专利名称：表达增强的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰以提高它们的表达特性的多肽分子。所述经修饰的多肽分子比它们的对应部分，即未经修饰(在核酸水平上)的多肽分子以更好/更高的产量表达。本发明进一步涉及包含这些多肽的组合物。最后，本发明提供制备前述经修饰的多肽分子的方法。在整个下面的说明书中，如熟练的读者将会理解的，提及(复合的(composite))多肽要被理解为意味着多肽本身和，在合适时，相应的核酸序列。对于(所需的)多肽和表达增强结构域(EED)也同样适用。
在微生物宿主系统中表达重组多肽是生产大量所需多肽的有效途径。当意欲将生产的多肽用作诊断和/或治疗剂时，进一步的修饰表达的多肽通常是必需的。例如，意欲用作诊断剂的多肽可能需要进行修饰从而使它能够结合固体支持物。或者，所述多肽可能需要偶联到试剂中以便让它通过某种成像方法进行成像。意欲施用给患者作为治疗过程一部分的多肽可能需要进行修饰以便调节其体内特性，例如它的药物动力学特性。
重组生产的多肽的衍生化作用最经常通过化学物质(“衍生化作用部分”)与包含在多肽内的一个或多个氨基酸的反应性侧基团之间的化学反应来实现。结果是衍生化作用部分共价偶联到多肽上，其中这种偶联的定位和化合价由多肽内反应性氨基酸的各自位置和数目所决定。这意味着在具有多个反应性氨基酸的多肽中，衍生化作用部分与多肽的化学偶联将在整个多肽的位置上，对应于反应性氨基酸的位置发生多次。
为了一些目的，衍生化作用部分与多肽的这种多价的，位点非特异性偶联可能是需要的，但更多时间是不需要的。例如，在诊断过程中，精确量化测量以便将每个多肽分子的衍生化作用数目限制为一个可能是重要的。类似地，多肽在体内的成功治疗性应用可能依医师准确预测和控制这种多肽的生物学活性的能力而定，能够理解在这种情况下缘自所用多肽的非控制性的和位点非特异性的衍生化作用的变异可能与希望的治疗过程不相一致。此外，治疗性或诊断性多肽与衍生化作用部分的位点非特异性偶联可导致多肽的所需活性的损害。这可以是例如这样的情况，当单链抗体多肽以位点非特异性的方式进行衍生化从而在空间上和或静电上防止抗原结合位点结合抗原或减弱其结合活性。在这种情况下，可以消除或至少减弱单链抗体的预期治疗或诊断作用。
那么，经常需要工程设计重组多肽从而使得只在预定位置上，或只在多肽分子中的一个预定位置上的衍生化作用成为可能。偶联的化合价(valency)可以通过控制多肽中的反应性氨基酸的数目来改变，并且所需的多肽活性和/或化学特性可以通过计划这些偶联的位置进行调节，而不会物理损害多肽与环境中其它分子的相互作用。
在这方面已经被证明有用的一种氨基酸是半胱氨酸。因为它通过形成二硫键在稳定蛋白质结构中的重要性，半胱氨酸正常情况下只出现在多肽中指定的位置上。通过将单个半胱氨酸并入对于所需多肽活性非直接必需的多肽“温和”(benign)区，就可以利用半胱氨酸的反应性硫醇基(thiol)(即巯基(sulfhydryl))侧链作为所需衍生化作用的天然锚定点，而不会，或不会显著影响所需的多肽活性(Volkel T.，等人(2004)Biochim Biophys Acta1663，158-66)。
不过，为了衍生化作用的目的而将另外的半胱氨酸残基并入多肽中必然会有某些缺点。通常，为了结构稳定的目的，所需的多肽在其氨基酸序列中将已然具有半胱氨酸残基。在这种情况下为了用衍生化作用部分对该多肽进行衍生的目的而并入的其它半胱氨酸可以与已经存在的半胱氨酸一起形成不需要的二硫键，严重扰乱对于所需活性所必需的多肽结构。
即使所需的多肽本身在其氨基酸序列中并不包含任何半胱氨酸残基，并入单一半胱氨酸残基仍然能够带来问题。在宿主生物中表达后，包含工程化设计半胱氨酸氨基酸残基的多肽能够通过各自多肽中两个半胱氨酸残基的巯基(即sulfhydryl)之间的分子间二硫键彼此形成多肽二聚体(AlbrechtH.，等人(2004)Bioconjug Chem 15，16-26；Olafsen T.，等人(2004)Protein EngDes Sel 17，21-7)。当使用原核表达系统来生产多肽时这种危险特别大。这是因为在这些系统中，蛋白质逐渐运输到微生物宿主的周质间隙，在那里氧化性条件占优势。尽管这种氧化性条件是在初生多肽链中形成所需结构稳定性二硫键所必需的，它们还促进形成游离半胱氨酸残基之间的不希望的分子间二硫键，所述游离半胱氨酸残基意欲分别作为两种多肽中以后的衍生化作用点。
上面的问题并不限于在原核生物中的表达。在Luo等人(1997)JBiochem 121，831-4中，描述了这样的实验，其根据scFv多肽是否包含一个或两个C-末端半胱氨酸残基比较了酵母表达单体和二聚体(即通过分子间二硫键连接的)scFv多肽的量。据发现具有单一C-末端半胱氨酸残基的scFv更有可能以二聚体形式存在，而具有两个C-末端半胱氨酸残基的scFv更有可能以单体形式存在。由此出版物还显而易见的是表达多肽的总量保持大约相同，而不论同工型(isoform)分布情况如何。另外，据揭示具有两个半胱氨酸残基的构建体(其显示形成分子内二硫键的倾向)只显示微弱的结合活性。
特别是当意欲将表达多肽用于治疗性用途时，由于产物同质性(homogeneity)的原因生产单体而非二聚体同工型通常是重要的。那么，由上述Luo等人的出版物具体表达的现有技术，为对于表达可在半胱氨酸上衍生的单体多肽感兴趣的研究者提供了某些工具以实现这一结果。不过，现有技术并未提供适于以可接受的量表达(单体)同工型的工具，所述同工型具有可接受的结合活性。因而，本发明的目标是发展一种允许高产表达展示可接受的结合活性的相应多肽的DNA构建体，其中所述多肽主要作为单体多肽获得。
如权利要求书中所定义的，本发明人已经通过提供编码根据本发明的所谓复合多肽(composite polypeptide)的核酸而解决了这一目的。所述核酸，如果适当表达的话，提供复合多肽，所述复合多肽包含所需的多肽和表达增强结构域(″EED″)，所述EED分别包含第一和第二半胱氨酸氨基酸残基Cys1和Cys2，Cys1比Cys2定位更接近重组多肽分子的N-末端，其中Cys1和Cys2通过多肽接头分隔，所述接头·不含半胱氨酸和脯氨酸；·定义了足以允许Cys1和Cys2彼此形成分子内二硫键的长度；并且·具有柔韧的(flexible)多肽构象，其在含水溶液(aqueous solution)中基本上无二级多肽结构，其中Cys1和Cys2的至少一个用衍生化作用部分进行衍生化。
通过将并非一个而是两个半胱氨酸残基Cys1和Cys2并入EED并且通过调整长度和指定配置于其间的多肽接头序列的性质来促进Cys1和Cys2之间分子内二硫键的形成，这样的二硫键形成，使得Cys1和Cys2不能参与如上所述不利的分子间或分子内二硫键。在一种意义上，Cys1和Cys2中的每一个都变成彼此的保护基团。当分子内二硫环已经在Cys1和Cys2之间形成时，Cys2可以被视为Cys1的衍生部分。相反地，Cys1可以被视为Cys2的衍生部分。
已经在核酸水平上进行过工程化设计以包含如上所述的两个半胱氨酸残基的复合多肽具有这样的优点，即它们具有化学锚定点用于后面的(即表达和分离后)衍生化作用。同时，形成不利的分子间二硫键的危险大大减小，因为在这种情况下这种危险将主要缘自存在于所需多肽中用于多肽结构的(所需)二硫稳定作用的其它半胱氨酸残基。这种二硫键正常情况下在氧化性环境中在翻译过程中和/或翻译后随着初生多肽逐渐生长而形成。由此，稳定多肽结构所需的半胱氨酸的任何游离巯基在正常情况下都相对快速地发现其二硫伴侣并且因而阻抑了其它不希望的反应。并入长度，化学和空间特性优化的接头以允许Cys1和Cys2形成共有二硫键确保了Cys1和Cys2将只与彼此反应并且不会与多肽中空间上远离的半胱氨酸残基反应，所述空间上远离的半胱氨酸残基是多肽结构的稳定所必需的，但其尚未与预期的对应半胱氨酸残基反应。简言之，该接头确保了Cys1和Cys2将比Cys1或Cys2与多肽中任一个其它的半胱氨酸残基更近。
