种内源基因的表达。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其包含按照笫2或3项的表达单元以及功能性连接的待表达基因，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的。
该基因修饰微生物特别优选包含本发明的表达盒。
本发明特别优选涉及包含载体、特别是穿梭载体或质粒载体的基因修饰微生物、特别是棒杆菌，所述载体含有至少一种如本发明所定义的重组核酸构建体。
在基因修饰微生物的一个优选实施方案中，上述基因为至少一种编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸。
在基因修饰微生物的一个特别优选的实施方案中，上述基因选自编码来自生蛋白氨基酸与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸以及编码来自酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中所述基因可任选包含另外调节元件。
来自氨基酸生物合成途径的优选蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白质、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
来自氨基酸生物合成途径的蛋白质及基因的特别优选实例如上描述于表1及表2中。
优选的微生物或基因修饰微生物为细菌、藻类、真菌或酵母茵。
具体地，特别优选的微生物为棒杆菌。
优选的棒杆菌为棒杆菌属细菌、特别是谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)及Corynebacterium efficiens或者短杆菌属细菌、特别是黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)及叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)。
特别优选的棒杆菌与短杆菌属细菌选自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC 15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870、热产氨棒杆菌FERM BP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965、Corynebacteriumeffciens DSM 44547、Corynebacterium effciens DSM 44548、Corynebacterium effciens DSM 44549、黄色短杆菌ATCC 14067、乳糖发酵短杆茵ATCC 13869、叉开短杆菌ATCC 14020、谷氨酸棒杆菌KFCC10065及谷氨酸棒杆菌ATCC 21608。
缩写KFCC是指韩国联邦茵物保藏中心，缩写ATCC是指美国典型培养物保藏中心，缩写DSM是指德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikrorganismen)。
其它特别优选的棒杆菌与短杆菌属细菌列于表3中







这些缩写具有以下含义ATCC美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，美国FERM发酵研究所，Chiba，日本NRRLARS保藏中心，北方农业研究所，Peoria，IL，美国CECT西班牙典型培养物保藏中心，Valencia，西班牙NCIMB国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，英国CBS真菌菌种保藏中心，Baarn，荷兰NCTC国立典型培养物保藏中心，London，英国DSMZ德国微生物保藏和细胞培养中心，Brunswick，德国。
通过具有启动子活性的本发明核酸及本发明表达单元，可以借助于上述本发明的方法调节上述本发明的基因修饰微生物中的特定生物合成产物的代谢途径。
为了此目的，例如，导致特定生物合成产物的代谢途径可以通过影响或提高该生物合成途径中基因转录速率或表达速率来增强，其中增加的蛋白质数量导致目的生物合成途径的这些蛋白质的总活性增加，且因此导致通向目的生物合成产物的代谢通量增加。
此外，从特定生物合成产物分支的代谢途径可通过降低该分支生物合成途径的基因转录速率或表达速率来减弱，其中减少的蛋白质数量导致不必要的生物合成途径的那些蛋白质的总活性减少，并且因此额外导致通向目的生物合成产物的代谢通量增加。
本发明基因修饰微生物能够产生例如来自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素的生物合成产物或来自甘油与乙醇的生物合成产物。
因此，本发明涉及通过培养本发明的基因修饰微生物来生产生物合成产物的方法。
取决于目的生物合成产物，必须提高或降低多种基因的转录速率或表达速率。通常，有利的是改变多个基因的转录速率或表达速率，即提高基因组合的转录速率或表达速率和/或降低基因组合的转录速率或表达速率。
在本发明基因修饰微生物中，至少一种基因的改变了的(即提高的或降低的)转录速率或表达速率是归因于具有启动子活性的本发明的核酸或本发明表达单元。
另外，基因修饰微生物中其它基因的额外改变的(即额外提高的或额外降低的)转录速率或表达速率可(但不是必需)源自具有启动子活性的本发明的核酸或本发明表达单元。
因此，本发明进一步涉及通过培养本发明基因修饰微生物来生产生物合成产物的方法。
优选的生物合成产物为精细化学品。
术语“精细化学品”为本领域所知并且包括由生物生产并用于许多种工业例如(但不限于)制药业、农业、化妆品业、食品业及饲料业的化合物。这些化合物包括有机酸，例如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸、生蛋白氨基酸及非生蛋白氨基酸、嘌呤及嘧啶碱基、核苷及核苷酸(如描述于例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and related compounds，第561-612页，在Biotechnology，第6卷，编者Rehm等，VCHWeinheim及其中的参考文献)、脂类、饱和及不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二元醇(如丙二醇及丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸及海藻糖)、芳族化合物(如芳族胺、香草醛及靛蓝)、维生素及辅因子(如描述于Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613页，(1996)VCHWeinheim及其中的参考文献；及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”UNESCO会议录/Confederation of Scientificand Technological Associations in Malaysia和the Society for Free RadicalResearch-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCSPress(1995))、酶及由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation，NoyesData Corporation，ISBN0818805086及其中指出的参考文献中所述的所有其它化学品。以下进一步说明特定精细化学品的代谢及用途。
I.氨基酸的代谢和用途氨基酸构成所有蛋白质的基础结构单元并且因此对于细胞的正常功能是必需的。术语“氨基酸”为本领域所知。生蛋白氨基酸有20种，它们作为蛋白质的结构单元起作用，在蛋白质中氨基酸通过肽键连接在一起，而非生蛋白氨基酸(已知有数百种)通常不出现在蛋白质中(见Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97页，VCHWeinheim(1985))。虽然L-氢基酸是天然存在蛋白质中常见的唯一一种类型，但是氨基酸可以以D或L构型存在。20种生蛋白氨基酸中每一种的生物合成和降解途径已经在原核细胞和真核细胞中进行了很好表征(见例如，Stryer，L.Biochemistry，第3版，第578-590页(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)可通过简单的生物合成途径转变成其它11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，对于“必需”氨基酸，之所以如此称呼是因为由于其生物合成的复杂性其必须从食物中摄取。高等动物能够合成这些氨基酸中的一些氨基酸，但是必须从食物中摄取必需氨基酸以便进行正常蛋白质合成。
