专利名称：具有增加的组氨酸含量的动物饲料组合物的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求2004年5月28日提交的美国临时申请60/575,628以及2004年6月4日提交的美国临时申请60/577,363的优先权，这些文献的全部内容引入本文作为参考。
背景技术：
所有动物均需要氨基酸(AA)，其是最佳生长、繁殖、哺乳和维持生活所需的蛋白质的结构单元。牛小肠吸收的氨基酸来源于微生物蛋白质和在其瘤胃中未降解的膳食蛋白质。小肠内消化的蛋白质必须补充10种不能由牛产生的必需氨基酸(EAA)，其包括精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。理想地，所吸收的各EAA的相对比例将与牛的需要量精确地匹配，因为缺乏一种就可能限制其它氨基酸的利用。
反刍动物(牛、羊)具有复杂的蛋白质营养，因为它们有进行消化的前胃。在前两个室瘤胃和网胃中，共生细菌和原生动物群体使饲料发酵，并利用非蛋白氮源如氨或尿素生长。这些细菌可消化植物纤维，使牛能够从这些饲料中获得能量。它们还由廉价的副产物合成蛋白质。微生物蛋白质产量直接与微生物生长有关，其主要由碳水化合物例如淀粉、中性洗涤纤维(NDF)、糖以及残余非纤维碳水化合物(例如果胶和β-葡聚糖)存在决定。微生物群体不断地从瘤胃中冲洗出进入真胃(即皱胃)中，在该处被消化以给牛补充氨基酸。
除从微生物产生的蛋白质获得氨基酸以外，反刍动物还从经由瘤胃到皱胃未降解的必需氨基酸(UEAA)获得氨基酸。哺乳反刍动物在乳汁中分泌比在牛膳食消耗以及小肠中出现的更多的特定氨基酸(例如组氨酸)。这些缺乏的氨基酸称作限制氨基酸。给动物补充限制氨基酸可提高产奶量和奶组分组成。可以以UEAA形式提供限制氨基酸。
发明内容
本文提供了通常引起奶牛及其它反刍动物产奶量增加的组合物和方法。喂养反刍动物以获得最佳畜产品产量包括了解氨基酸、脂肪酸和碳水化合物营养。本文提供了提高所述反刍动物营养，特别是氨基酸营养的组合物和方法。本文还提供通过给反刍动物喂食具有增加含量的一种或多种限制氨基酸的饲料，来减少氨基酸限制并提高哺乳反刍动物产奶量和奶组分组成的方法。
通过给奶牛喂食特定的递送平衡改善的十种必需氨基酸的饲料组合物，可增加牛的产奶量。特别地，所述饲料组合物可具有增加含量的一种或多种限制氨基酸，该含量由牛用于维持生活、生长和产奶量的氨基酸需要量所确定。限制氨基酸可包括组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和/或苏氨酸。所述饲料组合物可配制成递送平衡改善的过瘤胃必需氨基酸。
所述饲料组合物一般包含至少一种具有增加的组氨酸含量的成分，且该成分一般来源于非动物源(例如细菌、酵母和/或植物)。例如，所述组合物可包含组氨酸源，所述组氨酸源包含L-组氨酸和产组氨酸微生物发酵中形成的生物质。在另一实施例中，所述饲料组合物包含组氨酸源，所述组氨酸源可包含L-组氨酸和产组氨酸微生物发酵中形成的溶解和悬浮成分。在其它实施方案中，所述饲料组合物可具有粗蛋白质部分，所述粗蛋白质部分包含至少一种非动物源的富含组氨酸的蛋白质(即由细菌、酵母和/或植物生产的富含动物或非动物组氨酸的蛋白质)。另外，所述饲料组合物可包含由重组细菌、酵母和/或植物(例如通过重组细菌发酵)产生的富含动物或非动物组氨酸的蛋白质。例如，可对细菌、酵母和/或植物进行工程化来生产存在于血粉中的富含组氨酸的蛋白质(例如血红素α链)。所有所述饲料组合物通常包含至少一种附加营养组分。
所述饲料组合物可包含至少约1g/kg的所述组氨酸源。在一些实施方案中，所述饲料组合物包含至少约2g/kg的所述组氨酸源。所述饲料组合物可包含高达约10g/kg的所述组氨酸源。
如本文所述，L-组氨酸包括作为游离氨基酸的组氨酸和组氨酸盐(例如组氨酸(HCl))。当本文提及L-组氨酸的量时，所述量是指以基于游离氨基酸计的组氨酸。
所述饲料组合物可包含产组氨酸微生物发酵中形成的发酵成分。如本文所述，“发酵成分”可包含来自发酵液的任何适合的成分。例如，发酵成分可包含来自发酵液的溶解和/或悬浮成分。所述悬浮成分可包含(例如在溶液中一种或多种组分过饱和的情况下)未溶解的可溶成分和/或所述发酵液中存在的不可溶物质。所述发酵成分还可包含至少部分发酵中形成的生物质。所述发酵成分可包含发酵结束时存在的基本所有干固体(例如通过喷雾干燥发酵液和由发酵生产的生物质)或者可包含其一部分。例如，可将产组氨酸微生物发酵得到的粗发酵产物分级分馏和/或部分纯化以增加除组氨酸之外可能还含有发酵成分的物质中的组氨酸含量。
所述饲料组合物可包含组氨酸含量至少约2.8重量％的粗蛋白质部分。在合适的实施方案中，所述粗蛋白质部分的组氨酸含量可为至少约3％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，在合适的实施方案中至少约20％。通常，所述饲料组合物可包含组氨酸含量高达约7.0重量％的粗蛋白质部分。更通常地，所述饲料组合物可包含组氨酸含量为约2.8-5.0重量％，更通常为3.0-4.0重量％的粗蛋白质部分。
基于游离氨基酸计，所述饲料组合物可包含组氨酸含量为至少约300克/kg干固体的组氨酸源。在合适的实施方案中，基于游离氨基酸计，所述组氨酸源的组氨酸含量为至少约400克/kg干固体，至少约500克/kg干固体，至少约600克/kg干固体，至少约700克/kg干固体和/或至少约800克/kg干固体。
所述饲料组合物可包含瘤胃保护的组氨酸源，所述瘤胃保护的组氨酸源可包含瘤胃保护的L-组氨酸和/或非动物源的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质。可通过将L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质与至少一种还原碳水化合物(例如还原糖)反应来对所述L-组氨酸和/或所述富含组氨酸的蛋白质进行瘤胃保护。适合的还原碳水化合物可包括木糖、乳糖和/或葡萄糖。可通过将L-组氨酸和/或所述富含组氨酸的蛋白质用至少一种脂肪酸包衣来对所述L-组氨酸和/或所述富含组氨酸的蛋白质进行瘤胃保护。适合的脂肪酸可包括至少部分氢化的植物油，例如大豆油。
所述瘤胃保护的组氨酸源可能能够过瘤胃地递送至少约40％的瘤胃保护的组氨酸。更通常地，所述瘤胃保护的组氨酸源可能能够过瘤胃地递送至少约50％、60％、70％、80％或90％的瘤胃保护的组氨酸。
可以采用包括但不限于全料形式、浓缩物形式、掺合形式和基础混合形式的几种形式来使用所述组合物。美国专利5,145,695和美国专利5,219,596描述了通过经组合物的特定全料、浓缩物、掺合或基础混合形式来平衡必需氨基酸以增加奶牛产奶量的饲料形式，这些文献公开的内容全部引入本文作为参考。
如果所述组合物为全料形式，蛋白水平百分比(粗蛋白含量)可为约10至约25％，更合适地为约14至约24％(或约14至约19％)；然而，如果所述组合物为浓缩物形式，所述蛋白水平可为约30至约50％，更合适地为约32至约48％。如果所述组合物为掺合形式，所述组合物中的蛋白水平可为约20至约30％，更合适地约24至约26％；如果所述组合物为基础混合形式，所述组合物的蛋白水平可为约55至约65％。除非本文另作说明，百分比表示以重量百分比计。
所述全料形式组合物可包含粗小麦粉、玉米、大豆粉、玉米面筋粉、酒糟或酒糟残液、盐、常量矿物质、痕量矿物质和/或维生素。其它成分一般可包括但并不限于葵籽饼粉、芥花粉(canola meal)、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亚麻籽饼粉、麦芽根和大豆皮。
所述浓缩物形式组合物通常包含粗小麦粉、玉米、大豆粉、玉米面筋粉、酒糟或酒糟残液、盐、常量矿物质、痕量矿物质和维生素。可选的成分一般包括但并不限于葵籽饼粉、芥花粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亚麻籽饼粉和麦芽根。所述掺合形式组合物通常包括粗小麦粉、玉米面筋粉、酒糟或溶性酒糟、盐、常量矿物质、痕量矿物质和/或维生素。可选的成分一般包括但并不限于玉米、大豆粉、葵籽饼粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亚麻籽饼粉、麦芽根和大豆皮。
所述基础形式组合物通常包括粗小麦粉、玉米面筋粉和/或酒糟或酒糟残液。其它成分一般包括但并不限于大豆粉、葵籽饼粉、棉籽粉、全棉籽、啤酒糟、亚麻籽饼粉、麦芽根、常量矿物质、痕迹矿物质和/或维生素。
所述全料形式组合物、浓缩物形式组合物、掺合形式组合物和基础形式组合物还可包含对一种或多种所选的氨基酸具有增加的氨基酸含量的产品。特别地，所述产品对一种或多种产奶限制氨基酸具有增加的氨基酸含量。由于产品中游离氨基酸存在和/或产品中含有所述氨基酸的蛋白质或肽存在，所述产品可具有增加的氨基酸含量。例如，所述产品可具有增加含量的作为游离氨基酸存在的组氨酸和/或存在于富含组氨酸的蛋白质中的组氨酸。一般地，所述产品来自非动物来源，例如微生物(如细菌和酵母)和/或植物。所述产品可包含非动物和/或动物蛋白质(例如重组细菌、酵母和/或植物生产的富含组氨酸的动物蛋白质)。
所述产品可具有增加含量的一种或多种氨基酸，特别是一种或多种确定为限制产奶量的必需氨基酸。限制氨基酸可包括组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或色氨酸，其可以作为游离氨基酸或作为富含所选氨基酸的蛋白质或肽存在于所述产品中。例如，所述产品可包含至少一种富含组氨酸的蛋白质。如本文所定义，富含组氨酸的蛋白质一般将具有至少约5％组氨酸残基/蛋白质的总氨基酸残基，更一般地至少约10％组氨酸残基/蛋白质的总氨基酸残基。在合适的实施方案中，富含组氨酸的蛋白质可具有至少约15％组氨酸残基和/或至少约20％组氨酸残基/蛋白质的氨基酸残基总量。
相对于产品中的总氨基酸含量的重量(由产品中的粗蛋白含量确定)，具有增加含量的组氨酸的产品的组氨酸含量(包括游离组氨酸和存在于蛋白质或肽中的组氨酸)一般为至少约2.8重量％，更一般地为至少约3.0重量％，4.0重量％，在合适的实施方案中，相对于产品中的总氨基酸含量，重量为5.0重量％。
可以以微生物发酵方法生产具有增加含量的组氨酸的产品。在一个实施例中，将过量产组氨酸的细菌或酵母在发酵系统中培养，并进一步加工发酵液和/或发酵生物质以生产具有增加含量的组氨酸的产品。可将发酵液和/或生物质干燥(例如喷雾干燥)，以生产具有增加含量的组氨酸的产品。
组氨酸或具有增加含量的组氨酸的产品可从发酵液或溶解生物质中至少部分被纯化。例如，可根据组氨酸的等电点分离组氨酸或富含组氨酸的蛋白质，和/或可根据所述分子中存在的咪唑基团分离组氨酸。类似地，可根据蛋白质的等电点，用富含组氨酸的蛋白质中组氨酸的存在来分离所述蛋白质。在一个实施方案中，可使用重组技术改变富含组氨酸的蛋白质所期望的等电点，从而改变所述蛋白质的氨基酸组成(例如产生具有所选的组氨酸含量和期望的等电点的蛋白质)。
与其它氨基酸相比组氨酸的独特等电点(pI)可使得组氨酸选择性沉淀，优先萃取入有机溶剂中，或与各种离子交换树脂或金属螯合基质结合。例如，组氨酸的独特pI可导致富含组氨酸的蛋白质的特定且独特的pI值，由此使得随后用于饲料或食品中的这些蛋白质从其它细胞蛋白质中选择性沉淀。
富含组氨酸的蛋白质可显示出可促进所述蛋白质分离的独特结合性能。例如，一段六(6)个组氨酸残基序列称作组氨酸标记，其与过渡金属例如镍(Ni)结合，可用于促进蛋白质分离(例如将组氨酸标记的蛋白质与含镍基质结合)。除镍之外，可使用其它的过渡金属，比如铜(Cu)。