一旦表达和分离后，这种在Cys1和Cys2之间展示二硫键的复合多肽可以暴露于足以(只)打开Cys1和Cys2之间的二硫键的还原性条件。此后，可以用衍生化作用部分而非各自的其它(the respective other)Cys1或Cys2进行Cys1和/或Cys2的衍生化作用。
除了获得衍生多肽(其可以在分离后再次衍生)的优点，没有上述缺点之外，还令人吃惊地发现被工程化设计来包含EED的多肽(即，在本发明意义之内的复合多肽)，与不含EED的多肽相比，显示出较高水平的由其相应核酸的整体表达。尽管可以预期根据本发明的复合多肽比不含EED的多肽导致较少的不利(unwanted)二聚体，但基于现有技术的教导(例如，上面引用的Luo等人的出版物)完全无法预期通过并入根据本发明的EED将会提高具有可接受结合活性的完整多肽的整体表达。那么，与不含EED的所需多肽相比，本发明的复合多肽能够以整体较高的产量进行生产，其中相对于二聚体复合多肽的单体复合多肽的比率，相对于缺失EED的所需多肽的生产中的见到的比率，得以提高。以此方式，单体多肽不仅超越了二聚体多肽，而且多肽的整体较高量也导致更多的(5倍以上)单体多肽，其随后能够根据需要进行衍生化。
不受理论所束缚，本发明人相信观察到的总的表达多肽的令人吃惊的提高至少部分归因于EED内Cys1和Cys2与彼此形成二硫键的倾向。为了解释为什么据信是这样，考虑在不含如上所定义的EED的两个相同多肽的随后表达期间发生了什么是有所帮助的。为上前述讨论的目的，这些相同多肽将称为PP1和PP2，每一种都包含相同的所需多肽及其只具有一个半胱氨酸残基的部分C-末端(即PP1或PP2都不包含如上所定义的EED)。那么，描述符1和2并不表示不同的多肽同一性，而是相同多肽表达的时间顺序。
考虑到既然PP1在PP2之前表达，它(PP1)将以N-->C的方向逐渐运输到氧化性细胞环境中，意味着所需多肽的氨基末端将是暴露于(emerge)所述氧化性环境中的第一端。以此方式暴露，将参与结构稳定二硫键的所需多肽内的半胱氨酸残基只需要等待其伴侣半胱氨酸残基，后者定位更接近所需多肽的C-末端以暴露于氧化性环境中形成所述二硫键。这一过程随着所需多肽持续暴露而继续，直到在所需多肽内形成了结构稳定所必需的所有二硫键。一旦PP1的所需多肽组分完全暴露(并且正确折叠)，只具有一个半胱氨酸残基的P1的C-末端部分暴露出来。不过在这里，不存在这一单一半胱氨酸可以与之反应形成二硫键的伴侣半胱氨酸，从而这一单一半胱氨酸保持未配对。一旦释放出完成的PP1，那么，所需的PP1的多肽部分得以正确折叠并且二硫稳定化，分子的C末端具有一个带有反应性巯基的半胱氨酸残基。
考虑到既然PP2开始表达入完整的PP1残基存在的相同环境中，PP2的N-末端将首先暴露出来。在PP2的所需多肽部分内的第一个半胱氨酸残基暴露出来但尚不能形成预期的结构稳定性二硫键，因为它的在PP2的所需多肽部分内的半胱氨酸反应伴侣尚未暴露出来。不过，在PP2的所需多肽部分内单一的，未配对的半胱氨酸残基可以与已经完成的PP1的C末端部分中的单一的，未配对的半胱氨酸残基反应。以此方式，在PP2的所需多肽部分内的第一个半胱氨酸残基与PP1的C末端部分中的未配对半胱氨酸残基之间形成了不利的二硫键。在这种情况下，在PP2的所需多肽部分内的第二个半胱氨酸残基将会与PP2的C末端部分中的未配对半胱氨酸残基，或，在PP2的所需多肽部分内的另一个半胱氨酸残基反应。在二种方式中，得到的二硫键的排列将会极有可能导致不适当组配的多肽复合物缺乏，或基本上缺乏所需多肽的生物学活性。
这种不适当组配的多肽有可能被细胞内蛋白酶所识别和降解，因而减少获得的总的多肽量。当这种不适当组配的多肽未以此方式活跃降解时，它有可能与其它这种类型的畸形多肽一起积聚，并且将会在标准的多肽分离过程中由适当组配的多肽中去除。在任何情况下，以此方式不适当组配的多肽将趋于降低在标准多肽分离过程中最终获得的适当组配的多肽的量。
相反地，根据本发明的复合多肽不仅在EED中包含两个半胱氨酸残基(Cys1和Cys2)，还包含排列于其之间的接头，所述接头已经优化以促进Cys1和Cys2之间的二硫键形成。根据上面有关PP1和PP2的思考，并且假定PP1和PP2既然是根据本发明的复合多肽(即它们每个都包含EED)，显然在各个EEDs中的Cys1或Cys2都会不会保持未配对状态，因为在各自EED中的Cys1和Cys2将彼此形成二硫键。避免不适当组配的多肽，从而具有这样的效应，即产物不被细胞内蛋白酶所降解和/或不形成积聚物。作为结果，表达和分离的复合多肽的量得以大大提高。
那么，总之，根据本发明的复合多肽的表达导致多肽的单体二聚体比率的提高。同时，获得的全部多肽的水平-不论多肽的同工型如何-相对于缺少如上所定义的EED的多肽也得以提高。净结果是与缺少如上所定义的EED的比较性所需多肽的观察结果相比，用包含如上所述的EED的复合多肽获得了极小量的二聚和/或多聚体多肽和极大量的单体多肽。
在本发明的意义内，″N-末端″和″C-末端″将根据生物化学中的确定惯例来理解多肽的N-末端是以氨基结束的多肽链的末端，而多肽的C-末端是以羧基结束的多肽链的末端。Cys1比Cys2的位置更接近多肽链末端的事实确定了Cys1和Cys2相对于彼此在多肽链内的方位。由此，也确定了其中包含Cys1和Cys2的EED的方位(orientation)。
在本发明的这个实施方案的意义中，具有“柔韧的多肽构象”的多肽接头是在多肽链内的每个共价键上具有足够的转动自由度以使得该多肽接头在三维空间内其可以呈现的构象中很大程度上不受限制，即只被其长所限。由此，设想在三维空间的假想点上于一端锚定并且用对应于完全伸展的多肽接头的长度的半径来定义此点周围的范围，如果多肽接头具有″柔韧的多肽构象″，在相同情况下这一多肽接头的远端(即游离的，未锚定端)必定能够接触位于所述范围之上或之内的三维空间的任意点。这种模型给出了这样的推论，即这种具有“柔韧的多肽构象”的多肽接头也必定“基本上不含二级多肽结构”，例如，不含α-螺旋或β-折叠的伸展。接近多肽二级结构基序的多肽接头的任何倾向都将必然会限制接头游离端所享有的空间自由度，由此相对于它能够在上面定义的范围之间达到的点而限制这一端。这种柔韧性有助于接头向后折拢其自身(double back on itself)的能力，由此允许Cys1和Cys2形成分子内二硫键。
根据需要，比如，如果要将脯氨酸残基存在于接头序列中(已知脯氨酸中受到限制的环引发多肽主链中的纽结)，可以将不需要的二级结构排列整齐(如上述α-螺旋和β-折叠的情况)或可以将其打乱。不受理论所束缚，本发明人相信Cys1和Cys2之间接头的固有柔韧性是确保在这两个半胱氨酸残基之间形成二硫键的主要决定因素，并且有效的二硫键形成与观察到的整体多肽表达的明显增强相联系(见如上给出的原因)。为此避免在接头序列中包括氨基酸如脯氨酸是重要的，因为这种并入限制接头的自由运动，而所述自由运动是允许Cys1和Cys2迁移入彼此邻近从而形成所需二硫键所必需的。在根据本发明的接头中允许的氨基酸残基包含，但不限于，Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Met，Tyr，Asn，Gln。