除了其在蛋白质生物合成中的功能以外，这些氢基酸本身是令人感兴趣的化合物，例如已经发现许多氨基酸在食品、饲料、化学品、化妆品、农业及制药业中具有多种应用。不但对于人类营养，而且对于单胃物种如家禽及猪，赖氨酸为重要的氨基酸。谷氨酸为最常用作调味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)，并且广泛用于食品业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同样如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸皆用于制药业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸用于制药业及化妆品业。苏氨酸、色氨酸及D/L-甲硫氨酸广泛使用于饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)Amino acids-Technical production anduse，第466-502页，在Rehm等人，(编者)Biotechnology，第6卷，第14a章，VCHWeinheim)。已经发现，这些氨基酸额外适合作为合成氨基酸及蛋白质合成的前体，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟基色氨酸以及描述于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97页，VCHWeinheim，1985中的其它物质。
已经很好地表征了这些天然氨基酸在能够生产它们的生物(例如细菌)中的生物合成(对于细菌氨基酸生物合成及其调节的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。谷氨酸通过α-酮戊二酸(柠檬酸循环中的一种中间体)的还原性胺化反应合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的每一个由谷氨酸相继产生。在三步骤方法中进行丝氨酸生物合成，开始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)，并在氧化、转氨基和水解步骤之后得到此氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸各自从丝氨酸产生，前者通过高半胱氨酸与丝氨酸的缩合作用产生，而后者通过在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中将侧链β-碳原子转移至四氢叶酸而产生。苯丙氨酸和酪氨酸从糖酵解及戊糖磷酸途径的前体赤藓糖-4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸于9步骤生物合成途径中合成，其仅在预苯酸合成后的最后两步中分开。色氨酸同样从这两个起始分子产生，但其通过11步的途径合成。酪氨酸也可通过苯丙氨酸羟化酶催化反应从苯丙氨酸制备。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸各自从糖酵解终产物丙酮酸生物合成。天冬氨酸从草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)形成。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自通过天冬氨酸转化产生。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸在复杂的9步途径中从5-磷酸核糖-1-焦磷酸(一种活化糖)形成。
超过细胞中蛋白质生物合成所需量的氨基酸无法被储存，而是被分解，所以给细胞中的主要代谢途径提供中间体(对于综述，见Stryer，L.Biochemistry，第3版，第21章，“Amino Acid Degradation and the UreaCycle”，第495-516页，(1988))。虽然细胞能够将不需要的氨基酸转变成为有用的代谢中间体，但是就合成所需的能量、前体分子及酶而言氨基酸的生产是昂贵。因此毫不奇怪氨基酸生物合成受反馈抑制的调节，由此特定氨基酸的存在使其自身生产减慢或完全停止(对于氨基酸生物合成途径中反馈机制的综述，见Stryer，L.Biochemistry，第3版，第24章，“Biosynthesisof Amino Acids and Heme”，第575-600页，(1988))。因此特定氨基酸的产出受细胞中该氨基酸量的限制。
II.维生素、辅因子及营养补充品(Nutraceutical)的代谢和用途维生素、辅因子及营养补充品包含其它组的分子。高等动物已丧失合成它们的能力，所以必须摄取，但是其可轻易地由其它生物如细菌合成。这些分子为本身具有生物活性分子或者为作为许多代谢途径中的电子载体或中间体的生物活性物质前体。这些化合物除了具有营养价值以外，它们还作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它加工辅料具有明显的工业价值。(对于这些化合物的结构、活性及工业应用的综述，见例如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613，VCHWeinheim，1996)。术语“维生素”为本领域所知并且包括生物正常功能所需要但无法由该生物本身合成的营养物。维生素组可包括辅因子和营养补充品化合物。术语“辅因子”包含正常酶活性所需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机的或无机的；本发明的辅因子分子优选是有机的。术语“营养补充品”包括在植物和动物、特别是人中具有健康促进作用的食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂以及某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
这些分子在能够生产它们的生物(如细菌)中的生物合成已被详细地表征(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613页，VCHWeinheim，1996，Michal，G(1999)BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wilely&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health andDisease”UNESCO会议录/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia和the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)。
硫胺(维生素B1)由嘧啶及噻唑单元化学偶联形成。核黄素(维生素B2)从鸟苷5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素用于合成黄素单核酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族统称为“维生素B6”(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛5’-磷酸和商业使用的盐酸吡哆醇)，其皆为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，R-(+)-N-((2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵制备。泛酸生物合成的最后步骤为ATP驱动的β-丙氨酸与泛解酸的缩合。负责转变成泛解酸和转变成β-丙氨酸以及缩合成泛酸的生物合成步骤的酶是已知的。泛酸的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5个酶促步骤产生。泛酸、磷酸吡哆醛5’-磷酸、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸的形成，还催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸内酯、(R)-泛醇(维生素原B5)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的生产。
已经详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰-CoA的生物合成，并且已经鉴定出几个有关基因。已显示许多相应蛋白质参与Fe簇合物合成并且属于nifS蛋白质类。硫辛酸源自辛酸并且作为能量代谢中的辅酶，它成为丙酮酸脱氢酶复合物和α-酮戊二酸脱氢酶复合物的组成成分。叶酸类为全部源自叶酸的一组物质，叶酸依次从L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基喋呤衍生而来。已经在某些微生物中详细研究了从代谢中间产物鸟苷5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸开始的叶酸及其衍生物的生物合成。
类咕啉(如钴胺素，特别是维生素B12)和卟啉属于通过四吡咯环系统区别的一组化学品。维生素B12的生物合成太过复杂以至于尚未完全了解，但现已知大多数有关的酶及底物。烟酸(烟酸酯)及烟酰胺为吡啶衍生物，也称为“尼克酸”。尼克酸是重要辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。
虽然这些化合物中有一些已经通过大规模微生物培养而生产，如核黄素、维生素B6、泛酸和生物素，但是这些化合物在工业规模上的生产主要基于无细胞的化学合成。只有维生素B12由于其合成的复杂性而只能通过发酵生产。体外方法需要相当大的材料花费和时间，并且成本常常很高。
III.嘌呤、嘧啶、核苷及核苷酸的代谢和用途用于嘌呤和嘧啶代谢的基因及其相应蛋白质对于肿瘤疾病和病毒感染的治疗为重要的目标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包含含氮碱基，其是核酸、辅酶及核苷酸的组分。术语“核苷酸”包含核酸分子的基础结构单元，其包括含氮碱基、戊糖(在RNA中此糖为核糖，在DNA中此糖为D-脱氧核糖)和磷酸。术语“核苷”包含作为核苷酸前体的分子，但与核苷酸相比其无磷酸单元。通过抑制这些分子的生物合成或者通过抑制其动员形成核酸分子，可以抑制RNA和DNA合成；在癌细胞中对该活性的靶向抑制则能够抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。
