使用干细胞的体外技术的制作方法

专利名称：：使用干细胞的体外技术的制作方法使用干细胞的体外技术交叉参考相关申请本申请要求下面的优先权(a)2004年6月1日提交的、标题为"Invitrotechniquesforusewithstemcells"的美国临时专利申请60/576,266禾口(b)2004年7月15日提交的、标题为"Indicationsforstemcelluse"的美国临时专利申请60/588,520。这两个申请都转让给本专利申请的受让人，且并入本文参考。发明领域本发明通常涉及治疗患有血管障碍的人类患者的方法和装置，更具体地涉及促进血管发生(angiogenesis)和/或新血管形成和/或血管生成(vasculogenesis)的方法禾口装置。发明背景由于由脂肪沉积或其他血管异常造成的动脉狭窄弓I发了一些动脉机能障碍。这可干扰血流和/或妨碍组织和器官得到充足的营养和氧气。血管障碍是普遍的病症并且可严重地危及患者的生活质量。尽管医学治疗中取得了巨大进展以及对动脉机能障碍的血管形成术的改进，诸如冠状血管的冠状动脉移植、球囊血管成形术和放置支架，但是很大比例的患者患有动脉机能障碍衍生的疾病。已经将内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)用来治疗患有血管疾病的患者。在这种严重情况中，当药物或直接血管形成术不再有效或不能使用时，需要替代的治疗。EPC已经被应用到缺血组织中。EPC有能力分化以形成构成血管的细胞层的内皮。这些细胞涉及重新内皮化、新血管化(neovascularization),血管生成以及血管发生过程。植入的EPC可成为治疗过程一部分的机制包括自身再增殖(self-repopulation)、与受损组织的细胞融合以及分泌细胞因子与生长因子。EPC的再增殖及它们分化为成熟的内皮细胞使它们能在重新内皮化、新血管化、血管生成以及血管发生过程中发挥功能。最近的证据表明EPC与受损组织的细胞的融合增强了组织功能再生。而且，随着细胞因子和生长因子的分泌，EPC可影响组织固有细胞的细胞生存，并可帮助将干细胞转移到受损组织。普通的祖细胞，造血成血管细胞(hemangioblast)，使内皮前体和造血(血细胞)前体产生。该祖细胞分化成造血干细胞和成血管细胞，成血管细胞是分化成内皮细胞前体的中胚层前体细胞。这些细胞具有增殖、迁移和分化成内皮细胞的能力，但是还没有获得明确的成熟内皮细胞标志。随着定型为内皮细胞谱系，在被称为血管生成的过程中成血管细胞聚集成静脉和动脉的原始血管丛。通过血管发生以及通过新形成血管的改造(remodeling)和动脉生成，随后将这原始脉管系统细化到功能网络中。已经显示EPC在患有血管损伤或急性心肌梗死(AMI)的患者体内可被动员(即以增加的数目从骨髓(BM)迁移进入循环)(见下面两篇作为并入本文参考的文章(a)Gill，M.，S.Dias，等人(2001),"VasculartraumainducesrapidbuttransientmobilizationofVEGFR2(+)AC133(+)endothelialprecursorcells",CirRes88(2):167-74;和(b)Shintani,S.，T.Murohara,等人(2001),"Mobilizationofendothelialprogenitorcellsinpatientswithacutemyocardialinfarction,"Circulation103(23):2776國9.)通常，使用EPC的目的是促使在缺血或伤疤组织内形成天然旁路，从而减轻这些患者的临床情形。大量的动物实验和临床试验已经研究了该治疗对增大血流并得到有关缺血症状的减轻的潜力，如通过患者在生理功能上的改进所显现。已经描述了用于移植的自身EPC的多种来源，包括直接从骨髓(BM)吸取的干细胞，和BM衍生的外周血液干细胞。祖细胞或干细胞包括能够增殖、迁移和分化成很多细胞类型的骨髓细胞。骨髓造血干细胞特征为"CD34阳性"(CD34+)，即表达CD34标记。假设明确定义的造血祖细胞群的可塑性使它们能够横向分化(trans-differentiate)以响应在靶器官中存在的环境暗示，更特异地，它们转变成内皮细胞。临床需要骨髓移植是因为医疗操作相对简单。它需要从髂嵴中吸取骨髓并立即重新注射吸取物或选择的细胞到梗塞后伤疤中。不过，该操作是侵入性的，必须在麻醉下进行。当来自健康人类志愿者的单核血细胞示出获得体外内皮细胞样表型并掺入体内毛细血管中时，获得了表明在成人循环中存在EPC的第一个i正据(见Asahara,T.,T.Murohara,等人(1997),"Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis，"Science275(5302):964-7，其并入本文参考)。经由胚胎内皮祖细胞和造血干细胞(HSC)所共享的两个抗原CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2/KDR)的表达来鉴定这些推定的EPC。除了CD34，早期造血祖细胞还表达CD133(AC133),其在分化后不再表达。当前，为实践目的，在循环中广泛接受的EPC的定义是CD34+ZVEGFR-2+或CD133十/VEGFR-2+细胞。从未治疗患者或者从治疗患者的血液中可获得外周血液EPC，以便利用诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的细胞因子来增大EPC的迁移。在患有血液性和动脉衍生障碍的患者中通常避免该迁移治疗。已经报道了诸如HMGCoA还原酶抑制剂(他汀类药物(statins))的治疗能提高循环中EPC的数量，例如见1、DimmelerS.，等人(2001),"画G-CoAreductaseinhibitors(statins)increaseendothelialprogenitorcellsviathePI3-kinase/Aktpathway,"J.Clin.Invest.簡:391-397.2、Hyun-Jae,Hyo-SooKim,等人(2003),"EffectsofintracoronaryinfUsionofperipheralbloodstem-cellsmobilizedwithgranulocyte-colonystimulatingfactoronleftventricularsystolicfimctionandrestenosisaftercoronarystentinginmyocardialinfraction:theMAGICcellrandomizedclinicaltrial,"TheLancet363:751-756.3、BrigitAssmus,VolkerSchachinger等人，(2002),"Transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfraction(TOPCARE-AMI),"Circulation106:3009-3017.4、AlexandraAicher，WinfreidBrenner,等人,(2003),"Assessmentofthetissuedistributionoftransplantedhumanendothelialprogenitorcellsbyradioactivelabeling,"Circulation107:2134-2139.这些文章的每一篇都并入本文参考。取出外周血液的操作对患者来说比BM的移除更简单和更方便。可将EPC从外周血液中分离的事实是在选择使用这些细胞进行治疗时的一个额外重要因素。来自含有多种细胞类型的BM的祖细胞的分离在技术上同样是更具挑战性的。在心肌梗塞的老鼠模型中，由EPC和BMC治疗的结果显示了改进的心脏功能、更大的毛细血管密度、并行管数量显著增加、心动回声图左心室射血分数的提高、缺血区域瘢痕化的减少以及防止心肌细胞凋亡。此外，在裸鼠缺血模型中显示了后肢改善的血流和毛细血管密度以及肢体丧失率降低。以下作为并入本文参考的文章描述了可与在此所述技术联合使用的技术(1)Kalka,C.,H,Masuda，等人(2000)."Vascularendothelialgrowthfactor(165)genetransferaugmentscirculatingendothelialprogenitorcellsinhumansubjects."CircRes86(12):1198-202.(2)Kawamoto，A,，H.C.Gwon，等人(2001)."Therapeuticpotentialofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsformyocardialischemia."Circulation103(5):634-7.(3)Kawamoto,A.，T.Tkebuchava,等人(2003)."Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia,"Circulation107。》461-8.(4)Kamihata,H.,H.Matsubara,等人(2001)."Implantationofbonemarrowmononuclearcellsintoischemicmyocardiumenhancescollateralperfusionandregionalfunctionviasidesupplyofangioblasts,angiogenicligands，andcytokines."Circulation104(9):1046-52.(5)Kocher,A.A.,M.D.Schuster,等人(2001)."Neovascularizationofischemicmyocardiumbyhumanbone-marrow-derivedangioblastspreventscardiomyocyteapoptosis,reducesremodelingandimprovescardiacfunction."NatMed7(4):430-6.以下也并入本文参考的文章和书籍章节描述了可用来与在此所述技术联合使用的技术FlammeraJ等人(2002)."Theimpactofocularbloodflowinglaucoma."ProgressinRetinalandEyeResearch21:359-393.ZarbinMA(2004)."Currentconceptsinthepathogenesisofage-relatedmaculardegeneration."ArchOphthalmol.122(4):598-614.FrankRN(2004)."Diabeticretinopathy."NEnglJMed350:48-58.SingletonJR(2003)."Microvascularcomplicationsofimpairedglucosetolerance."Diabetes52:2867-2873.BahlmannFHet.(2004)."Erythropoietinregulatesendothelialprogenitorcells."Blood103(3):921画6.Greenfield,Ed.(2001)."Surgery:Scientificprinciplesandpractice."Lippincot:Philadelphia,chapter107.Ko而enhovenEA等人(2000)."Etiologyandpathophysiologyofchronictransplantdysfunction."TransplantInternat.13(6):385-401.BrowneEZ等人(1986》"Complicationsofskingraftsandpedicleflaps."HandClin.2:353-9.Chen等人(1991)."Fourtypesofvenousflapsforwoundcoverage:aclinicalappraisal."J.Trauma31(9):1286-93.Beatrice等人(2004)Dermatol.Surg.30(3):399.Ferretti等人(2003)."Angiogenesisandnerveregenerationinamodelofhumanskinequivalenttransplant."LifeSci.73:1985-94.Schechner等人(2003)."Engraftmentofavascularizedhumanskinequivalent."FASEBJ.17(15):2250-60.在最近几年中己经在人类开展研究检査使用EPC和其它骨髓衍生细胞治疗心肌障碍的潜在好处。近期研究证明急性心肌梗死之后植入自身祖细胞似乎能限制梗塞后损害。以下临床试验集中于评估在心脏病患者体内施用骨髓衍生或血液衍生细胞的安全性和效力的研究。Perin等人进行了包括21个患者(14个患者在治疗组，7个患者在对照组)的临床试验，这些患者接受经心内膜注射的自身单核BMC(见Perin,E.C,,H.F.Dohmann,等人(2003),"Transendocardial,autologousbonemarrowcelltransplantationforsevere,chronicischemicheartfailure,"Circulation107(18):2294-302，其并入本文参考)。在4个月时，射血分数提高，收縮末期体积减小，并且在治疗患者注射段中有显著的机械性改另一组在患有心肌梗死并进行了冠状动脉旁路移植术的六名患者中将自身EPC注射到梗死边缘区域。手术后的三到九个月，所有患者都健在，并且在四个名者中整体左心室功能增强。所有六名患者都报告在运动能力上有显著提高。通过定性分析，心肌灌注扫描报告六名患者中的五名已经获得显著改进。这一研究结果表明EPC植入到心脏中很可能诱导血管发生，从而改善梗塞心肌的灌注(见Stamm,C.，B.Westphal,等人(2003)，"Autologousbone-marrowstem-celltransplantationformyocardialregeneration,"Lancet361(9351):45-6，其并入本文参加)。急性心肌梗死中祖细胞移植以及再生增强(TOPCARE-AMI)研究涉及在再灌注急性心肌梗死患者梗塞后内皮祖细胞或骨髓细胞直接循环到冠状动脉的输送(见Assmus，B.,V.Schachinger，等人(2002),"TransplantationofProgenitorCellsandRegenerationEnhancementinAcuteMyocardialInfarction(TOPCARE-AMI),"Circulation106(24):009-17，其并入本文参考)。在第一批20名患者中，ll名接受EPC，9名接受BMC。4个月，祖细胞移植导致整体左心室射血分数的显著增加，心动回声图显示在梗塞区域中改善的局部室壁活动、减少的收缩末期左心室体积以及与非随机化、匹配的参考组相比在梗塞区域增加的心肌活力。在任何一名患者中没有治疗不利事件发生，如心律失常或肌酸激酶和肌钙蛋白增加。在BM衍生细胞和外周血液衍生细胞之间没有差别。由UniversityofPittsburgh的AmitPatel领导的小组所进行的研究涉及20名患有严重心力衰竭的患者，对其中IO名患者用BM衍生EPC注射到冠状血管中。在随后的l个月、3个月和6个月，与其他患者相比干细胞患者的射血分数比率显著增力[K见AbstractfromAmericanAssociationforThoracicSurgery,Toronto,May2004)。下面并入本文参考的文章也是感兴趣的J.Folkman，Y.Shing，J.Biol.Chem.267，10931(1992)w.Brugger，S.Heimfeld，R.J.Berenson,R.Merterlsmann，L.Kanz,N.EnglJ.Med.333,283,(1995)F.Katz，R.W.Tindle,D.R.Sutherland,M.D.Greaves,Leuk.Res.9，191(1985)R.G.Andrews,J.W.Singer,I.D.Bernstein,Blood67,842(1986)Armellino,etal,Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.187，1579(1992)B.Millauer,S.Wizigmann-Voos，H.Schnurch,R.Martinez,N.P.H.Moller，etal，Cell72,835(1993)J.C.Voyta,D.P.Via,C.E.Butterfieki,B.R,Zetter，J.CellBiol.99，2034(1984)P.J.Newman,M.C.Berndt，J.Gorski,G.C.White,S.Lyman,etal,Science247，1219(19卯)T.N.Sato,Y.Tozawa,U.Deutsch，K.Wolburg-Buchholz,YFujiwara,etal,Nature376,70(1995)H.Schnurch,W.Risau,Development119,957(1993)J.L.Liesveld，K.E.Frediani,A.W.Harbol，J.RDiPersio，C.N.Abboud,Leukemia8,2111(1994).S.Takeshita,L,RZheng,E.Brogi,M.Kearney,L.Q.Pu,etal,J.Clin,Invest.93,662(1994)R.Baffour，J.Berman，J.L.Garb,S.W.Rhee,J.Kaufman，etal，J.Vase.Surg.16,181(1992)J.M.Isner,A.Pieczek,R.Schainfeld,R.Blair,L.Haley,etal,Lancet348,370(1996)Y.Sato，K.Okamura，A.Morimoto，R.Hamanaka,K.Hamanaguchi,etal,Exp.CellRes.204,223(1993)下面同样并入本文参考的文章也是感兴趣的Badorff，C.