P的制作方法

专利名称：P的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸序列用于调节基因转录和表达的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的基因修饰微生物及通过培育该基因修饰微生物制备生物合成产物的方法。
背景技术：
多种生物合成产物，例如精细化学品(尤其例如氨基酸、维生素)及蛋白质是通过天然代谢过程在细胞中产生的，并用于包括食品、饲料、化妆品业、饲料业、食品业及医药业的许多工业领域中。这些物质统称为精细化学品/蛋白质，其尤其包含有机酸、生蛋白氨基酸和非生蛋白氨基酸(proteinogenic and non-proteinogenic amino acid)、核苷酸和核苷、类脂类和脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素和辅因子以及蛋白质和酶。通过培养为了产生及分泌大量特定目的物质而开发出的细菌，这些物质的生产以工业规模上最有利的方式进行。特别适于该目的的生物为棒杆菌(coryneform bacteria)，其为革兰氏阳性非病原菌。
已知通过棒杆菌菌株的发酵，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的发酵来制备氨基酸。由于其重要性，在其生产过程的改良上进行了不懈的努力。该过程改良可与以下事宜相关发酵技术的手段，例如搅拌与供氧；或营养培养基的组成，例如发酵中的糖浓度；或用于获得产物的处理，例如通过离子交换层析或喷雾干燥；或微生物自身的内在性能特性。
通过扩增个别基因并研究其对精细化学品/蛋白质的生产的作用，重组DNA技术已在产生精细化学品/蛋白质的棒杆菌菌株的菌株改良中应用了许多年。
用于发展生产精细化学品、氢基酸或蛋白质的方法，或用于增加或提高已存在的生产精细化学品、氨基酸或蛋白质的方法的生产率的其他方式是增加或改变一种或多种基因的表达，和/或用合适的多核苷酸序列影响mRNA的翻译。就此而言，影响可包括基因表达的增加、减少或其他限制因素，例如时序表达模式(chronological expression pattern)。
对于本领域的技术人员，细菌调节序列的各种组分是已知。对于以下结合位点已作出了区分调节物结合位点，也称为操纵基因；RNA聚合酶全酶结合位点，也称为-35与-10区及核糖体16S RNA结合位点，也称为核糖体结合位点或Shine-Dalgarno序列。
基于本发明的目的，也称为Shine-Dalgarno序列的核糖体结合位点序列是指位于翻译起始密码子上游高达20个碱基处的多核苷酸序列。
据文献(E.coli和S.typhimurium，Neidhardt F.C.1995 ASM Press)报导，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列的组成和碱基序列串及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距离均对翻译起始速率具有显著影响。
具有启动子活性的核酸序列可以多种方式影响mRNA的形成。其活性不依赖于生物的生理生长期的启动子称为组成型。而其他启动子响应外部的化学及物理刺激，例如氧、代谢物、热、pH等。而其他启动子在不同生长期中显示出对其活性的强依赖性。例如，文献中描述的在微生物的指数生长期中或恰好在微生物生长的稳定期中显示特别显著的活性的启动子。根据代谢途径，启动子的两种特征可对精细化学品及蛋白质的生产率具有有益的作用。
例如，在生长过程中关闭基因表达，但在最佳生长后又启动基因表达的启动子可用于调节控制代谢物产生的基因。于是，修饰的菌株显示与起始菌株相同的生长参数，但每个细胞产生更多产物。该种类型的修饰可增加滴度(产物的克数/升)及C产率(产物的克数/C源的克数)。
已经可以从棒杆菌菌种中分离出那些可用于增强或减弱基因表达的核苷酸序列。根据细胞内部和/或外部条件，这些受调节的启动子可提高或降低基因转录的速率。在某些情况下，被称为诱导物的特定因子的存在可刺激从启动子的转录速率。诱导物可直接或间接影响从启动子的转录。被称为抑制物的另一类因子能够降低或抑制从启动子的转录。类似于诱导物，该抑制物也可直接或间接地起作用。另一方面，温度调节型启动子也为已知的。因此，例如，可通过将生长温度增至高于细胞的正常生长温度来增强或减弱这类启动子的转录水平。
至今已描述了少量源自谷氨酸棒杆菌的启动子。DE 4440118中描述了源自谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶基因的启动子。该启动子被插入到编码蛋白质的结构基因的上游。这种构建物转化进入棒杆菌之后，对该启动子下游的结构基因的表达进行调节。一旦在培养基中添加适当的诱导物，就诱导该结构基因的表达。
Reinscheid等人在Microbiology 145503(1999)中描述了源自谷氨酸棒杆菌的pta-ack启动子与报道基因(氯霉素乙酰转移酶)之间的转录融合作用。包含这种转录融合作用的谷氨酸棒杆菌细胞在含有乙酸的培养基上生长时，呈现报道基因的增强表达。与此相比，在葡萄糖上生长的转化细胞未显示该报道基因的增强表达。
Pa’tek等人在Microbiology 1421297(1996)中描述了能够增强报道基因在谷氨酸棒杆菌细胞中表达的某些源自谷氨酸棒杆菌的DNA序列。将这些序列在一起进行比较以便确定谷氨酸棒杆菌启动子的共有序列。
专利WO 02/40679中已经描述了可用于调节基因表达的其他源自谷氨酸棒杆菌的DNA序列。这些分离的多核苷酸表现为可用于增加或降低基因表达的源自谷氨酸棒杆菌的表达单元。该专利还描述了重组质粒，在这些重组质粒上源自谷氨酸棒杆菌的表达单元与异源基因连接在一起。本文所描述的将源自谷氨酸棒杆菌的启动子与异源基因融合的方法，尤其可用于调节氨基酸生物合成的基因。

发明内容
本发明的一个目的是提供具有利特性的其他启动子和/或表达单元。
发明人已发现通过使用具有启动子活性的核酸可实现该目的，该核酸包含以下用于基因转录的序列A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段(functionally equivalentfragment)。
根据本发明，“转录”是指从DNA模板开始产生互补RNA分子的过程。该过程涉及例如RNA聚合酶、所谓的σ因子及转录调节蛋白的蛋白质。接着，合成的RNA用作翻译过程中的模板，其随后产生生物合成活性蛋白质。
产生生物合成活性蛋白质的形成速率是转录速率与翻译速率的结果。根据本发明，两种速率均可改变，且因此改变微生物中产物的形成速率。
根据本发明，“启动子”或“具有启动子活性的核酸”是指以与待转录的核酸功能性连接的方式调节该核酸转录的核酸。
就此而言，“功能性连接”是指，例如一种具有启动子活性的本发明的核酸和待转录的核酸序列以及适当条件下的其他调节元件(例如，确保核酸转录的核酸序列及终止子)的顺序排列，这种方式使得各调节元件均可在该核酸序列的转录中发挥其功能。因此，化学意义上的直接连接并非绝对必要。例如增强子序列的遗传控制序列能够对甚至较远位置，或甚至其他DNA分子的靶序列执行其功能。优选待转录的核酸序列位于本发明的启动子序列之后(即，在3’末端)的排列，以便两个序列共价连接在一起。就此而言，启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，进一步优选小于50个碱基对。
根据本发明，“启动子活性”是指在特定时间内由启动子形成的RNA量，即指转录速率。
根据本发明，“特异启动子活性”是指各启动子在特定时间内由启动子形成的RNA的量。
根据本发明，术语“野生型”是指合适的起始微生物。
视上下文而定，术语“微生物”是指起始微生物(野生型)或本发明的遗传修饰微生物或其两者。
优选地，尤其是在不能明确归类微生物或野生型的情状下，“野生型”是指在为了改变或影响启动子活性或转录速率、为了改变或影响表达活性或表达速率及为了增加生物合成产物的含量的各个情况下的参考生物。
在一个优选实施方案中，该参考生物为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
在一个优选实施方案中，所用的起始微生物已能够产生所要精细化学品。就棒杆菌属细菌的特别优选微生物及特别优选的精细化学品L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸而言，特别优选那些已能够产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的起始微生物通常。这些起始微生物特别优选为其中(例如)编码天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去调节或反馈抑制作用已消除或降低的棒杆菌。这类细菌具有，例如在ask基因中导致反馈抑制作用降低或消除的突变，例如T311I突变。
因此，在与野生型相比，基因相关的“影响启动子活性”或转录速率的情况下，导致与野生型相比在野生型中不以该方式存在的RNA的形成。
因此，在与野生型相比，基因相关的改变的启动子活性或转录速率的情况下，与野生型相比特定时间内产生的RNA的量改变。
就此而言，“改变”优选指增加或降低。
例如，这可通过增加或降低本发明的内源启动子的特异启动子活性进行，例如通过使该启动子突变，或通过刺激或抑制该启动子。
实现启动子活性或转录速率增加的另一种可能性是，例如通过具有启动子活性的本发明的核酸或具有增加的特异启动子活性的核酸调节来微生物中基因的转录，其中这些基因相对于这些具有启动子活性的核酸是异源的。
通过具有启动子活性的本发明的核酸或具有增加的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录优选是通过以下方式实现
将一种或多种具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录；或将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的内源核酸的控制下进行一种或多种导入基因的转录；或将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸及与功能性连接的一种或多种待转录核酸。
具有启动子活性的本发明的核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表源自谷氨酸棒杆菌的糖-磷酸差向异构酶(P2-10)的启动子序列。SEQ.ID.NO.1对应于野生型的启动子序列。
本发明还涉及具有启动子活性的核酸，其包含通过核苷酸的取代、插入或缺失从SEQ.ID.NO.1序列衍生的，且在核酸水平上与SEQ.ID.NO.1序列具有至少90％同一性的序列。
通过来自数据库的核酸序列与上述序列SEQ ID NO1的同一性比较，本发明的启动子的本发明的其他天然实例可容易地从例如基因组序列已知的多种生物中发现。
从序列SEQ ID NO1开始通过人工变异及突变(例如，通过核苷酸的取代、插入或缺失)可容易地得到本发明的人工启动子序列。
本文中术语“取代”是指由一种或多种核苷酸置换一种或多种核苷酸。“缺失”是指通过直接连接来置换核苷酸。“插入”是指将核苷酸插入核酸序列中，伴随一种或多种核苷酸对直接连接的形式置换。
两种核酸间的同一性是指在各情况下核酸完整长度上的核苷酸同一性，具体地，同一性通过借助Informax(美国)的Vector NTI Suite 7.1软件，使用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月；5(2)151-1)进行比较计算出来的，其中参数设定如下多序列比对参数缺口开放罚分 10缺口拓展罚分 10缺口分离罚分范围 8缺口分离罚分 关比对延迟同一性％ 40残基特定缺口 关亲水性残基缺口关过渡权重(transition weighing) 0双序列比对参数FAST算法 开K-数组尺寸(tuplesize) 1缺口罚分 3窗口尺寸 5最佳对角线数目(Number of best diagonal) 5因此，与序列SEQ ID NO1具有至少90％同一性的核酸序列是指当其序列与序列SEQ ID NO1比对时显示至少90％同一性的核酸序列，所述比对具体指根据具有以上参数设定的上述程序设计的算法。
特别优选的启动子显示与核酸序列SEQ.ID.NO.1的91％同一性，进一步优选为92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特别优选为99％同一性。
此外，以本身已知方式，通过杂交技术可容易地发现启动子的其他天然实例来源于上述核酸序列，尤其是来源于来自基因组序列未知的多种生物的序列SEQ.ID NO1。
因此，本发明的另一方面涉及具有启动子活性的核酸，其包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.1杂交的核酸序列。该核酸序列包含至少10个核苷酸，更优选多于12、15、30、50个核苷酸或特别优选多于150个核苷酸。
根据本发明，在严格条件下进行杂交。这种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57页或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
严格杂交条件具体是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42℃孵育过夜，随后在65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
“功能等效片段”是指具有与起始序列大体相同或更高的特异启动子活性的启动子活性片段的核酸序列。
“基本上一致”是指呈现起始序列的特异启动子活性的至少50％、优选60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％、特别优选95％的特异启动子活性。
“片段”是指实施方案A)、B)或C)描述的具有启动子活性的核酸的部分序列。这些片段优选具有多于10个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相连核苷酸。
特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作为启动子，即用于基因的转录。
Genbank条目AP005283已在未说明功能的情况下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本发明进一步涉及本发明的新的具有启动子活性的核酸序列。
具体地，本发明涉及具有启动子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述具有启动子活性的所有核酸，例如通过双螺旋的单个重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPress New York，第896-897页)由已知方式进行寡核苷酸的化学合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及补平缺口。
本发明进一步涉及表达单元的用途，该表达单元包含一种具有启动子活性的本发明的核酸及另外功能性连接的核酸序列，该核酸序列确保用以基因表达的核糖核酸的翻译。
根据本发明，表达单元是指具有表达活性的核酸，即以与待表达核酸功能性连接的方式调节表达的核酸或基因，其中所述表达即指该核酸或该基因的转录及翻译。
就此而言，“以功能性连接”是指，例如一种本发明的表达单元与待转基因表达的核酸序列以及适当条件下的其他调节元件(如终止子)的顺序排列，这种方式使得各调节元件均可在该核酸序列的转基因表达中发挥其功能。化学意义上的直接连接对此而言并非绝对必要。例如增强子序列的遗传控制序列能够对较远位置，或甚至不同DNA分子的目标序列执行其功能。优选待转基因表达的核酸序列位于本发明的表达单元序列后(即，在3’末端)的排列，以便这两个序列共价连接在一起。在这种情况下，表达单元序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，进一步优选小于50个碱基对。
根据本发明，“表达活性”是指在特定时间内由表达单元产生的蛋白质的量，即表达速率。
根据本发明，“特异表达活性”是指各表达单元在特定时间内由表达单元产生的的蛋白质的量。
因此，在与野生型相比，基因相关的“影响表达活性”或表达速率的情况下，导致与野生型相比在野生型中不以该方式存在的蛋白质的产生。
因此，在与野生型相比，基因相关的“改变的表达活性”或表达速率的情况下，与野生型相比特定时间内产生的蛋白质的量改变。
就此而言，“改变”优选指增加或降低。
例如，这可通过增加或降低内源表达单元的特异活性进行，例如通过使该表达单元突变或通过刺激或抑制该表达单元。
另外，例如通过本发明的表达单元或具有增加的特异表达活性的表达单元调节微生物中基因的表达可以实现增加表达活性或表达速率，其中这些基因相对于这些表达单元是异源的。
通过本发明的表达单元或具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中基因的表达优选是通过以下方式实现将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达；或将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入基因的表达；或将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明的表达单元包含具有启动子活性的上述本发明的核酸及另外功能性连接的核酸序列，该核酸序列确保核糖核酸的翻译。
在一个优选实施方案中，本发明的表达单元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2表示源自谷氨酸棒杆菌的糖-磷酸差向异构酶(P2-10)的表达单元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2对应于野生型的表达单元的序列。
本发明还涉及表达单元，其包含通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列。