组氨酸的咪唑基团也可促进组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质的分离。例如，咪唑基团可允许使用尺寸排阻色谱和离子交换树脂的独特组合来从包含其它氨基酸和副产物的发酵液中分离组氨酸。
富含组氨酸的蛋白质可选自文献所述的富含组氨酸的蛋白质，例如来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的富含组氨酸蛋白II和/或一种或多种来自称作“histatin”的一类蛋白质的蛋白质，其表现出抗细菌和抗真菌活性。富含组氨酸的蛋白质还可包含与全长天然蛋白质相比具有增加的组氨酸含量的已知富含组氨酸的蛋白质的特定片段。例如，来自恶性疟原虫的富含组氨酸蛋白II的组氨酸组成为约32％。然而，该蛋白质的氨基酸61至130片段的组氨酸组成为约44％，该蛋白质的氨基酸58至80片段的组氨酸组成为约55％。富含组氨酸的蛋白质无需保持其原来的功能来适应本文所述的组合物或方法。
富含组氨酸的蛋白质可以是重组工程化蛋白质。例如，如上所述，因为聚组氨酸基序与过渡金属例如镍结合，一般将称作“组氨酸标记”的聚组氨酸基序加入蛋白质中以助于纯化。然而，所述重组工程化蛋白质除组氨酸外还具有增加含量的其它氨基酸。特别地，所述蛋白质可具有增加含量的一种或多种必需氨基酸，或所述蛋白质可具有增加含量的一种或多种其它产奶限制氨基酸，所述限制氨基酸可包括赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸。因而，可将所述重组工程化蛋白质设计成包含所选氨基酸谱(profile)。除产奶限制氨基酸外，还可将所述蛋白质工程化成包含半胱氨酸残基，以使得形成分子内和/或分子间二硫键。所述重组工程化蛋白质中的氨基酸比例可改变或设计以与基于奶牛饲料研究或预测所预期的最佳比例相匹配。在一个实施方案中，例如在重组生产的蛋白质中所选氨基酸谱与血粉谱相似。当已经设计蛋白质且其基因已经克隆入表达载体中后，所述蛋白质可用微生物宿主(例如大肠杆菌(E.coli.)、棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母)和植物等在重组系统中进行表达(或过表达)。
为优化蛋白质在宿主中的表达，可将编码所述蛋白质的基因设计成利用在宿主中占优势的特定tRNA。或者，所选的tRNA可在宿主中共表达以促进所述蛋白质的表达。
所述重组工程化蛋白质可包含特定序列以促进蛋白质纯化。例如，所述蛋白质可包含组氨酸标记。所述蛋白质还可包含“前导序列”，其将所述蛋白质靶定到宿主细胞中的特定位置例如胞外质，或靶定所述蛋白质分泌。例如，所述宿主细胞可为细菌，且蛋白质可包含非细菌性分泌信号序列，例如果胶裂解酶分泌信号序列。
所述重组工程化蛋白质还可包含蛋白酶切割位点，以促进皱胃中蛋白质的切割，并增加所述蛋白质中氨基酸到小肠的传递。例如，一种这样的蛋白酶为胃蛋白酶，其是牛皱胃中的一种蛋白质消化酶。证明胃蛋白酶优先在P1和P1′位的疏水残基，优选芳族残基处切割肽。特别地，胃蛋白酶在苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和亮氨酸残基的羧基侧切割蛋白质。因而，所述蛋白质可包含一个或多个胃蛋白酶切割位点。
在另一实施例中，所述产品可包含用具有增加含量的其它氨基酸特别是限制氨基酸的肽或蛋白质扩增的富含组氨酸的蛋白质。例如，产品可包含具有增加含量的一种或多种相同或不同氨基酸的一种或多种蛋白质。因而，产品可包含多种蛋白质、肽和/或氨基酸。
所述富含组氨酸的蛋白质或肽可在微生物宿主(例如埃希氏菌、棒状杆菌、短杆菌、芽孢杆菌、酵母)和植物等中过表达。可将整个微生物生物质进行喷雾干燥并用于动物饲料，或者所述富含组氨酸的蛋白质和相关蛋白质或肽可从所述生物质至少部分被纯化。或者，当所述微生物宿主分泌组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质时，可从发酵产生的生物质中分离出富含组氨酸的发酵液，并可将澄清的发酵液例如以液体形式或喷雾干燥形式用作动物饲料成分。在一个实施方案中，可通过将所述蛋白质中的组氨酸标记与包含镍金属的基质结合来纯化富含组氨酸的蛋白质。
可能希望使用不含有具有内毒素作用的脂多糖(“LPS”)的微生物宿主，例如革兰氏阳性菌，如棒状杆菌和短杆菌。革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌，通常含有具有内毒素作用的LPS。当要制备生物质并将其用作组氨酸源时，选择不包含内毒素性LPS的细菌可能是特别重要的，因为LPS的大部分仍然与细菌结合，且除非所述细菌溶解，否则其基本上不释放到发酵液中。因而，预期发酵后内毒素性LPS将定位在生物质中。
所述产品可包含已经处理的以促进过瘤胃的成分。例如，所述产品可包含处理的组氨酸和/或处理的富含组氨酸的蛋白质。所述组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可与一种或多种还原碳水化合物(例如木糖、乳糖、葡萄糖等)反应。在各种实施方案中，组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可用聚合化合物、定型蛋白质(formalized protein)、脂肪、脂肪和钙的混合物、脂肪和蛋白质的混合物包衣或用长链脂肪酸的金属盐包衣。组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可用可被修饰的植物油(例如大豆油)包衣，该植物油可以被修饰。例如，组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可用至少部分氢化的植物油包衣。特别地，组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可用脂肪酸金属盐(例如硬脂酸锌)和脂肪酸(例如硬脂酸)的混合物包衣。组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质也可用pH敏感的聚合物包衣。pH-敏感的聚合物在瘤胃pH下是稳定的，但当其接触皱胃pH时分解，在皱胃中释放出用于消化的蛋白质，并在小肠中吸收。
一方面，所公开的方法包括几个步骤。首先，合成氨基酸或富含一种或多种氨基酸的蛋白质。如上所述，适合的氨基酸可为组氨酸，而适合的蛋白质可为富含组氨酸的蛋白质。可用微生物发酵系统来生产发酵生物质以合成所述氨基酸和/或富含氨基酸的蛋白质，可将发酵生物质干燥(例如喷雾干燥)得到干燥的发酵生物质。或者，所述氨基酸和/或蛋白质可存在于发酵液中，(例如通过过滤)可将所述发酵液与发酵生物质分离，并喷雾干燥以制得具有增加含量的氨基酸和/或蛋白质的干发酵液。另外，可在制备干产品之前从所述生物质和/或发酵液中分离或至少部分纯化所述氨基酸和/或富含氨基酸的蛋白质。所述干发酵生物质、干发酵液和/或干制品可包以包衣，以提供包衣产品和/或(例如通过使所述干发酵生物质、干发酵液和/或干制品与还原碳水化合物例如木糖反应)来进行处理。所述包衣可是疏水性的。所述包衣和/或处理可保护所述产品，并使其经过瘤胃降解减少，并向皱胃和/或小肠传递至少一部分所述产品。因而，所述包衣和/或处理使所述包衣和/或处理的产品绕过瘤胃(即过瘤胃)。可给反刍动物喂食所述包衣和/或处理的产品以提高产奶量以及提高奶蛋白质组成。
附图简述
图1是微生物生长模式的简图。NDF-“中性洗涤纤维”；NFC-“非纤维碳水化合物”；VFA-“挥发性脂肪酸”；RDP-“瘤胃可降解蛋白质”；rH-“瘤胃的pH”。
图2是用于包封产品的一般旋转盘方法的简图。
图3显示了游离组氨酸和包衣组氨酸的体外组氨酸降解速率对组氨酸浓度图。
具体实施例方式
认为组氨酸是反刍动物饲料中一种初级速率(primary rate)的限制氨基酸，其在饲料中的浓度与奶牛的产奶量直接相关。目前动物饲料中使用血粉，其富含组氨酸源。另外，血粉中存在的组氨酸在瘤胃中不显著地降解。血粉替代物缺乏相似的组氨酸含量，且缺乏血粉的饲料将需要补充组氨酸以满足氨基酸需求。另外，随着奶产量增加，除组氨酸之外，对其它氨基酸的需求也相应增加。也需要满足这种对其它氨基酸的需求。
蛋白质必须避免瘤胃降解，并到达小肠以补充足量的氨基酸。所开发的防止氨基酸发酵性消化的主要方法包括(1)用保护所述产品免于在瘤胃中降解的组合物包衣具有增加含量的氨基酸的产品和(2)对所述氨基酸进行结构处理以产生证明在瘤胃中降解减少的氨基酸类似物。瘤胃中的单个组氨酸残基比存在于蛋白质或肽中的组氨酸更易于降解，因此，富含组氨酸的蛋白质可能提供优于单个组氨酸残基的优势。另外，具有重要二级或三级结构(例如二硫键)的蛋白质可显示出更好的瘤胃保护。
除提供用于反刍动物饲料的组氨酸源外，富含组氨酸的蛋白质还可与血粉中存在的“富含组氨酸”蛋白质极其类似。例如，血粉可包含牛血红素α链，SwissProt.登记号为P01966，其组氨酸含量超过7％(组氨酸残基/总残基)，氨基酸序列为
1mvlsaadkgn vkaawgkvgg haaeygaeal ermflsfptt ktyfphfdls51 hgsaqvkghg akvaaaltka vehlddlpga lselsdlhah klrvdpvnfk101 llshsllvtl ashlpsdftp avhasldkfl anvstvltsk yr。
从文献中已知其它富含组氨酸的蛋白质，其包括来自恶性疟原虫的富含组氨酸蛋白II，登记号为AAC47453，其组氨酸含量超过32％(组氨酸残基/总残基)，氨基酸序列为1 mvsfsknkvl saavfasvll ldnnnsafnn nlcsknakgl nlnkrllhet51qahvddahha hhvadahhah haadahhahh aadahhahha adahhahhaa101 dahhahhaay ahhahhaada hhahhasdah haadahhaay ahhahhaada151 hhahhasdah haadahhaay ahhahhaada hhaadahhat dahhahhaad201 arhatdahha adahhatdah haadahhaad ahhatdahha adahhatdah251 haadahhaad ahhatdahha hhaadahhaa ahhatdahha tdahhaaahh301 eaathclrh。
如上所述，蛋白质片段可适于用作富含组氨酸的蛋白质或肽。例如，可在蛋白质的N-末端或C-末端截断以生成富含组氨酸的蛋白质，其中所述蛋白质包含富含组氨酸的内部氨基酸序列。片段可为任何长度，不过特别适合的片段可包含至少约20个氨基酸。来自恶性疟原虫的富含组氨酸蛋白II的氨基酸61至130片段的组氨酸含量为约44％(组氨酸残基/总残基)，而该蛋白质的氨基酸58至80片段的组氨酸含量为约55％。因而，这些片段可特别适用作富含组氨酸的蛋白质。
另一富含组氨酸的蛋白质为来自小家鼠(Mus musculus)的富含组氨酸糖蛋白，登记号为AAH11168，其组氨酸含量超过10％(组氨酸残基/总残基)，氨基酸序列为