，R.P.Brandes,等人(2003)."Transdifferentiationofblood-derivedhumanadultendothelialprogenitorcellsintofunctionallyactivecardiomyocytes."Circulation107(7):1024-32.Bhattacharya，V.，P.A.McSweeney,等人(2000)."EnhancedendothelializationandmicrovesselformationinpolyestergraftsseededwithCD34(+)bonemarrowcells."Blood95(2):581-5.Grant,M.B.，W.S.May,等人(2002)."Adulthematopoieticstemcellsprovidefunctionalhemangioblastacitivityduringretinalneovascularization."NatMed8(6):607-12.Hirata,K.,T.S.Li,等人(2003)."Autologousbonemarrowcellimplantationastherapeuticangiogenesisforischemichindlimbindiabeticratmodel."AmJPhysiolHeartCircPhysiol284(1):H66-70.Ikenaga，S.，K.Hamano,等人(2001)."Autologousbonemarrowimplantationinducedangiogenesisandimproveddeterioratedexercisecapacityinaratischemichindlimbmodel."JSurgRes96(2):277-83.Kalka,C.，H.Masuda，等人(2000)."Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization."ProcNatlAcadSciUSA97(7):3422-7,Kaushal，S.，GE.Amiel,等人(2001)."Functionalsmall-diameterneovesselscreatedusingendothelialprogenitorcellsexpandedexvivo."NatMed7(9):1035-40.Kornowski,R.,M.B.Leon,等人(2000)."Electromagneticguidanceforcatheter-basedtransendocardialinjection:aplatformforintramyocardialangiogenesistherapy.Resultsinnormalandischemicporcinemodels."JAmCollCardiol35(4):1031-9.Li,R.K.，Z.Q.Jia，等人(1996)."Cardiomyocytetransplantationimprovesheartfunction."AnnThoracSurg62(3):654-60;discussion660-1.Rajnoch，C.，J.C.Chachques,等人(2001),"Cellulartherapyreversesmyocardialdysfunction."JThoracCardiovascSurg121(5):871-8.Schatteman,G.C.,H.D.Hanlon,等人(2000)."Blood-derivedangioblastsaccelerateblood-flowrestorationindiabeticmice."JClinInvest106(4):571-8.Shintani,S.，T.Murohara,等人(2001)."Augmentationofpostnatalneovascularizationwithautologousbonemarrowtransplantation."Circulation103(6):897画903.Strauer,B.E.，M.Brehm,等人(2002)."Repairofinfractedmyocardiumbyautologousintracoronarymononuclearbonemarrowcelltransplantationinhumans."Circulation106(15):1913-8.Taylor,D.A.，B,Z.Atkins,等人(1998)."Regeneratingfunctionalmyocardium:improvedperformanceafterskeletalmyoblasttransplantation."NatMed4(8):929-33.Thompson,C.A.，B.A.Nasseri，等人(2003)."Percutaneoustransvenouscellularcardiomyoplasty.Anovelnonsurgicalapproachformyocardialcelltreansplatation."JAmCollCardiol41(11):1964-71.Tomita，S.,R.K.Li，等人(1999)."Autologoustransplantationofbonemarrowcellsimprovesdamagedheartfunction."Circulation100(19Suppl):11247-56.Tomita,S.，D.A.Mickle,等人(2002)."Improvedheartflmctionwithmyogenesisandangiogenesisafterautologousporcinebonemarrowstromalcelltransplantation."JThoracCardiovascSurg123(6):1132-40.Wang等人(2004)."Rosiglitazonefacilitatesangiogenicprogenitorcelldifferentiationtowardendotheliallineage:anewparadigminglitazonepleiotropy,"Circulation109(11):1392-400.Rupp等人(2004)."Statintherapyinpatientswithcoronaryarterydiseaseimprovestheimpairedendothelialprogenitorcelldifferentiationintocardiomyogeniccells."BasicResCardiol.99(l》61-8.Quirici等人(2001)."DifferentiationandexpansionofendothelialcellsfromhumanbonemarrowCD133(+)cells."BrJHaematol.115(1):186-94.DiStefano等人(2002)"Differentgrowthconditionsforperipheralbloodendothelialprogenitors."CardiovascRadiatMed.3(3-4》172-5.Akita等人(2003)."Hypoxicpreconditioningaugmentsefficacyofhumanendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization,"LabInvest.83(l):65-73.Wang等人(2004)."Mechanical,cellular,andmolecularfactors'interacttomodulatecirculatingendothelialcellprogenitors."AmJPhysiolHeartCircPhysiol.286(5):H1985-93.Bahlmann等人(2003)."Endothelialprogenitorcellproliferationanddifferentiationisregulatedbyerythropoietin."KidneyInt.64(5):1648-52.Heeschen等人(2003》"Erythropoietinisapotentphysiologicstimulusforendothelialprogenitorcellmobilization."Blood.102(4》1340-6.Verma等人(2004)."C-reactiveproteinattenuatesendothelialprogenitorcellsurvival,differentiation,andflmction:FurtherevidenceofamechanisticlinkbetweenC-reactiveproteinandcardiovasculardisease."Circulation.109(17):2058隱67.授予Isner等人的美国专利5,980,887、6，569,428和6,676,937作为参考并入本文，这些专利通常描述了包括用在调节血管发生的方法中的EC祖细胞的药物产物，即用于在所选患者和在一些优选实施方案中将血管发生调节物靶向特异位置从而增强或抑止血管形成。例如，EC祖细胞可用于增强血管发生或用于输送血管发生调节物，例如将抗血管发生物质或促血管发生物质分别输送到病理性血管发生或功利性血管发生的位置。另外，在另一实施方案中，EC祖细胞可用于诱导受损血管的重新内皮化，从而通过间接抑制平滑肌细胞增殖来减少再狭窄。授予Kanz等人的、并入本文参考的美国专利5，541，103描述了对患有某种类型癌症的患者进行高剂量化疗治疗。为了便于恢复，描述了外周血液祖细胞的离体(exvivo)扩增过程，其中富集CD34+细胞并将其培养在包含IL-1、IL-3、IL-6、EPO和SCF的培养基中。可将该离体扩增的外周血液祖细胞施用给化疗后的癌症患者。并入本文参考的Itescu的美国专利申请公开2003/0199464描述了治疗涉及心肌细胞缺失的个体心脏障碍的方法。该方法包括给该个体施用一定量的能有效促使个体心脏内心肌细胞增殖的物质从而治疗该障碍。在一个实施方案中，该物质是人内皮祖细胞。该申请还描述了确定个体心肌细胞对凋亡敏感性的方法。并入本文参考的Itescu的PCT专利公开WO01/94420描述了剌激个体心肌梗塞损伤组织中血管生成的方法，该方法包含(a)从个体的一个位置上移出干细胞；(b)从这些干细胞中恢复内皮祖细胞；(c)将来自步骤(b)中的内皮祖细胞导入到个体的不同位置，使得前体迁移到该组织中并刺激该组织的再血管化。可以直接或通过迁移取出所述干细胞。在导入个体之前可扩增该内皮祖细胞。描述了在梗死部周围组织中诱导血管发生的方法。还描述了用于选择性增强将人骨髓衍生内皮细胞前体运输到由缺血损伤损害的组织的位置的方法，该方法包含(a)将内皮祖细胞施用给个体；(b)给个体施用趋化因子使得能够将内皮细胞前体吸引到缺血组织上。还描述了一种用于剌激个体心肌梗死损伤组织的血管发生或血管生成的方法，该方法包含将同种异型干细胞注射到个体体内。还描述了一种用于改进已经患有心肌梗死的患者的心肌功能的方法，该方法包含任何一种所述方法。还描述了一种用于改进已经患有心肌梗死的患者的心肌功能的方法，该方法包含将G-CSF或抗-CXCR4抗体注射到个体体内以动员内皮祖细胞。授予Gillis的美国专利5,199,942描述了接受细胞减数治疗的患者进行自身造血细胞移植的方法，该方法包括(1)在细胞减数治疗之前从患者的骨髓或外周血液中获得造血祖细胞；(2)用选自由白介素-3(IL-3)、青灰因子(SF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-l(IL-l)、GM-CSF/IL-3融合蛋白及其组合所组成的组中的离体生长因子来离体扩增造血祖细胞，从而提供包含祖细胞扩增细胞群的细胞制品；以及(3)与细胞减数治疗同步或在其之后将该细胞制品施用给患者。该方法任选地包括用募集生长因子将造血祖细胞募集至外周血液中的初步治疗以及用植入生长因子来促使细胞制剂中的造血祖细胞植入和增殖的后续治疗。本专利还描述了包含细胞培养基、离体生长因子和自体血清的造血祖细胞扩增培养基组成。并入本文参考的、授予Shoshan的美国专利4,656,130描述了胶原包被的细胞生长平板，该平板包括用胶原原纤维的存储稳定包被包被的基层。制备该胶原包被的细胞生长平板的方法包含将悬浮在蒸馏水中的生物活性胶原原纤维分布到组织培养皿中。其后，将含有该胶原原纤维悬浮液的平皿放置在设有无菌气流和紫外线灯的层流通风橱中。该原纤维沉淀并粘附在平皿底部，水蒸发到无菌气流中并在层流通风橱的排气处被去除，并且紫外线灯确保所得胶原原纤维薄层是无菌的并准备用于活细胞接种。还可将该方法描述成获得方便的预包被细胞生长平板，该平板当保持在室温中时可维持适度的贮藏期限而在细胞生长支持属性上没有任何明显的降低。并入本文参考的、授予Swiderek等人的美国专利5,932,473描述了用于盐溶液中含有细胞粘附促进剂的组合物包被的细胞培养基层。诸如塑料、玻璃或多孔纤维的基层用于0.005-0.5M柠檬酸盐溶液或硫酸盐溶液中含有大约5-1000ug/ml的聚-D-赖氨酸的组合物包被，以在供每平方厘米的基层上提供大约50-500ul的组合物。漂洗该包被的基层以去除外来杂质，并将其干燥以获得具有增加贮藏期限和/或稳定性的被包被的基层。该包被的基层可通过用诸如酒精的灭菌介质进行漂洗来进行灭菌。并入本文参考的、授予Septak的美国专利6,040,182描述了用于在组织培养治疗的塑料表面如聚苯乙烯分析平板上促进高蛋白结合能力的方法和材料。并入本文参考的、授予Ozkan的美国专利4,450,231描述了用以确定免疫复合物的血清样本或类似物的免疫测定法。描述了一种方法，该方法包括在塑料基底上产生能粘附在塑料基底上并具有吸收样本免疫复合物能力的非蛋白质、非离子聚合物的一个层面，将样本放置在该层面上并处理该层面以产生免疫复合物的量的指示。该聚合物可以是聚乙二醇、葡聚糖、聚氯乙烯、聚多元醇或聚乙二醇的加合物。用在该检定中的产品是由塑料、聚苯乙烯和聚氯乙烯制成的具有孔的平板或试管，并且在该平板孔或在该试管腔内具有所述非蛋白质、非离子聚合物层的一个层面。并入本文参考的、Kutryk等人的美国专利申请公开2003/0229393描述了用于产生如支架、支架移植物、合成血管移植物或心脏瓣膜等医疗设备的组合物和方法，这些医疗设备用整合了抗体、抗体片段或小分子的生物相容性基质包被，所述抗体、抗体片段或小分子识别、结合和/或与祖细胞表面抗原相互作用以便在设备的表面上固定细胞。该设备上的所述包被还可能含有化合物和生长因子，用于促进祖内皮细胞在该设备的表面上加速粘附、生长及结合的细胞分化为成熟和功能性内皮细胞以防止内膜超常增生。描述了用于制备所述医疗设备、组合物的方法以及治疗患有血管疾病如再狭窄、动脉粥样硬化或其他类型脉管梗阻的哺乳动物的方法。发明简述本专利申请详述了从组织中分离、分化和扩增干细胞的方法。例如，干细胞可包括内皮祖细胞(EPC)。可选或另外的，该组织可包括人体外周血液。典型地，将该干细胞移植到供体体内或另一个体体内(例如以便于增强血管生成和/或血管发生和/或新血管化)。本专利申请提供了用于获得含有适当数量功能性EPC的产品的方案。所述方法包括(a)从组织中提取细胞亚群；(b)在富集培养基中培养l-30天(或3—30或4、5、6、7或8天)扩增并分化EPC;和域(c)识别培养物的细胞组分；(d)将适当数量的EPC移植到患者体内。应当理解的是尽管在此所述一些实施方案特异性涉及衍生自血液的EPC，但是本发明的范围包括使用衍生自多种身体组织的干细胞的技术。对于一些应用，该方法包含从供体和/或患者中收集血液样品、从所述样品中分离外周血液单核细胞、从单核细胞级分中分离出富集CD31的细胞群和祖细胞以及在引起存在于细胞混合液中的造血祖细胞分化成EPC并进行增殖的条件下使这些细胞生长。可典型地利用这一离体扩增步骤，因为在循环中EPC的数量低于0.1X。这一增加阶段之后，可将这些细胞通过注射植入目标器官如患者的冠状动脉或心肌的血管中。因此，根据本发明的实施方案提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.068g/ml之间的细胞的数量。