专利名称：灌注的三维细胞/组织疾病模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及“多井板”格式的灌注生物反应器阵列，其中阵列的每个生物反应器由利用细胞种植的微尺度基质组成，其形成微组织、多重组织和/或细胞集合，以及用于在高处理量化验中来使用所述阵列的方法，该高处理量化验例如用于确定生物和/或化学试剂对微尺度组织阵列的影响、用于研究组织-组织相互作用、或者用于检测生物和/或化学试剂的存在的化验。
背景技术：
组织工程已作为这样的科学领域显现，其具有为了整形外科和移植的目的通过产生解剖组织和器官而辅助人类治疗的潜力。它结合了材料科学、细胞与分子生物学以及医学的科学领域以获得新的装置，用于体内组织和结构的替换、修复和重建。最近十年来已提出了许多方法。一种方法是将组织特异性细胞与开放的多孔聚合物支架相结合，其然后能够被植入。大量的细胞能够被添加到细胞培养物中的聚合物装置并通过扩散维持。在移植之后，发生脉管向内生长，细胞重建，并且随着聚合物通过水解作用降解而形成新的稳定组织。
已描述了若干方法，其用于制造用于细胞的体外或体内生长的组织再生装置。已描述了聚合物装置，其用于替换器官功能或提供支撑结构。这样的方法已通过以下报导Vacanti等人，Arch.Surg.123545-49(1988)；Yannas等人的美国专利No.4,060,081；Bell的美国专利No.4,485,097；以及Schmidt等人的美国专利No.4,520,821。通常，通过选择并修改用于植入的现有聚合物纤维成分，并且利用细胞种植，能够实施Vacanti等人利Schmidt等人使用的方法，而Yannas和Bell的方法则产生了非常特殊的修改后的胶原海绵状结构。
组织再生装置必须是多孔的，具有互连的微孔以允许细胞和组织渗透，如果所述装置具有任何显著厚度的话。诸如微孔尺寸、形状和弯曲度之类的因素全都能够影响组织向内生长，但是难以使用标准处理技术来控制。Cima&Cima的美国专利No.5,518,680描述了固体自由成型(solid free form)制造技术的使用，尤其是聚合物粉末的三维印刷，以形成基质，其能够用游离的细胞种植，并且移植以形成新的结构。从生物相容的合成或天然聚合物、无机材料、或无机材料与聚合物的合成物构造特定结构的固体自由成型方法的优点是显而易见的，其中，最后所得到的结构具有定义的微孔尺寸、形状和取向，尤其是在相同的装置之内具有不同的微孔尺寸和取向，同时在装置之内不同的特定位置处具有多于一个的表面化学或纹理。然而，该装置仍然具有主要的限制用于形成维持植入细胞的血管的新组织的向内生长，必须在相对于基质之内增加的细胞密度的恰当时机处发生，以维持植入的细胞，并且其他组织必须不得封闭或渗透基质以阻塞或另外地损伤植入的细胞。
Massachusetts Institute of Technology和Childrens’Medical CenterCorporation的PCT/US96/09344描述了使用固体自由成型制造(SFF)方法以制造用于允许组织再生并且用于种植和植入细胞以形成器官和结构部件的装置，其能够另外提供生物活性试剂的控制释放，其中基质特征在于内腔网络在功能上等效于利用植入细胞形成的组织的自然发生的脉管系统，并且其能够在植入时内衬内皮细胞并耦合到血管或其他管，以形成遍布基质的脉管或韧性网络。
然而，这种技术中一个也没有提供在体外维持组织的方法，也没有使用组织作为诊断或筛选工具。放置在典型的体外培养物中的细胞一般丧失它们通常作为体内有机物组织的部分展示的至少一些关键分化生理机能。这样一来，虽然培养的细胞可能足够用于一定的应用，例如在毒素和病原体的检测方面，但是它们在其他的应用方面必然失败，例如通过组织新陈代谢的药物、或者通过与复杂器官而不仅仅是单个孤立细胞类型的相互作用而清除的药物的筛选。例如，不存在乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的体外感染模型，大概因为典型培养状况中的原代肝细胞迅速停止表达病毒用于进入细胞的细胞表面受体。从当前不能使用培养细胞来筛选的已知病原体的这个例子能够推断，常常利用受体介导摄取的未知病原体(或毒素)能够类似地躲避培养细胞中的检测。类似地，必须被细胞特定受体约束来被活性细胞吸收的药物，也不能在这样的系统中测试。主要由肝脏中的一组酶执行的异物代谢，是培养的肝细胞迅速丧失的另一项机能。尽管肝酶使大多数的外来复合物毒性较少，但是其他分子(作为普通的例子，如镇痛药醋胺酚)当利用肝脏新陈代谢时实际上能够变得更有毒性。因此急需具有能够模拟体内状况的用于药物筛选的系统。