还有一些核苷酸不形成核酸分子而是作为能量储存(即AMP)或辅酶(即FAD和NAD)。
几个出版物已经描述了这些化学品在医学指征中的用途，其中嘌呤和/或嘧啶代谢受到影响(例如Christophrson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)，“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents”，Med.Res.Reviews 10505-548)。对嘌呤和嘧啶代谢所涉及酶的研究集中于可以用作例如免疫抑制剂或抗增殖剂的新药开发上(Smith，J.L.“Enzymes in Nucleotide Synthesis”Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757；Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-902)。然而，嘌呤及嘧啶碱基、核苷及核苷酸还有其它可能的用途作为多种精细化学品生物合成中的中间体(如硫胺、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸或核黄素)、作为细胞的能量载体(例如ATP或GTP)并且对于化学品自身通常用作增味剂(例如IMP或GMP)或用于许多医学应用(见例如Kuninaka，A.，(1996)“Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology”，第6卷，编者Rehm等，VCHWeinheim，第561-612页)。参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶也日渐成为为了作物保护而正在开发的化学品(包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂)所针对的目标。
这些化合物在细菌中的代谢已被表征(对于综述，见例如Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)“De novo purine nucleotide biosynthesis”，在Progressin Nucleic Acids Research and Molecular biology，第42卷，Academic Press，第259-287页；以及Michal，G.(1999)，“Nucleotides and Nucleosides”；第8章，在Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，Wiley，New York)。嘌呤代谢为深入研究的课题，其为细胞正常功能所必需的。高等动物中嘌呤代谢受损可能引起严重失调，例如痛风。通过许多步骤从核糖5-磷酸经由中间体化合物肌苷5’-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，导致产生鸟苷5’-单磷酸(GMP)或腺苷5’-单磷酸(AMP)，由此可轻易地制备作为核苷酸使用的三磷酸形式。将这些化合物还可以作为能量储存使用，以致于它们的降解能够为细胞中的许多不同生物化学过程提供能量。嘧啶生物合成从核糖5-磷酸经由尿苷5’-单磷酸(UMP)进行。之后将UMP转变成胞苷5’-三磷酸(CTP)。所有核苷酸的脱氧形式都是由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步还原反应中制备从而产生核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。
IV.海藻糖代谢和用途海藻糖由以α，α-1，1键连接在一起的两个葡萄糖分子组成。它通常在食品业中用作甜味剂、干燥或冷冻食品及饮料中的添加剂。然而，其还用于制药业或化妆品业和生物工程业(见例如Nishimoto等人，(1998)美国专利号5759610；Singer，M.A.和Lindquist，S.Trends Biotech.16(1998)460-467；Paiva，C.L.A和Panek，A.D.Biotech Ann.Rev.2(1996)293-314；以及Shiosaka，M.J.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖由许多微生物的酶生产并且以天然方式被释放入周围培养基，可通过本领域已知的方法从所述培养基中分离海藻糖。
特别优选的生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸与核苷、生蛋白与非生蛋白氨基酸、脂类与脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素与辅因子、酶及蛋白质。
优选的有机酸为酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。
优选的核苷与核苷酸描述于例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotides andrelated compounds，第561-612页，Biotechnology，第6卷，Rehm等人，编者，VCHWeinheim及其中所出现的参考文献。
优选的生物合成产物此外还有脂类、饱和及不饱和脂肪酸如花生四烯酸、二醇如丙二醇及丁二醇、糖类如透明质酸及海藻糖、芳香化合物如芳香胺、香草醛及靛蓝、维生素及辅因子(例如描述于Ullmann′s Encyclopediaof Industrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613页(1996)VCHWeinheim与其中所出现的参考文献及Ong，A.S.，Niki，E.与Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”UNESCO会议录/Confederation ofScientific and Technological Associations in Malaysia和the Society for FreeRadical Research-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science 28263-68)及所有其它描述于Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes DataCorporation，ISBN0818805086及其中所指出参考文献中的化学物质。
特别优选的生物合成产物为氨基酸，特别优选必需氨基酸，具体而言为L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-苏氨酸、L-高丝氨酸，尤其为L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸及苏氨酸在下文的每一情况下是指氨基酸的L型及D型，优选为L型，即例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。
具体而言，本发明涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率提高或受影响的基因修饰微生物来生产赖氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysR1的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的本发明表达单元对微生物中这些基因表达的调节可通过以下方式实现
dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
用于制备赖氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysR1的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。
用于制备赖氨酸的上述方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比还具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白质活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。
可通过(但不是必需)具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明表达单元引起上述这些额外增加或降低活性中的至少一种。
本发明进一步涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或受影响的基因修饰微生物来生产甲硫氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，其中所述内源表达单元可调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的本发明表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ合酶的核酸、编码胱硫醚β裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I活性的核酸、编码半胱氨酸合酶II的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。