1mkvlttalll vtlqcshals ptncdasepl aekvldlink grrsgyvfel51 lrvsdahldr agtatvyyla ldviesdcwv lstkaqddcl psrwqseivi101 gqckviatry snesqdlsvn gyncttssvs salrntkdsp vlldffedse151 lyrkqarkal dkyktdngdf asfrveraer virarggert nyyvefsmrn201 cstqhfprsp 1vfgfcrall sysietsdle tpdsidince vfniedhkdt251 sdmkphwghe rplcdkhlck lsgsrdhhht hktdklgcpp ppegkdnsdr301 prlqegalpq lppgypphsg anrthrpsyn hscnehpchg hrphghhphs351 hhppghhshg hhphghhphs hhshghhppg hhphghhphg hhphghhphg401 hhphghdfld ygpcdppsns qelkgqyhrg ygpphghsrk rgpgkglfpf451 hhqqigyvyr lpplnigevl tlpeanfpsf slpncnrslq peiqpfpqta501 srscpgkfes efpqiskffg ytppk该蛋白质的氨基酸331至406片段的组氨酸含量超过50％(组氨酸残基/总残基)，因此，该片段可特别适用作富含组氨酸的蛋白质。
另一富含组氨酸的蛋白质为来自欧洲桤木(Alnus glutinosa)的actinorizal nodulin AgNOD-GHRP，登记号为AAD00171，其组氨酸含量大约15％(组氨酸残基/总残基)，氨基酸序列为1mgysktflll glafavvlli ssdvsasela vaaqtkenmq tdgveedkyh51 ghrhvhghgh ghvhgngneh ghghhhgrgh pghgaaadet etetetnqn该蛋白质的氨基酸50至83片段的组氨酸含量超过44％(组氨酸残基/总残基)，因此，该片段可特别适用作富含组氨酸的蛋白质。
另一富含组氨酸的蛋白质为人富含组氨酸的钙结合蛋白，前体，登记号为AAH69795，其组氨酸含量大约12％(组氨酸残基/总残基)，氨基酸序列为1mqhhrpwlha svlwagvasl llppamtqql rqdqlgfrnr nnstqvagls
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其它富含组氨酸的蛋白质包括称作“histatin”的一类蛋白质。Histatin为富含组氨酸的蛋白质，其存在于唾液中，并具有抗真菌和抗细菌性能。例如参见Neuman等，(1996)Electrophoresis17266-270。这些富含组氨酸的蛋白质或肽可用作动物饲料例如奶牛动物饲料的组氨酸源。因为histatin具有抗真菌和抗细菌性能，除了用作组氨酸源外，其还可以使动物饲料的保存期更长。
氨基酸需求。可通过向动物饲料中补充限制氨基酸来向动物提供所述限制氨基酸，从而增加所选畜产品(例如奶)的产量。可通过分析所选畜产品的氨基酸谱(即产出谱)来鉴定限制氨基酸，并将该谱与提供给动物的氨基酸谱(即输入谱)进行比较。本领域公知确定氨基酸需要量的方法，并在美国专利5,145,695和美国专利5,219,596中有描述，该两篇文献以其全部内容引入本文作为参考。
氨基酸补充。反刍动物氨基酸来自两个来源(1)由微生物生长决定的微生物蛋白质；和(2)瘤胃中未降解的蛋白质(即“瘤胃未降解蛋白质”或“RUP”)。可根据瘤胃中发酵可获得的碳水化合物(例如淀粉、糖、中性洗涤纤维、果胶和β-葡聚糖)、瘤胃可降解蛋白质的供应以及瘤胃的pH预测微生物生长。因为微生物蛋白质是不可完全消化的，必须根据所述蛋白质的消化率调整由微生物蛋白质补充的微生物氨基酸的供应，以提供可消化的微生物氨基酸值。
氨基酸的第二来源是经瘤胃至皱胃后仍未降解的饲料成分(即所述绕过的蛋白质部分)。由瘤胃中的微生物以不同的速度加工并利用(即降解)饲料成分内的氨基酸。因而，不同的氨基酸将具有不同的未降解必需氨基酸(“UEAA”)值。此外，可根据小肠中氨基酸的消化率来调整UEAA值，以得到可消化的UEAA值。通过瘤胃的必需氨基酸的量可使用Craig等，“Amino Acids Released During ProteinDegradation by Rumen Microbes”(1984)Journal of Animal Science，58436-443中描述的方法来计算。可消化的微生物氨基酸和可消化的UEAA的总和为将提供给小肠的可消化的氨基酸值。对于奶牛来说，对所述氨基酸而言，有时其是指奶可消化氨基酸(“ddAA”)，例如牛奶可消化组氨酸(“ddAA HIS”)。
在膳食制剂中，从动物氨基酸需要量中减去预计的从瘤胃发酵得到的可消化微生物氨基酸值，其由动物谱确定。需要以UEAA形式由饲料补充的氨基酸量为动物氨基酸需要量与由可消化微生物氨基酸补充的氨基酸之间的差。
可将奶的氨基酸谱与动物消化道内微生物生产的氨基酸谱(即微生物氨基酸谱)相比较。微生物和奶氨基酸谱之间的差异表明其中的氨基酸可能过量或限制。然而，该氨基酸谱的对比仅提供了增强所选畜产品的产量所需的部分信息。还必须考虑机体将小肠中的氨基酸掺入所选畜产品中的效率。通过确定产出/输入氨基酸谱比例和确定掺入效率，可确定牛奶的可消化氨基酸需求。已经建立，组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸可能是奶牛产奶的限制氨基酸。可对肌肉的氨基酸谱进行类似的测定。
富含组氨酸产品的合成。富含组氨酸的产品可包括具有增加含量的做为游离氨基酸的组氨酸产品和/或包含富含组氨酸的蛋白质的产品。可以用本领域公知的方法生产富含组氨酸的产品。例如，可将富含组氨酸的发酵液用作组氨酸源。可由选择的过量产生或工程化以过量产生组氨酸的单细胞生物体(例如微生物如细菌或酵母)和/或植物生产所述富含组氨酸的发酵液。适合的微生物可包括属于埃希氏菌、芽孢杆菌、细杆菌、节杆菌、沙雷氏菌和棒状杆菌属的微生物。已知革兰氏阴性菌生产脂多糖(“LPS”)，其是内毒素。因而，可能期望选择革兰氏阳性菌作为宿主细胞(例如棒状杆菌和短杆菌)，尤其是要制备生物质时。因为LPS的大部分仍与宿主细胞结合，且直至所述宿主细胞溶解才释放入发酵液中，因此革兰氏阴性菌例如大肠杆菌可适用于生产组氨酸发酵液。
可将所述富组氨酸的发酵液进行喷雾干燥，直接作为组氨酸源使用或可将发酵液浓缩。在另一实施方案中，组氨酸可从所述发酵培养基和生物质至少部分被纯化。所述微生物生产的组氨酸可根据过瘤胃技术制备，并以所需的水平加入饲料中。
或者，可对微生物进行工程化以积聚并保留组氨酸，并可将所述微生物制备成喷雾干燥的生物质产品。任选地，所述生物质可通过已知的方法例如离析、滗析、离析和滗析组合、超滤或微滤进行分离。可将所述生物质产品进行进一步处理以促进过瘤胃。在一实施方案中，可从发酵介质中分离出所述生物质产品，喷雾干燥，并任选进行包衣以促进过瘤胃，并作为组氨酸源加入饲料中。
在另一实施方案中，可对微生物进行工程化以生产富含组氨酸的蛋白质。富含组氨酸的蛋白质可包括已知的和表征的蛋白质(例如来自恶性疟原虫的富含组氨酸蛋白II和/或histatin)和工程化的蛋白质(例如设计成具有所选的氨基酸谱的蛋白质)。例如，可将来自恶性疟原虫的富含组氨酸蛋白II或所选的histatin克隆到表达载体中并引入合适的宿主细胞中。或者，可将具有所选氨基酸谱的重组工程化蛋白质克隆到表达载体中，并引入到合适的宿主细胞(例如微生物)中。
所述富含组氨酸的蛋白质可被分泌入发酵介质中，或者，所述富含组氨酸的蛋白质可在所述微生物中积聚。可将所述微生物制备成喷雾干燥的生物质产品，或可从所述微生物质中分离出所述富含组氨酸的蛋白质或肽，以得到富含组氨酸的产品。不论是那种情况，均可以对所述富含组氨酸的产品进行进一步处理以增强过瘤胃。然后可将处理的产品作为组氨酸源加入饲料中。
富含组氨酸的蛋白质(HRP)或肽在微生物宿主大肠杆菌中的构建和表达。可如下述构建富含组氨酸的蛋白质构建体HrcpET30(Xa/LIC)。设计具有与pET30(Xa/LIC)载体(Novagen，Madison，MI)相容的突出端的引物，以克隆小家鼠富含组氨酸的钙结合蛋白基因(Hrc)。pET载体在Xa/LIC位点的5′端具有12个碱基的单链突出端，且在Xa/LIC位点的3′端具有15个碱基的单链突出端。将所述质粒设计成不需要连接的克隆(ligation independent cloning)，具有N-末端His和S-标记以及任选的C-末端His-标记。Xa蛋白酶识别位点(IEGR)位于感兴趣基因的起始密码子的前面，这样可以去除融合蛋白标记。
用于小家鼠Hrc基因pET30 Xa/LIC克隆的下列引物可购得正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGGGCTTCCAGGGGCCATGG-3′和反向5′AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACGACCTGTTCTGTTCTC3′。小家鼠Hrc基因的核酸序列和相应的蛋白质序列可从GenBank获得，登记号BC021623，由Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903(2002)提交，列于表1(所述基因的DNA序列)和表2(所述编码蛋白质的氨基酸序列)中。可设计Hrc基因内部引物，使得所生成的肽比天然蛋白质序列具有更高的组氨酸残值/总氨基酸百分比。
表1小家鼠富含组氨酸的钙结合蛋白mRNA的cDNA序列
1 ccacgcgtcc gccaagacct gaggaagata gagaggcaga gagtgggagc tataccacga61 caaaagggac aatctgaaag tcaaagccaa aaaggcacaa ggacccatca gaggcagctg121 aagccagcct ggtcagacgc tcagctgcta aacgtcccca tgggcttcca ggggccatgg181 ttgcacactt gtctcctttg ggccacagtg gccatcctgc tggtccctcc agtggtgacc241 caggagttga gaggggccgg tctgggcctg ggcaactgga acaacaatgc aggcatccct301 gggtcctcag aggacctatc aactgagttt ggtcaccaca tccaccgggg atatcaaggt361 gagaaggaca gaggccacag agaagagggt gaagacttct ccagggaata tggccacagg421 gtccaagacc acaggtaccc tggccgcgag gttggagagg agaatgtctc tgaagaggtc481 ttcagagggc atgttagaca gctccacggg caccgggaac atgacaatga agatttagga541 gactcggcag agaaccacct ccccagacag aggagccaca gccacgaaga tgaggatggc601 attgtctcca gtgagtatca ccgtcacgtc cccaggcatg cccaccatgg ccacggagag661 gaagatgatg acgatgatgg aggagaggag gaggagaggg tggatgtgat ggaggactct721 gatgataatg aacaccaggt ccatggtcac cagagccact caaaggagag agatgaactc781 catcatgccc acagccacag