目前，没有体外模型或动物模型充分捕捉人类组织对药物和环境因素的复杂反应。进而，没有体外模型捕捉肿瘤细胞与相邻正常组织的相互作用的复杂生物学。每年，许多新药由于未曾料到的毒性、尤其是肝脏毒性，或者由于未能说明抗肿瘤药剂的肝脏新陈代谢，而在早期临床试验中失败。肝脏细胞当放置在培养物中时迅速丧失肝脏特定机能。这样一来，在体外估计药物对人类肝脏组织的长期毒性就是不可能的。进一步，人类肝脏细胞的来源稀少，并且不能满足制药工业中对基于细胞和组织的化验的需要。进一步，培养人类组织的能力提供了机会，以建立单细胞转移和肿瘤生长的最先阶段的模型，提供了培养难以培养的恶性肿瘤的方法，以预测给出肿瘤转移和生长的倾向，以研究肿瘤生物学，并且测试抗癌化合物的功效。
当前现有技术2D和3D培养方法不能以复制生理流动的方式通过组织块灌注。
Griffith等人的美国专利No.6,197,575描述了适合于复杂分级组织或器官结构的种植、附着和培养的微基质和灌注组件。
因此本发明的目标是提供用于体外分析的装置，其有效地模拟组织利/或器官中的疾病，但是并不需要组织或器官。
发明内容
已构造了这样的系统，其通过正常人类组织概括了毛细血管床的特征。所述系统便利以毛细血管床的长度尺度的三维(3D)细胞单一培养和异型细胞一同培养的灌注。所述系统还允许在已形成组织之后添加诸如肿瘤细胞之类的第二细胞类型。主要特征在于，能够在“多井板”格式之内使用所述系统，其服从于高处理量化验，该高处理量处理适合于制药开发中通常使用的机器人技术的类型。所述系统提供了手段以实施对于毒理学和新陈代谢的化验，并且作为用于人类疾病的模型，该人类疾病例如包括肝炎的肝病、辐射相关的病状以及癌症。癌症应用包括原发性肝癌以及从其他癌症的转移，并且用于将药物代谢与抗肿瘤活性相连接。所述系统对于诸如癌症、病毒感染和慢性肝纤维化之类的复杂慢性疾病特别有用。所述系统也能够用作测试用于治疗疾病和先天遗传缺陷的基因疗法的方法。
图1是多井板格式的灌注生物反应器阵列的立体图(顶部)。
图2是多井板格式的灌注生物反应器阵列的立体图(底部)。
图3是多井板格式的灌注生物反应器阵列的分解图(顶部)。为简单起见，仅显示了5单元的生物反应器阵列。
图4是多井板格式的灌注生物反应器阵列的分解图(底部)。
图5是多井板格式的灌注生物反应器阵列的支架的立体详细图。
图6是盖子从多井板格式的灌注生物反应器阵列去除的立体图。
图7是盖子从多井板格式的灌注生物反应器阵列去除的顶视图。
图8是多井板格式的灌注生物反应器阵列的横截面A-A。
图9是多井板格式的灌注生物反应器阵列的横截面B-B。
图10是多井板格式的灌注生物反应器阵列的横截面A-A的详细图C。
具体实施例方式
I.系统基于被修改以利用高度平行的装置的灌注微基质方法，已开发了系统及其制造和使用方法，所述高度平行的装置用于通过组织或器官结构的微基质循环细胞培养基，使技术极其适合于高处理量化验。这个系统具有在测试药物毒性、癌转移模型、干细胞培养以及其他人类疾病模型中的应用。系统具有作为其基本部件的用于细胞或组织培养的灌注生物反应器和储槽(reservoir)对的密集阵列，以及阀和泵，它们经由共同的控制通道并行启动，并且通过生物反应器/储槽对的阵列再循环培养基。阵列中的每个生物反应器都包括生物反应器井及其自己的储槽井。通过允许再循环细胞培养基的流体通道连接生物反应器井和储槽井。每个生物反应器/储槽对与阵列中的所有其他生物反应器/储槽对流体隔离。经由共同的液压或气压控制通道并行地启动阵列中所有生物反应器的阀和泵。
在流体歧管(manifold)中制造或微制造生物反应器/储槽对。在控制歧管中制造或微制造控制通道。通过在流体和控制歧管之间夹入单片弹性隔膜，制造隔膜阀。通过控制通道施加的液压或气压传动能够偏转控制和流体通道之间的隔膜。通过串联连接的阀的顺序传动，泵送多个生物反应器中的细胞培养基。
每个生物反应器包括井，其包括三维细胞/组织支撑结构。在优选实施例中，细胞支架或载体由合成或天然多孔材料制成。在最优选实施例中，细胞支架由微孔滤器或隔膜支撑的固体膜或片中的微通道阵列形成。在特别优选的实施例中，支架能够人工地或用机器人从生物反应器井抽出。在优选实施例中，阵列中的所有生物反应器/储槽对都由共同可移动盖子覆盖，并且细胞/组织种植、试剂添加或试样收集能够通过移液操作或机器人技术添加。