在一个实施方案中，将血细胞施加到第一梯度，包括将血细胞施加至lJ包J舌如Ficoll-PaquePlus(TM)(AmershamBiosciences,'Uppsala,Sweden)或Lymph叩rep(TM)(Axis-ShieldpoCAS,Oslo,Norway)或从其它来源得到的蔗糖和环氧氯丙烷的共聚物的梯度。在一个实施方案中，由技术人员现场制备该密度梯度。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度，包括将第一批细胞施加到包括如OptiPrep(TM)或Nycodenz(TM)(Axis-ShieldpoCAS,Oslo,Norway)的碘克沙醇水溶液的梯度。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度，包括将第一批细胞施加到包括如Percoll(TM)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)的聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶的梯度上。根据本发明的一个实施方案进一步提供了使用提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第二批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.068g/ml之间的第三批细胞的第三梯度；和通过培养第三批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.068g/ml之间的细胞的数量。在一个实施方案中，第三梯度适于选择密度在1.059到1.068g/nil之间的细胞，并且其中将第二批细胞施加到第三梯度包括选择密度在1.059到1.068g/ml之间的细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括(例如包被有)血浆和/或抗体的表面上温育第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，另外提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；禾口在包括促生长分子(growth-enhancingmolecule)而非胶原或纤连蛋白的表面上温育第二批细胞。在一个实施方案中，温育第二批细胞包括在除了促生长分子外还包括胶原和纤连蛋白至少其中一种的表面上温育第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还另外提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括最高为5%血清(例如没有血清、少于1%的血清或在1%到5%之间的血清)的培养基中培养第二批细胞1到5天。根据本发明的一个实施方案，仍另外提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括大于或等于10%血清的培养基中培养第二批细胞1到5天。在一个实施方案中，培养第二批细胞包括在少于20%血清的培养基中培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到L074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在低血清阶段，在包括少于10%的血清的培养基中培养第二批细胞；禾口在高血清阶段，在包括大于10%的血清的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞1到5天。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞1到30天。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞之前，在低血清阶段培养第二批细胞。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞之后进行在低血.清阶段培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，进一步提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的低含氧量和/或高碳酸(H/H)阶段，在H/H条件下培养第二批细胞；和在一至少1天的非H/H阶段，在非H/H条件下培养第二批细胞。在本专利申请文中和权利要求中，术语高碳酸(hypercapnia)指C02的浓度大于5%。在一个实施方案中，H/H和非H/H阶段是在一少于30天的培养期内，且在H/H条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天于H/H条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，H/H和非H/H阶段是在一少于30天的培养期内，且在H/H条件下培养第二批细胞包括在培养期的最后两天于H/H条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，H/H和非H/H阶段是在一少于30天的培养期内，且在H/H条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间的至少两小时于H/H条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，在非H/H条件下培养第二批细胞之前，在H/H条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，在非H/H条件下培养第二批细胞之后进行在H/H条件下培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，进一步提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括至少以下物质中之一的培养基中培养第二批细胞促红细胞生成素、VEGF、IGF、FGF、来自雌激素家族的分子(例如，17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚)、来自孕激素(progestin)家族的分子(例如，孕酮(progesterone)、hydroxyprogesteronecaroate、酉昔酸甲夢圣孕酮)、"[也汀类药物(例如，辛伐他汀(Simvastatin)、阿伐他汀(Atorvastatin))以及抗糖尿病药物(例如，罗格列酮(Rosiglitazone))。在一个实施方案中，抗糖尿病药物包括罗格列酮，且培养第二批细胞包括在含有罗格列酮的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，他汀类药物包括辛伐他汀或阿伐他汀，并且培养第二批细胞包括在包括辛伐他汀或阿伐他汀的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，来自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-e-雌二醇和孕酮，并且培养第二批细胞包括在包括17-P-雌二醇和/或孕酮的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，来自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-e-雌二醇和孕酮，并且培养第二批细胞包括在包括17-e-雌二醇的培养基中培养第二批细胞，并在一定时期后向其中加入孕酮。在一个实施方案中，来自雌激素和孕激素家族的激素分子包括17-P-雌二醇和孕酮，并且培养第二批细胞包括在包括孕酮的培养基中培养第二批细胞，并在一定时期后向其中加入17-e-雌二醇。根据本发明的一个实施方案，进一步提供了使用所提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和通过培养第二批细胞3到30天，增加密度在1.059到1.068g/ml之间的细胞的数量。在一个实施方案中，该方法包括从骨髓中提取干细胞。在一个实施方案中，该方法包括动员来自骨髓的干细胞以促进干细胞的提取。在一个实施方案中，该方法包括从血液、脐带血、胚胎、胎儿或胎盘中提取干细胞。在一个实施方案中，培养第二批细胞包括在培养的第一阶段于第一容器中培养第二批细胞；在培养的第一阶段末期从第一容器中取出至少一些第二批细胞；和在培养的第二阶段于第二容器中培养从第一容器中所取出的细胞。在一个实施方案中，取出至少一些第二批细胞包括选择取出粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，取出至少一些第二批细胞包括选择取出没有粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，第一容器包括在其表面上的促生长分子，并且在第一容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第一容器中培养细胞。在一个实施方案中，第二容器包括在其表面上的促生长分子，并且在第二容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第二容器中培养细胞。在一个实施方案中，促生长分子选自下列血浆(其可以是自体的、同种异型的或异种的)、胶原、纤连蛋白、生长因子以及干细胞表面受体的抗体。根据本发明的一个实施方案，因此提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；禾口在所培养的细胞中鉴定内皮祖细胞。在一个实施方案中，将血液施加到第一梯度包括将血液施加到包括蔗糖和环氧氯丙垸共聚物的溶液中。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到碘克沙醇(iodixanol)的水溶液中。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶体的梯度密度溶液中。在一个实施方案中，将血细胞施加到第一梯度包括将血细胞施加到Ficoll样梯度(Ficoll-likegradient)中。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到OptiPrep样梯度中。在一个实施方案中，将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到Percoll样梯度中。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用所提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第二批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.068g/ml之间的第三批细胞的第三梯度；通过培养第三批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.068g/ml之间密度的细胞的数量；及鉴别所培养的细胞中的内皮祖细胞。在一个实施方案中，第三梯度适于选择具有在1.059到1.068g/ml之间密度的细胞，并且其中将第二批细胞施加到第三梯度包括选择具有1.059到1.068g/ml之间密度的细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度.，将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括血浆的表面上培养第二批细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，培养包括当表面用自体血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。在一个实施方案中，培养包括当表面用选自由同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用组织的方法，包括在包括血浆的表面上培养组织。在一个实施方案中，该组织包括血液。在一个实施方案中，血浆包括自体血浆。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括抗体的表面上培养第二批细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。在一个实施方案中，培养包括当表面用自体血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。在一个实施方案中，培养包括当表面用选自由同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养第二批细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。在一个实施方案中，培养第二批细胞包括在表面上培养第二批细胞，除了包括促生长分子外，该表面还包括胶原和纤连蛋白中的至少一种。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括最高为5%血清的培养基中培养第二批细胞1到5天；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括大于10%血清的培养基中培养第二批细胞1到5天；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，培养第二批细胞包括在包括少于20%血清的培养基中培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；批细胞的第二梯度；在低血清阶段，在包括少于10%血清的培养基中培养第二批细胞；在高血清阶段，在包括大于或等于10%血清的培养基中培养第二批细胞；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养第二批细胞包括在包括最高为5%血清的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养第二批细胞包括在无血清培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞的时间在1到5天之间。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞的时间在1到30天之间。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞之前，在低血清阶段培养第二批细胞。在一个实施方案中，在高血清阶段培养第二批细胞之后进行在低血清阶段培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的低氧阶段中，在低氧条件下培养第二批细胞；在一至少1天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养第二批细胞；禾口鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天在低氧条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最后两天在低氧条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在低氧条件下培养第二批细胞至少2小时。在一个实施方案中，在非低氧条件下培养第二批细胞之前在低氧条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，在非低氧条件下培养第二批细胞之后在低氧条件下培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括雌激素的培养基并随后包括孕激素的培养基中培养所选细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括孕激素的培养基并随后包括雌激素的培养基中培养所选细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括雌激素和孕激素的培养基中培养所选细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，孕激素包括孕酮。在一个实施方案中，雌激素包括雌二醇。在一个实施方案中，培养包括培养3到30天。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养第二批细胞，高碳酸阶段特征在于大于5%的C02水平；在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞，非高碳酸阶段特征在于小于或等于5%的(:02水平；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，设定高碳酸阶段中的C02水平为至少6%。