gcaccaaggc cacagtgatg atgacgatga cgatggtgtc841 tctactgagc atggacacca agctcacaga tatcaggatc atgaggagga agacgatggg901 gactcagatg aagacagtca cacccacaga gttcaaggcc gagaagatga aaatgatgat961 gaagacggtg actctggtga atacagacac catacccagg accaccaagg ccacaacgaa1021 gagcaagatg acgatgatga tgatgatgat gatgatgaag ataaagaaga ctccactgag1081 caccggcacc agacccaagg ccacaggaag gaagaagatg aggatgagtc agatgaagat1141 gatcatcatg tctccaggca tggacgccaa ggctatgaag aagaagaaga tgatgatgat1201 gatgatggag atgatgactc tactgagcat gtgcatcaag cccacagaca cagagaccat1261 gagcacaaag atgatgagga tgactcagaa gaagactacc atcatgtccc cggagtcctc1321 cggattgctc tctcgactgc cagtggggca gccgctgcct actcagcgcc ttgcctcaac1381 ttccccatca gtaccaacac cccctttacc ctcgtgtgga gcctaagaga acagaacagg1441 tcgtgaagcc agcaaagaaa agttctgtcg cgtttgtgaa cctttttttt tttttaatca1501 aatcgacaac aaacattaaa actttttttt ttraaaaagg acgttaaaaa atttaaaaag1561 tatatgagct tcatgggact aactcatcgc cttcccttgc gtacttcaga ttgtagccat1621 acttttaaaa aaaaaggcaa agaggataat gacatttttt atcagtattg tgaataaact1681 tgaacacaaa tacagaagtt ctatgtcctg tcttcagttg tagaagttgt cttctgcaag1741 gtacaaccac ccacttgaac ttcctctgat gacacaatcc acaattctat aagggaatca1801 gtgttcacgt ctctgtatat atttatttat gtgtaattta atgggatttg taaatatggt1861 gagtctgttt taaacctttt tttatttatc tggtgatctc gtttacctcc tgtttagtgg1921 gctttggatc ctccctgtta gttcttcatg tggttttact tagaaatcca aggtttgggt1981 aagactcccc ctccccaccc cttttctcca attcatggat ttagccccgt ggtagcatgt2041 taaacgatta taatgaaaca gctgaacaaa aacattttta aggtaaaata aaaatttata2101 tataattagt aaaaaaaaaa aaaaaaa
表2小家鼠富含组氨酸的钙结合蛋白的氨基酸序列MGFQGPWLHTCLLWATVAILLVPPVVTQELRGAGLGLGNWNNNAGIPGSSEDLSTEFGHHIHRGYQGEKDRGHREEGEDFSREYGHRVQDHRYPGREVGEENVSEEVFRGHVRQLHGHREHDNEDLGDSAENHLPRQRSHSHEDEDGIVSSEYHRHVPRHAHHGHGEEDDDDDGGEEEERVDVMEDSDDNEHQVHGHQSHSKERDELHHAHSHRHQGHSDDDDDDGVSTEHGHQAHRYQDHEEEDDGDSDEDSHTHRVQGREDENDDEDGDSGEYRHHTQDHQGHNEEQDDDDDDDDDDEDKEDSTEHRHQTQGHRKEEDEDESDEDDHHVSRHGRQGYEEEEDDDDDDGDDDSTEHVHQAHRHRDHEHKDDEDDSEEDYHHVPGVLRIALSTASGAAAAYSAPCLNFPISTNTPFTLVWSLREQNRS据报道tRNA浓度和氨酰tRNA合成酶的变化影响氨基酸生物合成。另外，tRNA通过减少蛋白质产物的氨基酸顺序的翻译和误差，可对微生物表达系统中异源基因的表达和过表达有大的影响。(例如参见O′Neill等，J.Bacteriol.1990 Nov；172(11)6363-71)；Smith等，Biotechnol Prog.1996 Jul-Aug；12(4)417-22)；Dieci等，Protein ExprPurif.2000 Apr；18(3)346-54)。因此，例如为增加富含组氨酸的蛋白质的表达，同时表达相应的组氨酰tRNA基因也是有利的。还可设计引物以将小家鼠Hrc基因引入带有HisSpET30 Xa/LIC的操纵子中，以使得富含组氨酸的钙结合蛋白和组氨酰tRNA合成酶共表达。
根据特定的富含组氨酸的蛋白质源的不同，可改变各基因的密码子偏好以与宿主微生物密码子的使用相匹配，从而实现较高的异源蛋白质表达。(例如参见Baca等，Int′l J.of Parasitology.30113-118)。可从多种来源获得密码子使用表。
从ATCC购得小家鼠富含组氨酸的钙结合蛋白mRNA(cDNA克隆MGC13723 IMAGE3979848)，编号MGC-13723。所有限制性酶从New England BioLabs(Beverly，MA)购得。除非另外说明，通过Intergrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)合成引物。
下面是PCR方案的一个版本，其可用于扩增小家鼠Hrc基因。在50μL的反应中，加入0.1-0.5μg模板、各引物1.5μM、各dNTP 0.4mM、3.5 U Expand High FidelityTM聚合酶和含Mg2+的1×ExpandTM缓冲液(Roche，Indianapolis，IN)。所选的温度循环程序包括在96℃下热启动5分钟，随后进行29个循环，该循环包括下列步骤94℃30秒、40-65℃ 1分钟(梯度温度循环)和72℃ 2分钟。29个循环后，将样品保持在72℃下10分钟，然后在4℃下储存。
PCR产物使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)用0.8或1％的TAE-琼脂糖凝胶进行凝胶纯化。在琼脂糖凝胶上将PCR产物与标准品进行比较定量，然后用T4 DNA聚合酶按以下厂商推荐的Ligation Independent Cloning(Novagen，Madison，WI)方案进行处理。
简要地，将约0.2pmol纯化的PCR产物在22℃下在dGTP存在下用1U T4 DNA聚合酶处理30分钟。聚合酶从PCR产物的3′端除去连续的碱基。当聚合酶遇到鸟嘌呤残基时，该酶的5′至3′聚合酶活性抵消核酸外切酶活性，以有效地防止进一步切除。由此产生了与pET Xa/LIC载体相容的单链突出端。通过在75℃下培养20分钟钝化聚合酶。
按Novagen的建议对载体和处理的插入物进行退火。将约0.02pmol处理的插入物和0.01pmol的载体在22℃下温育5分钟；加入6.25mM EDTA(终浓度)；并再在22℃下进行温育。将退火反应物(1μL)加入NovaBlueTMSingles感受态细胞(Novagen，Madison，WI)中，然后在冰上放置5分钟。混合后，将细胞在42℃下热休克30秒进行转化。将细胞放在冰上2分钟，然后在37℃下以225rpm摇动使其在250μL的室温SOC中恢复30分钟。将细胞在含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB板上培养。
将来自在含有卡那霉素的LB板上生长的培养物的质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒(Valencia，CA)纯化，并筛选正确的插入物。通过双脱氧链终止DNA测序(Seq Wright，Houston，TX)用S-标记和T7终止子引物(Novagen)和内部引物验证看起来具有正确插入物的质粒的序列。将序列验证的HrcpET30(Xa/LIC)根据Novagen方案转化入表达宿主BL21(DE3)中。
可如下进行大肠杆菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)细胞中富含组氨酸的蛋白质的表达。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)∷小家鼠Hrc/pET30(Xa/LIC)细胞板。将来自单个集落的过夜培养物(5mL)接种，并在30℃下在含有卡那霉素的LB培养基上生长。一般地，1至5ml接种物用于诱导100ml-500ml含50μg/mL卡那霉素的LB培养基。细胞在37℃下生长，并每小时取样直至得到OD600为0.35-0.8。然后将细胞用0.1mM IPTG诱导。经过约4-10小时生长(后诱导)后，将全部体积的培养物在4℃下以3500rpm离心20分钟。倾出上清液，如果不立即分析，将培养液和细胞(用无菌蒸馏水冲洗一次)单独在-80℃下冷冻。根据所述Novagen方案用Novagen BugBusterTM试剂和benzonase核酸酶以及Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III制备细胞提取物用于蛋白质分析。通过SDS-PAGE用4-15％梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)分析细胞提取物中的蛋白质表达水平。
一旦确定合适的引起富含组氨酸的蛋白质最大表达的诱导条件(例如时间和温度)，则在该条件下培养细胞，并将细胞沉淀重悬在适当量的合适等渗缓冲液例如生理盐水(0.85％NaCl pH 7.0)中。然后用本领域技术人员已知的方法，例如在弗氏压碎器中处理，将该细胞悬液裂解。在40℃下以10000-15000rpm将裂解的细胞离心20-30分钟，以分离生物质和细胞碎片，并产生含有富含组氨酸的蛋白质的无细胞提取液。将所述含有富含组氨酸的蛋白质的提取液进行喷雾干燥，以产生富含组氨酸的蛋白质的产品，其可原样加入动物饲料中，或进行适当包封后加入动物饲料中以确保活性地通过瘤胃。可使用文献所述或下述的方法来纯化和/或浓缩来自大肠杆菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)细胞的富含组氨酸的蛋白质。
富含组氨酸的重组或合成蛋白质或肽(富含组氨酸的蛋白质或肽-HRP)或与所选氨基酸组合且与合适的氨酰tRNA合成酶基因一起表达的组氨酸的构建和表达。可如下构建合成的富含组氨酸的蛋白质或肽构建体HEPpET30(Xa/LIC)。可将合成的肽或蛋白质设计成例如具有以下序列MHSCNEHPMH LHRPHLHHMH SHHPMGHHSHGHHLHGHHPH SHHLGHHPF GHHPHLHHPH LHHPHGHHPHFHHPHFHDFL DHHHH，其中组氨酸含量(H，44个残基，～52％)、苯丙氨酸含量(F，4个残基，～5％)和亮氨酸含量(L，7个残基，～8％)。