在一个实施例中，作为这里使用的系统的代表，阵列为简单起见仅包括多井板格式的5个生物反应器/储槽对，如图1-10所示。然而，部件的尺寸能够容易地按比例缩小，并且显著更高数目的生物反应器/储槽对能够被布置在单个板上。在当前的实施例中，多井板格式的灌注生物反应器阵列的设计已通过以下被改进将每个板的反应器数目从最初的5个反应器原型增加到12个反应器原型，以及增加每个反应器的细胞容量。支架现在从顶部可到达，并且出气口已从板中去除。每个生物反应器的主要功能部件是具有3D细胞/组织保持支架或载体8的井4。所述设计还已通过以下来改进在井中包括轮缘，以减少流体面的弯月面(meniscus)，并从而使在显微镜下的细胞/组织观察期间的光学畸变最小化；并且使反应器/储槽对呈烟囱(chimney)布置，以使相邻反应器之间的交叉污染最小化。烟囱能够与盖子中的相应形状的环相匹配，以使流体从反应器井、储槽井和连接表面通道的蒸发最小化。使阀呈蛤壳状(通常打开)补偿了拉紧的或起皱纹的隔膜，并且改善了阀性能。制造椭圆形而不是圆形的阀和泵减少了能够捕捉气泡的区域。
能够使用以下技术来制造支架或载体传统的硅加工技术，诸如光刻法、湿蚀刻或深度活性离子蚀刻之类；显微机械加工；放电机械加工；反应注模；热塑注模；显微模塑；冲孔；任何的固体自由成型技术，诸如三维印刷之类；或其他类型的制造，其能够在片材中产生微通孔，尤其是用于塑料的制造技术，诸如显微模塑、压花(embossing)、激光打孔或电子束加工之类。使用诸如光刻法以及显微机械加工、放电机械加工和电镀之类的方法，能够制造用于这些工艺中的一些的模。
若干材料共同用于形成基质。除非另外指定，术语“聚合物”将会用于包括任何的用于形成基质的材料，包括聚合物和单体，其能够被聚合或附着以形成整体单元，以及无机和有机材料，如下面讨论的那样。在一个实施例中，微粒由聚合物形成，所述聚合物能够溶解在有机溶剂中并且通过溶剂的去除而凝固，诸如合成热塑聚合物，或者可生物降解或者不可生物降解的，诸如聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚(酸酐)、聚原酸酯、乳酸和乙醇酸和其他α羟酸的聚合物、以及聚磷腈、蛋白质聚合物，例如白蛋白或胶原蛋白，或者多糖。能够用于形成基质的非聚合材料的例子包括有机和无机材料，诸如羟基磷灰石(hydoxyapatite)、碳酸钙、缓冲剂和乳糖，以及药物中使用的其他普通赋形剂，其通过粘合剂或胶合剂而不是溶剂的应用来凝固。在聚合物供制造用于细胞附着和生长的装置之用的情况下，基于聚合物对从细胞引出适当生物反应的能力，例如附着、迁移、增殖和基因表达，来选择聚合物。
通过参考The Polymer Handbook，3rd edition(Wiley，N.Y.1989)能够获得其他适当的聚合物。
对于适用于骨质(tailored to bone)的显微结构，最终装置中的无机粉末增加了装置的强度，并且提供了用于再生组织的矿物来源。诸如肝脏之类的软组织的强度要求基本上比用于骨质的低，所以能够容忍最终装置中的更大空隙度。
参考图1-10，例如通过多孔隔膜，或者通过微孔滤器9支撑的固体膜或片的微通道阵列，能够形成细胞/组织支撑结构8。例如通过纤维粘合(Vacanti等.MRS Proceedings，vol.252(1992)；Mikos等，J.Biomed.Mater.Res.27183-189(1993))、溶剂浇注/微粒沥滤(Mikos等，Biomaterials 14323-330(1993))、气体起泡(Mooney等，Biomaterials171417-1422(1996))以及气体分离(Lo等，Tissu Engineering 115-28(1995))，能够制造多孔支架。使用诸如通过深度活性离子蚀刻技术(Powers等，Biotechnology and bioengineering，78257(2002))的适当技术，能够微制造具有微通道阵列的硅支架。通过激光显微机械加工(Brenan等，Proc.SPIE，3912，76-87，Prog.Biomed.Optics，Micro-andNanotechnology for Biomedical and Environmental Applications，SanJose，January 26-27，2000)、注模(Weibezahn等，Micro SystemTechnologies’94，H.Reichl and A.Heuberger，eds.vde-verlag gmbh，Berlin，pp.873-878)或光聚作用，能够产生具有微通道的聚合物支架。
具有微通道的固体支架8能够具有包含保持细胞的微通道阵列的顶层。阵列中的每个微通道是生物反应器的功能单元。在这个层之下，存在微孔隔膜或滤器9。隔膜能够是细胞保持支架的单片部分，或者它能够例如热或超声地粘结到该支架。细胞和/或组织保持支架能够设置有密封垫7、11、支撑支架10和插入物12。微通道34能够具有正方形或狭缝横截面。正方形通道的典型尺寸为几百微米。狭缝能够为从几百微米到几毫米长。支架厚度典型地为几百微米。