在本发明的意义中，术语″衍生的″要被理解为描述这样一种情形，其中氨基酸残基Cys1和Cys2的一种或两种已经与″衍生化作用部分″反应。衍生化作用部分可以例如为包含顺丁烯二酰亚胺(maleimide)基团的化合物，例如包含顺丁烯二酰亚胺基团的PEG分子。在这种特定的示例性，非限制性情况下，得到的衍生的Cys1和/或Cys2将已经通过共价S-C键用PEG分子进行了衍生，所述S-C键源自Cys1和/或Cys2中的硫原子的亲核攻击，所述Cys1和/或Cys2一个不饱和碳原子在顺丁烯二酰亚胺环内。作为另一个例子，″衍生化作用部分″还可以是分子，其自身包含巯基，从而得到的衍生的Cys1和/或Cys2将已经通过共价S-S，即二硫键用这种分子进行了衍生。在″衍生的″意义之内，Cys1和/或Cys2能够与在相同或另一个多肽链中的另一个半胱氨酸残基反应。具体地，在如上所述的Cys1和Cys2之间形成所需的分子内二硫键要被理解为落入本发明的″衍生的″范围之内；在此情况下，Cys1将已经被Cys2所衍生化，反之亦然。通常，随后，由Cys1的观点来看，″衍生的″覆盖了所有这样的情形，其中Cys1参与了与其自身之外的物类(例如与Cys2)的共价化学反应。同样地″衍生的″还覆盖了所有这样的情形，其中Cys2参与了与其自身之外的物类(例如与Cys1)的共价化学反应。
根据本发明优选的实施方案，接头中至少75％的氨基酸残基选自Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Met，Tyr，Asn，和Gln。
最优选的是Gly，Ser，Ala和Thr。这些氨基酸不带电荷，能够良好地或相当好地溶于水，或二者兼有。
根据本发明优选的实施方案，所述复合多肽是单链多肽，意即所有的氨基酸都存在于单一的肽接合多肽链中。这种实施方案具有这样的优点，即可以非常有效地实现所需单链多肽产物的生产，因为适当的产物构象将只依赖于必需的二级和三级多肽结构的确立；当表达的复合多肽是单链复合多肽时，四级多肽结构，其中分离的多肽显示某种分子间三级结构关联，不需要进行考虑。
根据本发明的又一个实施方案，EED可以定位在复合多肽的C-末端或N-末端。每种定位都必然会有本文上述的预期优点，特别是观察到表达复合多肽总量的提高。C-末端定位的EED将最后表达，即在所需的多肽之后，作用是在所需多肽内的任何必需的二硫键都将会在EED的翻译之前有必需的时间来形成用于蛋白质稳定。这意味着当EED完全翻译时，在EED内Cys1和Cys2之间所需的二硫键将是最后形成的二硫键，并且所需多肽的结构将已经被任意内部二硫键所稳定化。所以在复合多肽的EED部分中的Cys1或Cys2与所需多肽内的另一个半胱氨酸残基之间形成不需要的二硫键的危险是最小的。
将EED定位在复合多肽的N-末端具有这样的效应，即编码EED的核酸将在编码所需多肽的核酸之前得以翻译。这意味着在EED内Cys1和Cys2之间的二硫键有可能在所需多肽内的任何其它半胱氨酸残基翻译之前而形成。这里再一次地，在复合多肽的EED部分中的Cys1或Cys2与所需多肽内的半胱氨酸残基之间形成不需要的二硫键的危险是最小的。
所以通过考虑衍生化作用部分要在何处结合到EED上将最不可能扰乱所需多肽的生物学活性，可以决定EED定位在复合多肽的N-末端或C-末端上。以此方式，达到了高度的实验柔韧性；实验者有余地选择EED的定位，其将允许在最终的衍生复合多肽中所需多肽的最高活性，而不必牺牲存在EED所赋予的好处，这些好处在上面已经进行了解释。
根据本发明优选的实施方案，复合多肽的EED是这种形式-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m，其中n是从2到20的任意整数；m是0(零)或1；而其中Xaa在每个位置上都被允许是任意天然发生的氨基酸，其中优选至少75％，还要更优选至少80或90％的Xaa残基选自Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Met，Tyr，Asn，和Gln。在优选的实施方案中，所有Xaa都是Gly，Ser，Ala，或Thr。通过让变量n从2，优选3，变化到20，在Cys1和Cys2之间的接头保持足够短以促进Cys1和Cys2之间二硫键的形成，还足够长以允许接头在自身上折回来这样做。已经发现4-5的接头长度特别有效地促进Cys 1和Cys2之间的二硫键，为此目的特别优选4个氨基酸的接头长度。在本段上面列出的氨基酸中，已经发现Gly和Ser，单独或混合，特别适于此目的。不受理论所束缚，本发明人相信这归因于这样的事实，即Gly是化学中性的并且是小的，由此减弱了接头参与不需要要的化学反应的倾向，同时保持最大程度的不受阻碍的空间柔韧性。据信氨基酸Ser通过其羟基赋予足够的亲水性测量，其可以有助于防止太过疏水的接头与所需多肽的疏水区发生不需要的疏水相互作用。应当注意在EED位于复合多肽N-末端的情况下，m为0(零)是有利的。
本发明的本实施方案还允许Pro残基在Cys2的C末端肽键合到后者上，尽管Pro的存在并非必需(即变量m还可以等于零)。已经发现提供Pro在一些情况下进一步提高复合多肽的表达产量。不受理论所束缚，本发明人相信这归因于脯氨酸抑制蛋白酶从复合多肽的C末端降低后者的能力。
在本发明的特别优选的实施方案中，n＝4并且(Xaa)4为(Gly)4，(Gly)3Ser，(Gly)2SerGly，GlySer(Gly)2或Gly(Ser)3。在本发明另一个特别优选的实施方案中，n＝5而(Xaa)5为(Gly)5，(Gly)4Ser，(Gly)3SerGly，(Gly)2Ser(Gly)2，GlySer(Gly)3或Ser(Gly)4。上面已经讨论了在EED的接头中单独或一起使用Gly和Ser的优点。如上所述，发现总共4个氨基酸的接头长度导致在Cys1和Cys2之间的二硫肽环的最有效的形成。
在本发明的其它实施方案中，EED的形式为(His)j-Cysl-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m或Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)j-(Pro)m，其中j是从2到15的任意整数，并且其中Xaa，n和m如上定义。多-His序列(″His-标签″)并入EED Cys1的N-侧或Cys2的C-侧有几个优点。第一，如本领域所已知的(Porath，J.，等人(1975)Nature 258，598-9；Sulkowski，E.(1985)Trends in Biotech 3，1-12)，His-标签可以在通过固定镍柱分离表达的多肽中以及在多肽的随后检测中成为宝贵的工具。但是也许对于本发明的复合多肽来说更有利的是His-标签对于在Cys1和Cys2之间形成二硫键的特定作用，和由此对于在获得的复合多肽总量的特定作用。当EED位于所需多肽的C-末端，所述多肽具有Cys1的His-标签N-末端时；或者当EED位于所需多肽的N-末端，所述多肽具有Cys2的His-标签C-末端时，这种作用特别显著-在每种情况中His-标签都位于EED和所需多肽的界面。不受理论所束缚，本发明人相信这种特定作用可以如下进行解释组氨酸一般具有阳性电荷，于是在重复性组氨酸基序中的个别组氨酸残基趋于彼此静电排斥，导致在组氨酸残基区域的多肽链延展。通过将这种组氨酸基序在所需多肽和EED之间的界面上放入EED中，复合多肽的这两种组分就会如His-标签长度所允许的而尽可能彼此伸展远离。这具有以下效应，减小了一方面包含Cys1和Cys2的EED的部分，与另一方面所需多肽之间的不需要的相互作用。同时，通过将EED与所需多肽物理分离，提高了Cys1和Cys2彼此形成二硫键的可能性。这是因为在此情况下Cys1和Cys2存在于和初生复合多肽其余部分或多或少的物理分离中；当不存在任何其它与Cys1或Cys2竞争形成二硫键的巯基时，二硫键更有可能在Cys1和Cys2上各自巯基之间以所需方式来形成。