就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的本发明表达单元对微生物中这些基因表达的调节可通过以下方式实现dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元控制下进行这些内源基因中一种或多种基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
用于制备甲硫氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性。
上述用于制备甲硫氨酸的方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
可通过(但不是必需)具有启动子活性的本发明核酸和/或本发明表达单元引起上述这些另外增加或降低的活性中的至少一种。
本发明进一步涉及通过培养与野生型相比至少一种基因的表达速率已提高或影响的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的本发明表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于表达单元而言是异源的，并且其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白质的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
就上述方法而言，通过本发明表达单元或者通过具有按照实施方案ch)的增加的比表达活性的本发明表达单元对微生物中基因的表达的调节可通过以下方式实现dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元控制下进行这些内源基因中的一种或多种基因的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或
dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的本发明表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
用于制备苏氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白质活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。
用于制备苏氨酸的上述方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比另外还具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
可通过(但不是必需)具有启动子活性的本发明的核酸和/或本发明表达单元引起上述这些另外增加或降低的活性中的至少一种。
术语蛋白质的“活性”在酶的情况下是指相应蛋白质的酶活性，在其它蛋白质的情况下，如结构蛋白或转运蛋白的情况下其是指蛋白质的生理活性。
酶通常能将底物转化为产物，或催化此转化步骤。
因此，酶的“活性”是指在特定时间内由酶转化的底物的量，或所形成的产物的量。
因此，当与野生型相比活性增加时，则与野生型相比在特定时间内由酶所转化的底物的量或所形成的产物的量增加。
对于前文和后文所述的所有活性，“活性”增加优选达到“野生型活性”的至少5％、优选至少20％、进一步优选至少50％、进一步优选至少100％、更优选至少300％、甚至更优选至少500％、特别优选至少600％。
因此，当与野生型相比活性降低时，则与野生型相比在特定时间内由酶转化的底物的量或形成的产物的量降低。
降低的活性优选是指微生物中此酶功能性会基于多种细胞生物学机制而部分或基本上完全抑制或阻断。
活性的降低包含酶数量的减少，直至酶基本上完全缺乏(即检测不到相应活性或缺乏酶的免疫学可检测性)。与野生型相比，微生物中活性优选降低至少5％，进一步优选至少20％，进一步优选至少50％，进一步优选100％。具体而言，“降低”也是指相应活性的完全丧失。
通过已知方法如酶分析法测定基因修饰微生物及野生型中特定酶的活性，并且由此测定酶活性的增加或降低。
例如，丙酮酸羧化酶是指显示将丙酮酸转化为草酰乙酸的酶活性的蛋白质。
因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量。
因此，当与野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加时，则与野生型相比在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白质转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量增加。
丙酮酸羧化酶活性的这种增加优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少5％、进一步优选至少20％、进一步优选至少50％、进一步优选至少100％、更优选至少300％、甚至更优选至少500％、具体而言至少600％。
此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指显示将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白质。
因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。
因此，当与野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低时，则与野生型相比在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白质转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量降低。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶数量的减少，直至烯醇丙酮酸磷酸羧激酶基本上完全缺乏(即检测不到烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性或者缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫学可检测性)。与野生型相比，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性优选降低至少5％、进一步优选至少20％、进一步优选至少50％、进一步优选100％。具体而言，“降低”也指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全丧失。
可以多种方式额外地增加活性，例如通过在表达及蛋白质水平上关闭抑制调节机制或通过与野生型相比增加编码上述蛋白质的核酸的基因表达。
同样地，与野生型相比增加编码上述蛋白质的核酸的基因表达可以多种方式进行，例如通过激活物诱导该基因，或者如上所述通过增加启动子活性或增加表达活性或通过将一个或多个基因拷贝导入微生物中。
增加编码蛋白质的核酸的基因表达也指根据本发明操纵微生物固有内源蛋白质的表达。
如上所述，这可以通过例如改变启动子和/或基因的表达单元序列来实现。例如，可通过缺失或插入DNA序列来进行这种导致基因表达速率提高的改变。
如上所述，可以通过施加外源刺激改变内源蛋白质的表达。这可通过特定生理条件，即应用外源物质进行。
本领域的技术人员可借助其它不同方法(单独或组合)实现基因表达的增加。因此，例如可增加适当基因的拷贝数，或将启动子及调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。另外，可通过诱导性启动子在发酵生产过程中增加表达。延长mRNA寿命的方法同样可改善表达。通过防止酶蛋白降解同样也可增强酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或在染色体中整合并扩增。备选地，也可通过改变培养基的组成及培养物处理实现相关基因的过表达。
本领域的技术人员可尤其在Martin等人(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))、欧洲专利第0472869号、美国专利第4,601,893号、Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991))、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、专利申请WO 96/15246、Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))、日本公开说明书JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996))及众所周知的遗传与分子生物学教科书中发现对此的指导。
此外，除了基因的表达或增强以外，消除有害副反应对生物合成产物，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸的生产是有利的(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，在Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编者)，Academic Press，London，英国，1982)。
在一个优选实施方案中，通过将至少一种编码相应蛋白质的核酸导入微生物中使编码上述蛋白质之一的核酸的基因表达增加。核酸导入可在染色体上或染色体外进行，即通过染色体上拷贝数的增加和/或在宿主微生物中复制的质粒上的一个拷贝基因。