从诸如聚碳酸酯之类的聚合物例如通过显微机械加工铣能够制造流体24和控制22歧管两者。这在小批量制造中能够是节省成本的。在大量制造中，能够使用诸如注模之类的大规模复制技术和例如聚苯乙烯或聚碳酸酯的材料。隔膜材料能够例如是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。隔膜23能够例如通过等离子氧化配合面并立即将该部分压在一起来粘合到流体和控制岐管(Duffy等，Anal.Chem.，70，4973-4984(1998))。可选择地，如图3和4所示，例如借助于在隔膜上提供恒力并且将歧管保持在一起的紧固件21或锁定机构，隔膜23能够夹在流体24和控制22歧管之间。
支架8能够例如被压配合到流体歧管24中的生物反应器井4的下锥形部分(tapered scction)中。生物反应器井4通过两个流体通道与储槽井6连接。上例如U型通道5用于将细胞培养基从生物反应器井4返回到储槽井6中。储槽的底部能够包含倒角(face-off)，用于插入微孔滤器26，其具有通过压配合插入物27固定在储槽井中的滤器支撑25(注意为了附图清晰起见，部件25、26和27标记在生物反应器/储槽对d而不是a上。板上阵列中的生物反应器/储槽对a、b、c、d和e等同。生物反应器/储槽对的标记以及气动管路或液压管路见图6)。滤器26能够用于从细胞培养基去除细胞残骸。在储槽井中使用滤器能够改善阀和泵的可靠性。另外，能够消除阻塞细胞/组织保持支架8背侧上的隔膜或微孔滤器9。过滤的培养基通过端口29被吸取到连接储槽6和生物反应器井4的底部流体通道30、31和32中。通道设置有形成泵的三个隔膜阀。通过在流体24和控制22歧管之间夹入单片弹性体隔膜23来产生阀。在控制通道交叉流体通道的地方产生阀。阀可以例如通常是关闭的。在那种情况下，通过将真空利用用O环17密封的配件16、15和14施加于控制歧管中的通道20、35和36(见图9)，弹性体隔膜23向下偏转，阀被打开，并且细胞培养基充满阀转移室19、18、13和隔膜23之上的所有其他连接的转移室。施加正压力迫使隔膜紧靠阀座和阀的转移室之外的细胞培养基。每个泵的阀以六步循环操作。最初，所有的阀都关闭。在第一步中，开启入口阀19和通过控制通道20串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。在第二步中，开启主隔膜阀18和通过控制通道35串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。在第三步中，关闭入口阀19和通过控制通道20串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。在第四步中，开启出口阀13和通过控制通道36串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。在第五步中，关闭主隔膜阀18和通过控制通道35串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。在第六步中，关闭出口阀13和通过控制通道36串联连接的生物反应器/储槽对b、c、d和e中的所有其他阀。例如通过连接到真空和压缩空气源的电磁阀能够控制泵送细胞培养基的阀。
通常关闭的单片隔膜阀自动启动，并且向前泵送或简单地通过倒转传动循环向后泵送细胞培养基。通过调整隔膜阀转移室的容量，能够在设计阶段确定每次传动泵送的体积。因此，隔膜阀可以用于精确地计量细胞培养基的体积。如果泵的转移室等同，则全部生物反应器中的细胞/组织将以相同的流速灌注。与此对比，如果泵具有不同容量的转移室，则每个生物反应器中的细胞/组织能够以不同的流速灌注。
例如通过将细胞培养基人工或机器人地移液操作到生物反应器或储槽井中并且在向前或倒转的方向上启动泵送循环，来灌注生物反应器和储槽对。如果有必要从流体通道去除气泡，则能够使用装配螺钉1和密封O环2的放气口。放气口经由通道33与生物反应器井5连接。
参考图1-10，通过将细胞悬浮液分配(例如通过人工或机器人移液操作)到生物反应器井4中，将细胞种植到支架8中。细胞培养基从储槽井6循环到生物反应器井4中。在生物反应器井4中的支架8中灌注3D细胞培养之后，细胞培养基返回到储槽井6。阵列的每个生物反应器a、b、c、d和e(见图6)具有其自己的储槽6，并且其微流体通道5、30、31和32与阵列中的所有其他生物反应器完全隔离。使用隔膜泵再循环细胞培养基。串联连接的三个隔膜阀形成隔膜泵。通过在流体24和控制22歧管之间夹入单片弹性体隔膜23，产生阀19、18和13并因而产生泵。在控制通道交叉流体通道的地方产生阀。控制和流体通道之间的薄隔膜23能够通过通过控制通道施加的液压或气压传动来偏转。通过串联连接的阀的顺序传动泵送细胞培养基。参考图6，经由共同的液压或气压控制管路x、y、z并行启动阵列中的全部生物反应器/储槽对a、b、c、d、e的阀。结果，在这种情况下，通过三个共同的气压或液压管路能够处理5个完全隔离的灌注生物反应器。然而，通过三个气压或液压管操作的阵列中的生物反应器/储槽对的数目能够显著地按比例增加。