通过来自数据库的该核酸序列与上述序列SEQ ID NO2的同一性比较，本发明的表达单元的本发明的其他天然实例可容易地从例如基因组序列已知的各种生物中发现。
可容易地发现本发明的表达单元的人工序列是通过人工变异及突变(例如，通过核苷酸的取代、插入或缺失)来源于序列SEQ ID NO2。
因此，与序列SEQ ID NO2具有至少90％同一性的核酸序列是指当其序列与序列SEQ ID NO2比对时显示至少90％同一性的核酸序列，所述的比对具体指根据具有以上参数设定的上述程序设计的算法。
特别优选的表达单元显示与核酸序列SEQ.ID.NO.2的91％同一性，进一步优选为92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特别优选为99％同一性。
此外，以本身已知方式，通过杂交技术可容易地发现表达单元的其他天然实例来源于上述核酸序列，尤其是来源于来自基因组序列未知的各种生物的序列SEQ.ID NO2。
因此，本发明的另一方面涉及包含在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.No.2杂交的核酸序列的表达单元。该核酸序列包含至少10个核苷酸，更优选多于12、15、30、50个核苷酸或特别优选多于150个核苷酸。
“杂交作用”是指在严格条件下多核苷酸或寡核苷酸结合至实际互补序列，同时在这种条件下不进行非互补配对之间的非特异性结合的能力。就此而言，序列应当优选为90-100％互补。例如，在Northern或Southern印迹技术或在PCR或RT-PCR引物结合中使用这种互补序列能够彼此特异结合的特性。
根据本发明，在严格条件下进行杂交。此种杂交条件描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57页或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
严格杂交条件具体是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已变性、剪切的蛙精DNA组成的溶液中于42℃孵育过夜，随后在65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
本发明的核苷酸序列还可能产生可用于识别和/或克隆其他细胞类型及微生物中的同源序列的探针及引物。这类探针及引物通常包含在严格条件下，与本发明的核酸序列的有义链或对应反义链上至少约12个、优选至少约25个(例如约45、50或75个)连续核苷酸杂交的核酸序列区域。
根据本发明，包含所谓的沉默突变的核酸序列，或与具体涉及的序列相比，根据具体起始生物或宿主生物的密码子选择进行修饰的核酸序列及其天然存在的变体，如其剪接变体或等位变体也包含在本发明中。
“功能等效片段”是指具有与起始序列大体相同或更高的特异表达活性的表达单元片段。
“基本上一致”是指呈现起始序列的特异表达活性的至少50％、优选60％、更优选70％、更优选80％、更优选90％、特别优选95％的特异表达活性。
“片段”是指实施方案E)、F)或G)描述的表达单元的部分序列。这些片段优选具有多于10个、更优选多于12、15、30、50个或特别优选多于150个核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相连核苷酸。
特别优选使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作为表达单元，即用于基因的表达。
本发明进一步涉及本发明的新的表达单元。
具体地，本发明涉及表达单元，其包含具有启动子活性的本发明的核酸及另外功能性连接的核酸序列，该核酸序列确保核糖核酸的翻译。
本发明特别优选涉及表达单元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本发明的表达单元包含一种或多种以下遗传元件负10(“-10”)序列、负35(“-35”)序列、转录序列起点、增强子区域及操纵基因区域。
这些遗传元件优选是棒杆菌种特异的，尤其是谷氨酸棒杆菌特异的。
另外，可以本身已知方式，通过从核苷酸结构单位进行化学合成来制备上述所有表达单元，例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸结构单位的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press NewYork，第896-897页)由已知方式进行寡核苷酸的化学合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及补平缺口。
本申请中用于本发明的方法及技术是熟悉微生物及重组DNA技术的本领域技术人员所知的。用于培养细菌细胞、将分离的DNA分子插入宿主细胞中并分离，及分离的核酸分子的克隆及测序等的方法与技术为这类技术与方法的实例。许多标准文献资料描述了这些方法Davis等人，BasicMethods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in BacterialGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1992)；M.Singer与P.Berg，Genes&Genomes，University ScienceBooks，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch与T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等人，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biologyand Medicine，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick与J.E.Thompson编著，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)及P.F.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本发明所有的核酸分子优选为分离的核酸分子的形式。“分离的”核酸分子是分离自存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子，另外，如果其是由重组技术制备的，则可基本上不含有其他细胞材料或培养基，或者如果其是经化学合成的，则可基本上不含化学前体或其他化学物。
另外，本发明包括与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其部分。
例如，如下所述，本发明的启动子和/或表达单元可特别有利地用于通过下述发酵来制备生物合成产物的改进方法中。
具体地，本发明的启动子和/或表达单元的优点在于其是通过应激(stress)在微生物中诱导的。可能通过对发酵过程进行适当控制来控制该特别用于增加目的基因的转录/表达速率的应激诱导。具体地，在L-赖氨酸产生中，极早达到该应激阶段，以便在这种情况下极早达到目的基因的增加的转录/表达速率。
与野生型相比，具有启动子活性的本发明的核酸可用于改变(即提高或降低)或影响微生物中基因的转录速率。
与野生型相比，本发明的表达单元可用于改变(即提高或降低)或影响微生物中基因的表达速率。
具有启动子活性的本发明的核酸及本发明的表达单元也可用于调节及增强微生物中(尤其是在棒杆菌菌种中)例如精细化学品、蛋白质(尤其为氨基酸)的各种生物合成产物的产生。
因此，与野生型相比，本发明涉及通过以下方式改变或影响微生物中基因转录速率的方法a)与野生型相比，改变微生物中具有启动子活性的本发明的内源核酸的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b)以具有启动子活性的本发明的核酸，或以具有实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因与所述具有启动子活性的核酸是异源的。
根据实施方案a)，与野生型相比，可通过改变(即增加或降低)微生物中特异启动子的活性来改变或影响的微生物中基因的转录速率。例如，这可通过具有启动子活性的本发明的核酸序列的定向突变(即通过核苷酸的定向取代、缺失或插入)来进行。可通过置换RNA聚合酶全酶结合位点(本领域的技术人员也称其为-10区与-35区)中的核苷酸来达到增加或降低启动子的活性。此外，通过缺失核苷酸或插入核苷酸来缩小或扩大所述RNA聚合酶全酶结合位点彼此之间的距离。另外通过将调节蛋白质(本领域的技术人员也称其为阻抑蛋白及激活蛋白)的结合位点(本领域的技术人员也称其为操纵基因)插入RNA聚合酶全酶的结合位点的空间相邻区域，使得在结合至启动子序列后，这些调节物减弱或增强RNA聚合酶完全酶的结合及转录活性或使其处于新的调节影响下。
就“特异启动子活性”而言，与野生型相比的增加或降低是指与野生型的具有启动子活性的本发明的核酸相比(即，例如与SEQ.ID.NO.1相比)，特异活性的增加或降低。
根据实施方案b)，微生物中基因转录速率与野生型相比的改变或影响，可通过以具有启动子活性的本发明的核酸或以具有根据实施方案a)的改变的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录来进行，其中这些基因与这些具有启动子活性的核酸是异源的。
此优选通过以下方式实现b1)将一种或多种具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的内源核酸控制下进行一种或多种导入的基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
因此，可能通过以下方式改变(即提高或降低)野生型内源基因的转录速率根据实施方案b1)，将一种或多种具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或根据实施方案b2)，将一种或多种内源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的内源核酸控制下进行一种或多种导入的内源基因的转录，或根据实施方案b3)，将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录内源核酸。
因此，另外可能通过以下方式影响与野生型相比的外源基因的转录速率根据实施方案b2)，将一种或多种外源基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的内源核酸控制下进行一种或多种导入的外源基因的转录，或根据实施方案b3)，将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的本发明的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录外源核酸。
此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行如实施方案b2)的基因插入。优选插入至非编码区中。
此外，可在染色体上或染色体外进行如实施方案b3)的核酸构建物的插入。优选核酸构建物的染色体插入。“染色体”整合是将外源DNA片段插入至宿主细胞的染色体中。该术语也用于外源DNA片段与宿主细胞染色体上适当区域之间的同源重组。
在实施方案b)中，优选也使用具有如实施方案a)的改变的特异启动子活性的本发明的核酸。在实施方案b)中，如实施方案a)中所述，这些核酸可在微生物中存在或制备，或将其以分离的形式导入微生物中。
“内源”是指已存在于野生型基因组中的遗传信息，例如基因。
“外源”是指不存在于野生型基因组中的遗传信息，例如基因。
与具有启动子活性的本发明的核酸进行的转录调节有关的术语“基因”优选是指核酸，其包含待转录的区域(即，例如调节翻译的区域)及编码区，且适当条件下进一步包含例如终止子的调节元件。
如下所述，与本发明的表达单元进行的表达调节有关的术语“基因”优选是指核酸，其包含编码区，且适当条件下进一步包含例如终止子的调节元件。
“编码区”是指编码蛋白质的核酸序列。
相对于具有启动子活性的核酸及基因而言的“异源性”是指所用基因在具有启动子活性的本发明的核酸的调节下，在野生型中不转录，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接及在野生型中不存在的具启动子活性的本发明的核酸与特定基因的功能性组合。
相对于表达单元及基因而言的“异源性”是指所用基因在具有启动子活性的本发明的表达单元的调节下，在野生型中不表达，但是产生了在野生型中不存在的新的功能性连接及在野生型中不存在的本发明的表达单元与特定基因的功能性组合。
在一个优选实施方案中，与野生型相比，本发明进一步涉及通过以下方式提高或影响微生物中基因的转录速率的方法ah)与野生型相比，增加具有启动子活性的本发明的内源核酸在微生物中的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)以具有启动子活性的本发明的核酸，或以具有实施方案a)所述的增加的特异启动子活性的核酸调节微生物中的基因的转录，其中所述基因相对于具有启动子活性的核酸而言是异源的。
以具有启动子活性的本发明的核酸，或以增加根据实施方案ah)的具有的特异启动子活性的本发明的核酸进行的微生物中基因转录的调节优选是通过以下方式实现bh1)将一种或多种具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明的内源核酸控制下进行一种或多种导入的基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的本发明的核酸以及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
在一个优选实施方案中，与野生型相比，本发明进一步涉及通过以下方式降低微生物中基因的转录速率的方法ar)与野生型相比，降低具有启动子活性的本发明的内源核酸在微生物中的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有实施方案a)所述的降低的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有降低的启动子活性的核酸的控制下进行内源基因的转录。
与野生型相比，本发明进一步涉及通过以下方式改变或影响微生物中基因表达速率的方法c)与野生型相比，改变本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或d)以本发明的表达单元，或以具有实施方案c)所述的改变的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
根据实施方案c)，与野生型相比，可通过改变(即增加或降低)微生物中的特异表达活性来改变或影响微生物中基因的表达速率。例如，这可通过具有启动子活性的本发明的核酸序列的定向突变(即，通过核苷酸的定向取代、缺失或插入)来进行。例如，延长Shine-Dalgarno序列与翻译起始密码子之间的距离通常导致变化，该变化为特异表达活性的减弱或增强。也可通过缺失或插入核苷酸来缩短或延长Shine-Dalgarno区(核糖体结合位点)的序列与翻译起始密码子之间的距离，从而实现特异表达活性的改变。但是，还可通过使其与互补的3’端16S rRNA的同源性增强或减弱方式改变Shine-Dalgarno区的序列来实现。
就“特异表达活性”而言，与野生型相比的增加或降低是指与野生型的本发明的表达单元相比(即，例如与SEQ.ID.NO.2相比)，特异活性的增加或降低。
根据实施方案d)，可通过本发明的表达单元，或具有根据实施方案c)的改变的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中基因的表达，从而改变或影响微生物中与野生型相比的基因的表达速率，其中这些基因相对于这些表达单元而言是异源的。
该优选通过以下方式达到d1)将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物的基因组中，以便在导入的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或
d2)将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入的基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
因此，可能通过以下方式改变(提高或降低)野生型内源基因的表达速率根据实施方案d1)，将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物的基因组中，以便在导入的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或根据实施方案d2)，将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入的基因的表达，或根据实施方案d3)，将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
因此，另外可能通过以下方式影响与野生型相比的内源基因的表达速率根据实施方案d2)，将一种或多种基因导入微生物的基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入的基因的表达，或根据实施方案d3)，将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的本发明的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达外源核酸。
此外，可通过将基因整合至编码区或非编码区中来进行根据实施方案d2)的基因插入。优选插入至非编码区中。
此外，可在染色体上或染色体外进行如实施方案d3)的核酸构建物的插入。优选核酸构建物的染色体插入。
在下文中，核酸构建物也称作表达盒。
在实施方案d)中，优选也使用具有根据实施方案c)的改变的特异表达活性的本发明的表达单元。在实施方案d)中，如实施方案c)中所述，这些表达单元可在微生物中存在或制备，或以分离的形式导入微生物中。