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天在高碳酸条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最后两天在高碳酸条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在高碳酸条件下培养第二批细胞至少2小时。在一个实施方案中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞之前在高碳酸条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞之后在高碳酸条件下培养第二批细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括选自以下至少一种物质的培养基中培养第二批细胞促红细胞生成素、VEGF、IGF、FGF、雌激素、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、来自孕激素家族的分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羟孕酮、他汀类药物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，施加组织包括将脐带血施加到第一梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胚胎细胞施加到第一梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胎盘细胞施加到第一梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胎儿细胞施加到第一梯度。在一个实施方案中，从骨髓中提取干细胞。在一个实施方案中，动员来自骨髓的干细胞以方便干细胞的提取。在一个实施方案中，从外周血提取干细胞。在一个实施方案中，培养第二批细胞包括在培养的第一阶段期间于第一容器中培养第二批细胞；在培养的第一阶段末从第一容器中取出至少一些第二批细胞；和在培养的第二阶段期间于第二容器中培养从第一容器中所取出的细胞。在一个实施方案中，取出至少一些第二批细胞包括选择取出粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，取出至少一些第二批细胞包括选择取出没有粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，第一容器在其表面上包括促生长分子，并且其中在第一容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第一容器中培养细胞。在一个实施方案中，促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。在一个实施方案中，第二容器在其表面上包括促生长分子，并且其中在第二容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第二容器中培养细胞。在一个实施方案中，促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及千细胞表面受体的抗体。根据本发明的一个实施方案，还提供了治疗疾病的方法，包括将内皮祖细胞(EPC)施加到选自如下的个体的组织附近或间隙个体的外周神经组织、个体的中枢神经系统神经组织、个体的视神经、个体的脉络膜组织、个体的视网膜组织、个体的视网膜下间隙、个体的角膜组织、个体的肾组织、个体的受损骨组织、个体的骨折的骨组织、个体的发炎组织、个体的被感染组织、个体的挫伤组织、个体皮肤的损伤、溃疡或创伤组织及个体的脑组织、个体的肢体组织、个体的皮肤移植物组织及个体的再植的断肢组织。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天，增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第二批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.068g/ml之间的第三批细胞的第三梯度；和通过培养第三批细胞3到30天，增加密度在1.055到1.068g/ml之间的细胞的数量。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括抗体的表面上培养第二批细胞。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.07化/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养第二批细胞。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括最高为5%血清的培养基中培养第二批细胞1到5天。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括大于10%血清的培养基中培养第二批细胞1到5天。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在低血清阶段，在包括小于10%血清的培养基中培养第二批细胞；禾口在高血清阶段，在包括大于或等于10%血清的培养基中培养第二批细胞。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的低氧阶段中，在低氧条件下培养第二批细胞；和在一至少1天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养第二批细胞。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养第二批细胞，高碳酸阶段特征在于大于5X的C02水平；和在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞，非高碳酸阶段特征在于小于或等于5X的C02水平。在一个实施方案中，该方法包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括选自下列至少一种物质的培养基中培养第二批细胞促红细胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕漠i素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羟孕酮、他汀类药物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮。将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞1到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞分成其各自的第一和第二部分；将第一批细胞的第一部分施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第一批细胞的第二部分与密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞混合.通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，划分第一批细胞包括设定第一部分大于第二部分。在一个实施方案中，划分第一批细胞包括设定第一部分小于第二部分。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到梯度以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过培养所选细胞3到30天来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。在一个实施方案中，增加细胞的数量包括培养细胞4到8天。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到包括蔗糖和环氧氯丙垸的共聚物的溶液中。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶的梯度密度溶液中。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到碘克沙醇的水溶液中。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到Ficoll样梯度中。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到OptiPrep样梯度中。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到Percoll样梯度中。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括自体血浆的表面上培养所选细胞3到30天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括抗体的表面上培养所选细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，培养包括当表面用自体血浆包被时在该表面上培养细胞。在一个实施方案中，培养包括当表面用选自同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养所选细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，培养细胞包括在表面上培养细胞，该表面除了促生长分子外还包括胶原和纤连蛋白中的至少一种。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括最高为5%血清的培养基中培养所选细胞1到5天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括大于10%血清的培养基中培养所选细胞1到5天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，培养细胞包括在包括小于20%血清的培养基中培养细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在低血清阶段，在包括少于10%血清的培养基中培养所选择的细胞；在高血清阶段，在大于或等于10%血清的培养基中培养所选择的细胞；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养细胞包括在包括最高为5%血清的培养基中培养细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养细胞包括在无血清培养基中培养细胞。在一个实施方案中，在低血清阶段培养细胞包括培养细胞1到5天。在一个实施方案中，在高血清阶段培养细胞包括培养细胞1到30天。在一个实施方案中，在高血清阶段培养细胞之前，在低血清阶段培养细胞。在一个实施方案中，在高血清阶段培养细胞之后，在低血清阶段培养细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在一至少2小时的低氧阶段中，在低氧条件下培养所选细胞；在一至少l天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养所选细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最初两天在低氧条件下培养细胞。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最后两天在低氧条件下培养细胞。在一个实施方案中，低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，并且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在低氧条件下培养细胞至少2小时。在一个实施方案中，在非低氧条件下培养细胞之前，在低氧条件下培养细胞。在一个实施方案中，在非低氧条件下培养细胞之后，在低氧条件下培养细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括:将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养所选择的细胞，高碳酸阶段特征在于大于5X的C02水平；在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养所选择的细胞，非高碳酸阶段特征在于小于或等于5X的C02水平；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，该方法包括设定高碳酸阶段中的C02水平为至少6%。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最初两天在高碳酸条件下培养细胞。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最后两天在高碳酸条件下培养细胞。在一个实施方案中，高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在高碳酸条件下培养细胞至少2小时。在一个实施方案中，在非高碳酸条件下培养细胞之前，在高碳酸条件下培养细胞。在一个实施方案中，在非高碳酸条件下培养细胞之后，在高碳酸条件下培养细胞。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有第一希望密度范围的细胞；在包括选自下列中至少一种物质的培养基中培养所选细胞VEGF、IGF、FGF、促红细胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-e-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羟孕酮、他汀类药物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别祖细胞包括鉴别EPC。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。在一个实施方案中，将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。根据本发明的一个实施方案，还提供了使用提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过培养所选细胞3到30天来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。在一个实施方案中，施加组织包括将脐带血施加到梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胚胎细胞施加到梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胎儿细胞施加到梯度。在一个实施方案中，施加组织包括将胎盘细胞施加到梯度。在一个实施方案中，该方法包括自骨髓提取干细胞。在一个实施方案中，该方法包括动员来自骨髓的干细胞以方便干细胞的提取。在一个实施方案中，该方法包括自血液提取干细胞。在一个实施方案中，该方法包括培养细胞，其包括在培养的第一阶段期间于第一容器中培养细胞；在培养的第一阶段末从第一容器中取出至少一些所述细胞；和在培养的第二阶段期间于第二容器中培养从第一容器中所取出的细胞。在一个实施方案中，该方法包括取出至少一些细胞包括选择取出粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，取出至少一些细胞包括选择取出没有粘附在第一容器表面上的细胞。在一个实施方案中，第一容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第一容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第一容器中培养细胞。在一个实施方案中，促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。在一个实施方案中，第二容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第二容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第二容器中培养细胞。在一个实施方案中，促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。具体实施方式根据本发明的一个实施方案，提供了用于从人体外周血液中分离、分化和生长内皮祖细胞(EPC)的方法。典型地将EPC植入到患者体内以诱导血管生成和/或血管发生和/或新血管化。