核酸的导入(例如以包含核酸的表达盒形式)优选在染色体上进行，具体而言通过上述SacB方法进行。
原则上，为了该目的可以使用编码上述蛋白质之一的任何基因。
以真核来源的包含内含子的基因组核酸序列为例，若宿主微生物不能够表达相应蛋白质或者不会使其表达相应蛋白质，则优选使用已经加工过的核酸序列，例如相应cDNA。
相应基因的实例列于表1及表2中。
通过以下方法中的至少一种优选降低微生物中的上述活性●导入至少一种用于诱导共抑制的有义核糖核酸序列或者确保其表达的表达盒；●导入至少一种针对相应基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子或者确保其表达的表达盒；●导入至少一种引起RNA降解的病毒核酸序列或者确保其表达的表达盒，●导入至少一种引起基因功能丧失的构建体，其中在所述构建体中通过例如在基因中产生插入、缺失、倒置或突变而产生终止密码子和使阅读框移位。可能且优选的是通过同源重组靶向插入至目的靶基因中或者通过导入针对靶基因的序列特异性核酸酶产生敲除突变体；●导入具有降低启动子活性的启动子或者具有降低表达活性的表达单元。
本领域的技术人员认识到，在本发明的范畴内还可使用其它方法来降低其活性或功能。例如，导入蛋白质的显性失活变体或确保其表达的表达盒也是有利的。
此外，这些方法中的每一个均可能引起蛋白质数量、mRNA数量和/或蛋白质活性降低。也可以想到这些方法的组合使用。其它方法对本领域技术人员而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白质加工、蛋白质或其mRNA的转运、抑制核糖体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译延伸或终止。
在用于生产生物合成产物的本发明方法中，优选在培养基因修饰微生物的步骤之后从微生物和/或发酵培养基中分离生物合成产物。这些步骤可同时进行和/或优选在培养步骤之后进行。
可用分批法(分批培养)或者补料分批或重复补料分批法中培养本发明基因修饰微生物，以连续或间断生产生物合成产物，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。在Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科书或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科书中找到已知培养方法概述。
待使用的培养基必须以适当地方式满足各个菌株的要求。在美国微生物学会的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，美国，1981)手册中描述了用于多种微生物的培养基。
根据本发明，这些可使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。
优选的碳源为糖例如单糖、二糖或多糖。良好碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可经诸如糖蜜的复杂化合物或糖精制的其它副产物将糖置于培养基中。添加多种碳源的混合物也是有益的。其它可能的碳源为油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸；醇，例如甘油、甲醇或乙醇以及有机酸，例如乙酸或乳酸。
氮源通常为有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵的铵盐、硝酸盐、尿素、氨基酸或诸如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其它物质的复合氮源。氮源可单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜及铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
为了产生精细化学品，尤其是甲硫氨酸，可能使用无机化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物作为硫源，但是也可使用有机硫化合物例如硫醇及硫醇类作为硫源。
可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。
可将螯合剂加入培养基以便保持溶液中的金属离子。特别适宜的螯合剂包括二羟基酚类如儿茶酚或原儿茶酸以及有机酸如柠檬酸。
根据本发明，所使用的发酵培养基通常还包含诸如维生素或生长促进剂的其它生长因子，其包括例如生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸及吡哆醇。生长因子及盐常常来自培养基的复杂成分例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。也可将适宜前体添加至培养基中。培养基中化合物的精确组成很大程度上视具体实验而定，并且将对于每一具体情况单独确定。对培养基进行优化的信息可从教科书“Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach”(编者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0199635773)得到。也可从商品供应商购买生长培养基，例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸出液，DIFCO)。
将所有培养基成分通过加热(1.5巴和121℃下20分钟)或无菌过滤灭菌。可将成分一起灭菌或视需要分开灭菌。所有培养基成分可在培养开始即存在或任选连续或分批加入。
培养基的温度通常在15℃与45℃之间，优选在25℃与40℃，且在实验过程中保持恒定或变化。培养基的pH值应处于5至8.5的范围内，优选为约7.0。在培养期间可通过添加诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或诸如磷酸或硫酸的酸性化合物来控制培养用的pH值。可通过使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡剂来控制泡沫产生。通过向培养基中添加具有选择作用的适宜物质，例如抗生素来维持质粒的稳定性。通过向培养基中导入氧或含氧气体混合物(例如环境空气)来维持需氧条件。培养物的温度通常为20℃至45℃。培养持续进行到目的产物的形成达到最大量。通常在10小时至160小时内达到此目标。
以此方式得到的发酵肉汤的干物质含量通常为7.5至25％(以重量计)。
此外，至少在发酵末期，但是具体是在超过发酵时间的至少30％的时候进行糖限制发酵也是有利的。这意味着在这段时间内发酵培养基中可利用的糖浓度保持在0至3g/l或是降低的。
根据所要生物合成产物及生物合成的副产物的物理/化学特性，以本身已知的方式从发酵肉汤和/或微生物中分离生物合成产物。
例如，可接着进一步处理发酵肉汤。视需要而定，可用分离方法例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合从发酵肉汤中全部或部分移除生物量或将其全部保留于其中。
接着用已知方法浓缩发酵肉汤，例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜式蒸发器通过逆渗透或通过纳米过滤。然后通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒或其它方法处理该浓缩的发酵肉汤。
然而，也可能进一步纯化生物合成产物，尤其为L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。为了该目的，在除去生物量之后，使用适宜树脂对含有产物的肉汤进行层析，其中目的产物或杂质全部或部分地滞留于层析树脂上。若需要，则可使用相同或不同层析树脂重复进行这些层析步骤。本领域的技术人员精通适宜层析树脂的选择及其最有效的使用。纯化的产物可通过过滤或超滤来浓缩且贮存于产物稳定性最大的温度下。
生物合成产物可以有多种形式，例如其盐或酯的形式。
可用现有技术确定所分离的化合物及纯度。这些现有技术包含高效液相层析法(HPLC)、光谱法、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定法或微生物测定。这些分析方法总结于Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 11 27-32以及Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.1967-70；Ulmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90页、第521-540页、第540-547页、第559-566页、575-581页及第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistryand Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)Applications of HPLC in Biochemistry，在Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第17卷中。