阀和泵是可缩放的，并且能够以密集的阵列微制造。Unger等，Science 286，113(2000)、T.Thorsen等，Science 298，580(2002)以及W.H.Grover等，Sensors and Actuators B 89，314(2003)，描述了产生单片阀和泵的过程。
由于生物反应器/储槽对的阵列具有开放设计并且由共同可移动的盖子(28)覆盖的事实，细胞种植以及试剂添加和试样收集能够使用自动化的机器人工作站来执行。
通过细胞代谢需要并且通过机械应力结果(issue)来确定通过系统的流速。在接近连续的基础上(长达15分钟的短期不流动是可行的)每1000个细胞需要培养基的0.1-1微升/分钟的范围内的流速。每个生物反应器根据执行的化验类型典型地包含从500到50,000个细胞。支架的设计允许系统以～500个细胞的单位(亦即一个通道)非常容易地按比例决定。通过系统的流速可以在培养或化验的时间期间变化以便执行化验(例如，流速可以放慢以允许化合物的完全转化，或者增加以便保持化合物的恒定浓度)。
传感器传感器能够用于检测pH、含氧量、诸如葡萄糖之类的特定代谢物的变化、诸如病毒蛋白之类的指示器分子存在与否、或对组织或暴露给生物反应器之内的组织的材料有影响的任何其他标记的存在与否。
在一个实施例中，损伤或感染的读出基于当由小型化光纤阵列检测时的组织的荧光变化，所述小型化的光纤阵列经由单或多光子装置激发荧光。激发的性质是技术开发中提出的临界参数。在分辨率和防止组织损伤方面，多光子激发提供了超过单光子的几个优点。
许多类型的荧光读出都是可能的。通过经由这些分子的固有荧光测量NAD(P)H水平的变化，能够估计组织的基本代谢参数的变化。细胞也能够用染料预加载，其在隔膜损坏的情况下泄漏，导致荧光强度降低。可选择地或者另外地，能够在应力相关的催化剂的控制下将报告基因转染到细胞中，该催化剂在组织损害期间被激活以产生荧光产物。这个后者的方法对于以迅速的时间标度检测病毒感染具有特殊的重要性。
检测方案中的目标是提供组织损害的快速、灵敏、领域可适应的、并且最低限度侵入的荧光光谱读出。已经识别电势指示器的面板，该指示器将会在荧光强度和/或光谱中变化。由于响应可能需要监视正常组织结构之内的细胞生化状态，所以仅分析组织中细胞的表面层可能是不够的，而是要选择性地监视若干细胞深入到通道内部中的细胞层。这些需要可以被总结成光学检测系统的4个设计标准(1)厚(300μm)组织中的深度选择检测；(2)灵活的激发和检测方案以成像多种指示器；(3)最低限度地侵入装置中的活组织培养；(4)具有高灵敏度的快速信号检测；(5)结实的和领域可适应的。
使用单光子激发，需要共焦检测以分离荧光，其源自来自该单光子表面的通道内部。共焦显微镜是开发良好的仪器，设计用来光学上切片厚样本。两个孔径或针孔布置在共轭面中；一个在光源前面，一个在检测器前面。通过单模光纤的使用，这种设计能够被简化并且使得对在线检测更加稳固。通过二色分光镜，激发光被引入到单模光纤中(图1；分光镜未显示)。从光纤发射的光能够利用透镜校准。第二透镜能够将校准的光聚焦到组织芯片的通道中。高分辨率在这个应用中不是关键性的——不需要成像——并因而低光学器件和芯片以提供流动室中用于液压设计的空间。来自样本的荧光由两个中继透镜收集并被反射返回到单模光纤中。小直径光纤同时起到这个系统中的激发和发射针孔孔径的作用。源于聚焦区外面的荧光不能由中继透镜再聚焦到光纤上并被丢弃。这个过程为我们提供了深度鉴别。在这个计划期间，能够考虑若干发色团，其具有跨越光谱的近UV到蓝绿区的激发波长。特殊兴趣的荧光指示器是内生的发色团，吡啶核苷酸。吡啶核苷酸NAD(P)H在区域365nm中被激发，并且在区域400-500nm中发荧光。所关心的另一个指示器是绿荧光蛋白质(GFP)，其能够在光谱的近UV或蓝区中激发，并且典型地在大约510nm处发射。为了激发这个宽范围的发色团，能够为这个研究取得可调UV氩离子激光器。尽管这个激光器对于现场应用并不足够稳固，但是它提供了测试一大组发色团的灵活性。在适当组的发色团被识别之后，能够容易地并入较少灵活但更加稳固和紧凑的激光系统。这种光纤共焦设计是成熟的技术，并且能够被迅速地并入到组织传感器中，以估计在组织芯片里面的毒素胁迫之下细胞生化方面的变化。