在设计要翻译成期望的富含组氨酸的肽的合成基因中考虑微生物宿主的密码子使用，使得不使用稀有密码子。例如，预计大肠杆菌中的密码子使用与棒状杆菌的密码子使用不同。本领域中已知密码子使用表，并可以获得。
根据Stemmer等，Gene 1995 Oct 16；164(1)49-53所述的方案，有可能(1)确定用于设计编码所期望肽的核酸序列的最好密码子，(2)设计跨越所合成核酸长度的重叠寡核苷酸的所需数目，和(3)使用PCR以组装合成基因，所述PCR不依赖于DNA连接酶而是利用DNA聚合酶的特性以在PCR组装反应中构建更长的DNA片段。然后可将编码富含组氨酸的肽的合成核酸克隆到所期望的含有合适的抗生素/选择标记物的载体中，以确保合成的富含组氨酸的肽在所选宿主例如植物、大肠杆菌、棒状杆菌、短杆菌、芽孢杆菌和酵母中表达。
如上所述，已报道tRNA浓度和氨酰tRNA合成酶的改变影响氨基酸生物合成。另外，tRNA通过减少蛋白质产品的氨基酸序列的翻译和误差，可对微生物表达系统中异源基因的表达和过表达有大的影响。(例如参见O′Neill等，J.Bacteriol.1990 Nov；172(11)6363-71；Smith等，Biotechnol Prog.1996 Jul-Aug；12(4)417-22)；Dieci等，Protein Expr Purif.2000 Apr；18(3)346-54)。因此，例如，为增加合成或重组富含组氨酸的蛋白质的表达，同时表达相应的组氨酰tRNA或各自的氨酰tRNA基因也是有利的。
还可以设计引物以将用于富含组氨酸的蛋白质或肽的合成或重组基因引入带有HisSpET30 Xa/LIC的操纵子中，使得富含组氨酸的蛋白质或肽和组氨酰tRNA合成酶共表达以增加产物合成。
可如下进行大肠杆菌BL21(DE3)∷HrcpET30(Xa/LIC)细胞中合成或重组的富含组氨酸的蛋白质或肽的表达。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备新鲜的大肠杆菌BL21(DE3)合成或重组HEP/pET30(Xa/LIC)细胞板。将来自单个集落的过夜培养物(5mL)接种，并在30℃下在含有卡那霉素的LB培养基上生长。一般地，将1至5ml接种物用于诱导100ml-500ml含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基。在37℃下培养细胞，并每小时取样直至得到OD600为0.35-0.8。然后将细胞用0.1mM IPTG诱导。经过约4-10小时生长后，将全部量的培养物在4℃下以3500rpm离心20分钟。倾出上清液，如果不立即分析，将培养液和细胞(用无菌双蒸水冲洗一次)分别在-80℃下冻存。根据Novagen方案用Novagen BugBusterTM试剂和benzonase核酸酶以及Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III制备细胞提取物用于蛋白质分析。通过SDS-PAGE用4-15％梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)分析细胞提取物中的蛋白质表达水平。
一旦确定合适的引起富含组氨酸的蛋白质最大表达的诱导条件(例如时间和温度)，则在该条件下培养细胞，并将细胞沉淀重悬在适当量的合适等渗缓冲液例如生理盐水(0.85％NaCl pH 7.0)中。然后用本领域技术人员已知的方法，例如在弗氏压碎器中处理，将该细胞悬液裂解。4℃下以10000-15000rpm将裂解的细胞离心20-30分钟，以分离生物质和细胞碎片，并产生含有富含组氨酸的蛋白质的无细胞提取液。将含有富含组氨酸的蛋白质的提取液进行喷雾干燥，以产生富含组氨酸的蛋白质的产品，其可原样加入动物饲料中，或进行适当包封后加入动物饲料中以确保活性地通过瘤胃。
如果必要的话，可对来自大肠杆菌BL21(DE3)∷HEPpET30(Xa/LIC)细胞的富含组氨酸的蛋白质进行纯化或浓缩。可使用文献所述或下面的方法将产生的富含组氨酸的蛋白质进行进一步的浓缩和纯化。
可如下构建组氨酸tRNA合成酶构建体HisSpET30(Xa/LIC)。设计具有与pET30(Xa/LIC)载体(Novagen，Madison，WI)相容的突出端的引物以克隆大肠杆菌组氨酸tRNA合成酶基因(HisS)。pET载体在Xa/LIC位点的5′端具有12个碱基的单链突出端，且在Xa/LIC位点的3′端具有15个碱基的单链突出端。将所述质粒设计成不需要连接的克隆，具有N-末端His和S-标记以及任选的C-末端His-标记。Xa蛋白酶识别部位(IEGR)位于感兴趣基因起始密码子的前面，这样可去除融合蛋白质标记。
可购得下列用于大肠杆菌组氨酸tRNA合成酶基因pET30Xa/LIC克隆的引物正 向5′-GGTATTGAGGGTCGCGTGGCAAAAAACATTCAAGC-3′和反向5′-5′AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAACCCAGTAACGTGCGCA-3′。
表5提供了大肠杆菌HisS基因的核酸序列，登记号M1 1843 J01629，表6中提供了用于编码多肽的氨基酸序列。
表3大肠杆菌组氨酸tRNA合成酶(hisS)的DNA序列1 gatatgatcg accagctgga agcacgcatt cgtgcgaaag ccagtcagct ggacgaagcg61 cgtcgaattg acgttcagca ggttgaaaaa taataacgtg atgggaagcg cctcgcttcc121 cgtgtatgat tgaacccgca tggctcccga aacattgagg gaagcgttga gggttcattt181 ttatattcag aaagagaata aacgtggcaa aaaacattca agccattcgc ggcatgaacg241 attacctgcc tggcgaaacg gccatctggc agcgcattga aggcacactg aaaaacgtgc301 tcggcagcta cggttacagt gaaatccgct tgccgattgt agagcagacc ccgctattca361 aacgtgcgat tggtgaagtc accgacgtgg ttgaaaaaga gatgtacacc tttgaggatc421 gcaatggcga cagcctgact ctgcgccctg aagggacggc gggctgtgta cgcgccggca481 tcgagcatgg tcttctgtac aatcaggaac agcgtctgtg gtatatcggg ccgatgttcc541 gtcacgagcg tccgcagaaa gggcgttatc gtcagttcca tcagttgggc tgcgaagttt601 tcggtctgca aggtccggat atcgacgctg aactgattat gctcactgcc cgctggtggc661 gcgcgctggg tatttccgag cacgtaactc ttgagctgaa ctctatcggt tcgctggaag721 cacgcgccaa ttaccgcgat gcgctggtgg cattccttga gcagcataaa gaaaagctgg781 acgaagactg caaacgccgc atgtacacta acccgctgcg cgtgctggat tcaaaaaatc841 cggaagtgca ggcgcttctc aacgacgctc cggcattagg tgactatctg gacgaggaat901 ctcgtgagca ttttgccggt ctgtgcaaac tgctggagag cgcggggatc gcttacaccg961 taaaccagcg tctggtgcgt ggtctggatt actacaaccg taccgttttc gagtgggtga1021 ctaacagtct cggctcccag ggcaccgtgt gtgcaggcgg tcgttatgac ggtcttgtgg1081 aacaactggg cggtcgtgca acaccggctg tcggttttgc tatgggcctc gaacgtcttg1141 tattgttagt acaggccgtt aatccggaat ttaaagccga tcctgttgtc gatatatacc1201 tggtggcttc aggtgctgat acacaatctg cggctatggc attagctgag cgtctgcgtg1261 atgaattacc gggcgtgaaa ttgatgacca accacggcgg cggcaacttt aagaaacagt1321 ttgcccgtgc tgataaatgg ggtgcccgcg ttgctgtggt gctgggtgag tctgaagtgg1381 ctaacggcac agcagtagtg aaggatttgc gctctggtga gcaaacggca gttgcgcagg1441 atagcgtagc cgcgcatttg cgcacgttac tgggttaagg aaggagaagg acagcgtgga1501 aatttacgag aacgaaaacg accaggtaga gcggttaaac gcttttttgc tgaaaatggc1561 aaagcactgg ctgttggggt gattttggcg ttggcgcact gattggctgg cgctactgga1621 acagccatca ggttgattct gcacgctccg cttctcttgc ctatcaaaat gcggttacc
表4大肠杆菌组氨酸tRNA合成酶(hisS)的氨基酸序列MAKNIQAIRGMNDYLPGETAIWQRIEGTLKNVLGSYGYSEIRLPIVEQTPLFKRAIGEVTDVVEKEMYTFEDRNGDSLTLRPEGTAGCVRAGIEHGLLYNQEQRLWYIGPMFRHERPQKGRYRQFHQLGCEVFGLQGPDIDAELIMLTARWWRALGISEHVTLELNSIGSLEARANYRDALVAFLEQHKEKLDEDCKRRMYTNPLRVLDSKNPEVQALLNDAPALGDYLDEESREHFAGLCKLLESAGIAYTVNQRLVRGLDYYNRTVFEWVTNSLGSQGTVCAGGRYDGLVEQLGGRATPAVGFAMGLERLVLLVQAVNPEFKADPVVDIYLVASGADTQSAAMALAERLRDELPGVKLMTNHGGGNFKKQFARADKWGARVAVVLGESEVANGTAVVKDLRSGEQTAVAQDSVAAHLRTLLG由ATCC购得大肠杆菌ATCC 10798的大肠杆菌基因组DNA，编号为10798D。从New England BioLabs(Beverly，MA)购得所有限制性酶。除非另外说明，通过Intergrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)合成引物。