在一个优选实施方案中，与野生型相比，本发明进一步涉及通过以下方式提高或影响微生物中基因表达速率的方法ch)与野生型相比，增加本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述表达单元调节内源基因的表达，或dh)以本发明的表达单元，或以具有实施方案c)所述的增加的特异表达活性的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因相对于所述表达单元而言是异源的。
以本发明的表达单元，或以具有实施方案c)所述的增加的特异表达活性的表达单元进行的微生物中基因表达的调节优选是通过以下方式实现dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的，适当条件下具有增加的特异表达活性的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元以及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
与野生型相比，本发明进一步涉及通过以下方式降低微生物中基因表达速率的方法cr)与野生型相比，降低本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dr)将实施方案cr)所述的具有降低的特异表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的具有降低的表达活性的表达单元的控制下进行内源基因的表达。
在用于改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的一个优选实施方案中，这些基因选自编码来自精细化学品的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，这些基因包含其他调节元件。
在用于改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率的上述本发明方法的特别优选的实施方案中，这些基因选自核酸编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，这些基因包含其他调节元件。
在一个特别优选的实施方案中，来自氨基酸的生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体(exporter carrier)、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白(efflux protein)、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
优选的蛋白质及编码源自氨基酸生物合成途径的上述这些蛋白质的优选蛋白质的核酸分别为微生物来源的蛋白质序列及核酸序列，优选源自棒杆菌属或短杆菌属细菌，优选源自棒杆菌，特别优选源自谷氨酸棒杆菌。
来自氨基酸生物合成途径的这些蛋白质的特别优选蛋白质序列及编码这些蛋白质的相应核酸序列的实例、其参考文献及其在参考文献中的编号列于表1中
表1





特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列及编码该蛋白质对应的核酸序列的其他实例为果糖-1，6-二磷酸酶2(也称作fbr2)的序列(SEQ.ID.NO.8)及对应的编码果糖-1，6-二磷酸酶2(SEQ.ID.NO.7)的核酸序列。
特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列及编码该蛋白质的对应核酸序列的其他实例为硫酸盐还原作用中的蛋白质(也称作RXA077)的序列(SEQ.ID.NO.10)及对应的编码硫酸盐还原作用中的蛋白质的核酸序列(SEQ.ID.NO.9)。
其他特别优选的来自氨基酸生物合成途径的蛋白质序列在各种情况下均具有该蛋白质在表1中所示的氨基酸序列，其中表2/第2列中所示的每个蛋白质的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一个上具有与表2/第3列同一行中所示的各氨基酸不同的生蛋白氨基酸。在另一个优选实施方案中，表2/第2列中所示的蛋白质的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一个上具有表2/第4列同一行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白质是氨基酸生物合成途径的突变蛋白，其具有特别有益的特性并因此特别适合通过本发明的启动子表达对应的核酸，并产生氨基酸。例如，T311I突变导致ask的反馈抑制被中止。
编码表2中的上述突变蛋白的对应核酸可以通过常规方法制备。
用于制备编码突变蛋白的核酸序列的适合出发点是，例如以保藏号ATCC 13032获自美国典型培养物保藏中心的谷氨酸棒杆菌菌株的基因组，或表1中提及的核酸序列。为了将突变蛋白的氨基酸序列逆翻译成编码这些蛋白质的核酸序列，最好使用该核酸序列将被导入的生物的密码子选择，或该核酸序列存在于其中的生物的密码子选择。例如，就谷氨酸棒杆菌而言，最好使用谷氨酸棒杆菌的密码子选择。可以本身已知的方式从数据库或专利申请中确定具体生物的密码子选择，所述专利申请描述了目的生物中的至少一种蛋白质及一种编码这种蛋白质的基因。
以如下方式理解表2中的信息第1列“符号”中指明与表1有关的各序列的明确名称。
第2列“AA位置”中，各数字是指来自表1的对应多肽序列的氨基酸位置。因此，“AA位置”列中“26”是指对应的所示多肽序列的氨基酸的第26位。位置的编号是由N末端+1起始。
第3列“AA野生型”中各个字母表示表1中相应野生型菌株序列上在第2列所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。
第4列“AA突变型”中各字母表示对应突变型菌株中第2列中所示位置上的氨基酸，其以单字母代码表示。
第5列“功能”中指明对应多肽序列的生理功能。
就具有特定功能(第5列)及特定起始氨基酸序列(表1)的突变蛋白而言，第2、3及4列描述了至少一个突变及某些序列的多个突变。该多个突变始终是指在各情况下最接近的上述起始氨基酸序列(表1)。术语特定氨基酸序列的“氨基酸位置中的至少一个”优选是指该氨基酸序列在第2、3及4列中所述的至少一个突变。
生蛋白氨基酸的单字母代码A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H组氨酸I异亮氨酸K赖氨酸L亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S丝氨酸T苏氨酸V缬氨酸W色氨酸Y酪氨酸表2




在用于改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率的上述本发明方法及用于产生基因修饰微生物(下面称为基因修饰微生物)的下述方法及用于产生生物合成产物的下述方法中，优选以SacB方法将具有启动子活性的本发明的核酸、本发明的表达单元、上述基因及上述核酸构建物或表达盒导入微生物中，具体地，将它们导入棒杆菌中。
SacB方法是本领域的技术人员所知道的，且描述于，例如Schfer A，Tauch A，Jger W，Kalinowski J，Thierbach G，Pühler A.；Smallmobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichiacoli plasmids pK18 and pK19selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum，Gene.1994年7月22日；145(1)69-73及Blomfield IC，Vaughn V，Rest RF，Eisenstein BI.；Allelicexchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and atemperature-sensitive pSC101 replicon；Mol Microbio1.1991年6月；5(6)1447-57中。
在上述本发明方法的一个优选实施方案中，通过将具有启动子活性的本发明的核酸或本发明的表达单元导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率。
在上述本发明方法的另一个优选实施方案中，通过将上述核酸构建物或表达盒导入微生物中来改变或影响微生物中基因的转录速率和/或表达速率。
因此，本发明也涉及表达盒，其包含至少一种本发明的表达单元，至少一种其他待表达核酸序列，即待表达基因，及适当条件下的其他遗传控制元件，例如终止子。
其中至少一种表达单元与其他待表达核酸序列功能性连接在一起，且所述的其他待表达核酸序列相对于该表达单元而言是异源的。
待表达核酸序列优选为编码来自精细化学品生物合成途径的蛋白质的核酸中的至少一种。
待表达核酸序列特别优选选自编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸。
来自氨基酸的生物合成途径的优选蛋白质描述如上，且其实例描述于表1与2中。
选择本发明的表达盒中表达单元相对于待表达基因的物理位置，以便表达单元调节转录，并优选也调节待表达基因的翻译，且因此能够产生一种或多种蛋白质。就此而言，“能够产生”包括产生过程中的组成型增加、在特定条件下产生的减少或阻断和/或在特定条件下产生的增加。就此而言，“条件”包含(1)向培养基中添加组分，(2)从培养基移除组分，(3)以另一种成份置换培养基中的一种组分，(4)提高培养基的温度，(5)降低培养基的温度及(6)调节大气条件，例如，培养基所处的氧或氮浓度。
本发明进一步涉及包含上述本发明的表达盒的表达载体。
载体为本领域技术人员熟知且可在“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，编者，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中发现。除质粒以外，载体也指本领域的技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒及线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或进行染色体复制。
适合且特别优选的质粒为那些在棒杆菌中复制的质粒。例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))的众多已知质粒载体基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。可用相同方式使用其他质粒载体，例如pCLiK5MCS或那些基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的质粒载体。
借助于染色体整合的基因扩增方法的那些质粒载体也同样适合用于复制及扩增hom-thrB操纵子，所述质粒载体，例如Reinscheid等人(Appliedand Environmental Microbiology 60，126-132(1994))所述。在该方法中，完整基因克隆至质粒载体中，该质粒载体能在宿主(通常为大肠杆菌(E.coli))中复制而不能在谷氨酸棒杆菌中复制。合适载体的实例为pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer等人，Gene 145，69-73(1994)，Bernard等人，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology1734510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene 41337-342)。随后通过转化，将包含待扩增基因的质粒载体转入目的谷氨酸棒杆菌菌株中。用于转化的方法是，例如Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))、Dunican与Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述的方法。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中该基因修饰作用导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的转录速率，且其取决于a)改变至少一种第1项所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性，该内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b)以第1项所述的具有启动子活性的核酸，或以具有实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的第1项所述的具有启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中这些基因相对于这些具有启动子活性的核酸而言是异源的。
就上述方法而言，以第1项所述的具有启动子活性的核酸，或以具有实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的第1项所述的具有启动子活性的核酸进行的微生物中基因转录的调节通过以下方式实现b1)将一种或多种第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比，具有至少一种基因的转录速率已提高或影响的基因修饰微生物，其中ah)与野生型相比，第1项所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，这些内源核酸调节内源基因转录，或bh)以第1项所述的具有启动子活性的核酸，或以具有实施方案ah)所述的增加的特异启动子活性的核酸调节微生物中基因的转录，其中这些基因相对于这些具有启动子活性的核酸而言是异源的。
就上述方法而言，以第1项所述的具有启动子活性的核酸，或以具有实施方案a)所述的增加的特异启动子活性的第1项所述的具有启动子活性的核酸进行的微生物中基因转录的调节通过以下方式实现bh1)将一种或多种第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸的控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸的控制下进行一种或多种导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含第1项所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比，具有至少一种基因的转录速率已降低的基因修饰微生物，其中ar)与野生型相比，至少一种第1项所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，该内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种实施方案a)所述的具有已降低的启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有已降低的启动子活性的核酸的控制下进行至少一种内源基因的转录。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其中该基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的表达速率，且其取决于c)与野生型相比，改变至少一种第2或3项所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性，该内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或d)以第2或3项所述的表达单元，或以具有实施方案a)所述的改变的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元调节微生物中基因的表达，其中这些基因相对于这些表达单元而言是异源的。
就上述方法而言，以第2或3项所述的表达单元，或以如实施方案a)的具有改变的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元进行的微生物中基因表达的调节通过以下方式实现d1)将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有改变的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的第2或3项所述的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比，具有至少一种基因的表达速率已提高或受影响的基因修饰微生物，其中ch)与野生型相比，至少一种第2或3项所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，该内源表达单元调节内源基因表达，或dh)以第2或3项所述的表达单元，或以具有实施方案a)所述的增加的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元调节微生物中基因的表达，其中这些基因相对于这些表达单元而言是异源的。
就上述方法而言，以第2或3项所述的表达单元，或以具有实施方案a)所述的增加的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元进行的微生物中基因表达的调节通过以下方式实现dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的第2或3项所述的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的第2或3项所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