典型地，由如Ficoll密度梯度分离的外周血单核细胞(PBMC)进一步通过一或多个其它密度梯度(如Percoll、OptiPrep或Nycodenz)来富集，接着使其能够粘附在组织培养皿上。细胞典型地在富集的培养基中生长3—30天。在培养期间的一些时间点上，采样进行表型评估。收集扩增的细胞并将其保存直到移植到患者体内。在下文中描述了根据本发明的实施方案在适当时可单独使用或组合使用的一系列方案。应当意识到的是提供的数值用于阐述而非限定。典型但非必要地，所示的每个数值是从所示数值的25%以内的数值范围内选出的例子。同样，虽然描述了具有很高水平特异性的某些步骤，但是本领域的普通技术人员将会意识到也可进行已作必要改动的其它步骤。组织培养皿包被方案如培养皿的适当容器可用EPC-促生长分子的一种或其组合来包被。这些分子可包含如CD34、CD133、Tie-2、VEGFR-2(KDR)、CD144的祖细胞表面受体的抗体或者如LDL、VEGF、FGF、IGF或血小板衍生生长因子(PDGF)的分子。实施例1:用自体血浆包被T-75烧瓶对于20个T-75烧瓶在细胞制备当天准备好用血浆包被T-75烧瓶表面可利用从离心分离的组织样品中取出的自体血浆来进行，或者可使用来自不同来源的血浆，如得自ChemiconofTemecula，CA、US的商购血浆。从Ficoll试管的上部级分中收集血浆。用2—5ml血浆填充每个烧瓶。在37'C中温育至少30分钟。清除血浆。在10ml的PBS中洗涤烧瓶两次。烧瓶准备使用。实施例2:用25Hg/ml的纤连蛋白包被T-75烧瓶对于20个T-75烧瓶(a)在细胞制备的当天准备好，或者(b)细胞制备的前一天准备好。在PBS中制备25ug/ml的纤连蛋白溶液50ml将250u1纤连蛋白5mg/ml加入到50ml的PBS中对每个烧瓶填充25iig/ml的纤连蛋白2-5ml。在37°C中温育至少30分钟。收集纤连蛋白溶液。如果将纤连蛋白保存在4t:、无菌50ml试管中，则纤连蛋白溶液可重复使用，典型地可保存最多l周。在PBS中洗涤烧瓶两次。在室温下干燥烧瓶。在室温下(RT)干燥的烧瓶可保存一周。实施例3:用纤连蛋白和5Ug/ml的抗-CD34包被T-75烧瓶对于20个T-75烧瓶(a)在细胞制备的当天准备好，或者(b)细胞制备的前一天准备好。如实施例1所述，用纤连蛋白包被烧瓶。在PBS中制备5ug/ml的抗-CD34溶液25ml将125y1的lmg/ml的抗-CD34加入到25ml的PBS中对每个烧瓶填充5ug/ml的抗-CD345ml。在37'C温育2小时或者在4'C温育过夜。撤出抗体溶液。在PBS中洗涤烧瓶两次。烧瓶备用。细胞制备通过轻柔地上下翻转血袋将血液混合。将血液从袋子中转移到500ml的无菌瓶中。将血液加载到Ficoll梯度中。用血液将试管填充到50ml。在1050g时于室温下不间断旋转试管20分钟。将大多数上层血桨收集在空的50ml试管内。从每个试管中收集白细胞层(例如PBMC)级分。将每个PBMC转移到新的50ml试管中，用15-20ml的PBS预填充。使用PBS将每个试管体积调整到30ml。在580g于室温下旋转试管15分钟并清除上清。轻柔地混合沉淀并用l-5ml的PBS重悬。将每四个试管中的内容物组合到一个50ml的试管中，并将该试管用PBS填充到50ml。例如(1)制备1.072g/ml的OptiPrep梯度。对于1.072g/ml的OptiPrep梯度36ml通过将如下溶液混合在一起来制备1.072g/ml的梯度(i)0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(缓冲到pH7.4)的溶液25ml与(ii)10mlOptiPrep溶液+5ml0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(缓冲至lJpH7.4)溶液的混合溶液llml。将(a)来自上述细胞制备步骤的10ml细胞与(b)10ml的OptiPrep溶液+5ml的0.5%人或牛的血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(缓冲到pH7.4)的溶液的10ml混合物混合在一起。将20ml的步骤(i)禾B(ii)中制备的1.072g/ml的OptiPrep梯度加至(a)与(b)的混合物的上方，并在其上方加上1.5ml0.5%人或牛血清白蛋白、0.8%NaCl、10mMHepes、lmMEDTA(缓冲到pH7.4)的溶液。在700g下离心30分钟，例如在室温或者4。C，无间断。从梯度和0.5X牛血清白蛋白、0.8。/。NaCl、10mMHepes、lmMEDTA、pH7.4的溶液之间的界面处收集分离的细胞。在395g于室温离心IO分钟。丢弃上清液并在10ml的培养基中重悬沉淀。(2)制备用于1.060-1.068g/ml细胞密度的Perco11梯度。例如，在50ml试管中，30ml连续Percoll梯度制备混合物13.5mlPercoll(Amersham)15.OmlMEM旋转修饰液(spinnermodification)1.5ml1OxEarle，s盐溶液在固定角度转子内于14000xg无间断离心10分钟。小心地将梯度从转子中取出。该梯度现在备用。所述试管应该能够抵抗14000xg离心。将所有的细胞施加到Percoll梯度中。在400xg无间断离心30分钟。收集富集的PBMC并转移到50ml试管中。用PBS充满试管，在300xg离心IO分钟。在50ml的PBS中重悬，于200xg离心IO分钟。在50ml的PBS中重悬，于200xg离心IO分钟。取50ul样品用于细胞计数。血清制备血清可直接从患者的凝固血浆中获得("除凝块(offtheclot)"血清)，或者从用抗凝血剂预处理过的血液中所产生的血桨来制备。例如，为了从用抗凝血剂预处理过的血液中制备血清采集从Ficoll试管的上部级分收集的血浆(见上述的细胞制备)。对于每50ml的血浆，加入1.2ml0.8M的CaCl22H20或者任何别的化学/生物凝固诱导物，如氯化钙、组织促凝血酶原激酶、凝血酶激动肽或其它物质以催化凝结机制。在37"C温育0.5-4小时。在3500g下离心凝固血浆10分钟。将血清收集到新的试管中。不要将凝结物并与血清混合。使用所收集的血清用于培养基制备，或者将其等份保存在-20。C直到使用。细胞计数对四个96w平板的每一个预先填充50u1的台盼蓝(TB)。通过将20ul的细胞样品转移至一个含有TB的孔中并上下吹打轻轻混合来制备l:5的稀释液。将10u1稀释后的细胞加载到血细胞计数器两个槽中的每一个。计数处于上下槽的中间25个方格内的透明细胞(活的)和蓝色细胞(死的)。如果计数少于10个细胞，则通过将50u1的细胞样品转移到50u1TB中来制备l:2的稀释液。如果计数多于200个细胞，则通过20nl的1:5的悬浮液转移到一个含有TB的孔中并通过上下吹打轻柔混合来制备h25的稀释液。根据下面的等式计算每个槽的细胞数活细胞数x10000x稀释因子二活细胞数/ml死细胞数x10000x稀释因子二死细胞数/ml%死细胞=死细胞数/(活细胞数+死细胞数)x100°/。死细胞典型地不超过30%。计算平均细胞数记录计数结果。总结最终细胞数并得到细胞/ml血液。培养基制备计算所需培养基的体积制备培养基。培养基应含有1-20%的自体血清。培养基可以0.5pg/ml-lng/ml、或者lng/ml-100ug/ml的不同浓度含有以下添加剂，例如EPO(0.01-10IU/ml)、IGF(l-100ng/ml)、FGF10-100ng/ml、VEGF(0.5-20ng/ml);肝素5-100IU/ml;不同分子根据它们的分子量及所需的体积摩尔浓度，范围可以是从pg-ug，或者相应的体积摩尔浓度他汀类分子(例如辛伐他汀5-100ug/ml)、抗糖尿病药物(例如罗格列酮5-500ug/ml)，和/或类固醇激素，如雌激素(例如17-e-雌二醇(2-2000ng/ml)和孕激素(例如孕酮2-2000ng/ml)及其组合。假设类固醇生殖系统激素(例如雌激素和孕激素)通过升高EPC血液水平来施加它们的影响。因此，特别是当来自外周血液的细胞受到它们的影响时，施加这些分子或其组合可增加生产产量或在体外将祖细胞分化为EPC。低％血清培养基的例子对于100ml培养基加入100iig/ml的VEGF2u1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(终浓度为5U/ml)5ml的自体血清94.9ml的无血清培养基高％血清培养基的例子1对于100ml培养基加入100ug/ml的VEGF2u1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(终浓度为5U/ml)20ml的自体血清79.9ml的无血清培养基高％血清培养基的例子2对于100ml培养基加入100iig/ml的VEGF5u1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(终浓度为5U/ml)5mg/ml的孕酮4P1(终浓度为0.2ug/ml)10ml的自体血清89.9ml的无血清培养基高％血清培养基的例子3对于100ml培养基加入100iig/ml的VEGF5y1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100p1(终浓度为5U/ml)0.05mg/ml的17-P-雌二醇4u1(终浓度为0.002pg/ml)10ml的自体血清89.9ml的无血清培养基高％血清培养基的例子3对于100ml培养基加入100ug/ml的VEGF5y1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(终浓度为5U/ml)0.05mg/ml的孕酮4u1(终浓度为0.002ug/ml)0.005mg/ml的17-P-雌二醇4u1(终浓度为0.0002ug/ml)10ml的自体血清89.9ml的无血清培养基高％血清培养基的例子4对于100ml培养基加入100ug/ml的VEGF2u1(终浓度为10ug/ml)5000U/ml的肝素100u1(终浓度为5U/ml)570uM的辛伐他汀330ul(终浓度为0.95uM)10ml的自体血清89.6ml的无血清培养基培养将混合的细胞悬液分开。在500g下于室温离心试管15分钟，丢弃上清液。轻轻混合细胞沉淀并重悬细胞至5-50X106/ml。种下l-5Xl(^细胞/ml。在37'C、5%032下温育烧瓶。在含有低血清水平(例如最高为5%)的培养基中温育细胞。或者或另外，使用高(>10%)血清水平。根据本发明的一个实施方案，在高血清培养基中温育之前先在低血清培养基中温育细胞。或者，在高血清培养基中温育之后在低血清培养基中温育细胞。根据一个实施方案，(a)在高血清培养基(>10%血清)中温育之前，在包含0.5%-5%血清的培养基中温育，以及(b)(i)在0.5%-5%血清培养基中温育之前、(ii)在包含0.5%-5%血清培养基中温育与在高血清培养基中温育之间、和/或(iii)在高血清培养基中温育之后，在无血清培养基中进行温育。或者，(a)在高血清培养基(>10%血清)中温育之后，在包含0.5%-5%血清的培养基中温育，以及(b)(0在0.5%-5%血清培养基中温育之前、(ii)在高血清培养基中温育与在包含0.5%-5%血清的培养基中温育之间、和/或(iii)在高血清培养基中温育之前，在无血清培养基中进行温育。在一个实施方案中，利用无血清培养基进行在此所描述的关于低血清培养基的技术。通过将细胞培养物暴露于低氧和/或高碳酸(H/H)2-12小时、12-24小时、24-36小时或36-48小时可获得升高的细胞扩增和分化。这可在细胞培养期间在不同的点上进行一或多次。(见下面应用低氧方案的例子)。在本专利申请的上下文以及权利要求中，术语高碳酸指C02的浓度大于5%。在培养的最初三天之后，细胞在含有高水平血清(例如，>10%)的培养基中生长。进行培养物形态学检查。每2-3天更新培养基。例如，当细胞在T-75烧瓶中培养时1、将细胞收集到50ml试管中。2、用5ml新鲜培养基填充每个烧瓶3、在450g、于室温离心试管10分钟，丢弃上清液。4、轻柔混合细胞沉淀并将细胞重悬于每个烧瓶的5ml新鲜培养基中。5、将5ml的细胞悬液返回到每个烧瓶中6、采样细胞用于荧光激活细胞分选术(FACS)和/或每几天(例如第6、9、13、16、20、24和30天)进行免疫组织学分析。7、无论何时处理培养物均观察并记录培养物形态学。8、在过程的开始和结束以及在培养期间每10天从生长皿中采样培养物用于无菌测试。9、收集所有培养的细胞(见下面的"用于FACS染色的细胞收集"部分)应用低氧和/或高碳酸对于一些应用来说，通过将细胞培养物暴露给低氧条件(例如1-5%或者5-15%氧)或者暴露给高碳酸条件(例如6-10%CO2)2-48小时可获得增加的细胞扩增和分化。这典型地可在细胞培养期间在不同的点上进行一或多次。例如在培养的第一天，可控氧培养箱中温育T-75烧瓶。将氧压设定在5%和/或将(^02浓度设定高于5%(例如6%-8%或8%-10%)，并维持这一水平6小时。从培养箱中取出烧瓶并检査所述培养物。提取细胞样品并通过台盼蓝排除方法测试存活力。将培养箱的氧压设定在21%和/或将C02浓度设定为5%。再次将烧瓶放入培养箱中并继续培养剩余的时间。这一过程可重复进行，例如培养期间每周一次和/或在培养终止前的24、48或72小时内进行。在一个实施方案中，在C02小于或等于5。％的环境中培养之前将细胞在高碳酸条件下培养。或者或另外地，在C02小于或等于5X的环境中培养之后将细胞在高碳酸条件下培养。粘附和/或分离和/或漂浮细胞的再种植例如对于一些应用来说，通过将所收集的细胞再种植到新的预包被的培养皿中的培养基中可实现增加的细胞扩增和分化。在培养的第三或第四天，收集所有培养的细胞。(见下面的部分，"用于FACS染色的细胞收集")在450g于室温离心试管10分钟。丢弃上清液。接着，轻柔地混合沉淀并将细胞重悬于每个烧瓶的10ml新鲜培养基中。最后，将悬浮细胞种植在新的预包被的T-75烧瓶中。继续培养这些细胞，并进行本文描述的适当的所有其它活动(例如，培养基更新、目测检查和/或流式细胞计量术)。这一过程可在培养期间每周进行和/或在培养终止前的24、48或72小时内进行。细胞保藏可将细胞保存在保藏培养基中或者冷冻在冷冻缓冲液中直到使用，例如植入到患者体内。用于FACS染色的细胞收集将细胞收集到50ml的试管中。用冷的PBS通过移液管小心地洗涤烧瓶表面以除去粘附的细胞。将所洗涤的粘附细胞收集到50ml的试管中。加入5ml的冷PBS。用细胞刮棒通过轻柔地圆周运动来除去剩余的粘附细胞。收集所分离的细胞并将它们加入到试管中。当适当时，加入5ml的EDTA并在37"C温育5分钟。收集所分离的细胞并将它们加入到试管中。在450g下于室温离心试管5分钟。将沉淀重悬在2-5ml的PBS中。对细胞进行计数并记录计数结果。总结最终细胞数量以及每个操作日的产量/种植细胞的数量。将等体积的细胞分入到FACS。FACS染色用PBS洗涤细胞。在450g下、4-8'C离心试管5分钟。通过倒掉缓冲液并吸去组织上的剩余来完全丢弃上清液。轻柔地混合细胞沉淀。加入染色试剂(根据染色表)并混合细胞沉淀。在黑暗中在冰水上温育试管15-30分钟。用PBS洗涤细胞。在450g下、4-8'C离心试管5分钟。通过倒掉缓冲液并吸去组织上的剩余来完全丢弃上清液。轻柔地混合细胞沉淀。每个试管加入0.5ml的PBS(或更少，如果试管含有少于1乂106个细胞)。如果可以看见聚积，则将细胞悬液通过200um筛。用FACS机器读取染色结果。总结并记录FACS结果。集落形成测试1、收集培养的细胞(见"用于FACS染色的细胞收集"部分)2、将100乂103细胞悬浮在0.7ml富集培养基中，该富集培养基为含有50ng/mlSCF、2IU/mlEPO、5ng/mlIL-3和25mg/mlBTI-内皮细胞生长补剂(ECGS)的M199。3、向圆底试管中加入如下成分并轻柔地混合；3丄甲基纤维素2X-1.4ml3.2.FCS隱0.9ml3.3.细胞悬液0.7ml4、将3ml的每种混合物种植到两个35mm平皿中(每个1.5ml)。5、将两个35mm平皿放入含有用ddH20预填充另外一个35mm平皿的100mm平皿中6、在37。C、5%C02、97%湿度下温育。7、用倒置显微镜，在10-14天后对集落评分管形成测试(tubeformationtest)1、在4°C融解ECMatrix过夜。2、将IOX稀释缓冲液100微升加入到无菌微离心试管内的900微升ECMatrix溶液中。3、轻柔地混合；不能将空气吸到溶液中。将溶液放在冰上以避免凝固。4、将40微升的缓冲过的ECMatrix溶液转移到已经在4'C预冷过夜的96-孔组织培养平板的每个孔中。5、在37。C温育至少1小时以便混合溶液能够凝固。6、收集所培养的细胞(见"用于FACS染色的细胞收集"部分)7、在含有10%人血清、25微克/ml的BTI-内皮细胞生长补剂(ECGS)和于M199内的5IU/ml肝素的富集培养基中将细胞悬浮至0.15X106/ml。8、将每个孔150微升的细胞悬液移到聚合的ECMatrix的表面上。9、在37。C、5%C02、97%湿度中温育过夜。10、在40X-200X放大倍数的倒置光显微镜下观察管形成。细胞说明如果细胞要移植到人体内，则典型地应当满足下列条件(I)通常细胞应当没有任何细菌或病毒污染。(II)细胞形态特征应为(a)尺寸上大于淋巴细胞和/或(b)伸长的、梭形或不规则形状和/或(c)粒状或深色核(darknucleated)和/或(d)具有鞭毛状结构或伪足和/或(e)形状上为成纤维细胞样或多边形。