实施方案现通过以下非限定性实施例更详细地描述本发明实施例1载体pSK1Cat的构建将穿梭载体pMT1(Follettie et al.(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)用限制酶XhoI和BamHI消化，随后用Klenow片段处理并重新连接。所得质粒命名为pMT1-del。将载体pMT1-del用限制酶BglII和XbaI消化。2.5kb片段包含来自谷氨酸棒杆菌的pSR1 ori并且连接到2kb plasposonpTnMod-Okm(Dennis和Zylstra(1998)Appl.Environ.Microbiol.642710-2715)，其已经同样用BglII和XbaI切割。所得载体命名为pSK1。plasposon pTnMod-Okm的片段具有来自大肠杆菌的pMB1复制起点和卡那霉素抗性标记(Tn903)。通过聚合酶链式反应(PCR)按照如Innis et al.(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods and Applications，AcademicPress中描述的标准方法，通过寡核苷酸引物A(SEQ.ID.NO.4)和B(SEQ.ID.NO.5)，使用载体PKK232-8(SEQ.ID.NO.3)作为模板扩增没有启动子的cat基因。载体和插入片段用限制酶BglII和KpnI消化后，将该PCR产物连接到载体pSK1。该质粒命名为pSK1Cat(

图1)。
寡核苷酸引物A SEQ.ID.NO.45’-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-3’寡核苷酸引物B SEQ.ID.NO.55’-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-3’实施例2质粒pSK1 Ptac的构建质粒pKK223-3 SEQ.ID.NO.6包含(Ptac)启动子。该启动子通过用限制酶BamHI消化来分离，并将该片段克隆入BamHI-线性化的载体pSK1Cat SEQ ID中。该质粒命名为pSK1Ptac(图2)。
实施例3 P1-35(SEQ.ID.NO.1)的克隆使用Eikmanns et al.(1994)Microbiology 1401817-1828的方法从晚指数期的细胞分离谷氨酸棒杆菌AS019E12的染色体DNA，并随后用限制酶Sau3AI部分消化。所得片段(大小为0.4-1.0kb)连接到已经用限制酶BamHI线性化的载体pSK1Cat中。通过电穿孔，使用Follettie et al.(1993)J.Bacteriol.1754096-4103的方法将连接混合物转化到谷氨酸棒杆菌AS019E12。将细胞接种在包含5μg/ml氯霉素的平板上。分离并分析生长在这些平板上的单个茵落的质粒。一种此类质粒是pSK1Cat P1-35，其包含启动子P1-35(SEQ.ID.NO.1)。该启动子位于编码ABC转运蛋白的基因的上游区。插入片段大小为280bp。
实施例4谷氨酸棒杆菌AS019E12中对氯霉素的抗性仅包含质粒pSK1Cat(图1)的谷氨酸棒杆菌的细胞不能在30℃下在MB平板(Follettie et al.(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)和MCGC平板(von der Osten et al.(1989)Biotechnol.Lett.1111-16)上在5μg/ml的氯霉素浓度下生长。cat基因不表达。相比，包含质粒pSK1CatPtac(图2)的谷氨酸棒杆菌的细胞将在MB和MCGC平板上在40μg/ml的氯霉素浓度下生长。在大于40μg/ml的氯霉素浓度下生长仅仅非常弱，几乎观察不到。包含质粒pSK1Cat P1-35的细胞能够在MB和MCGC平板上在40μg的氯霉素浓度下生长。
实施例5大肠杆菌中对氯霉素的抗性包含质粒pSK1CatPtac(图2)的大肠杆菌的细胞在LB平板上(Sambrook et al.(1989)Molecular cloning-A laboratory manual.ColdSpring Harbor Laboratory，2nded.，Cold Spring Harbor，N.Y.)在400μg/ml的氯霉素浓度下生长。不能观察到在600μg/ml氯霉素浓度下生长。包含质粒pSK1CatP1-35的细胞能够在LB平板上在600μg的氯霉素浓度下生长。
实施例6通过氯霉素转移酶(CAT)活性测定启动子强度测定谷氨酸棒杆菌AS019E12的CAT活性以便确定启动子P1-35(SEQ.ID.NO.1)的相对强度。为此，按照Jetten和Sinsky(1993)FEMSMicrobiol.Lett.111183-188的方法制备粗提物。通过Shaw et al(1993)Methods Enzymol.43737-755的方法测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性。反应混合物包含100mM Tris*HCl pH 7.5，1mM DTNB，0.1mM乙酰辅酶A，0.25mM氯霉素和合适量的酶。测量在412nm波长下光密度的改变。使用Bradford方法(1976)Anal.Biochem.72248-254分析蛋白质浓度。结果在下表中显示

图图1显示了pSK1Cat的质粒图(A)和BamHl克隆位点的核苷酸序列(B)。B中的带下划线的序列代表用于产生测序寡核苷酸的区域。指出了起始密码子和BamHl克隆位点。
图2显示了pSK1Ptac的核苷酸序列的部分。启动子Ptac以斜体显示。还指出了cat基因的-35和-10区、RBS和起始密码子。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>P1-35表达单元<130>AE 20040552<160>10<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>280<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220>
<221>启动子<222>(1)..(280)<223>
<400>1
gatctgactc agcctttacc cacgtcagga caggtttctt ggaccactcg cgtgatttac 60ggcggttcca atgagcaggt gcgtgtggtg caggattcca cctcttcggt gagcttcgga120gaccagtaat ttaccaatta gggttgccaa aatccccaac tgtggttcat acttgtctgc180atggatcttc aatagtcaaa accagcaaac taatttttta agttttacgt aactggcccc240accgcttgtg gcaggccttg cgttttgaca ttgaaggacc 280<210>2<211>286<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(286)<223>表达单元<400>2gatctgactc agcctttacc cacgtcagga caggtttctt ggaccactcg cgtgatttac 60ggcggttcca atgagcaggt gcgtgtggtg caggattcca cctcttcggt gagcttcgga120gaccagtaat ttaccaatta gggttgccaa aatccccaac tgtggttcat acttgtctgc180atggatcttc aatagtcaaa accagcaaac taatttttta agttttacgt aactggcccc240accgcttgtg gcaggccttg cgttttgaca ttgaaggacc cttttt 286<210>3
<211>5094<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5094)<223>质粒ttcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 60gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg120ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccagggaat180tcccggggat ccgtcgacct gcagccaagc ttgagtagga caaatccgcc gagcttcgac240gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt300tgatatatcc caatcgcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg360tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa420taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc480ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg540ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga600cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct660ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt720