本发明进一步涉及与野生型相比，具有至少一种基因的表达速率已降低的基因修饰微生物，其中cr)与野生型相比，至少一种第2或3项所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是降低的，该内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有已降低的表达活性的第2或3项所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的具有已降低的表达活性的第2或3项所述的表达单元的控制下进行至少一种内源基因的表达。
本发明进一步涉及基因修饰微生物，其包含第2或3项所述的表达单元及功能性连接的待表达基因，其中该基因相对于表达单元而言是异源的。
该基因修饰微生物特别优选包含本发明的表达盒。
本发明特别优选涉及包含载体的基因修饰微生物，具体地是包含载体的棒杆菌，所述载体具体地是穿梭载体或质粒载体，该载体锚定至少一种如本发明所定义的重组核酸构建物。
在基因修饰微生物的一个优选实施方案中，上述基因为编码来自精细化学品的生物合成途径的蛋白质的核酸中的至少一种。
在基因修饰微生物的一个特别优选的实施方案中，上述基因选自编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，这些基因包含其他调节元件。
来自氨基酸的生物合成途径的优选蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
来自氨基酸生物合成途径的蛋白质及基因的特别优选实例如上描述于表1及表2中。
优选的微生物或基因修饰微生物为细菌、藻类、真菌或酵母菌。
具体地，特别优选的微生物为棒杆菌。
优选的棒杆菌为棒杆菌属细菌，尤其为谷氨酸棒杆菌菌种、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)菌种、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌种、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)菌种、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)菌种及有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)菌种；或短杆菌属细菌，尤其为黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)菌种、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)菌种及叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)菌种。
特别优选的棒杆菌属与短杆菌属细菌选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC 15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870、热产氨棒杆菌FERM BP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965、有效棒杆菌DSM 44547、有效棒杆菌DSM 44548、有效棒杆菌DSM 44549、黄色短杆菌ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌ATCC 13869、叉开短杆菌ATCC 14020、谷氨酸棒杆菌KFCC 10065及谷氨酸棒杆菌ATCC 21608。
缩写KFCC是指韩国联邦菌物保藏中心(Korean Federation ofCulture Collection)，缩写ATCC是指美国典型培养物保藏中心及缩写DSM是指德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen)。
其他特别优选的棒杆菌属与短杆菌属细菌列于表3中









这些缩写具有以下含义ATCC美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，美国FERM发酵研究所，Chiba，日本NRRLARS保藏中心，北方农业研究所(Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，IL，美国CECT西班牙典型培养物保藏中心(Coleccion Espanola de CultivosTipo)，Valencia，西班牙NCIMB国立工业和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，英国CBS真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures)，Baarn，荷兰NCTC国立典型培养物保藏中心，London，英国DSMZ德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Brunswick，德国。
通过具有启动子活性的本发明的核酸及本发明的表达单元，可能借助于上述本发明的方法调节上述本发明的基因修饰微生物中的特定生物合成产物的代谢路径。
基于此目的，例如通过影响或提高某生物合成途径的基因转录速率或表达速率来增强产生特定生物合成产物的这个代谢路径，其中增加的蛋白质的量导致目的生物合成途径的这些蛋白质的总活性增加，且因此导致通向目的生物合成产物的代谢通量增加。
此外，可通过降低某分支生物合成途径的基因转录速率或表达速率来减弱从特定生物合成产物分支的代谢路径，其中降低的蛋白质的量导致非目的生物合成途径的那些蛋白质的总活性降低，且因此额外导致通向目的生物合成产物的增加。
本发明基因修饰微生物能够产生，例如来自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素的生物合成产物或来自甘油与乙醇的生物合成产物。
因此，本发明涉及通过培育本发明的基因修饰微生物来产生生物合成产物的方法。
基于目的生物合成产物，必须提高或降低多种基因的转录速率或表达速率。通常，最好改变多个基因的转录速率或表达速率，即，提高基因组合的转录速率或表达速率和/或降低基因组合的转录速率或表达速率。
在本发明的基因修饰微生物中，至少一种基因的改变的(即提高的或降低的)转录速率或表达速率是归因于具有启动子活性的本发明的核酸或本发明的表达单元。
另外，基因修饰微生物中其他基因的额外改变的(即额外提高的或额外降低的)转录速率或表达速率可(但不是必需)来自具有启动子活性的本发明的核酸或本发明的表达单元。
因此，本发明进一步涉及通过培育本发明的基因修饰微生物来产生生物合成产物的方法。
优选的生物合成产物为精细化学品。
术语“精细化学品”为本领域所知并且包括由生物产生且用于多种工业领域中的化合物，所述工业领域例如(但不限于)医药业、农业、化妆品业、食品业及饲料业。这些化合物包括例如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸的有机酸及蛋白型与非生蛋白氨基酸、嘌呤碱与嘧啶碱、核苷与核苷酸(例如，Kuninaka，A.(1996)在Nucleotides and related compounds，第561-612页，Biotechnology第6卷，Rehm等人，编者，VCHWeinheim中及其中所出现的参考文献中所述的)、类脂类、饱和与不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇(例如丙二醇及丁二醇)、糖类(例如透明质酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及靛蓝)、维生素与辅因子(如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613页(1996)VCHWeinheim及其中所出现的参考文献中及Ong，A.S.，Niki，E.及Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”Proceedingsof the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press(1995)中所述的)、由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所述的参考文献中所述的酶及所有其他化学品。某些精细化学品的代谢及用途进一步解释如下。
I.氨基酸的代谢及用途氨基酸包含所有蛋白质的基本结构单位且因此是正常细胞功能所必需的。术语“氨基酸”在本领域中是已知的。作为蛋白质的结构单位的生蛋白氨基酸有20种，其中它们通过肽键连接在一起，而非生蛋白氨基酸(其中数百种是已知的)通常不在蛋白质中出现(参阅Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A2卷，第57-97页VCHWeinheim(1985))。虽然L-氨基酸通常是天然存在的蛋白质中发现的仅有类型，但是氨基酸可以是D或L型。20种生蛋白氨基酸中每一种的生物合成和降解途径已经在原核细胞和真核细胞中进行了很好表征(例如参阅Stryer，L.Biochemistry，第三版，第578-590页(1988))。由于其生物合成的复杂性，因此所谓的“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸)必须由饮食摄取，它们通过简单生物合成途径转化为其他11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸及酪氨酸)。高等动物具有合成这些氨基酸中的一些氨基酸的能力，然而必需氨基酸必须与食物一起摄入来进行正常的蛋白质合成。
除了它们在蛋白质生物合成中的作用以外，这些氨基酸本身是令人感兴趣的化合物，且已发现它们在食品、饲料、化学品、化妆品、农业及医药业中的多种用途。赖氨酸不仅是人类营养的重要氨基酸，也是例如家禽及猪的单胃物种的重要氨基酸。谷氨酸最常用作调味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)并且广泛用于食品业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同样如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸及色氨酸皆用于医药业中。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸及丙氨酸用于医药业及化妆品工业中。苏氨酸、色氨酸及D/L-甲硫氨酸广泛用作饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)Amino acids-technical production anduse，第466-502页，Rehm等人，(编者)Biotechnology第6卷，第14a章，VCHWeinheim)。已发现这些氨基酸也适用于作为合成以下合成氨基酸及蛋白质的前体例如，N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨酸及Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97页，VCH，Weinheim，1985中所述的其他物质。
已经很好地表征了这些天然氨基酸在能够产生它们的生物(例如细菌)中的生物合成(回顾细菌氨基酸的生物合成及其调节，参阅Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通过α-酮戊二酸(柠檬酸循环的中间产物)的还原性胺化作用合成谷氨酸。由谷氨酸相继分别产生谷氨酰胺、脯氨酸及精氨酸。丝氨酸的生物合成是由一个3个步骤的方法进行，起始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间产物)，且在氧化、转氨基及水解步骤之后得到该氨基酸。由丝氨酸分别产生半胱氨酸及甘氨酸，前者通过高胱氨酸与丝氨酸的缩合得到，且后者通过在由丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中将侧链β-碳原子转移至四氢叶酸得到。苯丙氨酸及酪氨酸是在9个步骤的生物合成途径中，由糖酵解及戊糖磷酸途径的前体(赤藓糖4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸)合成，两者仅在预苯酸合成后的最后两个步骤不同。色氨酸同样是由这两种起始分子产生，然而其合成在11个步骤的途径中进行。也可在由苯丙氨酸羟化酶催化的反应反应中，由苯丙氨酸产生酪氨酸。丙氨酸、缬氨酸及亮氨酸分别为丙酮酸(糖酵解的最终产物)的生物合成产物。天冬氨酸由草酰乙酸(柠檬酸循环的中间产物)形成。通过天冬氨酸的转化分别产生天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸及赖氨酸。异亮氨酸由苏氨酸形成。组氨酸在复杂的9个步骤的途径中由5-磷酸核糖1-焦磷酸(活化糖)形成。
超过细胞中蛋白质生物合成所需量的氨基酸无法被储存，而是被分解，以便提供细胞的主要代谢路径的中间产物(回顾，参阅Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第21章，“Amino Acid Degradation and the UreaCycle”；第495-516页(1988))。虽然细胞能够将不需要的氨基酸转化为有用的代谢中间产物，然而就其合成所需的能量、前体分子及酶而言，氢基酸产生作用成本很高。因此，通过反馈抑制调节氨基酸的生物合成并不令人惊讶，其中具体氨基酸的出现减慢或完全终止其自身的产生(回顾氨基酸生物合成途径中的反馈机制，参阅Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第24章，“Biosynthesis of Amino Acids and Heme”，第575-600页(1988))。因此，具体氨基酸的产量受细胞中该氨基酸量的限制。
II.维生素、辅因子及营养补充品(Nutraceutical)的代谢及用途维生素、辅因子及营养补充品包含另一类分子。虽然它们易于由其他生物(如细菌)合成，高等动物已丧失了合成它们的能力，因此需要摄取它们。这些分子本身为生物活性分子或在众种代谢路径中作为电子载体或中间产物的生物活性物质的前体。除了其营养价值外，这些化合物还具有作为着色剂、抗氧化剂及催化剂或其他加工助剂的明显工业价值。(回顾这些化合物的结构、活性及工业应用，例如参阅Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613页，VCHWeinheim，1996)。术语“维生素”为本领域所知并且包括生物体正常机能所必需的营养物，然而其不能由生物体自身合成。维生素类可包括辅因子及营养补充品化合物。术语“辅因子”包括正常酶活性的出现必需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机或无机的；本发明的辅因子分子优选为有机的。术语“营养补充品”包括在植物和动物、特别是人中具有健康促进作用的食物添加剂。这些分子的实例为维生素、抗氧化剂及某些类脂类(例如多不饱和脂肪酸)。
这些分子在能够生产它们的生物(如细菌)中的生物合成已被详细地表征(“Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613页，VCHWeinheim，1996，Michal，G.(1999)BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.与Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health andDisease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia and the Society for free RadicalResearch-亚洲，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)。
通过嘧啶与噻唑单元的化学偶合形成硫胺素(维生素B1)。核黄素(维生素B2)是由5’-三磷酸鸟苷(GTP)与5-磷酸核糖合成。核黄素接着用于合成黄素单核苷酸(FMN)与黄素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族统称为“维生素B6”(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛5’-磷酸和商业使用的盐酸吡哆醇)，其皆为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。可通过化学合成或通过发酵来产生泛酸(Pantothenate)(泛酸(pantothenic acid)，R-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)。泛酸生物合成中的最后步骤由ATP-驱动的β-丙氨酸与泛解酸缩合组成。在转化成泛解酸、转化成β-丙氨酸及缩合成泛酸的生物合成步骤中发挥作用的酶是已知的。泛酸的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成通过5个酶促步骤进行。泛酸、5-磷酸吡哆醛、半胱氨酸及ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸的形成，而且也催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸内酯、(R)-泛醇(维生素原B5)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)及辅酶A的产生。