在本发明的特别优选的实施方案中，j＝6，即EED的形式为(His)6-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m或Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)6-(Pro)m，其中Xaa，n和m如上定义。
根据本发明的又一个实施方案，衍生的Cys1和/或Cys2 Cys1和/或Cys2残基与衍生化作用部分的反应产物，所述衍生化作用部分包含，例如，顺丁烯二酰亚胺基，巯基，或吡淀二硫基。所有这些化学基团都与巯基共价反应。本发明的这一实施方案的优点是大部分对用于衍生复合多肽重要的衍生化作用部分都可以与以上基团的其中一种官能化的形式而获得。由此，本发明的复合多肽可以用许多各种试剂进行衍生化用于各种治疗性和/或诊断性目的。在上述基团中，特别优选顺丁烯二酰亚胺基团。顺丁烯二酰亚胺基团在温和(mild)反应条件下与巯基几乎完全反应，所述温和反应条件将不太能损害复合多肽中的所需多肽，并且导致半胱氨酸的硫原子和顺丁烯二酰亚胺基环中的两个不饱和碳原子之一之间的强共价化学键。
在本发明的特别优选的实施方案中，包含顺丁烯二酰亚胺的衍生化作用部分选自PEG-顺丁烯二酰亚胺(″PEG-MAL″)，顺丁烯二酰亚胺-官能化的荧光标记，顺丁烯二酰亚胺-官能化的测试检测标记，顺丁烯二酰亚胺-官能化的(funcrionalized)放射性示踪剂，顺丁烯二酰亚胺-官能化的蛋白质交联剂，顺丁烯二酰亚胺-官能化的化疗剂或顺丁烯二酰亚胺-官能化的毒剂，例如顺丁烯二酰亚胺-官能化的免疫毒素。PEG-MAL的合适的例子是甲氧基PEG-MAL5kD；甲氧基PEG-MAL20kD；甲氧基(PEG)2-MAL40kD；甲氧基PEG(MAL)25kD；甲氧基PEG(MAL)220kD；甲氧基PEG(MAL)240kD；或其任意组合。任何这些试剂都可以用作衍生化作用部分以赋予PEG化作用已知的优点，包括增加本发明的复合多肽的血清半寿期和减弱免疫原性。合适的顺丁烯二酰亚胺-官能化的荧光标记的例子是生物素-顺丁烯二酰亚胺和地高辛-顺丁烯二酰亚胺。合适的顺丁烯二酰亚胺-官能化的放射性示踪剂的例子是DTPA-顺丁烯二酰亚胺。合适的顺丁烯二酰亚胺-官能化的交联剂的例子是N-羟基琥铂酰亚胺基(hydroxylsuccinimidyl)-顺丁烯二酰亚胺交联物，它通过其N-羟基琥铂酰亚胺基部分与另一种待偶联的化学物类反应，并且通过其顺丁烯二酰亚胺部分与本发明的复合多肽上Cys1和Cys2中的至少一个反应。可以有利地使用交联物来通过其N-羟基琥铂酰亚胺基部分影响，例如本发明的复合多肽的糖基化作用，硅烷化作用或pectinylation。
根据本发明的又一个实施方案，用包含巯基基团的衍生化作用部分来对Cys1和/或Cys2进行衍生化，特别是其中所述衍生化作用部分是通过二硫键偶联到Cys1上的Cys2。上面讨论了Cys1与Cys2形成二硫键的情形。Cys1或Cys2与包含巯基基团的衍生化作用部分的衍生化作用的又一例子是当衍生化作用部分是除了本发明的复合多肽的多肽或蛋白质时，衍生化作用通过在，一方面，本发明的复合多肽的Cys1和/或Cys2之间形成二硫键，和在另一方面，与其它多肽或蛋白质的Cys残基形成二硫键来完成。包含巯基基团的衍生化作用部分的又一可能性是包含5-硫代-2-硝基苯甲酸(“TNB-thiol(硫醇基)”)基团的衍生化作用部分。
根据本发明的又一个实施方案，Cys1和Cys2都用衍生化作用部分(derivatization moieties)进行衍生化。这导致每个本发明的复合多肽分子具有两个衍生化作用部分。当衍生化欲用作成像(imaging)试剂的复合多肽时这种衍生化作用可能特别有利。这是因为每个复合多肽的双衍生化作用将导致比使用每分子仅用一个衍生化作用部分衍生化的复合多肽强两倍的成像信号。在意欲将复合多肽用作治疗剂的某些情况下，每个复合多肽的双衍生化作用也被设想为是有利的。例如，如果希望在治疗性给药之前将复合多肽PEG化并且由于PEG的40kD而希望一种总分子量，可以证明在Cys1和Cys2上分别用两个20kD PEG-MAL的分子衍生化复合多肽比只在Cys1或Cys2上一个40kD PEG-MAL的分子衍生化更有利。一般，可以通过将本发明的复合多肽与摩尔数过量的衍生化作用部分反应来完成在Cys1和Cys2每一个上的衍生化作用。
根据又一个实施方案，Cys1或Cys2用第一衍生化作用部分进行衍生化，而各自另外的Cys2和Cys1，分别周第二衍生化作用部分进行衍生化，其中所述第二衍生化作用除了封闭(block)/保护它结合的Cys残基之外不显示任何功能性。与上述情形相反，有时只将本发明的复合多肽衍生一次可能是有利的或必需的，例如，当在复合多肽内的所需多肽的生物学活性与测量的信号之间需要1∶1的相关性的情况下使用复合多肽作为诊断性试剂之时。可以设想类似的情形，其中，比方说，只在一个位置上PEG化本发明的复合多肽将会是需要的或必需的。在这些情况中，可以将复合多肽有利地中温和还原性条件下进行温育，所述温和还原条件足以还原存在于Cys1和Cys2之间的二硫键，但并不还原存在于所需多肽的整个结构中的任何其它二硫键以稳定后者的结构。这种在温和条件下的选择性还原一般将是可能的，因为涉及多肽结构稳定的二硫键正常情况下将隐藏在这种多肽结构之内并且因此难以被溶液中的还原剂所接近，而更加暴露的，C-末端EED通常将更加易于接近。在EED内的二硫键打开之后，本发明的复合多肽随后能够与所需的第一衍生化作用部分反应从而使得第一衍生化作用部分的摩尔量等于或略小于本发明复合多肽的摩尔量。根据所用的第一衍生化作用部分精确化学计量调节这一比率可能是必需的，但这种调节都在熟练操作人员技术的范围之内。
在Cys1或Cys2与第一衍生化作用部分的反应之后，可以通过标准技术分离单次衍生的复合多肽并且有利地进行与第二衍生化作用部分进一步的反应。第二衍生化作用部分的功能是去活EED内未衍生化的其余游离巯基。为了确保与第二衍生化作用部分的反应有效，这一反应应当有利地在摩尔数过量的第二衍生化作用部分对复合多肽中进行。在此意义上，第二衍生化作用部分可以是任何将与EED内其余游离半胱氨酸残基共价反应的部分，并且可以采用上面在第一衍生化作用部分的内容中提到的任何偶联化学(coupling chemistries)。由于第二衍生化作用部分的功能仅仅是使得EED内其余游离半胱氨酸残基永远不能反应(unreactive)，所以第二衍生化作用部分不应当干扰所需多肽或连接EED中其余半胱氨酸残基的第一衍生化作用部分的预期活性。为此，第二衍生化作用部分应当在化学上和静电上惰性的并且尽可能小。特别优选的第二衍生化作用部分是乙基-顺丁烯二酰亚胺。这种第二衍生化作用部分将与EED中其余半胱氨酸残基的游离巯基反应来以上面已经描述的形式形成共价C-S键。
根据本发明的又一个实施方案，所需的多肽可以是任何希望足够表达的多肽。这包括各种大小(即分子量)的所有蛋白质和多肽分子，而不管等电点，一级氨基酸序列或所需的翻译后修饰如例如糖基化作用或磷酸化作用。所需的多肽可以有利地为受体，配体或结合分子。它可以在原核生物或在真核生物中表达，并且其自身可以是天然或重组来源的。