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<221>引物<222>(1)..(27)<223>引物<400>4ggaagatctt tcaagaattc ccaggca 27<210>5<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>引物<400>5ggggtaccta ccgtatctgt gggggg 26<210>6<211>4991<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4991)<223>质粒<400>6ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa 120
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<221>CDS<222>(1)..(1005)<223>
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100 105 110Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165170 175Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg
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<221>CDS<222>(1)..(1365)<223>
<400>9atg aat gat gag aat att caa agc tcc aac tat cag cca ttc ccg agt48Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Set Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser1 5 10 15ttt gac gat tgg aaa cag atc gag gtg tcg ctc tta gat gtc atc gaa96Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu20 25 30
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Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr405 410 415Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val420 425 430Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala435 440 445Lys Lys Phe Gln Gln Asn450
权利要求
1.一种具有启动子活性的核酸在基因转录中的用途，所述核酸包含A) 核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B) 通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C) 在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D) A)、B)或C)序列的功能等效片段。
2.一种表达单元在基因表达中的用途，所述表达单元包含根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸以及额外的功能性连接的核酸序列，其中所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述表达单元包含E) 核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F) 通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G) 在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H) E)、F)或G)序列的功能等效片段。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述表达单元由核酸序列SEQ.ID.NO.2组成。
5.一种具有启动子活性的核酸，其包含A) 核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B) 通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C) 在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D) A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.一种表达单元，其包含根据权利要求5所述的具有启动子活性的核酸以及额外的功能性连接的核酸序列，其中所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。
7.根据权利要求6所述的表达单元，其包含E) 核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F) 通过核苷酸替代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生并且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G) 在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H) E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.一种与野生型相比，改变或影响微生物中基因转录速率的方法，其通过以下方式实现a) 与野生型相比，改变根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b) 通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现b1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的转录速率，ah)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性或调节内源基因的转录的内源核酸在微生物中的比启动子活性是增加的，或bh)通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现bh1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的转录速率，ar)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性是降低的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有根据实施方案a)所述的降低的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行内源基因的转录。
13.一种与野生型相比，改变或影响微生物中基因表达速率的方法，其通过以下方法实现c)与野生型相比，改变根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的比表达活性，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或d)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案c)所述改变的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现d1)将一种或多种于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的表达速率，ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dh)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的表达速率，cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的比表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dr)将根据实施方案cr)所述具有降低的比表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行内源基因的表达。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中所述基因选自编码生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，所述基因可以包含其它调节元件。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
20.一种表达盒，其包含a) 至少一种根据权利要求2或3所述的表达单元，及b) 至少一种其它待表达核酸，及c) 于适当条件下的其它遗传控制元件，其中至少一种表达单元与其它待表达核酸序列功能性连接在一起，且所述其它待表达核酸序列相对于所述表达单元而言是异源的。
21.根据权利要求20所述的表达盒，其中所述其它待表达核酸序列选自编码生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸。
22.根据权利要求21所述的表达盒，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
23.一种表达载体，其包含根据权利要求20至22中任一项所述的表达盒。