尽管毒素敏感组织芯片可以基于单光子共焦方法建立，但是双光子方法的使用，通过增加荧光信噪比和降低组织损伤，而能够改善系统。这种新的研究方法基于Denk等人开发的双光子显微术(Denk等，Science 24873-77(1990))。发色团能够通过两个光子的同时吸收激发，其每一个都具有激发跃迁所需的一半能量。由于双光子激发仅发生在高数值孔径物镜的焦点处，光子的高度时空集中的区域。使用双光子激发，对于1.25数值孔径物镜，总荧光强度的80％以上来自关于焦点1μm厚的区域。双光子激发的这种深度鉴别效果起因于双光子荧光强度对离开焦平面就迅速降低的激发光子通量的二次相关性。深度鉴别是激发方法的物理结果，并且不需要共焦检测针孔孔径。双光子激发的这种定位能够在简单的漂白试验中被最好地目测到。
为了示范双光子激发的效果，双光子激发体积在15μm荧光乳胶球的中心聚焦。沿着x轴重复扫描激发体积，直到光致漂白发生为止。获得了乳胶球的3D图像栈，其中一系列的图像是距离中心增加距离处的球的x-y平面。超过1μm没有观察到光致漂白。
双光子激发允许在组织芯片通道的内部中的任何点处的组织生理状态的选择性估计。与样本的吸收和散射系数高的共焦方法相比，多光子方法存在若干优点，诸如组织中的那些(1)红外光谱范围中的典型的散射和吸收在小于近UV或蓝绿区的数量级之上。在双光子显微镜中使用红外激发使激发信号的衰减最小化。(2)共焦显微术使用发射针孔孔径以除去聚焦光之外的光子。在深部组织里面，信号光子的散射是不可避免的。跟着发生的路径偏移导致在共焦针孔处这些光子的严重丢失。用于荧光光子的收集几何形状在双光子的情况下不是那么关键，其中能够使用大面积检测器而需要针孔孔径。大多数的前向散射的光子能够保留。(3)双光子激发使组织光损伤最小化。传统共焦技术通过限制观察体积获得3D分辨率，但是荧光激发遍布沙漏状光路地发生。与此对比，双光子激发将光相互作用的区域限制到焦点处的亚毫微微升的体积。(4)双光子激发波长典型地红移到单光子激发波长的大约两倍。激发和发射光谱之间的这种宽分离确保了激发光和拉曼(Raman)散射能够被去处，同时滤出最小量的荧光光子。(5)许多荧光团已发现具有非常宽阔的双光子吸收光谱。单个适当选择的激发波长能够激发宽范围的荧光团，其具有从近UV到近红外范围的发射频带。
双光子方法的这些优点使得它成为单光子方法的有吸引力的替代。然而，双光子系统的小型化仍需要广泛的研究。诸如光纤系统里的脉冲扩散这样的问题仍不得不解决。因此，开发用于组织芯片的光学系统的第二焦点是用于双光子激发光谱学的小型化技术的开发。双光子显微镜能够被构造以估计作为芯片通道里的组织深度的函数的组织毒素反应，并且最优化光学构造来最大化组织芯片的独特的几何形状里的检测效率。当和单光子共焦方法比较时，如果双光子方法能够显示有利，则能够构造基于双光子激发的最终的小型化荧光检测系统。
能够使用的小型化光纤荧光光谱仪是可得到的。一个系统基于单光子激发和共焦检测方案。第二系统涉及双光子激发的使用。在多个指示器的同时检测方面，这个系统的优点包括较低的组织损伤，较高的生产量和较高的多用性。
除了荧光传感器之外的传感器也能被使用。例如，样本能够通过使用红外分光光度计、紫外分光光度计、气相色谱、高性能液相色谱、质谱以及本领域技术人员已知的其它检测手段来分析。这些能够用于测量细胞活动、感染以及新陈代谢的养分、气体、代谢物、pH和其他指标。测量可以对细胞本身进行或对培养基进行，或者对二者一起进行。在培养期间和培养结束时，测量可以作为时程化验或终点化验或两者来进行。
II.应用技术适用于大规模集成。这使执行整体并行化验成为可能。例如，不同的细胞或细胞混合物能够被种植到每个生物反应器井中。可选择地，不同的细胞培养基能够通过每个生物反应器/储槽对循环，或者每个生物反应器井中的细胞/组织能够暴露给不同的试剂。最初的细胞类型能够被添加(例如人的肝细胞隔离)，稳定成为组织，然后添加第二细胞类型(例如癌细胞)来检验反应。
细胞的(一个或多个)类型确定组织的功能。如在此使用的那样，组织指的是形态上和功能上或多或少相似的细胞的集合物。在一个实施例中，基质种植有细胞的混合物，包括内皮细胞和至少一种类型的实质细胞，诸如肝细胞、胰腺细胞，或其它器官细胞，或者基质种植有全能性的/多能性的干细胞，其能够分化成细胞，包括内皮细胞以形成细胞。不同功能的细胞混合物被称为细胞。内皮细胞(在一些情况下其它细胞诸如周皮细胞或星状细胞)能形成遍及组织的“血管”。器官指的是由各种细胞或组织构成并适合于特定功能的有机体的分化结构(McGraw-Hill Dictionary of Bioscience)。