已详细研究了微生物中自前体分子庚二酰-辅酶A进行的生物素的生物合成，且已经确定了几个有关基因。已发现许多对应的蛋白质参与Fe簇(Fe cluster)合成中且属于nifS蛋白质类。硫辛酸源自辛酸并且作为能量代谢中的辅酶，它成为丙酮酸脱氢酶复合物和α-酮戊二酸脱氢酶复合物的组成成分。叶酸类为全部衍生自叶酸的一类物质，而叶酸依次从L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基喋呤(methylpterin)衍生而来。已在某些微生物中详细研究了起始自代谢中间产物5’-三磷酸鸟苷(GTP)、L-谷氨酸及对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成。
类咕啉(例如钴胺素，特别是维生素B12)及卟啉属于以四吡咯环系统为特征的一类化学品。维生素B12的生物合成是太过复杂以至于尚未完全了解，然而其涉及的大多数酶及底物如今是已知的。烟酸(nicotinic acid)(烟酸(nicotinate))及烟酰胺为吡啶衍生物，也将其称作“尼克酸(niacin)”。尼克酸是重要的辅酶NAD(烟碱酰氨-腺嘌呤二核苷酸)及NADP(烟碱酰氨-腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。
虽然这些化合物中的一些已通过大规模培养微生物来生产，例如核黄素、维生素B6、泛酸及生物素，但是这些化合物在工业规模上的生产主要基于无细胞的化学合成。只有维生素B12由于其合成的复杂性而只能通过发酵生产。体外方法需要相当大的材料花费和时间，并且成本常常很高。
III.嘌呤、嘧啶、核苷与核苷酸的代谢及用途嘌呤与嘧啶代谢的基因及其对应的蛋白质是肿瘤疾病及病毒感染治疗的重要目标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包含含氮碱基，其是核酸、辅酶及核苷酸的组分。术语“核苷酸”包含核酸分子的基本结构单位，其包括含氮碱基、戊糖(RNA中该糖为核糖，且DNA中该糖为D-脱氧核糖)及磷酸。术语“核苷”包含作为核苷酸前体的分子，但与核苷酸相比，其不具有磷酸单元。通过抑制用于形成核酸分子的这些分子的生物合成或其活动来抑制RNA与DNA的合成是可能的；该活动在致癌细胞中的靶向抑制则能够抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。
还存在不形成核酸分子但作为能量储存物(AMP)或作为辅酶(即FAD与NAD)的核苷酸。
许多出版物已描述了这些化学品在那些嘌呤和/或嘧啶代谢受影响的医学适应症中的用途(例如，Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents”，Med.Res.Reviews 10505-548)。嘌呤及嘧啶代谢中涉及的酶的研究集中于新药的开发中，例如可用作免疫抑制剂或抗增殖剂(Smith，J.L.“Enzymes in Nucleotide Synthesis”Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757；Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-902)。然而，嘌呤碱基及嘧啶碱基、核苷及核苷酸也具有其他可能的用途作为各种精细化学品的生物合成的中间产物(例如硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸或核黄素)；作为细胞的能量载体(例如ATP或GTP)及作为化学品本身，其通常用作调味增强剂(例如IMP或GMP)，或用于许多医学用途中(例如参阅Kuninaka，A.，(1996)“Nucleotides and Related Compounds”inBiotechnology，第6卷，Rehm等人，编者，VCHWeinheim，第561-612页)。嘌呤、吡啶、核苷或核苷酸代谢中所涉及的酶也日益成为开发用于保护庄稼的化学品的目标，这些化学品包括杀真菌剂、除草剂及杀虫剂。
这些化合物在细菌中的代谢已被表征(回顾，例如参阅Zalkin，H.与Dixon，J.E.(1992)“De novo purine nucleotide biosynthesis”in Progress inNucleic Acids Research and Molecular Biology，第42卷，Academic Press，第259-287页和Michal，G.(1999)“Nucleotides and Nucleosides”；第8章，Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，Wiley，New York)。作为大量研究的主题的嘌呤代谢是细胞正常机能所必需的。高等动物中损嘌呤代谢受损可引起例如痛风的严重疾病。通过许多步骤从核糖5-磷酸经由中间化合物肌苷5’-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，，从而导致5’-单磷酸鸟苷(GMP)或5’-单磷酸腺苷(AMP)的产生，自此可易于制备作为核苷酸使用的其三磷酸盐形式。这些化合物也用作能量储存物，以便它们的降解作用为在细胞中许多不同生物化学过程提供能量。通过从5-磷酸核糖形成5’-单磷酸尿苷(UMP)来进行嘧啶的生物合成。接着UMP转化为5’-三磷酸胞苷(CTP)。所有核苷酸的脱氧形式皆由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步还原反应中制备而产生核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。在磷酸化作用之后，这些分子能够参于DNA的合成。
IV.海藻糖的代谢及用途海藻糖由两个通过α，α-1，1键连接在一起的葡萄糖分子组成。其通常在食品业中用作甜味剂、在干燥或冷冻食品及饮料中作为添加剂。然而，其也用于医药业、化妆品业及生物工程业中(例如参阅Nishimoto等人，(1998)美国专利第5759610号；Singer，M.A.与Lindquist，S.Trends Biotech.16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.与Panek，A.D.Biotech Ann.Rev.2(1996)293-314及Shiosaka，M.J.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖由多种微生物的酶产生且以天然方式释放至周围的介基中，可通过本领域已知的方法将其从中分离。
特别优选的生物合成产物选自有机酸、蛋白质、核苷酸与核苷、蛋白型与非生蛋白氨基酸、类脂类与脂肪酸、二醇、糖类、芳香化合物、维生素与辅因子、酶及蛋白质。
优选的有机酸为酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。
优选的核苷与核苷酸描述于，例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesand related compounds，第561-612页，Biotechnology，第6卷，Rehm等人，编者，VCHWeinheim及其中所出现的参考文献中。
其他优选的生物合成产物是的类脂类、饱和及不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、例如丙二醇及丁二醇的二醇、例如透明质酸及海藻糖的糖类、例如芳香胺、香草醛及靛蓝的芳香化合物、例如Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613页(1996)VCHWeinheim与其中所出现的参考文献及Ong，A.S.，Niki，E.与Packe，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press(1995))中描述的维生素及辅因子、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science 28263-68)及所有其他由Gutcho(1983)描述于Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所出现的参考文献中的化学品。
特别优选的生物合成产物为氨基酸，特别优选必需氨基酸，具体地为L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-苏氨酸、L-高丝氨酸，尤其为L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。例如赖氨酸、甲硫氨酸及苏氨酸的氨基酸在下文的各种情况下均是指氨基酸的L及D型，优选为L型，即例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。
具体地，本发明涉及通过培养与野生型相比，具有至少一种基因的表达速率是提高的或受影响的基因修饰微生物来产生赖氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，该内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的表达单元调节微生物中的基因的表达，其中这些等基因相对于这些表达单元而言是异源的，且其中这些基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysR1的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
就上述方法而言，以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的本发明的表达单元进行的微生物中这些基因表达的调节是通过以下方式实现dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元的控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
用于制备赖氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysR1的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。
用于制备赖氨酸的上述方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，该活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。
可用(但不是必需)具有启动子活性的本发明的核酸和/或本发明的表达单元引起上述这些额外增加或降低的活性中的至少一种。
本发明进一步涉及通过培养与野生型相比，具有至少一种基因的表达速率已提高的或受影响的基因修饰微生物来产生甲硫氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，该内源表达单元可调节内源基因的表达，或dh)以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中基因的表达，其中这些基因相对于这些表达单元而言是异源的，且其中这些基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ合酶的核酸、编码胱硫醚β裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I活性的核酸、编码半胱氨酸合酶II活性的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。
就上述方法而言，以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的本发明的表达单元进行的微生物中这些基因表达的调节是通过以下方式实现dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元的控制下进行这些内源基因中的一种或多种的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
用于制备甲硫氨酸的上述方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性。
上述用于制备甲硫氨酸的方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，该活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
可用(但不是必需)具有启动子活性的本发明的核酸和/或本发明的表达单元引起上述这些额外增加或降低的活性中的至少一种。
本发明进一步涉及通过培养与野生型相比，具有至少一种基因的表达速率已提高或影响的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中ch)与野生型相比，至少一种本发明的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，该内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中基因的表达，其中这些基因相对于这些表达单元而言是异源的，且其中这些基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
就上述方法而言，以本发明的表达单元，或以具有实施方案ch)所述的增加的特异表达活性的本发明的表达单元调节微生物中这些基因的表达通过以下方式实现dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元的控制下进行这些内源基因中一种或多种的表达，或dh2)将这些基因中的一种或多种导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的内源表达单元的控制下进行一种或多种导入基因的表达，或
dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的本发明的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
上述用于制备苏氨酸的方法的另一个优选实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，该活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。
上述用于制备苏氨酸的方法的另一个特别优选的实施方案包含基因修饰微生物，其与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，该活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
可用(但不是必需)具有启动子活性的本发明的核酸和/或本发明的表达单元引起上述这些额外增加或降低的活性中的至少一种。
术语蛋白质的“活性”在酶的情况下是指对应蛋白质的酶活性，且在其他蛋白质，如结构蛋白或转运蛋白的情况下是指蛋白质的生理活性。
酶通常能将底物转化为产物，或催化该转化步骤。
因此，酶的“活性”是指在特定时间内由酶转化的底物的量，或所形成的产物的量。
因此，当与野生型相比活性增加时，在特定时间内由酶所转化的底物的量或所形成的产物的量与野生型相比是增加的。
就本文中所述的所有活性而言，“活性”的增加优选达到“野生型活性”的至少5％、进一步优选为“野生型活性”的至少20％、进一步优选为“野生型活性”的至少50％、进一步优选为“野生型活性”的至少100％、更优选为“野生型活性”的至少300％、更进一步优选为“野生型活性”的至少500％、特别优选为“野生型活性”的至少600％。
因此，当与野生型相比活性降低时，在特定时间内由酶转化的底物的量或形成的产物的量与野生型相比是减少的。
降低的活性优选是指微生物中此酶功能性会基于多种细胞生物学机制而部分或基本上完全抑制或阻断。
活性的降低包含酶数量的减少至酶基本上完全没有(即，缺乏对应活性的可检测性或缺乏酶的免疫可检测性)。与野生型相比，微生物中活性优选降低至少5％，进一步优选降低至少20％，进一步优选降低至少50％，进一步优选降低100％。具体地，“降低”也是指对应的活性的完全失去。
通过已知的方法，例如酶分析法可测定基因修饰微生物及野生型中特定酶的活性，且由此测定酶活性的增加或降低。
例如，丙酮酸羧化酶是指表现将丙酮酸转化为草酰乙酸的酶活性的蛋白质。
因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量。
因此，当与野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加时，在特定时间内由丙酮酸羧化酶蛋白转化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量与野生型相比是增加的。
丙酮酸羧化酶活性的这种增加优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少5％、进一步优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少20％、进一步优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少50％、进一步优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少100％、更优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少300％、更进一步优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少500％、特别优选为野生型丙酮酸羧化酶活性的至少600％。
此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指表现将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白质。
因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。