24.一种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的转录速率，并取决于a) 改变微生物中至少一种根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸的比启动子活性，所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b) 通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。
25.根据权利要求24所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现b1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有改变的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
26.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的转录速率，其中ah)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性是增加的，其中所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案ah)所述增加的比启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因相对于所述具有启动子活性的核酸而言是异源的。
27.根据权利要求26所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比启动子活性的权利要求1所述具有启动子活性的核酸对微生物中基因转录的调节通过以下方式实现bh1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所导入的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种所导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、于适当条件下具有增加的比启动子活性的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
28.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的转录速率，其中ar)与野生型相比，至少一种根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的比启动子活性是降低的，其中所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种具有根据实施方案a)所述的降低的启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行至少一种内源基因的转录。
29.一种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的表达速率，并取决于c)与野生型相比，改变根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的比表达活性，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或d)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
30.根据权利要求29所述的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述改变的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现d1)将一种或多种于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在所述于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有改变的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
31.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的表达速率，其中ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的比表达活性是增加的，其中所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
32.根据权利要求31的基因修饰微生物，其中通过根据权利要求2或3所述的表达单元，或者通过具有根据实施方案a)所述增加的比表达活性的权利要求2或3所述表达单元对微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dh1)将一种或多种于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述内源表达单元控制下进行一种或多种所导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建体导入微生物中，所述核酸构建体包含于适当条件下具有增加的比表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
33.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的表达速率，其中cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的比表达活性是降低的，其中所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有降低的表达活性的根据权利要求2或3所述表达单元导入微生物基因组中，以便在所导入的具有降低的表达活性的权利要求2或3所述表达单元控制下进行至少一种基因的表达。
34.一种基因修饰微生物，其包含根据权利要求2或3所述的表达单元以及功能性连接的待表达基因，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
35.根据权利要求34所述的基因修饰微生物，其包含根据权利要求20至22中任一项所述的表达盒。
36.根据权利要求24-35中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述基因选自编码生蛋白与非生蛋白氨基酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码核苷酸与核苷生物合成途径的蛋白质的核酸、编码有机酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码脂类与脂肪酸生物合成途径的蛋白质的核酸、编码二元醇生物合成途径的蛋白质的核酸、编码糖类生物合成途径的蛋白质的核酸、编码芳香化合物生物合成途径的蛋白质的核酸、编码维生素生物合成途径的蛋白质的核酸、编码辅因子生物合成途径的蛋白质的核酸及编码酶生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，所述基因还包含其它调节元件。
37.根据权利要求36所述的基因修饰微生物，其中所述来自氨基酸生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
38.一种通过培养根据权利要求24-37中任一项所述的基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。
39.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰的微生物来制备赖氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysR1的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysR1的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。
42.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备甲硫氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ合酶的核酸、编码胱硫醚β裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I的核酸、编码半胱氨酸合酶II的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
45.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述生物合成产物是在培养步骤后和/或培养步骤期间中从培养基中分离的并且在适当条件下是从培养基中纯化的。
全文摘要
本发明涉及用于调节基因转录和表达的核酸序列的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的基因修饰微生物及通过培养该基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。
文档编号C12P13/04GK1984991SQ200580023730
公开日2007年6月20日 申请日期2005年7月16日 优先权日2004年7月20日
发明者J－S·乔, W·K·曾, I·K·基姆, S·H·利姆, H-S·李 申请人:巴斯福股份公司