根据本发明的特别优选的实施方案，所需的多肽具有多肽结构稳定所需的平均半胱氨酸残基数目。这在正常情况下将是重要的，特别是当所需的多肽是单链多肽(即在表达后将不与任何其它多肽链相互作用来形成多链多肽产物)时，因为稳定多肽结构所需的每个二硫键都需要存在两个半胱氨酸残基。
根据本发明的特别优选的实施方案，所需的多肽是抗体形式的结合分子。包括在本发明这一实施方案中的“抗体”的意义之内的是单链单特异性或双特异性抗体，以及包含多个多肽链的抗体，如免疫球蛋白分子(其中表达具有其自身EED的组成型多肽链可能是有利的)或diabodies(其中两个scFv分子，每个都具有其自身的EED，线性头-尾相联以形成能够结合两种不同抗原的分子物)。这种免疫球蛋白分子可以是单特异性的(即免疫球蛋白的两条结合臂中每条都结合相同的抗原)或双特异性(即免疫球蛋白的两条结合臂中每条结合不同的抗原)，例如由杂合体杂交瘤获得的双特异性免疫球蛋白。
在本发明的特别优选的实施方案中，所需的多肽是单特异性单链抗体。在本发明的意义之内，术语″单特异性单链抗体″可以被理解为包含至少一个抗体可变区的单一多肽链。这种至少一个抗体可变区可以天然存在，例如在天然起源的抗体库中，或可以是合成性的，因为它包含天然发现或源自天然的元件，但这些组合存在的元件并不像天然存在的那样组合。或者，单特异性单链抗体可以包含天然和合成性的元件。具体落入术语″单特异性单链抗体″的意义中的是单结构域抗体，scFv分子，以及人源化的和/或其去免疫的变体。
根据进一步特别优选的本发明的实施方案，所需的多肽可以是双特异性单链抗体。在本发明的意义之内，术语″双特异性单链抗体″可以被理解为如上所述的存在于单一多肽链上的两个单特异性单链抗体，优选通过合适的多肽间隔序列彼此分隔。这些间隔序列的例子可以见于例如EP623679B1和US5,258,498。由此，复合多肽可以有利地代表衍生的双特异性抗体。
根据本发明的又一个实施方案，双特异性单链抗体包含特异性结合效应抗原的第一单特异性单链抗体(第一结合部分)和特异性结合靶抗原的第二单特异性单链抗体(第二结合部分)。这种一般性的构建具有这样的优点，即所需的多肽能够将其第一结合部分特异性结合到效应抗原上，从而使得结合的效应抗原例如得以活化。通过这种效应抗原诱发的生物学替代性随后可以指向，例如，具有靶抗原的细胞，双特异性单链抗体的第二部分特异性结合到所述靶抗原上。这里，要理解的是术语″第一″和″第二″并不意味着相对于多肽的N-末端或C-末端限制抗体部分的定位。所以在本发明的实施方案范围之内的是复合多肽包含所需的多肽，其中特异性效应抗原的第一结合部分可以定位于接近所需多肽的N-末端或C-末端。
在本发明的特别优选的实施方案中，效应抗原(effector antigen)选自CD3抗原，CD64抗原，CD89抗原和NKG2D抗原。在本发明另一个优选的实施方案中，靶抗原选自EpCAM，CCR5，CD19，HER-2 neu，HER-3，HER-4，EGFR，PSMA，CEA，MUC-1(粘液素)，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，hCG，Lewis-Y，CD20，CD33，CD30，神经节苷脂GD3，9-O-Acetyl-GD3，GM2，Globo H，岩藻糖基(fucosyl)GM1，Poly SA，GD2，Carboanhydrase IX(MN/CA IX)，CD44v6，Sonie Hedgehog(Shh)，Wue-l，浆细胞抗原，(膜结合的)IgE，黑素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MelanomaChondroitin Sulfate Proteoglycan)(MCSP)，CCR8，TNF-α前体，STEAP，mesothelin，A33抗原，前列腺干细胞抗原(PSCA)，Ly-6；桥粒核心糖蛋白(desmoglein)4，E-cadherin neoepitope，胎儿乙酰胆碱受体(FetalAcetylcholine Receptor)，CD25，CA19-9标记，CA-125标记和Muellerian I抑制物(MIS)II型受体，sTn(唾液酸化的(sialylated)Tn抗原；TAG-72)，FAP(成纤维细胞激活抗原)，内皮唾酸蛋白(endosialin)，EGFRvIII，LG，SAS和CD63。这里，所有上面的抗原(效应抗原和靶抗原)都可以是人抗原。
在本发明的极优选的实施方案中，靶抗原是人CD19抗原，而效应抗原是人CD3抗原。由此，这一实施方案提供能够将细胞毒性T细胞的细胞毒性潜力导向具有CD19抗原的B淋巴细胞的衍生复合多肽。这种药物作为B细胞恶性瘤治疗中的治疗剂具有很大潜力。作为结果，非常令人感兴趣的是用一个或多个PEG分子在其EED中衍生这种复合多肽，以便提高血清半寿期同时减弱复合多肽的免疫原性。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，靶抗原是人EpCAM抗原，而效应抗原是人CD3抗原。由此，这一实施方案提供能够将细胞毒性T细胞的细胞毒性潜力导向具有EpCAM抗原的细胞的衍生复合多肽。EpCAM抗原在许多人恶性细胞中表达；所以这种衍生的复合多肽在广谱的人类癌症的治疗中具有很大潜力。用上述抗-CD3xanti-CD19复合多肽，非常令人感兴趣的是用一个或多个PEG分子在其EED中衍生这种抗-CD3xanti-EpCAM复合多肽。
本发明的又一方面涉及包含上述任一种复合多肽以及药用载体的组合物。
在又一方面，本发明提供生产复合多肽的方法，其中所述复合多肽包含所需的多肽并且比所需多肽以更高的产量表达，所述方法包括a)提供编码所需多肽的核苷酸序列；b)在编码所需多肽的核苷酸序列任一端并入编码表达增强结构域(“EED”)的核苷酸序列，所述编码EED的核苷酸序列分别包含第一和第二半胱氨酸残基Cys1和Cys2的密码子，Cys1的密码子比Cys2的密码子定位更加靠近核苷酸序列的5’-末端，其中Cys1和Cys2的密码子通过编码多肽接头的核苷酸序列所分隔，所述接头不合半胱氨酸；并且定义足以允许Cys1和Cys2彼此形成分子内二硫键的长度；c)将来自步骤(b)的核苷酸序列在合适的载体中转染入宿主表达系统；d)在适于导致来自步骤(b)的核苷酸序列表达的条件下孵育宿主表达系统；e)分离在步骤(d)中表达的多肽以获得复合多肽。
本发明的这一方面的优选实施方案包括另外的步骤，即在Cys1和/或Cys2上衍生化在步骤(e)中获得的复合多肽。这种衍生化作用可以如上所述进行，即在还原性条件下(例如使用二硫苏糖醇，或DTT)通过还原Cys1和Cys2之间的分子内二硫键(这种分子内二硫键本身被视为衍生化作用)，后接还原产物与具有化学基团的另一种衍生化作用部分的反应，所述化学基团与Cys1和Cys2的游离巯基中的至少一个反应。
现在将通过下列非限制性的附图和实施例的方式来更加详细地描述本发明。
附图简述
图1依赖于Cys1和Cys2之间接头长度的抗原-特异性ELISA。
图2作为表达产物的测量的抗原-特异性ELISA结果，所述表达产物具有一个C末端半胱氨酸残基，并且具有由4个甘氨酸接头分隔的两个C-末端半胱氨酸残基。
图3作为表达产物的测量的蛋白质(Western)印迹结果，所述表达产物具有一个C末端半胱氨酸残基，并且具有由4个甘氨酸接头分隔的两个C-末端半胱氨酸残基。
图4凝胶过滤层析结果，显示根据本发明的复合多肽的洗脱模式和只具有一个C-末端半胱氨酸残基的多肽的洗脱模式。