因此，当与野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低时，在特定时间内由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白转化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量与野生型相比是降低的。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶数量的降低至烯醇丙酮酸磷酸羧激酶基本上完全没有(即，缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的可检测性或缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫可检测性)。与野生型相比，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性优选降低至少5％、进一步优选降低至少20％、进一步优选降低至少50％、进一步优选降低100％。具体地，“降低”也是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全失去。
可以多种方式额外增加活性，例如通过在表达及蛋白质水平上关闭抑制调节机制，或通过增加与野生型相比的编码上述蛋白质的核酸的基因表达。
同样地，可以多种方式增加与野生型相比的编码上述蛋白质的核酸的基因表达，例如通过激活物诱导该基因，或如上所述，通过增加启动子活性或增加表达活性或通过将一种或多种基因拷贝导入微生物中。
根据本发明，增加编码蛋白质的核酸的基因表达也是指操纵微生物内在的内源蛋白质的表达。
如上所述，这可通过例如改变启动子和/或基因的表达单元序列来实现。例如，可通过缺失或插入DNA序列来进行这种改变，这种改变导致基因表达速率提高。
如上所述，通过施加外源刺激来改变内源蛋白质的表达是可能的。这可通过特定的生理条件进行，即通过外源物质的使用。
本领域的技术人员可借助于其他不同的方法(单独或组合)来实现基因表达的增加。因此，例如可增加合适基因的拷贝数，或可使启动子及调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。另外，可能通过诱导型启动子在发酵生产过程中增加表达。延长mRNA存在时间的方法可同样增加表达。通过防止酶蛋白的降解同样也可增强酶活性。基因或基因构建物可以不同拷贝数存在于质粒中，或整合到染色体中并扩增。或者，也可通过改变培养基的组成及对培养的管理来达到相关基因的过表达。
本领域的技术人员可尤其在Martin等人(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya与Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))、欧洲专利第0472869号、美国专利第4,601,893号、Schwarzer与Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991))、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、专利申请WO 96/15246、Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))、日本公开的说明书JP-A-10-229891、Jensen与Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996))及众所周知的遗传与分子生物学教科书中发现对此的指导。
此外，除了基因的表达或增强作用，消除有害的副反应对产生生物合成产物，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸是有利的(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，Overproduction ofMicrobial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编者)，Academic Press，London，英国，1982)。
在一个优选实施方案中，通过将至少一种编码对应蛋白质的核酸导入微生物中来增加编码上述蛋白质之一的核酸的基因表达。可在染色体上或染色体外进行核酸导入，即通过增加染色体上的拷贝数和/或增加在宿主微生物中复制的质粒上的基因的拷贝。
核酸的导入(例如，以包含该核酸的表达盒形式)优选在染色体上进行，具体地，通过上述SacB方法进行。
原则上，为了这个目的可能使用任何编码上述蛋白质之一的基因。
在真核来源的包含内含子的基因组核酸序列的情况下，若宿主微生物不能表达对应蛋白质或不能使其表达对应蛋白质，则优选使用已经处理过的核酸序列，例如对应的cDNA。
对应基因的实例列于表1及表2中。
优选通过以下方法中的至少一种降低微生物中的上述活性●导入至少一种用于诱导共抑制的有义核糖核酸序列或确保其表达的表达盒●导入至少一种针对对应基因、RNA或蛋白质的DNA或蛋白质结合因子或确保其表达的表达盒●导入至少一种引起RNA降解的病毒核酸序列或确保其表达的表达盒●导入至少一种产生功能缺失的构建物，所述功能缺失是例如通过在基因中产生插入、缺失、倒置或突变在阅读框内产生例如终止密码子或移位。可能并优选通过同源重组来靶向插入至目的靶基因中，或导入针对靶基因的序列特异性核酸酶来产生敲除突变体。
●导入具有降低的启动子活性的启动子或导入具有降低的表达活性的表达单元。
本领域的技术人员知道在本发明的范畴内还可使用其他方法来降低其活性或功能。例如，导入蛋白质的显性失活变体或确保其表达的表达盒也可是可行的。
此外，这些方法中的每一个均可能引起蛋白质的量、mRNA的量和/或蛋白质的活性降低。也可以想到这些方法的组合使用。其他方法对为本领域的技术人员而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白质的加工、蛋白质或其mRNA的转运、抑制染色体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译延伸或终止。
在用于产生生物合成产物的本发明方法中，优选在培养基因修饰微生物的步骤之后从微生物和/或自发酵肉汤中分离生物合成产物。这些步骤可同时和/或优选在培育步骤之后进行。
可用分批法(分批培育)或补料分批法或重复补料分批法培养本发明的基因修饰微生物，连续或间断地产生生物合成产物，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。已知培育方法的概述可在Chmiel(Bioprozeβtechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科书或Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科书中发现。
待使用的培养基必须以适当地方式满足每个菌株的要求。在“Manualof Methods for General Bacteriology”of the American Society forBacteriology(Washington D.C.，美国，1981)手册中描述了用于各种微生物的培养基。
根据本发明，这些可使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源为例如单糖、二糖或多糖的糖。非常好的碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以例如糖蜜的复合化合物或糖精制的其他副产物将糖置于培养基中。添加各种碳源的混合物也是有益的。其他可能的碳源为油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸；醇，例如甘油、甲醇或乙醇以及有机酸，例如乙酸或乳酸。
氮源通常为有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵的铵盐、硝酸盐、尿素、氨基酸或例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他物质的复合氮源。氮源可单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜及铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
为了产生精细化学品，尤其是甲硫氨酸，可能使用以下物质作为硫源例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物的无机化合物及例如硫醇及某硫醇(thiol)的有机硫化合物。
可能使用以下物质作为磷源磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。
为了使溶液中存在金属离子，可将螯合剂添加到培养基中。尤其适合的螯合剂包含例如儿茶酚或原儿茶酸盐的二羟基酚类(dihydroxyphenol)，或例如柠檬酸的有机酸。
根据本发明，所使用的发酵培养基通常也包含例如维生素或生长促进剂的其他生长因子，其包括，例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸及吡哆醇。生长因子及盐常常来自例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆及其类似物的培养基的复合成份。也可将合适的前体添加至培养基中。培养基中化合物的精确组成很大程度上视具体实验而定，且将由各具体状况分别确定。最优化的培养基的信息获自教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(编者为P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0199635773)。也可从例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸出液，DIFCO)等商业供应商购得生长培养基。
将培养基的所有成分通过加热(1.5巴和121℃下20分钟)或无菌过滤灭菌。可将成分一起灭菌或视需要分开灭菌。所有培养基成分可在培养开始即存在或任选连续或分批加入。
培养物的温度通常在15℃与45℃之间，优选在25℃至40℃，且在实验过程中可保持恒定或变化。培养基的pH值应处于5至8.5的范围内，优选为约7.0。在培养期间可通过添加例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或例如磷酸或硫酸的酸性化合物来控制培养需要的pH值。可通过使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡剂来控制泡沫的形成。可通过向培养基中添加具有选择作用的合适物质，例如抗生素来维持质粒的稳定性。通过向培养基中导入氧或含氧气体混合物(例如周围的空气)来维持需氧条件。培养物的温度通常为20℃至45℃。培养持续进行到目的产物的形成达到最大量。通常在10小时至160小时内达到该目标。
以该方式得到的发酵肉汤的干物质含量通常为7.5至25重量％。
此外，最好至少还在发酵末期进行糖限制(sugar limitation)，但具体地，在超过经发酵时间的至少30％时进行。这是指在这段时间内发酵培养基中可利用的糖浓度保持在0至3g/l或是降低的。
根据目的生物合成产物及该生物合成的副产物的物理/化学特性，以本身已知方式从发酵肉汤和/或微生物中分离生物合成产物。
例如，可接着进一步处理发酵肉汤。视需要而定，可用分离方法(例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合)从发酵肉汤中全部或部分移除生物质或将其全部保留于其中。
接着可用已知方法浓缩发酵肉汤，例如借助于旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜式蒸发器浓缩发酵肉汤通过逆渗透或纳米过滤，。然后通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒或其他方法来处理该浓缩的发酵肉汤。
另外，也可能进一步纯化生物合成产物，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸及L-苏氨酸。基于此目的，在除去生物质之后，使用适合的树脂对含有产物的肉汤进行层析，目的产物或杂质全部或部分地保留于层析树脂上。若需要，则可使用相同或不同层析树脂重复进行这些层析步骤。本领域的技术人员精通于选择适合的层析树脂及其最有效的使用方法。纯化的产物可通过过滤或超滤来浓缩，并保存于产物的稳定性最大的温度下。
生物合成产物可以各种形式得到，例如以其盐或酯的形式。
可用现有技术测定分离的化合物的特性及纯度。这些现有技术包含高效液相层析法(HPLC)、光谱法、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定或微生物测定。这些分析方法概述于Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 11 27-32及Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.1967-70.Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90页、第521-540页、第540-547页、第559-566页、575-581页及第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistryand Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)Applications of HPLC in Biochemistry inLaboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第17卷中。
实施方案现通过以下非限定性实施例更详细地描述本发明实施例1载体p5K1的构建将穿梭载体pMT1(Follettie等人(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)用限制酶XhoI和BamHI消化，随后用Klenow片段处理并重新连接。所得质粒命名为pMT1-del。将载体pMT1-del用限制酶BglII和XbaI消化。该2.5kb片段包含来自谷氨酸棒杆菌的pSR1 ori并且连接到2kbplasposon pTnMod-Okm(Dennis和Zylstra(1998)Appl.Environ.Microbiol.642710-2715)上，其已经同样用BglII和XbaI切割。所得载体命名为pSK1。plasposon pTnMod-Okm的片段具有来自大肠杆菌的pMB1复制起点和卡那霉素抗性标记(Tn903)。按照Innis等人(1990)PCRProtokols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press中描述的标准方法，使用寡核苷酸引物A(SEQ.ID.NO.4)和B(SEQ.ID.NO.5)，使用载体PKK232-8(SEQ.ID.NO.3)作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增没有启动子的cat基因。载体和插入片段用限制酶BglII和KpnI消化后，将该PCR产物连接到载体pSK1上。该质粒命名为pSK1Cat(

图1)。寡核苷酸引物A SEQ.ID.NO.45’-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-3’寡核苷酸引物B SEQ.ID.NO.55’-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-3’
实施例2质粒pSK1 Ptac的构建质粒pKK223-3 SEQ.ID.NO.6包含(Ptac)启动子。该启动子通过用限制酶BamHI消化来分离，并将该片段克隆进入BamHI-线性化的载体pSK1Cat SEQ ID.。该质粒命名为pSK1Ptac(图2)。
实施例3 P2-10(SEQ.ID.NO.1)的克隆使用Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828的方法从晚指数期的细胞分离谷氨酸棒杆菌AS019E12的染色体DNA，并随后用限制酶Sau3AI部分消化。所得片段(大小为0.4-1.0kb)连接到已经用限制酶BamHI线性化的载体pSK1Cat中。通过电穿孔，使用Follettie等人(1993)J.Bacteriol.1754096-4103的方法将连接混合物转化进入谷氨酸棒杆菌AS019E12。将细胞涂布在包含5μg/ml氯霉素的平板上。分离并分析来自生长在这些平板上的单个菌落的质粒。一种此类质粒是pSK1Cat P2-10，其包含启动子P2-10(SEQ.ID.NO.1)。该启动子位于编码糖-磷酸差向异构酶的基因的上游区。插入片段大小为208bp。
4.谷氨酸棒杆菌AS019E12对氯霉素的抗性在30℃下，仅包含质粒pSK1Cat(图1)的谷氨酸棒杆菌细胞不能在5μg/ml氯霉素浓度的MB平板(Follettie等人(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)和MCGC平板(von der Osten等人(1989)Biotechnol.Lett.1111-16)上生长。cat基因不表达。相反，包含质粒pSK1CatPtac(图2)的谷氨酸棒杆菌细胞将在40μg/ml氯霉素浓度的MB和MCGC平板上生长。在大于40μg/ml氯霉素浓度下的生长非常微弱，几乎观察不到。包含质粒pSK1Cat P2-10的细胞能够在大于40μg氯霉素浓度的MB和MCGC平板上生长。
5.大肠杆菌对氯霉素的抗性包含质粒pSK1CatPtac(图2)的大肠杆菌细胞在400μg/ml氯霉素浓度的LB平板(Sambrook等人(1989)Molecular cloning-A laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.)上生长。在600μg/ml氯霉素浓度下的生长不能观察到。包含质粒pSK1CatP2-10的细胞能够在600μg氯霉素浓度的LB平板上生长。