(III)最终细胞悬液应当通常含有至少1X1()S个细胞，这些细胞表达一或多个标记CD31，禾口/或CD34,和/或CD133，和/或CD34+CD133，和/或KDR，和/或CD34+KDR,和/或CD144，和/或冯维勒布兰德因子(vonWillebrandfactor),禾口/或SH2(CD105)，禾口/或SH3，和/或纤连蛋白，和/或胶原(1、III和IV型)，禾口/或ICAM(1或2型)禾口/或VCAM1和/或波形蛋白和/或BMP-RIA禾口/或BMP-RII禾口/或CD44和/或整联蛋白bl禾口/或aSM-肌动蛋白和/或MUC18和/或对于酶反应Dil-Ac-LDL是阳性的。根据本发明的实施方案获得的结果实施例1.如上所述，使用Ficoll(第一批)和OptiPrep(第二批)在七个独立实验中进行EPC的两次分离。表1中的结果显示了第二批细胞中CD34+细胞富集百分比。富集定义为第二批后的CD34+细胞的百分比除以使用OptiPrep的第一批后的CD34+细胞百分比。表l.第二批细胞中XCD34的富集<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>实施例1.在一组单独的实验中，在存在培养基的纤连蛋白包被的T-75烧瓶中体外生长之后用管形成测试评估第一批富集的EPC产生管的能力，所述培养基含有高血清水平(〉10%自体血清或非自体血清)、1、2、10或20ng/ml的VEGF、和5-25IU/ml的肝素。图1呈现了典型的管形成图象。在这些用人血进行的实验中，使用本文上面描述的方案，利用x4和x20放大率的倒置显微镜(NikonECLIPSETS100)获得图像。图1显示了来自培养物中第一批EPC富集物的管形成测试。实施例2.在一组单独的实验中，在存在培养基的纤连蛋白包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第二批细胞的EPC富集物，所述培养基含有自体血清、VEGF、b-FGF、IGF和肝素。实施例2的表中总结了20个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。在这些用人血进行的实验中，使用本文上面描述的方案，在含有高血清水平(>10%)和l、2、10或20ng/ml的VEGF的培养基中培养的细胞的FACS染色结果示出了从0天到13天染色水平的如下改变:实施例2的表.在13天培养后第二批EPC富集<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>实施例3.在一组单独的实验中，在存在培养基的纤连蛋白包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC的富集，所述培养基含有自体血清、VEGF和肝素。实施例3的表中总结了独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。总结在含有5-20%自体血清(典型为10%);1、2、10或20ng/ml的VEGF和5-25IU/ml肝素的培养基中培养的细胞的FACS染色结果。分析下列表面标记CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34和CD117、和EPC/内皮细胞标记CD133、KDR(VEGF-R)、CD144和Dil-Ac-LDL。实施例3的表.在存在VEGF的情况下在纤连蛋白预包被的烧瓶中培养的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>实施例4.在一组单独的实验中，在存在培养基的自体血浆包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC富集，所述培养基含有自体血清、VEGF和肝素。实施例4的表中总结了17个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。总结在含有5-20%自体血清(典型为10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF禾Q5-25IU/ml肝素的培养基中培养的细胞的FACS染色结果。分析下列表面标记:CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34和CD117、和EPC/内皮细胞标记CD133和KDR(VEGF-R)。实施例4的表.在血浆包被的烧瓶中培养的第一批EPC的特征标记AVGSECD4589.461.75CD346.941.29CD1174.250.72CD1332.030.57KDR1.310.39实施例5.在一组单独的实验中，在存在培养基的自体血浆包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC富集，所述培养基含有自体血清、VEGF、孕酮和肝素。实施例5的表中总结了3个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。总结在含有5-20%自体血清(典型为10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF、0.02-2微克/ml的孕酮和5-25IU/ml肝素的培养基中培养的细胞的FACS染色结果。分析下列表面标记CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34和CD117、和EPC/内皮细胞标记CD133和KDR(VEGF-R)。实施例5的表.在存在孕酮的情况下在血浆预包被的烧瓶中培养的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例6.在一组单独的实验中，在存在培养基的自体血浆包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC的富集，所述培养基含有自体血清、VEGF、17-e-雌二醇和肝素。实施例6的表中总结了3个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。总结在含有5-20%自体血清(典型为10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF，0.002-2微克/ml的17-P-雌二醇和5-25IU/ml肝素的培养基中培养的细胞的FACS染色结果。分析下列表面标记CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34和CD117、和EPC/内皮细胞标记CD133禾nKDR(VEGF-R)。实施例6的表.在存在17-3-雌二醇的情况下在血浆预包被的烧瓶中培养的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例7.在一组单独的实验中，在存在培养基的用血浆和抗CD34抗体包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC的富集，所述培养基含有自体血清、VEGF和肝素。实施例7的表中显示了2个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。显示了在用5ml自体血浆和0.5-10微克/ml抗人CD34包被的T-75烧瓶中在含有5-20%自体血清(典型为10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF和5-25IU/ml肝素的培养基中培养的细胞的FACS染色结果。分析下列表面标记CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34和CD117、和EPC/内皮细胞标记CD133和KDR(VEGF-R)。实施例7的表.在血浆和抗CD34包被的烧瓶中培养的第一批EPC的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>实施例8.在一组单独的实验中，在高XC02湿环境中，在存在培养基的纤连蛋白包被的T-75烧瓶中体外生长之后，评估来自第一批细胞的EPC的富集，所述培养基含有自体血清、VEGF和肝素。实施例8的表中总结了3个独立实验的流式细胞计量术百分比染色结果。使用本文上面描述的方案，用人血进行这些实验。温育之前，细胞显示少于1%CD34。显示了在37。C、6.5-12.5%(:02和97%湿度下温育的5-20%自体血清(典型为10%)，1、2、10或20ng/ml的VEGF，0.002-2微克/ml的17-P-雌二醇和5-25IU/ml肝素。分析下列表面标记CD45(泛淋巴细胞标记)、干细胞/祖细胞标记CD34、和EPC/内皮细胞标记CD133。实施例8的表.在含有高碳酸条件的潮湿环境下培养的第一批EPC的特征标记AVGSECD45卯.474.53CD3423.7717-93CD1334.482.10对机体组织的血液供给完全或部分丧失(缺血)在许多疾病中或者是疾病结果的原因或者造成疾病结果的中期阶段的常见机制。在供给上的这一短缺导致受影响的组织进行性地变得不能完成其功能，导致由于营养丧失、主要是氧的丧失以及代谢物如co2的聚集所产生的病理过程的开始。如果这些过程很严重，它们最终导致细胞和组织死亡。诱导新血管形成以增加或代替受损害的血液供给导致了受影响组织或器官的功能的恢复，并防止受影响的细胞的死亡。心脏病学家实施的对缺血器官恢复血液供给(例如，通过冠状血管移植物手术和球囊血管成形术)的原则是恢复心脏功能并防止进一步的恶化。这一侵入性方法通常仅在较大和中等大小的血管发生梗塞时可行。然而，在许多与血管化衰退有关的疾病中，梗塞发生在并不适用于这类介入的小血管中。在本发明的一个实施方案中，给血液匮乏的器官和组织供应EPC以便利用将自身或非自身内皮祖细胞/干细胞直接注入到缺血组织或者该缺血组织周围的亲代血管中，通过在匮乏器官中产生新的血管来增加或代替缺陷的血管化。这种脉管系统的成功创建通常恢复功能、防止进一步恶化、阻断在血液供给丧失所继发的病理过程形成、和/或防止受影响器官的细胞死亡。此外，在一些情况下，在器官某些区域内可控血管形成减少了器官内其他区域的会降低器官功能的病理血管化。在本发明的一个实施方案中，对器官或组织供应EPC来治疗一或多种如下的缺血相关病症。受损的血液供应的改善结果通常部分或完全治愈了疾病或者导致病症进展的停止或减慢。*青光眼。这种疾病包括与视神经头部(opticnervehead)缺血相关的视神经纤维的进行性死亡。导致视神经头脉管系统康复的治疗通常阻止疾病发展并恢复视神经的一些功能(至少在那些尽管在神经头部处轴突已经损害，但细胞体还没有死亡的视神经纤维上)。在本发明的一个实施方案中，将EPC注射到视神经头部和/或其周围通常产生希望的脉管系统诱导。(见上述FlammeraJ等人的文章)*年龄相关黄斑变性。这一疾病与脉络膜中的循环紊乱有关，脉络膜是为视网膜外层供血以满足其代谢需求的血管组织。这些紊乱损害视网膜，导致其进行性死亡并相继引起视觉功能降低。在本发明的一个实施方案中，将EPC注射到脉络膜中通常阻止疾病的进展并防止失明。(见上述ZarbinMA的文章)*糖尿病视网膜病。这一疾病是导致视网膜局部缺血因此水肿而损害视觉的小血管疾病。虽然发生新血管化，但是其作为缺血的结果还会发生，并且它发生在对精确视觉最重要的区域一一视网膜中区(macula)，从而损害视觉。在本发明的一个实施方案中，通过将EPC施予到邻近但不在视网膜中区之中的区域而产生的可控诱导血管生长来减少或者消除视网膜中区内血管生长和水肿形成。这一EPC诱导的可控诱导血管生长典型地给视网膜供应充足的血液以消除视网膜对视网膜中区血管化的需求。(见上面参考的FrankRN的文章以及上面参考的SingletonJR等人的文章。)*糖尿病肾病。这一疾病涉及肾脏血管的动脉粥样硬化堵塞和肾脏的血液过滤结构的破坏从而导致必须进行透析的肾衰竭。在本发明的一个实施方案中，通过将EPC注射到肾脏中诱导血管替换而阻止该过程。(见上面参考的BahlmannFH等人的文章。(2004))*骨不结合。这一在外伤和手术后发生的事通常由受影响骨的骨折/手术切口区域内血液供应不足造成的。在本发明的一个实施方案中，对受影响骨的骨折/手术切口区域局部应用EPC可恢复血管化并使损伤康复。*慢性皮肤溃疡。这些损伤是皮肤相关区域受损的血液供应的结果。在本发明的一个实施方案中，对慢性皮肤溃疡局部应用EPC可恢复血液供应并通常导致伤口愈合。*中风后血管性痴呆。这一状态由大脑中血管的进行性不可逆闭合所产生。在本发明的一个实施方案中，给大脑供应EPC可恢复至少部分受损循环从而恢复脑功能和/或使脑功能恶化减慢。*糖尿病血管病变。在肢体上的这一小血管进行性梗塞通常是引起手术截肢的原因。在本发明的一个实施方案中，通过在受影响肢体处局部注射EPC恢复循环来防止这种截肢。类似所有的移植，皮肤移植物倚赖血液供给存活(例如，见上述Greenfield编辑的书籍和上述Kouwenhoven等人的文章。)游离移植物和皮瓣都有因为血管化不足而失败。游离移植物需要在床上足够的血管化，而皮瓣需要自己连续的血液供应直到建立局部吻合(例如，见上述BrowneEZ等人、Chen等人以及Beatrice等人的文章)。对于由人工皮肤制成的移植物这也是正确的(例如，见上述Ferretti等人的文章)。在这些例子中，良好的血管化是移植物的最佳神经移植术的先决条件。在本发明的一个实施方案中，通过用EPC种植皮肤移植物来诱导血管化。这种EPC诱导血管化通常增加皮肤移植物存活的可能性。对于一些应用来说，使用了这种EPC种植技术并结合了修改的上述Scheduler等人的文章中所述内皮细胞移植技术。在本发明的一个实施方案中，通过在断肢再接期间将EPC种植在连接位置处可诱导血管化。这种EPC种植通常帮助恢复再接肢体的微循环。注意的是本文上面所述的指示仅是治疗性使用EPC的例子。在本发明的其它实施方案中，其中血液循环受损的其它病症可通过给血管不足或没有血管的位置恰当地应用EPC来进行治疗。还值得注意的是本文所述的关于在给心脏病患者施用前增加干细胞群的技术也适用于具有本文上述任何一种病症的患者。本发明的一个实施方案包含实施在一或两个下面临时专利申请中所述的技术(任选结合本文所述技术)(a)2004年6月1日提交的、题为"Invitrotechniquesforusewithstemcells"的美国临时专利申请60/576,266，禾口(b)2004年7月15日提交的、题为"Indicationsforstemcelluse"的美国临时专利申请60/588,520。这两个申请都转让给本专利申请的受让人，并并入本文参考。在正在进行的临床研究中评价了从第一批细胞中富集的EPC的安全性和效力。这些实验利用本文上述方案用患者的自体血液进行。由TheraVitae发起并根据本发明的一个实施方案进行的临床试验中已经登记了16名在最大药物治疗中仍患有严重心绞痛的患者。如心血管临床试验的常规做法一样，跟踪这些患者达6个月。每名患者用治疗后的状态与治疗前的状态相比构成他/她的自身对照。下面显示了已经跟踪至少三个月的最初十名患者的一些结果。应当强调的是本文所显示的结果不是完整的，临床试验结束后将进行数据的全面分析。安全性-该治疗显示了很高的安全特性。有限数量的患者发展了被界定为可能与治疗有关的轻微的不良事件(在血管造影期间红细胞沉降率升高、胸部疼痛)。在短暂时期后这些现象消失并不影响患者的临床状态。效力(见表1、2禾B3)-如在加拿大心血管协会对心绞痛评分等级(CanadianCardiovascularSocietyGradingScaleforAnginaPectoris)(CCS)中的改进所示，所有患者一般临床症状均有所改善，显示了更好的活动能力。所有患者改善了他们无心脏症状的行走能力。这一发现还通过估计的运动负荷(workload)的增加而被支持，通过sestamibi扫描进行活动能力的客观评估。两个结果显示了很高的统计学显著性。表I:由加拿大心血管协会对心绞痛评分等级(CCS)所证明的患者的临床改善<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表III:由评估工作量(METs)所证明的在3个月时的患者改善在一个实施方案中，可给人或动物施用本文任一权利要求记述的由任一技术所产生的EPC。在一个实施方案中，在治疗血管和/或心脏紊乱、或者治疗衰老、或者治疗系统紊乱、或者治疗多系统紊乱中可使用本文任一权利要求记述的任一技术所产生的EPC。对于一些应用，本文所述技术可应用于动物组织。本领域的技术人员将会意识到本发明并不限于本文所特定示出和描述的。而是，本发明的范围包括本文上述各种特征的组合及子组合，以及其在现有技术中没有的改动和修正，本领域的技术人员在阅读前面说明时将会想到这些改动和修正。权利要求1、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；和鉴别所培养的细胞中的内皮祖细胞。2、根据权利要求1的方法，其中将血液施加到第一梯度包括将血液施加到包括蔗糖和环氧氯丙垸的共聚物的溶液中。3、根据权利要求l的方法，其中将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到碘克沙醇的水溶液中。