图5通过凝胶过滤层析获得的单体和二聚体scFv物类(species)的SDS-PAGE；显示了在非还原性(左)和还原性(右)条件下的凝胶结果。
图6具有一个或两个C-末端半胱氨酸残基scFv的SDS-PAGE，与20kD PEG-顺丁烯二酰亚胺反应之前和之后。
现在将通过下列非限制性的实施例的方式来进一步详细地描述本发明。
实施例实施例1具有C-末端(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFv(即具有如上所定义的EED的scFv)的克隆和表达将scFv分子，即合并重链和轻链抗体可变区以及排列于其中的(Gly4Ser)3多肽接头的多肽，用作证明本发明概念的模式分子。这种scFv特异性结合预定的抗原，接下来称为“抗原”(Antigen)。通过用VL-特异性引物进行PCR反应来构建具有C-末端(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFv，而scFv核苷酸序列用(His)6-Cys-(Gly)x-Cys-Pro基序(ATGCGGTGGCTGCCCGTAA，BGCGGTGGCGGTTGCCCGTAA，CTGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA，DTGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA)的各个核苷酸进行独立地延伸。这产生了四种编码4种分离scFvs的核苷酸序列，每一种都带有C-末端标签，具有由不同长度的甘氨酸接头分隔的两个半胱氨酸残基。在后面的检测和纯化步骤中采用His-标签。通过限制性酶识别位点SalI和NotI(通过PCR导入)将得到的VL片段亚克隆入pBADpelB(源自来自Invitrogen的载体pBADMycA-His)，其在用于周质表达的pelB引导序列之后包含相应的VH。在转化入热击的感受态大肠杆菌XL1Blue后，将单一克隆培养在选择性培养基中(LB50μg/ml羧苄青霉素)并根据标准方案制备质粒。通过对插入片段进行测序来确认成功的克隆(Sequiserve，Munich)。
用编码各个具有一个或两个C-末端Cys残基的表达质粒来转化大肠杆菌BL21DE3并生长在选择性琼脂上。使用一个菌落于37℃接种5ml LB50g/ml羧苄青霉素过夜。对于生产培养，将21摇瓶中包含20mM MgCl2和50μg/ml羧苄青霉素的500ml SB生长培养基接种过夜培养物的细菌混悬液并进一步于37℃孵育至最佳密度，OD600为0.6-0.8。通过加入L-阿拉伯糖至最终浓度0.2％并将温度降至30℃来诱导蛋白质生产。于30℃四个小时的生产期后收获细菌并重悬于40ml PBS中。通过四轮于-70℃冷冻和于37℃融解来通过温度冲击破坏外膜并将可溶的周质蛋白包括scFv片段释放到液体中。在通过离心去除完整细胞和细胞碎片后，将上清液用于ELISA分析。
使用涂布了ProteinL(2μg/ml于PBS中)的ELISA-板(Nunc MaxiSorp)实施周质制品的ELISA分析。涂布在4℃过夜进行。在用PBS 0.05％Tween洗涤后，用包含3％BSA的100μl PBS于室温封闭所述板1h。在洗涤后，加入50μl周质(periplasm)，连续稀释1∶3并于室温温育1h。另外的洗涤步骤后，利用由链霉抗生物素-HRP(Dako，1μg/ml于包含1％BSA的PBS中)检测的50μl抗原-生物素(1.5μg/ml包含PBS 1％BSA)特异性实施结合到ProteinL上的scFv的检测。通过加入100μl ABTS(2，2′-Azino-二[3-ethylbenzthiazoline磺酸盐(6)]二铵盐)-底物溶液15-30min来检测信号。于405nm的波长在ELISA读取器上测量OD值。结果显示于图1中，其中“HCP”，CH2GlyCP”，“HC3GlyCP”，“HC4GlyCP”和“HC5GlyCP”分别指具有包含(His)6-Cys-Pro，(His)6-Cys-(Gly)2-Cys-Pro，(His)6-Cys-(Gly)3-Cys-Pro，(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro和(His)6-Cys-(Gly)5-Cys-Pro的C-末端标签的scFv分子。如在图1中可见，对于具有四个甘氨酸用作两个C-末端半胱氨酸之间接头的构建体观察到结合抗原的scFv最高产量。
实施例2确认与具有(His)6-Cys-Pro标签(即没有如上定义的EED)的scFv相比具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签(即如上定义的EED)的scFv的更高蛋白质产量比较了延展以(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签(即具有如上定义的EED，在图2中称为“4Gly”)的scFv和延展以(His)6-Cys-Pro C-末端标签(即没有如上定义的EED，在图2中称为“HCP”)的scFv的蛋白表达水平。利用大肠杆菌菌株BL21DE3对两种构建体进行了小量分析。在每种情况中将10个不同的菌落于37℃接种在摇动培养箱中的5ml SB/20mM MgCl2/50μg/ml羧苄青霉素中四小时。通过向细胞培养物中加入0.2％L-阿拉伯糖并将温度降至30℃再次起始蛋白质生产。在过夜诱导期后收获细胞，重悬于1ml PBS中并通过冻/融方法分离周质级分并如实施例1中所述在抗原特异性ELISA中进行分析。这种分析的结果显示在图2中。ELISA结果清楚地显示与包含C-末端(His)6-Cys-Pro基序，但缺乏第二半胱氨酸残基的scFv相比，在粗制周质中具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签(“4Gly”)的scFv产量明显增加。那么，显然在C-末端标签(即如上定义的EED)中的两个半胱氨酸残基之间形成受控制的，分子内二硫键的能力对于达到观察到的提高的产物产量是十分重要的。
通过根据标准方案的非还原性SDS-PAGE，后接蛋白质印迹技术来进一步分析周质级分。使用抗-penta His抗体，Qiagen(1μg/ml于包含0.1％BSA的PBS中)来完成His-标签的scFv的检测，所述抗-penta His抗体用碱性磷酸酶缀合的羊抗小鼠抗体，Sigma(1μg/ml于包含0.1％BSA的PBS中)进行检测。通过加入BCIP/NBT底物溶液(Sigma，B-1911)来显影蛋白质印迹。结果显示在图3中。
在图3中显示的蛋白质印迹的泳道1和2显示在C-末端具有(His)6-Pro的scFv的条带。对应于在多肽的C-末端具有(His)6-Cys-Pro的scFv，看到在蛋白质印迹中scFv条带的强度-因此是总的表达多肽量-在泳道3和4中显著减少。对应于在多肽的C-末端具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro的scFv，泳道5和6显示可再次与泳道1和2中见到的强度相比的条带强度。这清楚地表明通过加入第一半胱氨酸残基恢复了由于向scFv多肽的C-末端加入单一半胱氨酸残基而造成的蛋白质表达损失(泳道3和4)，所述第二半胱氨酸残基通过多肽接头与第一半胱氨酸残基分隔开，所述多肽接头允许在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键(泳道5和6)。