6.通过氯霉素转移酶(CAT)活性测定启动子强度测定谷氨酸棒杆菌AS019E12的CAT活性以便确定启动子P2-10(SEQ.ID.NO.1)的相对强度。为此，按照Jetten和Sinsky(1993)FEMSMicrobiol.Lett.111183-188的方法制备粗提物。通过Shaw等人(1993)Methods Enzymol.43737-755的方法测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性。反应混合物包含100mM Tris*HCl pH 7.5、1mM DTNB、0.1mM乙酰辅酶A、0.25mM氯霉素和合适量的酶。测量在412nm波长下光密度的改变。使用Bradford方法(1976)Anal.Biochem.72248-254分析蛋白质浓度。
结果在下表中显示

图图1显示了pSK1Cat的质粒图(A)和BamHI克隆位点的核苷酸序列(B)。B中的带下划线的序列代表用于产生测序寡核苷酸的区域。指出了起始密码子和BamHI克隆位点。
图2显示了pSK1Ptac的核苷酸序列的部分。启动子Ptac以斜体显示。还指出了cat基因的-35和-10区、RBS和起始密码子。
序列表<110> 巴斯福股份公司(BASF AKTIENGESELLSCHAFT)<120> P2-10表达单元<130> AE 20040551<160> 10<170> PatentIn版本3.1<210> 1<211> 208<212> DNA<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220>
<221> 启动子<222> (1)..(208)<223>
<400> 1agatccgcct cactgtccac ataatctctt atgtgttggg gcgttgttgg tcgcgctgac 60tggaattaat ttacacaccc gcccaacagt ccgcaactgc ccaggtcaag cgctcttctt120accgggccac gcccggcaag aatgcgtggt gaggacgtgg ggcggcgtcg ataagcggaa180atcttgaaat atttaggtgt gatctttt 208<210> 2<211> 420
<212> DNA<213> 谷氨酸棒杆菌<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(420)<223> 表达单元<400> 2agatccgcct cactgtccac ataatctctt atgtgttggg gcgttgttgg tcgcgctgac 60tggaattaat ttacacaccc gcccaacagt ccgcaactgc ccaggtcaag cgctcttctt120accgggccac gcccggcaag aatgcgtggt gaggacgtgg ggcggcgtcg ataagcggaa180atcttgaaat atttaggtgt gatcttttgg ggggaggtat ttaatgatcc taccaatcct240ttagtttcgt ctgtagagcg atgtgtgacg caagttttaa gactctaaac ccacgtcaca300agaaatgagg ggtgctttgt ttactatcac tggttttgca gatgagatcg cacatgatct360cgacgaacag atttccttac ttaataaact gaagaacagc tcgcggaagc taaagccaaa420<210> 3<211> 5094<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(5094)<223> 质粒<400> 3ttcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 60gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg120ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccagggaat180
tcccggggat ccgtcgacct gcagccaagc ttgagtagga caaatccgcc gagcttcgac240gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt300tgatatatcc caatcgcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg360tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa420taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc480ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg540ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga600cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct660ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt720gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt780caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt840tcatcatgcc gtctgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta900ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac960gcctggtgct acgcctgaat aagtgataat aagcggatga atggcagaaa ttcgtcgagg 1020cggcacctcg ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga 1080actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc 1140agccgcacgc ggcgcatctc ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 1200agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 1260cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 1320gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 1380cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 1440aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 1500gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat 1560ggcctttttg cgtttctaca aactcttcct gtcgtcatat ctacaagcca tccccccaca 1620gatacggtaa actagcctcg tttttgcatc aggaaagcag ctgttttggc ggatgagaga 1680agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1740tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1800gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1860caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 1920gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa 1980
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<221> 引物<222> (1)..(27)<223> 引物<400> 4ggaagatctt tcaagaattc ccaggca 27<210> 5<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> 引物<222> (1)..(26)<223> 引物<400> 5ggggtaccta ccgtatctgt gggggg 26<210> 6<211> 4991<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> 质粒<222> (1)..(4991)<223> 质粒<400> 6ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60
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权利要求
1.一种具有启动子活性的核酸在基因转录中的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生的，并在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
2.一种表达单元在基因表达中的用途，所述表达单元包含根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸及额外的功能性连接的核酸序列，所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述表达单元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生的，并在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述表达单元由核酸序列SEQ.ID.NO.2组成。
5.一种具有启动子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.1衍生的，并在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.1杂交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.一种表达单元，其包含根据权利要求5所述的具有启动子活性的核酸及额外的功能性连接的核酸序列，所述核酸序列确保核糖核酸的翻译。
7.根据权利要求6所述的表达单元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通过核苷酸的取代、插入或缺失从序列SEQ.ID.NO.2衍生的，并在核酸水平上与序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在严格条件下与核酸序列SEQ.ID.NO.2杂交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前提条件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.一种与野生型相比，改变或影响微生物中基因转录速率的方法，其通过a)与野生型相比，改变微生物中根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸的特异启动子活性，所述内源核酸调节内源基因的转录，或b)以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因与所述具有启动子活性的核酸是异源的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录通过以下方式达到b1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的转录速率，ah)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因与所述具有启动子活性的核酸是异源的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录通过以下方式达到bh1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的转录速率，ar)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或br)将具有根据实施方案a)所述的降低的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行内源基因的转录。
13.一种与野生型相比，改变或影响微生物中基因表达速率的方法，其通过c)与野生型相比，改变微生物中根据权利要求2或3所述的内源表达单元的特异表达活性，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或d)以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案c)所述的改变的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因与所述表达单元是异源的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因表达通过以下方式达到d1)将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了提高或影响微生物中基因的表达速率，ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dh)以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因表达，其中所述基因与所述表达单元是异源的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因表达通过以下方式达到dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中与野生型相比，为了降低微生物中基因的表达速率，cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的内源表达单元在微生物中的特异表达活性是降低的，所述内源表达单元调节所述内源基因的表达，或dr)将根据实施方案cr)所述的具有降低的特异表达活性的表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的表达活性的表达单元控制下进行内源基因的表达。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中所述基因选自编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，所述基因包含其他调节元件。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述来自氨基酸的生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰-转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
20.一种表达盒，其包含a)至少一种根据权利要求2或3所述的表达单元，及b)至少一种其他待表达核酸，及c)适当条件下其他遗传控制元件，其中至少一种表达单元与其他待表达核酸序列功能性连接在一起，且所述其他待表达核酸序列与所述表达单元是异源的。
21.根据权利要求20所述的表达盒，其中所述其他待表达核酸序列选自编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸。
22.根据权利要求21所述的表达盒，其中所述来自氨基酸的生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰-转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
23.一种表达载体，其包含根据权利要求20至22中任一项所述的表达盒。
24.一种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的转录速率，并取决于a)改变微生物中至少一种根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸的特异启动子活性，所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或b)以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因转录，其中所述基因与所述具有启动子活性的核酸是异源的。
25.根据权利要求24所述的基因修饰微生物，其中以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录通过以下方式达到b1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或b2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种导入基因的转录，或b3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有改变的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