4、根据权利要求1的方法，其中将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶的梯度密度溶液中。5、根据权利要求1的方法，其中将血细胞施加到第一梯度包括将血细胞施加到Ficoll样梯度中。6、根据权利要求1的方法，其中将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到OptiPrep样梯度中。7、根据权利要求1的方法，其中将第一批细胞施加到第二梯度包括将第一批细胞施加到Percoll样梯度中。8、一种使用所提取的干细胞的方法，包括-将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第二批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.068g/ml之间的第三批细胞的第三梯度；和通过培养第三批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.068g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的内皮祖细胞。9、根据权利要求8的方法，其中第三梯度适于选择密度在1.059到1.068g/ml之间的细胞，并且其中将第二批细胞施加到第三梯度包含选择密度在1.059到1.068g/ml之间的细胞。10、一种使用所提取的血液的方法，包含将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包含血浆的表面上培养第二批细胞；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。11、根据权利要求10的方法，其中培养包括当所述表面用自体血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。12、根据权利要求10的方法，其中培养包括当所述表面用选自同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。13、一种使用组织的方法，包含在包含血浆的表面上培养组织。14、根据权利要求13的方法，其中所述组织包含血液。15、根据权利要求13的方法，其中所述血浆包含自体血浆。16、一种使用所提取的血液的方法，包含将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包含抗体的表面上培养第二批细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。17、根据权利要求16的方法，其中祖细胞包括内皮袓细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包含鉴别EPC。18、根据权利要求16的方法，其中培养包括当所述表面用自体血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。19、根据权利要求16的方法，其中培养包括当所述表面用选自同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养第二批细胞。20、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包含促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养第二批细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。21、根据权利要求20的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。22、根据权利要求20的方法，其中培养第二批细胞包括在除了促生长分子外还包含胶原和纤连蛋白中的至少一种的表面上培养第二批细胞。23、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括高至5%的血清的培养基中培养第二批细胞1到5天；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。24、根据权利要求23的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。25、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括大于10%的血清的培养基中培养第二批细胞1到5天；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。26、根据权利要求25的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包含鉴别EPC。27、根据权利要求25的方法，其中培养第二批细胞包括在包含少于20%的血清的培养基中培养第二批细胞。28、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在低血清阶段，在包括少于10%的血清的培养基中培养第二批细胞；在高血清阶段，在大于或等于10%的血清的培养基中培养第二批细胞；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。29、根据权利要求28的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。30、根据权利要求28的方法，其中在低血清阶段培养第二批细胞包括在包含最高为5%的血清的培养基中培养第二批细胞。31、根据权利要求28的方法，其中在低血清阶段培养第二批细胞包括在无血清的培养基中培养第二批细胞。32、根据权利要求28的方法，其中在低血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞1到5天。33、根据权利要求28的方法，其中在高血清阶段培养第二批细胞包括培养第二批细胞1到30天。34、根据权利要求28的方法，其中在高血清阶段培养第二批细胞之前，在低血清阶段培养第二批细胞。35、根据权利要求28的方法，其中在高血清阶段培养第二批细胞之后，在低血清阶段培养第二批细胞。36、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的低氧阶段中，在低氧条件下培养第二批细胞；在一至少1天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养第二批细胞；及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。37、根据权利要求36的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。38、根据权利要求36的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天在低氧条件下培养第二批细胞。39、根据权利要求36的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最后两天在低氧条件下培养第二批细胞。40、根据权利要求36的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在低氧条件下培养第二批细胞至少2小时。41、根据权利要求36的方法，其中在非低氧条件下培养第二批细胞之前，在低氧条件下培养第二批细胞。42、根据权利要求36的方法，其中在非低氧条件下培养第二批细胞之后，在低氧条件下培养第二批细胞。43、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括雌激素的培养基中并随后在包括孕激素的培养基中培养所选择的细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。44、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括孕激素的培养基中并随后在包括雌激素的培养基中培养所选择的细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。45、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过在包括孕激素和雌激素的培养基中培养所选择的细胞来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。46、根据权利要求43-45任一项的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。47、根据权利要求43-45任一项的方法，其中孕激素包括孕酮。48、根据权利要求43-45任一项的方法，其中雌激素包括雌二醇。49、根据权利要求43-45任一项的方法，其中培养包括培养3到30天。50、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养第二批细胞，高碳酸阶段特征在于C02水平大于5%;在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞，非高碳酸阶段特征在于C02水平小于或等于5X;以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。51、根据权利要求50的方法，其中祖细胞包括内皮袓细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。52、根据权利要求50的方法，包括在高碳酸阶段设定C02水平为至少6%。53、根据权利要求50的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天在高碳酸条件下培养第二批细胞。54、根据权利要求50的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最后两天在高碳酸条件下培养第二批细胞。55、根据权利要求50的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养第二批细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在高碳酸条件下培养第二批细胞至少2小日寸。56、根据权利要求50的方法，其中在非高碳酸条件下培养第二批细胞之前，在高碳酸条件下培养第二批细胞。57、根据权利要求50的方法，其中在非高碳酸条件下培养第二批细胞之后，在高碳酸条件下培养第二批细胞。58、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括选自下列至少一种物质的培养基中培养第二批细胞促红细胞生成素、VEGF、IGF、FGF、雌激素、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、来自孕激素家族的分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羟孕酮、他汀类药物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。59、根据权利要求58的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。60、一种使用所提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；禾口鉴别所培养的细胞中的祖细胞。61、根据权利要求60的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。62、根据权利要求60的方法，其中施加组织包括将脐带血施加到第一梯度。63、根据权利要求60的方法，其中施加组织包括将胚胎细胞施加到第一梯度。64、根据权利要求60的方法，其中施加组织包括将胎盘细胞施加到第一梯度。65、根据权利要求60的方法，其中施加组织包括将胎儿细胞施加到第一梯度。66、根据权利要求60的方法，包括自骨髓提取干细胞。67、根据权利要求60的方法，包括动员来自骨髓的干细胞以方便干细胞的提取。68、根据权利要求60的方法，包括自外周血提取干细胞。69、根据权利要求60的方法，其中培养第二批细胞包括在培养的第一阶段期间于第一容器中培养第二批细胞；在培养的第一阶段末期从第一容器中取出至少一些第二批细胞；和在培养的第二阶段期间于第二容器中培养从第一容器中所取出的细胞。70、根据权利要求69的方法，其中取出至少一些第二批细胞包括选择取出粘附在第一容器表面上的细胞。71、根据权利要求69的方法，其中取出至少一些第二批细胞包括选择取出没有粘附在第一容器表面上的细胞。72、根据权利要求69的方法，其中第一容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第一容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第一容器中培养细胞。73、根据权利要求72的方法，其中促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。74、根据权利要求69的方法，其中第二容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第二容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第二容器中培养细胞。75、根据权利要求74的方法，其中促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。76、一种治疗病症的方法，包括将内皮祖细胞(EPC)施加到选自如下的个体的组织附近或间隙个体的外周神经组织、个体的中枢神经系统神经组织、个体的视祌经、个体的脉络膜组织、个体的视网膜组织、个体的视网膜下间隙、个体的角膜组织、个体的肾组织、个体的受损骨组织、个体的骨折的骨组织、个体的发炎组织、个体的被感染组织、个体的挫伤组织、个体皮肤的损伤、溃疡或创伤组织及个体的脑组织、个体的肢体组织、个体的皮肤移植物组织及个体的再植的断肢组织。77、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量。78、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第二批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.068g/ml之间的第三批细胞的第三梯度；和通过培养第三批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.068g/ml之间的细胞的数量。79、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括抗体的表面上培养第二批细胞。80、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度;在包括促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养第二批细胞。81、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括最高为5%的血清的培养基中培养第二批细胞1到5天。82、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和在包括大于10%的血清的培养基中培养第二批细胞1到5天。83、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在低血清阶段中，在包括小于10%的血清的培养基中培养第二批细胞；禾口在高血清阶段中，在包括大于或等于10%的血清的培养基中培养第二批细胞。84、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时低氧阶段中，在低氧条件下培养第二批细胞；和在一至少1天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养第二批细胞。85、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养第二批细胞，高碳酸阶段特征在于C02水平大于5%;和在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养第二批细胞，非高碳酸阶段特征在于C02水平小于或等于5X。