总之，ELISA(图2)和蛋白质印迹(图3)分析的结果清楚地显示与只具有一个C-末端半胱氨酸的scFv构建体相比具有两个C-末端半胱氨酸的scFv构建体的蛋白质/scFv产量更高。
实施例3纯化具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签(即如上定义的EED)的scFv用表达质粒转化大肠杆菌BL21DE3并生长于选择性琼脂上。使用单一菌落来于37℃过夜接种5ml LB 50μg/ml羧苄青霉素。对于生产培养，将21摇瓶中500ml SB/20mM MgCl2/50μg/ml羧苄青霉素接种过夜培养物的细菌混悬液并于37℃生长至最佳密度，OD600为0.6-0.8。通过加入L-阿拉伯糖至最终浓度0.2％并将温度降至30℃来诱导蛋白质生产。于30℃过夜的生产期后收获细菌并重悬于40ml PBS中。通过温度冲击破坏外膜并将可溶的周质蛋白包括scFv片段释放到液体中。在通过离心去除完整细胞和细胞碎片后，将上清液作进一步纯化。
通过与C-末端His-标签相互作用的IMAC亲和柱来起始纯化SCA分子。这根据生产商提供的方案使用Qiagen Ni-NTA超流柱来进行。用20mM磷酸钠0.4M NaCl，pH7.2来平衡柱并以2ml/min的流速将周质制品(40ml)应用到柱上。然后用包含0.025M咪唑的5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱以除去未结合的样品。用包含0.025M咪唑的5倍柱体积的平衡缓冲液进行洗脱。收集洗脱的蛋白质级分用于进一步的纯化步骤。
为了实现分子量的分离，即分离成多聚体，二聚体和单体级分，在PBS平衡的superdex S75制品级柱(Gibco)上进行凝胶过滤层析。将通过连续280nm光吸收测量所监测的洗脱蛋白(流速1ml/min)进行标准SDS-PAGE。结果显示在图4中。图4显示两种洗脱模式A和B，下面的一个(模式(profile)A)是具有C-末端(His)6-Cys-Pro基序的scFv的洗脱模式，上面的一个(模式B)是具有C-末端(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro基序的scFv(即具有如上所定义的scFv)的洗脱模式。可以清楚地看到，在scFv的C-末端部分将第二半胱氨酸残基并入到离第一半胱氨酸残基充足隔离之处以形成二硫环不仅导致较高的单体二聚体产物比率，还导致较高的总体蛋白产量，而不管是单体或二聚体同工型。
通过同工型浓度的计算来确证这种明显的光学分析。利用AUC值(通过UNICORN软件计算)和序列特异性消光系数来计算蛋白质浓度。将获得的浓度值总结在下表1中表1
由上表，可以进行下列陈述。首先，对于在其C-末端部分具有单一半胱氨酸残基的scFv来说单体二聚体的比率为大约1∶2.25。通过将第二半胱氨酸加入到scFv的C-末端部分和通过将合适的接头配置在第一和第二半胱氨酸残基之间，促进形成了分子内二硫键，并且所获scFv的单体∶二聚体的比率提高大约5.5倍，到1∶0.4。不管多肽同工型如何，从总体多肽产量的观点来看，产量从具有单一半胱氨酸残基的scFv的276.6μg到具有两个半胱氨酸残基的scFv的775.2μg表现出总体蛋白表达大约280％，或几乎3-倍的提高。
在非还原性和还原性条件下通过SDS-PAGE进行的凝胶过滤的单体和二聚体级分的分析(图5)清楚地显示大约80％的在其C-末端部分具有单一半胱氨酸的scFv的二聚体级分是二聚体化的，通过二硫键交联(图5，非还原性凝胶，泳道2)，而在其C-末端部分具有两个半胱氨酸残基的scFv的二聚体级分主要作为单体而存在，因为在两个C-末端半胱氨酸残基之间形成了二硫环(图5，非还原性凝胶，泳道4)。二聚体解聚成单体(图5，非还原性凝胶，泳道4)表明聚合仅仅是通过蛋白质-蛋白质相互作用而发生的，并不是因为二硫键交联。图5的泳道1和3(还原性和非还原性条件)显示相应的单体级分。
还将相同的样品在还原性凝胶上进行电泳(图5)。关于没有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFv，泳道2显示存在于非还原性凝胶中的任何二聚体事实上都归因于两个多肽分子各自的半胱氨酸残基之间形成了不需要的二硫键。这对于具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFv的二聚体的残留最小量来说也是一样(泳道4)。在还原性凝胶内的还原性条件足以打开这些二硫键，从而只有观察到的条带是scFv多肽的单体种类(monomeric species)，其中在scFv内没有半胱氨酸残基能够与任何其它半胱氨酸残基形成二硫键。
实施例4有和无C-末端(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFvs的侧向PEG化作用游离半胱氨酸上的PEG化作用将致成稳定的均一scFv-PEG缀合物。将分别包含纯化的具有C-末端(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro标签的scFv和具有C-末端(His)6-Cys-Pro标签的scFv的蛋白质溶液与终浓度为2mM的DTT一起于室温孵育一小时以减少末端二硫键，致成两个游离的巯基基团。
随后使用PBS作为工作缓冲液分别对每种多肽进行凝胶过滤(SephadexG25M，Amersham)以除去残余的DTT。以10倍过量摩尔数的PEG分子将mPEG-顺丁烯二酰亚胺MW20 kD(Shearwater，2D2M0P01)加入到每种多肽样品的第一半中。这里术语“mPEG”具有已知的意义，即“甲氧基聚乙二醇”。将每种多肽样品的另一半与10倍过量摩尔数的乙基顺丁烯二酰亚胺(Sigma，E-1271)一起孵育作为对照。
让每个反应在室温搅动进行2小时。在非还原性条件下通过SDS-PAGE来分析所有样品并根据标准方案进行银染(Invitrogen，目录号LC6100)。结果显示在图6中。
图6的泳道1描绘了在其C-末端具有(His)6-Cys-Pro的scFv。所述半胱氨酸残基已经通过与乙基顺丁烯二酰亚胺反应而封闭。图6的泳道2显示在其C-末端具有(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro的scFv，其中两个胱氨酸残基都已经通过与乙基顺丁烯二酰亚胺反应而封闭。在泳道1和2中条带的相对强度(即泳道2中的泳道比泳道1中相同位置上的条带更强)是与当表达具有单一C-末端半胱氨酸残基的scFv时所实现的效率相比，当表达具有两个C-末端半胱氨酸残基的scFv时所实现的提高的表达效率的测量。
图6的泳道3显示用20kD分子量的PEG-顺丁烯二酰亚胺偶联具有单一C-末端半胱氨酸残基的scFv的结果。如在泳道3上面部分中所见，只观察到非常微弱的PEG偶联scFv的条带，其微弱性可能表明微弱的表达产量，并因此表明利用只具有单一C-末端半胱氨酸残基的scFv获得的较少scFv绝对量。正相反，图6的泳道4，其中具有由4-甘氨酸接头彼此分隔的两个C-末端半胱氨酸残基的scFv已经与20kD PEG反应，显示两条不同的条带。一条条带与相应的未反应物具有相同分子量，表明与20kD PEG反应并未完成。另一条，分子量较高的条带表明20kD PEG已经与scFv的C-末端部分中的两个半胱氨酸残基都反应了，因为它与只具有单一C-末端半胱氨酸残基的scFv的PEG化作用产物具有更高的分子量。应当强调的是通过并入并非一个，而是两个半胱氨酸残基在scFv的C-末端部分中仅仅是有可能对于随后的PEG化反应获得足够的包含半胱氨酸残基的起始材料，所述两个半胱氨酸残基由4-甘氨酸接头彼此分隔。