26.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的转录速率，其中ah)与野生型相比，根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是增加的，所述内源核酸调节内源基因的转录，或bh)以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案ah)的增加的特异启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录，其中所述基因与所述具有启动子活性的核酸是异源的。
27.根据权利要求26所述的基因修饰微生物，其中以根据权利要求1所述的具有启动子活性的核酸，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异启动子活性的权利要求1所述的具有启动子活性的核酸来调节微生物中基因的转录通过以下方式达到bh1)将一种或多种根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在导入的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸控制下进行一种或多种内源基因的转录，或bh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的内源核酸控制下进行一种或多种导入基因的转录，或bh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含根据权利要求1所述的具有启动子活性、适当条件下具有增加的特异启动子活性的核酸及功能性连接的一种或多种待转录核酸。
28.根据权利要求24或25所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的转录速率，其中ar)与野生型相比，至少一种根据权利要求1所述的具有启动子活性的内源核酸在微生物中的特异启动子活性是降低的，所述内源核酸调节至少一种内源基因的转录，或br)将一种或多种具有根据实施方案a)所述的降低的启动子活性的核酸导入微生物基因组中，以便在所述导入的具有降低的启动子活性的核酸控制下进行至少一种内源基因的转录。
29.一种基因修饰微生物，其中所述基因修饰导致与野生型相比，改变或影响至少一种基因的表达速率，并取决于c)与野生型相比，改变微生物中根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元的特异表达活性，所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或d)以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因与所述表达单元是异源的。
30.根据权利要求29所述的基因修饰微生物，其中以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的改变的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因表达通过以下方式达到d1)将一种或多种适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在所述导入的适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或d2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在所述适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或d3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有改变的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
31.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有提高或影响的表达速率，其中ch)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的特异表达活性是增加的，所述内源表达单元调节内源基因的表达，或dh)以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因的表达，其中所述基因与所述表达单元是异源的。
32.根据权利要求31的基因修饰微生物，其中以根据权利要求2或3所述的表达单元，或以具有根据实施方案a)所述的增加的特异表达活性的权利要求2或3所述的表达单元来调节微生物中基因的表达通过以下方式达到dh1)将一种或多种适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元控制下进行一种或多种内源基因的表达，或dh2)将一种或多种基因导入微生物基因组中，以便在适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的内源表达单元控制下进行一种或多种导入基因的表达，或dh3)将一种或多种核酸构建物导入微生物中，所述核酸构建物包含适当条件下具有增加的特异表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元及功能性连接的一种或多种待表达核酸。
33.根据权利要求29或30所述的基因修饰微生物，其与野生型相比，至少一种基因具有降低的表达速率，其中cr)与野生型相比，根据权利要求2或3所述的至少一种内源表达单元在微生物中的特异表达活性是降低的，所述内源表达单元调节至少一种内源基因的表达，或dr)将一种或多种具有降低的表达活性的根据权利要求2或3所述的表达单元导入微生物基因组中，以便在导入的具有降低的表达活性的权利要求2或3所述的表达单元控制下进行至少一种基因的表达。
34.一种基因修饰微生物，其包含根据权利要求2或3所述的表达单元及以功能性连接的待表达基因，其中所述基因与所述表达单元是异源的。
35.根据权利要求34所述的基因修饰微生物，其包含根据权利要求20至22中任一项所述的表达盒。
36.根据权利要求24-35中任一项所述的基因修饰微生物，其中所述基因选自编码来自蛋白型与非生蛋白氨基酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自核苷酸与核苷的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自有机酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自类脂类与脂肪酸的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自二醇的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自糖类的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自芳香化合物的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自维生素的生物合成途径的蛋白质的核酸、编码来自辅因子的生物合成途径的蛋白质的核酸及编码来自酶的生物合成途径的蛋白质的核酸，其中如果合适，所述基因包含其他调节元件。
37.根据权利要求36所述的基因修饰微生物，其中所述来自氨基酸的生物合成途径的蛋白质选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸异构酶、转录调节物LuxR、转录调节物LysR1、转录调节物LysR2、苹果酸-醌氧化还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮酶、转醛酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、磷酸丝氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸输出子载体、苏氨酸脱水酶、丙酮酸氧化酶、赖氨酸输出子、生物素连接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰转移酶亚基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶、铁氧还蛋白NADP还原酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、RXA00655调节物、RXN2910调节物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苏氨酸排出蛋白、丝氨酸羟甲基转移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
38.一种通过培养根据权利要求24至37中任一项所述的基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。
39.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备赖氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱氢酶的核酸、编码二氨基庚二酸脱羧酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸合成酶的核酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码转录调节物LuxR的核酸、编码转录调节物LysR1的核酸、编码转录调节物LysR2的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码精氨酰-tRNA合成酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码蛋白质OpcA的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸及编码6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱氢酶活性、二氨基庚二酸脱羧酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、转录调节物LuxR的活性、转录调节物LysR1的活性、转录调节物LysR2的活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、转酮酶活性、转醛酶活性、赖氨酸输出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素连接酶活性。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高丝氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸输出子活性、苏氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性及苏氨酸合酶活性。
42.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备甲硫氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码高丝氨酸脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸、编码胱硫醚γ合酶的核酸、编码胱硫醚β裂合酶的核酸、编码丝氨酸羟甲基转移酶的核酸、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸、编码亚甲基四氢叶酸还原酶的核酸、编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核酸、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的核酸、编码半胱氨酸合酶I的核酸、编码半胱氨酸合酶II的核酸、编码辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶的核酸、编码硫酸腺苷酰转移酶的核酸、编码磷酸腺苷磷酰硫酸还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白NADPH-还原酶的核酸、编码铁氧还蛋白的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的核酸、编码硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的核酸、编码RXA0655调节物的核酸及编码RXN2910调节物的核酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、亚甲基四氢叶酸还原酶活性、磷酸丝氨酸氨基转移酶活性、磷酸丝氨酸磷酸酶活性、丝氨酸乙酰转移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰转移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸还原酶活性、铁氧还蛋白-亚硫酸盐还原酶活性、铁氧还蛋白NADPH-还原酶活性、铁氧还蛋白活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA077的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA248的活性、硫酸盐还原作用的蛋白质RXA247的活性、RXA655调节物的活性及RXN2910调节物的活性。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自高丝氨酸激酶活性、苏氨酸脱水酶活性、苏氨酸合酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
45.一种通过培养根据权利要求24、25、31或32中任一项所述的基因修饰微生物来制备苏氨酸的方法，其中所述基因选自编码天冬氨酸激酶的核酸、编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的核酸、编码3-磷酸甘油酸激酶的核酸、编码丙酮酸羧化酶的核酸、编码丙糖磷酸异构酶的核酸、编码高丝氨酸激酶的核酸、编码苏氨酸合酶的核酸、编码苏氨酸输出子载体的核酸、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸、编码转醛酶的核酸、编码转酮酶的核酸、编码苹果酸-醌氧化还原酶的核酸、编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核酸、编码赖氨酸输出子的核酸、编码生物素连接酶的核酸、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、编码苏氨酸排出蛋白的核酸、编码果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、编码OpcA蛋白质的核酸、编码1-磷酸果糖激酶的核酸、编码6-磷酸果糖激酶的核酸及编码高丝氨酸脱氢酶的核酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有增加的下列活性中的至少一种，所述活性选自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸异构酶活性、苏氨酸合酶活性、苏氨酸输出子载体活性、转醛酶活性、转酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、苹果酸-醌氧化还原酶活性、高丝氨酸激酶活性、生物素连接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、苏氨酸排出蛋白活性、蛋白质OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性及高丝氨酸脱氢酶活性。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述基因修饰微生物与野生型相比，额外具有降低的下列活性中的至少一种，所述活性选自苏氨酸脱水酶活性、高丝氨酸O-乙酰转移酶活性、丝氨酸羟甲基转移酶活性、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氢吡啶二羧酸合成酶活性、二氢吡啶二羧酸还原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、赖氨酸输出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸还原异构酶活性、支链氨基转移酶活性、辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、非辅酶B12依赖型甲硫氨酸合酶活性、二羟基-酸脱水酶活性及二氨基吡啶甲酸脱羧酶活性。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述生物合成产物在培养步骤后和/或培养步骤期间中从培养基中分离，且在适当条件下纯化。
全文摘要
本发明涉及核酸序列用于调节基因转录和表达的用途、新启动子及其表达单元、用于改变或影响基因转录速率和/或表达速率的方法、包含该表达单元的表达盒、具有改变的或受影响的转录速率和/或表达速率的基因修饰微生物及通过培育该基因修饰微生物来制备生物合成产物的方法。
文档编号C12N15/77GK1989247SQ200580024120
公开日2007年6月27日 申请日期2005年7月16日 优先权日2004年7月20日
发明者J-S·崔, W·K·郑, I·K·金, S·H·林, H-S·李 申请人:巴斯福股份公司