下面是PCR方案的一种版本，其用于扩增大肠杆菌HisS基因。在50μL的反应中，加入0.1-0.5μg模板、各引物1.5μM、各dNTP 0.4mM、3.5 U Expand high fidelityTM聚合酶和含Mg2+的1×ExpandTM缓冲液(Roche，Indianapolis，IN)。所选的温度循环程序包括在96℃下热启动5分钟，随后进行29个循环，该循环包括下列步骤94℃30秒、40-65℃ 1分钟(梯度温度循环)和72℃ 2分钟30秒。29个循环后，将样品保持在72C下10分钟，然后在4℃下储存。
PCR产物使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)用0.8或1％TAE-琼脂糖凝胶进行凝胶纯化。PCR产物在琼脂糖凝胶上与标准品比较定量，然后按下述厂商推荐的Ligation Independent Cloning方案(Novagen，Madison，WI)用T4 DNA聚合酶处理。
简要地，将约0.2pmol纯化的PCR产物在22℃下在dGTP存在下用1 U T4 DNA聚合酶处理30分钟。该聚合酶从PCR产物的3′端除去连续的碱基。当聚合酶遇到鸟嘌呤残基时，该酶的5′至3′聚合酶活性抵消了核酸外切酶活性，以有效地防止进一步切除。由此产生了与所述pET Xa/LIC载体相容的单链突出端。通过在75℃下温育20分钟钝化聚合酶。
按Novagen的建议将载体和处理的插入物退火。将约0.02pmol处理的插入物和0.01pmol的载体在22℃下温育5分钟；加入6.25mMEDTA(终浓度)；并再在22℃下温育。将退火反应物(1μL)加入NovaBlueTMSingles感受态细胞(Novagen，Madison，WI)中，然后在冰上放置5分钟。混合后，将细胞在42℃下热休克30秒进行转化。将细胞放在冰上2分钟，然后在37℃下以225rpm摇动使其在250μL的室温SOC中恢复30分钟。将细胞铺在含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB板上。
将来自在含有卡那霉素的LB板上生长的培养物的质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒(Valencia，CA)纯化，并筛选正确的插入物。通过双脱氧链终止DNA测序(Seq Wright，Houston，TX)用S-标记和T7终止子引物(Novagen)和内部引物验证看起来具有正确插入物的质粒序列。将序列验证的HisSpET30(Xa/LIC)根据Novagen方案转化入表达宿主BL21(DE3)中。
发酵实验后，可如下纯化富含组氨酸的蛋白质或肽。首先将表达富含组氨酸的蛋白质或肽的细胞使用文献已知的方法，例如在表压960psi(细胞内～19000psi)下多次通过弗氏压碎器来进行破碎。在4℃下以15000rpm离心将细胞碎片与富含组氨酸的蛋白质分离。无细胞提取液或上清液中含有富含组氨酸的蛋白质，使用其它方法以特异地结合富含组氨酸的蛋白质，并将其与无细胞提取液中的其它蛋白质分离。
一种纯化富含组氨酸的蛋白质的方法是基于组氨酸标记序列结合组氨酸结合树脂的能力，通过使富含组氨酸的蛋白质与树脂结合，并进行金属螯合色谱技术来进行。可从Novagen商购获得“His BindKit”。将富含组氨酸的蛋白质的组氨酸残基和/或富含组氨酸片段与固定在组氨酸结合树脂上的Ni2+阳离子结合。洗掉非结合的蛋白质，并可用咪唑洗脱来回收富含组氨酸的蛋白质。可对富含组氨酸的蛋白质进行透析以除去咪唑，然后进行浓缩或喷雾干燥，以原样加入饲料组合物中，或进行适当的处理加入饲料组合物中以使瘤胃中的降解最小化。
除用发酵系统生产富含组氨酸的产品外，还可用转基因植物系统生产富含组氨酸的产品。本领域公知制备转基因植物系统的方法。
组氨酸和富含组氨酸产品的瘤胃保护。可对组氨酸和/或富含组氨酸的产品(即组分)进行处理和/或包衣或包封，以减少在瘤胃中的降解(即促进过瘤胃)。合适的包衣可具有如下所述的相对高的熔解温度。
合适的包衣可包括疏水性高熔点化合物和脂质的混合物。一种或多种疏水性高熔点化合物(例如脂肪酸的无机盐，如商品级的硬脂酸锌)与一种或多种脂质组合，生成能够保护被包衣组分的含量和功能的包衣材料。可将这些包衣配制成满足高温和加压工艺条件的需要，并保护有效负荷的氨基酸免于瘤胃的微生物环境破坏。美国专利2003/0148013描述了合适的包衣，该文献全文引入本文作为参考。
疏水性高熔点化合物一般具有至少约70℃的熔点，更理想地，大于100℃的熔点。特别地，熔点为约115℃至130℃的脂肪酸的锌盐是适合的疏水性高熔点化合物。
所述脂质组分一般具有至少约0℃，更合适地不低于约40℃的熔点。所述脂质组分可包括植物油例如大豆油。在其它实施方案中，所述脂质组分可为熔点约45-75℃的三酰甘油。可选用商品级硬脂酸作为代表性脂质，所述硬脂酸包括但不限于硬脂酸、氢化动物脂、动物脂(例如牛脂)、植物油(例如天然植物油和/或氢化植物油，部分或完全氢化的植物油)、卵磷脂、软脂酸、动物油、蜡、脂肪酸酯(C8至C24)、脂肪酸(C8至C24)。
相对于被包衣组分的重量，所述包衣在包衣产品中的量可为1-2000重量％。通常，相对于被包衣组分的重量，所述包衣为约15至85重量％。更一般地，相对于被包衣组分的重量，所述包衣为约20至60重量％，和/或30至40重量％。所述包衣可由疏水性混合物制备。所述包衣可包含表面活性剂。
所述包衣可使用一种或多种疏水性不溶性化合物与脂质组合。例如，商品级硬脂酸锌极其疏水，且完全不溶于水。将商品级硬脂酸锌加入所述包衣制剂中，与仅仅脂质包衣相比，可以显著提高所述组分及其功能的保护水平。例如，通过将硬脂酸锌与有些不溶的脂质例如商品级硬脂酸组合，当所述包衣产品处于水介质中时，所述包衣化合物可以提供更好地保护免于淋失(即包衣产品中活性成份的损失)。因而本发明的包衣组合物的优点可以在设计用于反刍动物过瘤胃并将活性成份递送到小肠的饲料中利用。
除了促进过瘤胃之外，所述包衣还用于在生产过程(制粒和挤出)中保护被包衣的组分免于经受热和压力。所述包衣组合物可用于施加热且使用热敏感组分的各种生产方法中。可受益于这种保护形式的组分是那些受热破坏或降解的组分，例如氨基酸、蛋白质、酶、维生素、色素和引诱剂。
除保护组分免受与热有关的损坏或损失外，还需要保护组分免受由于与其它组分缔合或发生化学反应产生的损坏或损失。所述包封方法可防止与其它组分的有害缔合。因而，所述包封方法提供预包装或将制剂中组分组合的能力，其中所述组分通常单个包装。
可通过多种方法制备所述包衣组合物。优选地，所述制备方法包括制备锌有机盐组分和脂质组分的固体溶液。在一实施方案中，可将所述锌有机盐和所述脂质组分熔化直至两者溶解形成溶液。然后可将所述溶液固化形成固体溶液。
除所述锌有机酸组分和所述脂质组分之外，所述包衣可包含其它组分。例如，所述包衣可包含一种或多种乳化剂，例如甘油、多糖、卵磷脂、胶凝剂和肥皂，它们可以提高所述包封方法的速度和效率。另外，所述包衣可包含抗氧化剂以提供改善的抗氧化效果。另外，所述包衣组合物可包含在形成所述固体溶液中可溶或不溶的其它组分。例如，所述包衣组合物可包含少量的氧化锌及其它元素或化合物。
可由部分氢化的植物油例如大豆油制备合适的包衣。其它合适的至少部分氢化的植物油包括棕榈油、棉籽油、玉米油、花生油、棕榈油、巴巴苏油、向日葵油、红花油及其混合物。
可由包含部分氢化的植物油和另外的组分例如蜡的混合物制备合适的包衣。合适的蜡包括蜂蜡、石油蜡、米糠蜡、蓖麻蜡、微晶蜡及其混合物。在一些实施方案中，由包含约85-95％部分氢化的植物油(优选为约90％)和约5-15％蜡(优选为约10％)的混合物制备合适的包衣。
所述包衣可包含改变所述被包衣基质密度的试剂，例如表面活性剂，如聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯85、丙二醇、丁二酸二辛酯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、脂肪酸乳酰酯、脂肪酸聚甘油酯及其混合物。
可通过在包含L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质的基质上喷雾包含部分氢化植物油(85％-95％)和蜡(5％-15％)的疏水性混合物来制备包衣基质(或预包衣基质)。任选地，可对所述预包衣基质的表面用表面活性剂喷雾以进行进一步包衣，形成所述包衣基质。所述包衣基质可具有下列组成基质(40-80％)；疏水性混合物(20-60％)；表面活性剂(0-40％)(任选)。所述包衣基质的比重为约0.3-2.0(更适当地为约1.3-1.5)。在一个实施方案中，所述包衣基质包含约50％基质；约35％疏水性混合物和约15％表面活性剂。可用疏水性混合物对所述基质进行预包衣，然后用表面活性剂对所述预包衣基质进行包衣来制备所述包衣基质。
制备所述包衣组合物后，可以用其来制备被保护的组分。制备所述被保护组分的一种合适方法使用包封技术，优选微型包封技术。微型包封是一种将微量气体、液体或固体组分用第二种材料，在本文中是包衣组合物，封入或围绕的方法，以保护所述组分免受周围环境破坏。大量微型包封方法可用于制备所述被保护的组分，例如旋转盘(spinning disk)、喷雾、共挤出以及其它化学方法例如复合凝聚、相分离和胶凝方法。一种合适的微型包封方法为旋转盘法。在旋转盘法中，制备所述活性成分和所述包衣组合物的乳液和/或悬浮液，并利用重力进料至热旋转盘的表面上。当盘旋转时，所述乳液/悬浮液在盘的表面铺展，由于离心力形成薄层。在盘的边缘，所述乳液/悬浮液断成不连续的液滴，在所述液滴中所述包衣包覆所述活性成分。当该液滴由盘落入集料斗中时，所述液滴冷却形成微型包封的组分(即包衣产品)。(例如参见图2所示合适的旋转盘包衣系统简图)。由于所述乳液或悬浮液不通过板孔挤出，该方法可以使用较高粘度的包衣，并在包衣中可以有高负载量的所述组分。
美国专利公开2003/0148013描述了用于动物饲料的组分的包封，该文献全文引入本文作为参考。
还可以对氨基酸(例如组氨酸)和/或蛋白质(例如富含组氨酸的蛋白质)进行化学改变以在瘤胃中保护所述氨基酸，并增加皱胃和小肠中特定氨基酸的供给。例如，已用甲硫氨酸羟基类似物(MHA)作为氨基酸补充物。另外，可以以氨基酸/矿物螯合物形式提供氨基酸。已用甲硫氨酸锌和赖氨酸锌络合物作为氨基酸补充物。
可包含L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质的组氨酸源可与还原碳水化合物反应以保护组氨酸免于瘤胃降解(例如通过美拉德反应)。例如，L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质可与还原糖反应，该还原糖例如但不限于木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、核糖及其混合物。糖来源可包括玉米产品和玉米产品的水解物(例如至少部分水解的玉米淀粉和/或改性玉米淀粉)、糖蜜和糖蜜水解物、半纤维素和半纤维素水解物、包含于亚硫酸废液中的糖及其混合物。
包含L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质的组氨酸源可与于反应混合物中的还原糖反应以生成处理的组氨酸源。然后可将所述处理的组氨酸源加入饲料组合物中。或者，可将包含L-组氨酸和/或富含组氨酸的蛋白质的组氨酸源加入饲料组合物中，以形成补充的饲料组合物。所述补充的饲料组合物可与于反应混合物中的还原糖反应以保护所述补充的饲料组合物中存在的氨基酸，其包括存在于所述组氨酸源中的氨基酸。