86、根据权利要求76的方法，包括通过下面步骤产生EPC:将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；在包括选自下列至少一种物质的培养基中培养第二批细胞促红细胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-e-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲羟孕酮、他汀类药物、辛伐他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮；将包括干细胞的组织施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；和通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量。87、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；通过培养第二批细胞1到30天，增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。88、根据权利要求87的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。89、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；将第一批细胞划分成其各自的第一和第二部分；将第一批细胞的第一部分施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；将第一批细胞的第二部分与具有1.055到1.074g/ml之间密度的细胞混合；通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。90、根据权利要求89的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。91、根据权利要求89的方法，其中划分第一批细胞包括设定第一部分大于第二部分。92、根据权利要求89的方法，其中划分第一批细胞包括设定第一部分小于第二部分。93、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有第一希望密度范围的细胞；通过培养所选择的细胞3到30天来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。94、根据权利要求93的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。95、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。96、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。97、根据权利要求93的方法，其中增加细胞的数量包括培养细胞4到8天。98、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到包括蔗糖和环氧氯丙烷共聚物的溶液中。99、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到包括用聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶的梯度密度溶液中。100、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到碘克沙醇的水溶液中。101、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到Ficoll样梯度中。102、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到OptiPrep样梯度中。103、根据权利要求93的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到Percoll样梯度中。104、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括自体血浆的表面上培养所选择的细胞3到30天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。105、根据权利要求104的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。106、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括抗体的表面上培养所选择的细胞；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。107、根据权利要求106的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。108、根据权利要求104或106的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。109、根据权利要求104或106的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。110、根据权利要求106的方法，其中培养包括当表面用自体血浆包被时，在该表面上培养细胞。111、根据权利要求106的方法，其中培养包括当表面用选自同种异型血浆和异种血浆中的至少一种血浆包被时，在该表面上培养细胞。112、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括促生长分子而非胶原或纤连蛋白的表面上培养所选择的细胞；禾口鉴别所培养的细胞中的祖细胞。113、根据权利要求112的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。114、根据权利要求112的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。115、根据权利要求112的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。116、根据权利要求112的方法，其中培养细胞包括在表面上培养细胞，该表面除了促生长分子外还包括胶原和纤连蛋白中的至少一种。117、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括最高为5%的血清的培养基中培养所选择的细胞1到5天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。118、根据权利要求117的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。119、根据权利要求117的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。120、根据权利要求117的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到L074g/ml之间的细胞的梯度。121、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括大于10%的血清的培养基中培养所选择的细胞1到5天；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。122、根据权利要求121的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。123、根据权利要求121的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。124、根据权利要求121的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。125、根据权利要求121的方法，其中培养细胞包括在包括小于20%的血清的培养基中培养细胞。126、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在低血清阶段，在包括少于10%的血清的培养基中培养所选择的细胞；在高血清阶段，在包括大于或等于10%的血清的培养基中培养所选择的细胞；以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。127、根据权利要求126的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。128、根据权利要求126的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。129、根据权利要求126的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。130、根据权利要求126的方法，其中在低血清阶段培养细胞包括在包括最高为5%的血清的培养基中培养细胞。131、根据权利要求126的方法，其中在低血清阶段培养细胞包括在无血清培养基中培养细胞。132、根据权利要求126的方法，其中在低血清阶段培养细胞包括培养细胞1到5天。133、根据权利要求126的方法，其中在高血清阶段培养细胞包括培养细胞1到30天。134、根据权利要求126的方法，其中在高血清阶段培养细胞之前，在低血清阶段培养细胞。135、根据权利要求126的方法，其中在高血清阶段培养细胞之后，在低血清阶段培养细胞。136、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在一至少2小时的低氧阶段中，在低氧条件下培养所选择的细胞；在一至少1天的非低氧阶段中，在非低氧条件下培养所选择的细胞；鉴别所培养的细胞中的祖细胞。137、根据权利要求136的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。138、根据权利要求136的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。139、根据权利要求136的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。140、根据权利要求136的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最初两天在低氧条件下培养细胞。141、根据权利要求136的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最后两天在低氧条件下培养细胞。142、根据权利要求136的方法，其中低氧和非低氧阶段都在一小于30天的培养期内，且其中在低氧条件下培养细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在低氧条件下培养细胞至少2小时。143、根据权利要求136的方法，其中在非低氧条件下培养细胞之前，在低氧条件下培养细胞。144、根据权利要求136的方法，其中在非低氧条件下培养细胞之后，在低氧条件下培养细胞。145、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在一至少2小时的高碳酸阶段中，在高碳酸条件下培养所选择的细胞，高碳酸阶段特征在于<:02水平大于5%;在一至少1天的非高碳酸阶段中，在非高碳酸条件下培养所选择的细胞，非高碳酸阶段特征在于C02水平小于或等于5X;以及鉴别所培养的细胞中的祖细胞。146、根据权利要求145的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。147、根据权利要求145的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。148、根据权利要求145的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。149、根据权利要求145的方法，包括设定高碳酸阶段中的C02水平为至少6%。150、根据权利要求145的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最初两天在高碳酸条件下培养细胞。151、根据权利要求145的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最后两天在高碳酸条件下培养细胞。152、根据权利要求145的方法，其中高碳酸阶段和非高碳酸阶段都在一少于30天的培养期内，并且其中在高碳酸条件下培养细胞包括在培养期的最初两天和最后两天之间在高碳酸条件下培养细胞至少2小时。153、根据权利要求145的方法，其中在非高碳酸条件下培养细胞之前，在高碳酸条件下培养细胞。154、根据权利要求145的方法，其中在非高碳酸条件下培养细胞之后，在高碳酸条件下培养细胞。155、一种使用所提取的血液的方法，包括将血液施加到梯度以选择具有希望密度范围的细胞；在包括选自下列至少一种物质的培养基中培养所选择的细胞VEGF、IGF、FGF、促红细胞生成素、雌激素、雌激素家族分子、17-P-雌二醇、雌酮、雌三醇、雌二醇衍生物、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇、美雌醇、炔雌醚、孕激素、孕激素家族分子、孕酮、合成孕酮、hydroxyprogesteronecaroate、醋酸甲夢5孕酮、他汀类药物、辛4戈他汀、阿伐他汀、抗糖尿病药物和罗格列酮；和鉴别所培养的细胞中的祖细胞。156、根据权利要求155的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。157、根据权利要求155的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。158、根据权利要求155的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的梯度。159、一种使用所提取的干细胞的方法，包括将包括干细胞的组织施加到梯度中以选择具有第一希望密度范围的细胞的梯度；通过培养所选择的细胞3到30天来增加具有第二希望密度范围的细胞的数量；和鉴别所培养的细胞中的袓细胞。160、根据权利要求159的方法，其中祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)，并且其中鉴别所述祖细胞包括鉴别EPC。161、根据权利要求159的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的细胞的梯度。162、根据权利要求159的方法，其中将血液施加到梯度中包括将血液施加到适于选择密度在1.055到L074g/ml之间的细胞的梯度。163、根据权利要求159的方法，其中施加组织包括将脐带血施加到梯度。164、根据权利要求159的方法，其中施加组织包括将胚胎细胞施加到梯度。165、根据权利要求159的方法，其中施加组织包括将胎儿细胞施加到梯度。166、根据权利要求159的方法，其中施加组织包括将胎盘细胞施加到梯度。167、根据权利要求159的方法，包括自骨髓提取干细胞。168、根据权利要求159的方法，包括动员来自骨髓的干细胞以方便干细胞的提取。169、根据权利要求159的方法，其中包括自血液提取干细胞。170、根据权利要求159的方法，其中培养细胞包括在培养的第一阶段期间于第一容器中培养细胞；在培养的第一阶段末期从第一容器中取出至少一些细胞；和在培养的第二阶段期间于第二容器中培养从第一容器中所取出的细胞。171、根据权利要求170的方法，其中取出至少一些细胞包括选择取出粘附在第一容器表面上的细胞。172、根据权利要求170的方法，其中取出至少一些细胞包括选择取出没有粘附在第一容器表面上的细胞。173、根据权利要求170的方法，其中第一容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第一容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第一容器中培养细胞。174、根据权利要求173的方法，其中促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。175、根据权利要求170的方法，其中第二容器包括在其表面上的促生长分子，并且其中在第二容器中培养细胞包括在包括促生长分子的第二容器中培养细胞。176、根据权利要求175的方法，其中促生长分子选自如下血浆、胶原、纤连蛋白、生长因子、以及干细胞表面受体的抗体。全文摘要本发明提供了一种使用所提取的血液的方法，包括(a)将血液施加到适于选择密度小于1.077g/ml的第一批细胞的第一梯度；(b)将第一批细胞施加到适于选择密度在1.055到1.074g/ml之间的第二批细胞的第二梯度；(c)通过培养第二批细胞3到30天来增加密度在1.055到1.074g/ml之间的细胞的数量；和(d)鉴别所培养的细胞中的内皮祖细胞。还描述了其它实施方案。文档编号C12N5/00GK101151362SQ200580024306公开日2008年3月26日申请日期2005年6月1日优先权日2004年6月1日发明者丹尼·贝尔金,斯韦特兰娜·波罗佐夫,瓦伦丁·富尔加,耶尔·波拉特,达夫纳·希莫尼-扎尔克申请人:运作投资有限公司