在优选的实施例中，供体组织被分离成个体细胞，细胞类型被分离并纯化，并以这样的方式在通道内重新组合其允许重组组织的组织类型结构。使用标准的程序来获得和分离细胞。例如，使用标准的胶原酶灌注能够分离原代人鼠肝细胞和非实质细胞(Griffith等， N.Y.Acad.Sci.831(1997)；Cima等，Biotech.Bioeng.38145-58(1991))。人的肝细胞能够从组织的胶原酶灌注获得，所述组织通过新英格兰器官银行从肝切除或从肝活组织检查获得(Fortaine等，J.Ped.Surg.3056-60(1995))。大鼠的微脉管内皮细胞能够从脂类的胶原酶灌注获得。人的微脉管内皮细胞能够从Clonetics获得。未必需要为微脉管内皮匹配组织类型，因为内皮展示了适应新环境的很大可塑性。使用具有分化诱导的标准技术，例如通过用各种细胞因子代替LIF，能够在全能状态下培养胚胎干细胞(ES细胞)。
各种不同的细胞能够适用于支撑基质。在优选实施例中，这些是正常人体细胞或人体肿瘤细胞。这些细胞可以是均匀悬浮体或细胞类型的混合物。不同细胞类型可以在最初的悬浮体被允许附着并增生之后(例如，内皮细胞，继之以肝细胞)或者一起被顺序地种植到基质上和/或中。通过将细胞悬浮体分配(例如通过人工或机器人移液操作)到生物反应器井中，将细胞种植到支架中。为了允许细胞附着到支架，灌流量能够在种植之后立即减少或关闭一段时间。
培养基成分必须从两个方面考虑基本营养物(糖、氨基酸)和生长因子/细胞因子。细胞的共同培养由于通过细胞自身的调节高分子的产生，通常允许浆液从培养基减少或消除。以生理的方式供应这样的高分子调节因子的能力是使用3D灌注共同培养的主要原因。补充有适合于初级分化肝细胞的长期培养的几种生长因子的无浆液培养基(Block等，J.Cell Biol.1321133-49(1996))已被测试并发现支持肝细胞和内皮细胞的共同培养。在白血病抑制因子(LIF)存在的情况下，ES细胞照常维持在全能状态下(Williams等，Nature 336684-87(1998))，其激活gp130信号路径(Satio等，J.Immunol.1484066-71(1996))。几种培养基配方能支持ES细胞的分化，同时不同的细胞因子混合产生分化的不同模式(Millauer等，Cell 72835-46(1993)；Gendron等，Dev.Biol.，177332-46(1996)；Bain等，Dev.Biol.168342-57(1995))。培养基更换速率通过测量关键糖和氨基酸以及关键生长因子/细胞因子的损耗速率来确定。生长因子损耗是很少认识到的确定培养基更换速率的限制因子(Reddy等，Biotechnol.Prog.10377-84(1994))。如果使用具有碳酸氢钠的细胞培养基，那么环境控制能够通过例如将具有生物反应器/储槽对的模块放置到CO2培养箱中来提供。试剂的添加或样本的提取在那种情况下应当在无菌的环境下进行。如果使用具有有机缓冲剂的细胞培养基，那么具有生物反应器/储槽对的模块能够放置在无菌的环境中，其中能够执行人工或机器人添加试剂或样本提取。
能够从细胞培养或活组织检查得到细胞。细胞能够是一种或多种类型，或者分化的细胞，诸如内皮细胞或实质细胞，包括神经细胞，或者未分化的细胞，诸如干细胞或胚胎细胞。在一个实施例中，基质种植有细胞的混合物，包括内皮细胞，或者种植有全能性的/多能性的干细胞，其能分化成这样的细胞，其包括内皮细胞，其将形成“血管”，以及至少一种类型的实质细胞，诸如肝细胞、胰腺细胞或其它器官细胞。
细胞能够最初被培养然后用于化合物毒性的筛选，其中不同的反应器包含不同的细胞类型(例如，肝在反应器1-10中，胰腺细胞在反应器11-20中，表皮细胞在反应器21-30中，等等)。细胞也能够用于筛选具有期望效果的化合物。例如内皮细胞能用来筛选抑制血管生成的化合物。肿瘤细胞能用来筛选抗肿瘤活性的化合物。表达一定配体或受体的细胞能够用于筛选结合配体或激活受体的化合物。干细胞能单独或和其它类型的细胞一起种植。细胞能够最初被种植，然后在建立最初的生物反应器组织以后引入第二组细胞，例如，生长在肝组织环境下的肿瘤细胞。肿瘤细胞能够被研究用于肿瘤细胞的行为，或者能够在肿瘤细胞生长期间观察分子活动。细胞能够在引入到装置中之前或之后修改。细胞能够是用于诊断或预后测试的来自患者的原发肿瘤细胞。能够评估肿瘤细胞对试剂或基因治疗的敏感性。肿瘤细胞对试剂或基因治疗的敏感性能够联系到试剂或基因治疗的肝代谢。细胞能够是干细胞或祖细胞，并且干细胞或祖细胞被成熟的组织诱导分化。成熟的细胞能够通过系统中流速或培养基成分的操纵来诱导复制。