所述反应混合物一般包含至少约1摩尔还原糖/1摩尔游离氨基酸。一般地，所述反应混合物包含至少约3-5摩尔还原糖/1摩尔游离氨基酸。所述反应混合物的pH一般为约4.0-10.5(合适地为约6.0-8.5)。所述反应混合物的含水量一般为约6-40％(合适地为约15-25％)。通常将所述反应混合物加热到约20-150℃(合适地约80-110℃和/或约90-100℃)约0.5-72小时(合适地约1-4小时)。所述反应混合物可进行加压(例如压力为约2000-3500KPa(约300-500p.s.i.))。可在加热所述反应混合物之前、期间或之后将所述反应混合物加压。所述反应混合物可为挤出的和/或压片的。
从提供被保护的产品的角度考虑，酵母可能是表达富含组氨酸的蛋白质和/或氨基酸特别合适的宿主。已经证明，赖氨酸累积酵母将赖氨酸从赖氨酸干重4％累积至15％。赖氨酸的大部分包含于液泡中，其用瘤胃液培养时是稳定的，但当接触胃蛋白酶-皱胃的蛋白质消化酶之一时立即释放。因此，该有机体可能是表达蛋白质和/或氨基酸并提供可增强可被肠吸收的蛋白质和/或氨基酸量的被保护的饲料补充剂的有用的宿主。
具有增加含量的一种或多种必需氨基酸的饲料制剂。最初，使用经验方法来产生泌乳牛所需的必需氨基酸需要量。将瘤胃微生物蛋白质的必需氨基酸组成与奶蛋白质的必需氨基酸组成相比较(表5)。(可对肌肉蛋白进行同样的比较，作为生长、维持生活和繁殖所需氨基酸需要量的指示)。
然后将预计的限制氨基酸作为进一步研究的候选物。一旦确定氨基酸的需要量，开发一种满足这些氨基酸需要量的方法。第一步是计算瘤胃中微生物氨基酸的产量。图1中给出了氨基酸生产的微生物模式。通过微生物生长测定微生物氨基酸的产量，而微生物生长通过瘤胃中发酵的包括淀粉、中性洗涤纤维(“NDF”)、糖和残余非纤维碳水化合物(“RNFC”)例如果胶和β-葡聚糖在内的碳水化合物的浓度来测定。
为确定瘤胃微生物蛋白质对动物饮食的氨基酸的贡献，将总瘤胃微生物蛋白质乘以该蛋白质中存在的每种特定氨基酸的百分比。许多研究人员已经发现瘤胃微生物蛋白质的氨基酸组成保持非常稳定。细菌氨基酸的消化率假定为每种氨基酸的80％。然后从所述氨基酸需要量中减去由瘤胃微生物蛋白质提供得到的氨基酸量。其差值(即所述需要量和由瘤胃微生物蛋白质补充的所述氨基酸的差)表示作为未降解的必需氨基酸(UEAA)应有利地补充在饲料中的氨基酸的量。
评价UEAA(或“绕过”氨基酸)含量高的饲料组分以确定有效的UEAA源。过去一般将血粉用作UEAA源。血粉也是良好的组氨酸源(表6)。
动物氨基酸需要量。奶牛饲料中所需的氨基酸称为奶可消化氨基酸(“ddAA”)。可消化微生物氨基酸加上同一氨基酸的可消化瘤胃未降解的必需氨基酸(UEAA)浓度总和为ddAA。奶可消化氨基酸表示补充到小肠的总的可消化AA。产奶动物的总氨基酸需要量可按如下确定。所需氨基酸(“TAAR”)的总量等于维持生活所需的量(“维持氨基酸”或“MAA”)加上产奶所需的氨基酸量(“奶氨基酸产出”或“MAAO”)加上生长所需的氨基酸量(“生长氨基酸”或“GAA”)(即TAAR＝MAA+MAAO+GAA+GAA)。
包封。图2所示的方法表示旋转盘技术微型包封。其它微型包封方法包括喷雾、离心共挤出和化学方法。
该方法以制备所述包衣开始，例如使用脂肪包衣使水溶性营养物(nutrient)免于溶于水。在脂肪存储槽中将所述包衣加热到其熔点直至该包衣液化。所述营养物一般为所制备的氨基酸、生物质、肽或蛋白质干粉。(在一些情况下，如果所述营养物粒径过大，可将该营养物过筛(例如SWECO筛分机))。将营养物放入容量给料器中，该容量给料器以恒定的速度递送已知精确浓度的营养物(例如干粉)。
使用计量泵以控制的速度将液体脂肪加入所述浆液容器中。选择加入速度，以使该液体脂肪与所述营养物以所选的比例组合。例如，如果包衣产品具有35％的营养物，且以100lbs/小时的速度来生产该产品，必须以65lbs/小时的速度加入所述熔化的脂肪，且所述容量给料器必须以35lbs/小时的速度递送营养物。
在所述浆液容器中将所述熔化的脂肪和营养物混合在一起，以生成乳液或悬浮液。从该容器底部排出该乳液/悬浮液，然后将其以一层施用到该容器下面的转盘上。因为离心力该乳液/悬浮液在盘上铺展。当该层到达盘的边缘时，该层断成不连续的颗粒(即液滴或微囊)，颗粒中含有被所述包衣包覆的营养物。当所述颗粒从盘上落下时，所述包衣冷却并固化。所述被包衣的颗粒落入所述集料斗中，并由该集料斗落到转载输送机上。该输送机批量递送所述高熔点包衣冷却物和固化物。所述微囊落入所述集料斗中，沿该集料斗侧壁向下，并向下落到转载输送机上。该输送机批量递送颗粒至大容量存储器进行进一步包装。
饲料制剂。饲料制剂中可包含具有增加含量的组氨酸的产品。表7-14提供了具有增加的组氨酸含量的饲料制剂的实例。
例如，表7给出了具有增加的组氨酸含量的全料的实例。表7列出了可用于制成该具有增加的组氨酸含量的示例性全料的饲料组分的相对量。该全料组合物包含组氨酸含量约10％的富含组氨酸的蛋白质。表8列出了存在于表7所述的全料组合物中的大量常用营养物的量。
表9给出了具有增加的蛋白质含量的饲料浓缩物的实例。表9列出了可用于制成该具有增加的组氨酸含量的示例性饲料浓缩物的饲料组分的相对量。该饲料浓缩物包含组氨酸含量约10％的富含组氨酸的蛋白质。表10列出了存在于表9所述的饲料浓缩物中的大量常用营养物的量。
表11给出了具有增强的瘤胃保护的组氨酸含量的补充物的一个实例。表11列出了可用于制成该示例性补充物的饲料组分的相对量。该补充物包含瘤胃保护的组氨酸源，例如瘤胃保护的组氨酸和/或组氨酸含量约为10％的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质。表12列出了存在于表11所述的补充物中的大量常用营养物的量。
表13给出了具有增强的瘤胃保护的组氨酸含量的全料组合物的一个实例。表13列出了可用于制成该示例性饲料组合物的饲料组分的相对量。该饲料组合物包含瘤胃保护的组氨酸源，例如瘤胃保护的组氨酸和/或组氨酸含量约为10％的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质。表14列出了存在于表13所述的饲料组合物中的大量常用营养物的量。
例证性实施方案以下实施方案是例证性的，不应理解为限制权利要求的范围。
在一个实施方案中，提供了一种饲料组合物。该饲料组合物包含组氨酸源和至少一种附加营养组分。该组氨酸源包含L-组氨酸和来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分。所述饲料组合物含有组氨酸含量为至少约2.8重量％的粗蛋白质部分。一般地，该饲料组合物的粗蛋白质部分中组氨酸含量为约2.8-7.0重量％、2.8-5.0重量％，在合适的实施方案中为约3.0-4.0重量％。
在一些实施方案中，所述粗蛋白质部分可以占所述饲料组合物的至少约10重量％。一般地，该粗蛋白质部分占所述饲料组合物至少约14-19重量％。
至少部分该组氨酸源可以被保护而免于被瘤胃降解。例如，存在于该组氨酸源中的L-组氨酸可与还原碳水化合物反应，和/或用包衣混合物包衣。该包衣混合物可以包含至少一种脂肪酸。该包衣混合物可包含部分氢化的植物油(例如大豆油)和/或表面活性剂。
所述发酵成分可包含来自所述产组氨酸微生物发酵中生成的发酵液的可溶和/或不可溶成分。所述发酵成分可包含来自所述产组氨酸微生物发酵中生成的发酵液的溶解和/或未溶解的成分。所述发酵成分可包含所述产组氨酸微生物发酵中生成的生物质。
在一些实施方案中，所述产组氨酸微生物为棒状杆菌。在其它的实施方案中，所述产组氨酸微生物为短杆菌。
在一些实施方案中，所述组氨酸源为瘤胃保护的，且所述饲料组合物能够提供过瘤胃的、期望量的存在于瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸。例如，在一些实施方案中，所述饲料组合物能够提供至少约50％的过瘤胃的瘤胃保护的组氨酸。例如，存在于瘤胃保护的组氨酸源中的约1g组氨酸可导致约500mg存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸被过瘤胃递送。在其它实施方案中，至少约60％、70％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送，在合适的实施方案中，80％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
在另一实施方案中，提供了一种饲料组合物。所述饲料组合物包含组氨酸源和至少一种附加的营养物化合物。该组氨酸源包含L-组氨酸和来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分。所述组氨酸源中的组氨酸以游离氨基酸计含量为至少约10克/千克干固体。
至少部分该组氨酸源可被保护而免于被瘤胃降解。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送，在合适的实施方案中，80％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
在另一实施方案中，提供了一种饲料组合物。该饲料组合物包含瘤胃保护的组氨酸源和至少一种附加营养组分。该瘤胃保护的组氨酸源包含瘤胃保护的L-组氨酸和/或非动物源的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质。在一些实施方案中，至少约50％、60％、70％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送，在合适的实施方案中，80％存在于该瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
在一些实施方案中，所述组氨酸源中的组氨酸以游离氨基酸计含量为至少约10克/千克干固体。存在于瘤胃保护的组氨酸源中的富含组氨酸的蛋白质的组氨酸含量相对于该蛋白质中的氨基酸总量可为至少约10％。
在一些实施方案中，所述瘤胃保护的L-组氨酸和/或非动物源的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质与至少一种还原糖(例如乳糖和/或木糖)反应。在一些实施方案中，将所述瘤胃保护的L-组氨酸和/或非动物源的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质用包含至少一种脂肪酸的包衣混合物包衣。该包衣混合物可包含部分氢化的植物油(例如大豆油)和/或表面活性剂。
在其它的实施方案中，提供一种饲料组合物。所述饲料组合物包含具有至少约40重量％(基于干固体计)L-组氨酸游离氨基酸的瘤胃保护的组氨酸源。所述饲料组合物可具有组氨酸含量为至少约2.8重量％的粗蛋白质部分。在一实施方案中，所述饲料包含组氨酸含量为约2.8至7.0重量％的粗蛋白质部分。
所述瘤胃保护的组氨酸源可包含来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分。
在一些实施方案中，通过将所述组氨酸源与至少一种还原糖反应将所述组氨酸源进行瘤胃保护以提供瘤胃保护的组氨酸源。该还原糖可包括乳糖和/或木糖。
所述组氨酸源可用含有至少一种脂肪酸的包衣混合物包衣，以提供瘤胃保护的组氨酸源。例如，所述组氨酸源可用包含部分氢化的植物油例如大豆油的疏水性混合物进行包衣。该疏水性混合物可包含蜡例如蜂蜡。该组氨酸源可用表面活性剂包衣。在一些实施方案中，将该组氨酸源用疏水性混合物包衣，然后用表面活性剂包衣。