权利要求
1.一种复合多肽，所述复合多肽包含所需的多肽和表达增强结构域(″EED″)，所述EED分别包含第一和第二半胱氨酸氨基酸残基Cys1和Cys2，Cys1比Cys2定位更接近复合多肽分子的N-末端，其中Cys1和Cys2通过多肽接头分隔，所述接头·不含半胱氨酸和脯氨酸；·定义了足以允许Cys1和Cys2彼此形成分子内二硫键的长度；并且·具有柔韧的多肽构象，其在含水溶液中基本上无二级多肽结构，其中Cys1和Cys2中的至少一个用衍生化作用部分进行衍生化。
2.权利要求1的复合多肽，其中接头中至少75％的氨基酸残基选自Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Met，Tyr，Asn，和Gln。
3.权利要求1或2的复合多肽，其中所述复合多肽是单链多肽。
4.以上权利要求中任一项的复合多肽，其中EED位于复合多肽的C-或N-末端。
5.以上权利要求中任一项的复合多肽，其中EED形式为-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m，其中·n是从2到20的任意整数；·m是0(零)或1；并且·Xaa在每个位置上允许为Gly，Ala，Thr，或Ser。
6.权利要求5的复合多肽，其中n＝4而(Xaa)4为(Gly)4，(Gly)3Ser，(Gly)2SerGly，GlySer(Gly)2或Gly(Ser)3。
7.权利要求5的复合多肽，其中n＝5而(Xaa)5为(Gly)5，(Gly)4Ser，(Gly)3SerGly，(Gly)2Ser(Gly)2，GlySer(Gly)3或Ser(Gly)4。
8.权利要求5-7中任一项的复合多肽，其中EED形式为-His-His-His-His-His-His-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m；或-Cys1-(Xaa)n-Cys2-His-His-His-His-His-His-(Pro)m。
9.以上权利要求中任一项的复合多肽，其中衍生的Cys1和/或Cys2是Cys1和/或Cys2残基与包含顺丁烯二酰亚胺基团，巯基基团或吡啶基二硫化物基团的衍生化作用部分的反应产物。
10.权利要求9的复合多肽，其中包含顺丁烯二酰亚胺基团的衍生化作用部分选自PEG-顺丁烯二酰亚胺(″PEG-MA L″)，顺丁烯二酰亚胺-官能化的荧光标记，顺丁烯二酰亚胺-官能化的试验检测标记，顺丁烯二酰亚胺-官能化的放射性示踪剂或顺丁烯二酰亚胺-官能化的蛋白交联剂。
11.权利要求10的复合多肽，其中PEG-MAL选自·甲氧基PEG-MAL 5 kD；·甲氧基PEG-MAL 20 kD·甲氧基(PEG)2-MAL 40 kD；·甲氧基PEG(MAL)2 5 kD；·甲氧基PEG(MAL)2 20 kD；·甲氧基PEG(MAL)2 40 kD；或·其任意组合。
12.权利要求9的复合多肽，其中用包含5-硫代-2-硝基苯甲酸(“TNB-硫醇基”)基团或巯基的衍生化作用部分来对Cys1和/或Cys2进行衍生化，特别是其中所述衍生化作用部分是通过二硫键偶联到Cys1上的Cys2。
13.以上权利要求中任一项的复合多肽，其中Cys1和Cys2都用衍生化作用部分进行衍生化。
14.权利要求1-12中任一项的复合多肽，其中Cys1或Cys2用第一衍生化作用部分进行衍生化，而用第二衍生化作用部分分别对Cys1或Cys2各自相应其它的进行衍生化。
15.权利要求14的复合多肽，其中第二衍生化作用部分是乙基顺丁烯二酰亚胺。
16.以上权利要求中任一项的复合多肽，其中所述抗体选自单特异性单链抗体或双特异性单链抗体。
17.权利要求16的复合多肽，其中双特异性单链抗体包含特异性结合到效应抗原上的第一部分和特异性结合到靶抗原上的第二部分。
18.权利要求17的复合多肽，其中效应抗原选自人CD3抗原，人CD64抗原，人CD89抗原和人NKG2D抗原。
19.权利要求17或18的复合多肽，其中靶抗原选自EpCAM，CCR5，CD19，HER-2 neu，HER-3，HER-4，EGFR，PSMA，CEA，MUC-1(粘液素)，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，hCG，Lewis-Y，CD20，CD33，CD30，神经节苷脂GD3，9-O-Acetyl-GD3，GM2，Globo H，岩藻糖基-GM1，Poly SA，GD2，Carboanhydrase IX(MN/CA IX)，CD44v6，SonicHedgehog(Shh)，Wue-1，浆细胞抗原，(膜结合的)IgE，黑素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)，CCR8，TNF-α前体，STEAP，mesothelin，A33抗原，前列腺干细胞抗原(PSCA)，Ly-6；桥粒核心糖蛋白4，E-cadherin neoepitope，胎儿乙酰胆碱受体，CD25，CA19-9标记，CA-125标记和Muellerian I抑制物(MIS)II型受体，sTn(唾液酸化的Tn抗原；TAG-72)，FAP(成纤维细胞激活抗原)，内皮唾酸蛋白，EGFRvIII，LG，SAS和CD63，其中所有的所述抗原是人抗原。
20.包含以上权利要求中任一项的复合多肽和药用载体的组合物。
21.产生权利要求1-19中任一项的复合多肽的方法，其中所述复合多肽包含所需的多肽并且比所需多肽以更高的产量表达，所述方法包括a)提供编码所需多肽的核苷酸序列；b)在编码所需多肽的核苷酸序列任一端并入编码表达增强结构域(“ EED”)的核苷酸序列，所述编码EED的核苷酸序列分别包含第一和第二半胱氨酸氨基酸残基Cys1和Cys2的密码子，Cys1的密码子比Cys2的密码子定位更加靠近核苷酸序列的5’-末端，其中Cys1和Cys2的密码子由编码多肽接头的核苷酸序列所分隔，所述接头不含半胱氨酸；并且定义足以允许Cys1和Cys2彼此形成分子内二硫键的长度；c)将来自步骤(b)的核苷酸序列在合适的载体中转染入宿主表达系统；d)在适于导致来自步骤(b)的核苷酸序列表达的条件下培育宿主表达系统；e)分离在步骤(d)中表达的多肽以获得复合多肽。
22.权利要求21的方法，所述方法包括另外的步骤，即在Cys1和/或Cys2上衍生化在步骤(e)中获得的复合多肽。
全文摘要
一种复合多肽，所述复合多肽包含所需的多肽和表达增强结构域(″EED″)，所述EED分别包含第一和第二半胱氨酸氨基酸残基Cys1和Cys2，Cys1比Cys2定位更接近重组多肽分子的N－末端，其中Cys1和Cys2通过多肽接头分隔，所述接头不含半胱氨酸和脯氨酸；定义了足以允许Cys1和Cys2彼此形成分子内二硫键的长度；并且具有柔韧的多肽构象，其在水溶液中基本上无二级多肽结构，其中Cys1和Cys2中的至少一个用衍生化作用部分进行衍生化。
文档编号C12N15/67GK101018809SQ200580024002
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月15日 优先权日2004年7月16日
发明者帕特里克·霍夫曼, 西尔克·米特尔斯特拉斯, 詹斯·亨内克, 托比亚斯·劳姆 申请人:米克罗麦特股份公司