在一些实施方案中，当给反刍动物喂食所述饲料组合物时，至少约50％的存在于瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。更通常地，当给反刍动物喂食所述饲料组合物时，至少约60％、70％的存在于瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送，在合适的实施方案中，80％的存在于瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
实施例美拉德反应方案
1.将等量的糖(1.5g木糖、果糖、乳糖或葡萄糖)和氨基酸(1.5g组氨酸或赖氨酸)放入50ml离心管中。加入水(0.9ml)，并将该管加帽。在80℃的水浴中将这些管温育达2小时。将样品冷冻干燥，然后再溶解在40ml H2O中。通过测量在420nm处的吸光度来检测美拉德反应产物。如果必要，将样品用水稀释，以获得小于2.0吸光单位的吸光度。
2.将组氨酸(0.g)和双醛淀粉(0.5g)溶于在50ml离心管中的10ml0.05M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中。将该管加帽，并在65℃或100℃下培养达4小时。将溶解的美拉德产物在4℃下储存。通过测量在420nm处的吸光度来检测美拉德反应产物。如果必要，将样品用水稀释，以获得小于2.0吸光单位的吸光度。
测定美拉德-保护的组氨酸的体内降解用使用钴(CoII)作为瘤胃流动标记来跟踪美拉德-保护的组氨酸(其已与乳糖反应)流出瘤胃的技术来测定游离氨基酸的体内降解。相对于瘘管牛(fistulated cow)中CoII流出量评价美拉德-保护的组氨酸的损失。将游离组氨酸或由美拉德反应方案修饰的组氨酸和钴II一起引入瘘管牛中。将所述组氨酸或修饰的组氨酸引入牛中后，定时地取出瘤胃液样品，并使用Roth(1971)，Anal.Chem.43880描述的邻苯二甲醛测定法来测定组氨酸的量。使用电感耦合等离子体发射光谱测定CoII的量。以与CoII结合(related)的组氨酸的量对时间作图以计算游离和保护的组氨酸的降解系数(Kd)。测得游离组氨酸的降解系数为Kd＝0.75-0.95/小时。测得由美拉德反应方案修饰的组氨酸的降解系数为Kd＝0.17/小时。
包衣组氨酸的制备通过以下制备包衣组氨酸用部分氢化的大豆油和蜡的混合物喷雾商品级L-组氨酸以制备预包衣的L-组氨酸基质。然后将所述预包衣L-组氨酸基质使用基本上美国专利5,190,775；6,013,286和6,106,871描述的方法用表面活性剂进行包衣，这些文献的全部内容引入本文作为参考。
测定包衣组氨酸的体外降解体外组氨酸降解和体外赖氨酸降解。向带橡皮塞的16×100mm管中加入不同量的游离赖氨酸和组氨酸(来自100mM储备液)。最终的组氨酸和赖氨酸浓度为从0至5mM。向带橡皮塞的25×150mm管中加入不同量的包衣组氨酸和包衣赖氨酸(称重)。最终的组氨酸和赖氨酸浓度为从0至5mM。
收集2头禁食的奶牛的瘤胃液，并(在CO2下)滤过4层干酪包布。在重复移液器(repeat pipetor)(在39℃下保持)中，将300ml滤过的瘤胃液加入700ml McDougall缓冲液中。将2ml瘤胃液溶液加入游离氨基酸管中，并包封容量为10ml的氨基酸管。将这些管用CO2冲洗，用橡皮塞加帽，然后在39℃的水浴中放置30分钟。通过加入0.2ml或1ml 55％偏磷酸(MPA)使MPA终浓度为5％来停止反应。
将游离氨基酸反应物转移到12×75mm离心管中，并在4℃下以9000rpm旋转10分钟。将上清液转移至13×100mm管中，并在4℃下储存直至测试。包衣氨基酸反应将0.2ml转移至微量管中，并旋转5分钟，RT，速度为#14。将上清液转移至干净的微量管中，并在4℃下储存直至测试(管A)。将剩余的反应物在80℃的水浴中温育5分钟，以熔化颗粒并释放出保护的氨基酸。将一毫升所述反应物转移至12×75mm离心管中，并在4℃下以9000rpm旋转10分钟。将上清液转移至13×100mm管中，并在4℃下储存直至测试(管B)。[B中的[氨基酸]-A中的[氨基酸]＝被保护的量。
使用Pauly测试法(参见SOP)测定游离组氨酸的浓度。使用LysOxidase测定法(参见SOP)测定游离赖氨酸的浓度。以氨基酸降解速度(V，μmol/ml/hr)对起始氨基酸浓度(So，μmol/ml)作图。该数据拟合Hill方程v＝Vmax[S]h/(K′+[S]h)。图7显示了游离组氨酸和包衣组氨酸的结果。
在进行实验的前一晚制备McDougall溶液(不含CaCl2)。McDougall缓冲液(1升)S-8875碳酸氢钠(NaHCO3)(9.8g)；S-0876磷酸氢二钠(Na2HPO4*7H2O)(7.0g或3.71g无水的Na2HPO4)；P-4504氯化钾(KCl)(0.57g)；S271-500氯化钠(NaCl)(0.47g)；M-1880硫酸镁(MgSO4*7H2O)(0.12g)；C-5080氯化钙(CaCl2)(0.04g，在使用前加入)；用CO2起泡器(Bubble)鼓泡使pH为6.8-7.2。在实验当天，每升McDougall加入1.45g麦芽糖；每升McDougall加入1.45g纤维二糖。每升SRP大约加入0.525mL BME。该定量溶液包含70％McDougall、30％SRF。
测定包衣组氨酸的体内降解用该试验测定四个不同来源的AA的肠内消化率。分别用部分氢化的植物油包衣组氨酸和赖氨酸晶体，以测试它们分别与组氨酸(HCl)和赖氨酸(HCl)相比的消化率。组氨酸(HCl)包含74.3重量％组氨酸，而包衣产品包含40重量％组氨酸。赖氨酸(HCl)包含78.8重量％赖氨酸，而包衣产品包含45重量％赖氨酸。
为该试验，以低水平加入测试颗粒。用对照膳食作空白来测定内源损失，并计算组氨酸和赖氨酸的消化率。该对照膳食分别使用组氨酸(HCl)或赖氨酸(HCl)(0.50％包含率)用组氨酸或赖氨酸示踪。这分别提供0.372％和0.394％的组氨酸和赖氨酸。加入所述包衣的组氨酸和赖氨酸产品以提供与组氨酸(HCl)或赖氨酸(HCl)分别提供的相同水平的组氨酸或赖氨酸。测定酪蛋白中的组氨酸和赖氨酸的消化率，通过计算所述包衣的组氨酸和包衣的赖氨酸的消化率评定该效果。所有测试膳食与所述对照膳食含有相同量的酪蛋白(组氨酸和赖氨酸的唯一其它来源)。结果列于表15中。
表15家禽消化率试验
本申请中引用的所有参考文献、专利和/或申请代表本发明所属领域技术人员的水平，它们以其包括任何表格和图在内的全部内容以相同的程度引入本文作为参考，引入程度如同每篇参考文献以其单个全部内容引入本文作为参考一样。
本领域技术人员十分清楚，在不偏离本发明的范围和精神的前提下，可对本文公开的发明进行各种替代和修改。本文例示性描述的发明可在缺少本文没有特别公开的任何一种或多种成分、一种或多种限制的情况下适当被实施。所使用的术语和表述用做描述性术语，而非限制性作用，且无意于在使用这些术语和表述时排除所表明和描述特征的任何等价物或其一部分，而是应意识到各种修改可能在本发明的范围内。因此，应理解，虽然已经通过特定实施方案和任选特征例示了本发明，但本领域技术人员可对本文公开的思想进行修改和/或变化，且认为这些修改和变化在本发明的范围之内。
另外，关于就马库什要素或其它可选择要素描述本发明的特征或方面的情况，本领域技术人员应意识到因此也就马库什要素或其它要素中的任一单个成员或亚组成员描述了本发明。
另外，除非给出相反的说明，对于实施方案提供不同的数值的情况，通过取任意两个不同值作为一范围的端点还描述了另外的实施方案。这些范围也包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种饲料组合物，其包含(a)组氨酸源，所述组氨酸源包括L-组氨酸和来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分；和(b)至少一种附加营养组分；其中所述饲料组合物具有组氨酸含量为至少约2.8重量％的粗蛋白质部分。
2.权利要求1的饲料组合物，其包含至少约10重量％的所述粗蛋白质部分。
3.权利要求1的饲料组合物，其中至少部分所述组氨酸源被保护免于瘤胃降解。
4.权利要求1的饲料组合物，其中所述发酵成分包含至少一种来自所述产组氨酸微生物发酵中形成的发酵液的可溶和不可溶成分。
5.权利要求1的饲料组合物，其中所述发酵成分包含至少一种来自所述产组氨酸微生物发酵中形成的发酵液的溶解和未溶解成分。
6.权利要求1的饲料组合物，其中所述发酵成分包含所述产组氨酸微生物发酵中形成的生物质。
7.权利要求1的饲料组合物，其中所述产组氨酸微生物为棒状杆菌(Corynebacterium)。
8.权利要求1的饲料组合物，其中所述产组氨酸微生物为短杆菌(Brevibacterium)。
9.权利要求3的饲料组合物，其中至少约50％存在于所述瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
10.一种饲料组合物，其包含(a)组氨酸源，所述组氨酸源包括L-组氨酸和来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分；和(b)至少一种附加营养组分；其中基于游离氨基酸计，所述组氨酸源的组氨酸含量为至少约400克/千克干固体。
11.权利要求10的饲料组合物，其中至少部分所述组氨酸源被保护免于瘤胃降解。
12.权利要求11的饲料组合物，其中至少约50％存在于所述瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
13.一种饲料组合物，其包含含有至少约40重量％(dsb)L-组氨酸的瘤胃保护的组氨酸源。
14.权利要求13的饲料组合物，其中所述饲料组合物含有组氨酸含量为至少约2.8重量％的粗蛋白质部分。
15.权利要求13的饲料组合物，其含有组氨酸含量为约3.0至7.0重量％的粗蛋白质部分。
16.权利要求13的饲料组合物，其中所述瘤胃保护的组氨酸源还包含来自产组氨酸微生物发酵的发酵成分。
17.权利要求13的饲料组合物，其中至少约50％存在于所述瘤胃保护的组氨酸源中的组氨酸能够被过瘤胃递送。
18.权利要求13的饲料组合物，其中所述瘤胃保护的组氨酸源包含已与至少一种还原糖反应的组氨酸。
19.权利要求18的饲料组合物，其中所述至少一种还原糖包括乳糖。
20.权利要求13的饲料组合物，其中所述组氨酸源已用含有至少一种脂肪酸的包衣混合物包衣。
21.权利要求20的饲料组合物，其中所述包衣混合物包含部分氢化的植物油。
22.权利要求13的饲料组合物，其包含至少约1g/kg所述瘤胃保护的组氨酸源。
23.一种饲料组合物，其包含(a)瘤胃保护的组氨酸源，其包含至少以下一种(i)瘤胃保护的L-组氨酸，(ii)非动物源的富含瘤胃保护的组氨酸的蛋白质；和(iii)它们的混合物；和(b)至少一种附加营养组分。
全文摘要
本发明公开了用于补充反刍动物饲料的组合物和方法。所述组合物包含至少一种具有增加的组氨酸含量的成分。该成分一般来源于非动物源。所述方法包括给反刍动物喂食包含所述成分的饲料组合物以提高产奶量。
文档编号C12R1/15GK1997285SQ200580024532
公开日2007年7月11日 申请日期2005年5月26日 优先权日2004年5月28日
发明者迈克尔·A.·梅斯曼, 默文·L.·德苏扎, 戴维·B.·瓦尼奥尼, 蒂莫西·W.·亚伯拉罕, 霍利·J.·杰森, 奥尔佳·V.·赛利夫诺娃, 伊格纳西奥·R.·伊法拉盖尔 申请人:嘉吉公司, Can科技公司