系统具有许多不同的应用疾病标记的识别；评估抗癌疗法的功效；测试基因疗法的媒介物(vector)；药物开发；筛选；细胞研究，尤其是干细胞；关于生物转化、清除、代谢和异生物质的激活的研究；关于通过上皮层的化学试剂的生物利用率和传输的研究；关于通过上皮层的生物试剂的生物利用率和传输的研究；关于通过脑血管屏障的生物或化学试剂传输的研究；关于化学试剂的急性基本毒性的研究；关于化学试剂的急性局部或急性特定器官毒性的研究；阿滚于化学试剂的慢性基本毒性的研究；关于化学试剂的慢性局部或慢性特定器官毒性的研究；关于化学试剂的致畸性(teratinogenicity)的研究；关于化学试剂的生殖毒性、致癌性和诱变性的研究；传染性生物试剂和生物武器的检测；有害化学试剂和化学武器的检测；关于传染性的疾病的研究；关于化学试剂治疗疾病的有效性的研究；关于生物试剂治疗疾病的有效性的研究；关于治疗疾病的试剂的最佳剂量范围的研究；预测体内器官对生物试剂的反应；预测化学或生物试剂的药物代谢动力学；预测化学或生物试剂的药效学；关于遗传内容对试剂反应的影响的研究；微尺度组织下面的过滤器或多孔材料可以被选择或构造以便约束变性的单链DNA；关于基因转录对化学或生物试剂的反应的研究；关于蛋白质表达对化学或生物试剂的反应的研究；关于代谢变化对化学或生物试剂的反应的研究；通过数据库系统和相关模型预测试剂影响；通过专家系统预测试剂影响；以及通过基于结构的模型预测试剂影响。
生物反应器能够通过配体或特定受体约束分子的附着而被修改，以修改细胞的附着或行为。
药物能够被添加并通过每个单独生物反应器中的组织块循环，同时在几个时间点处取样以确定代谢清除轮廓；剂量反应能够通过使用单个板上的几个单独反应器中的药物稀释来确定。不同剂量的药物能够被添加到相同的板之内的不同生物反应器，并且潜伏几天或甚至几周来确定慢性或亚慢性毒性反应。最终的读出与光板化验一致。系统也能用于细胞筛选，用于细胞对材料的影响(例如，以与药物的组织代谢等效的方式)。
如果希望在生物反应器阵列外面(例如在执行化验之后)调查生物样本，则具有细胞/组织的支架能够从生物反应器井抽出到具有转移井的板中。这能够对全部或只对挑选的生物反应器井人工或机器人执行。
来自这些研究的结果能够被输入到数学模型中来预测体内器官的反应。结果也能被输入到数学模型中来预测化学或生物试剂的药物代谢动力学和/或药效学。系统能够和其它测试系统集成，诸如涉及染色体组、基因转录、蛋白质表达和所关心的其它生物现象的那些。
使用微尺度组织阵列的测试系统具有用于体外化验的广泛用途。使用该阵列，能够研究生物转化、清除、代谢和异生物质的激活。能够研究通过上皮层和通过脑血管屏障的化学和生物试剂的生物利用率和传输。还能够研究化学试剂的急性基本毒性、急性局部毒性或急性特定器官毒性、致畸性、生殖毒性、致癌性和诱变性。能够检测传染性的生物试剂、生物武器、有害化学试剂和化学武器。能够研究传染性的疾病、化学和生物试剂治疗这些疾病的有效性、以及这些试剂的最佳的剂量范围。能够预测体内器官对化学和生物试剂的反应、以及这些试剂的药物代谢动力学和药效学。能够研究遗传内容对这些试剂的反应的影响。
能够确定对化学或生物试剂反应的蛋白质表达的数量。能够研究响应化学或生物试剂反应的代谢的变化。通过数据库系统和相关模型、专家系统或基于结构的模型，能够预测试剂的影响。
有毒物质，包括对所有细胞具有固有毒性的化合物(例如氰化物)和那些通过实质细胞新陈代谢转变成有毒的代谢物(通常是亲电子试剂)，通过使用综合的方法来检测将要导致细胞死亡的活动，也能够被检测。这能够是通用而不是专用的；亦即不是专用于单独的毒素，而是通用于整个种类。例子包括线粒体毒物、DNA破坏试剂和膜破坏试剂。
代谢检测可以通过使用在线检测方法诸如UV、可见光或荧光检测器和/或质谱分析监视来自细胞的液体流出物来实现。另外，来自细胞的流出物能够定期取样，并使用标准的分析技术以离线的方式分析代谢物的存在。
细胞下面的过滤器或多孔材料可以被设计以包括收集剂和/或基质，作为用于检测代谢物的方法。这些收集剂(亦即缩氨酸或亲核的有机物种)将暴露给从细胞发出的液体，并将共价结合到由细胞产生并释放到灌注液中的反应代谢物。由收集剂和反应代谢物的共价键形成的复合物然后能够就地检测，或者能够通过使将收集剂连接到过滤器或多孔材料的不稳定键的开裂从过滤器或多孔材料释放。通过化学方法、放射性或酶，或者通过特定波长的光的暴露，能够开裂该不稳定健。
感染的三种潜在荧光读出，每个作为时程的函数，是胞质酶泄漏、胞质NAD(P)H减少、以及链接到内皮细胞或肝细胞中的应激诱导启动子的GFP的表达。
与化学毒素相比较，生物毒素通过不同的机制起作用并可能表现出作用的不同敏感性和时程。能够评估生物毒素对肝和ES细胞二者的影响。代表性的例子包括志贺样毒素(SLT或志贺样毒素)，其由出血性大肠杆菌产生，和Vac(空泡毒素)，其由幽门螺杆菌产生。SLT通过使宿主细胞核糖体的60S亚单位失活来停止宿主细胞蛋白合成(Tesh等，Mol.Microbiol.51817-22(1991))。Vac毒素通过未知的受体与细胞结合，并且可能通过抑制钠-钾ATP酶的活性，诱导空泡的形成。
使用多种激光诱发荧光(LIF)技术，能够满足与在这个动态组织传感器的范围之内实时监视细胞毒性相关的技术挑战。LIF提供在毫微微摩尔(10-15摩尔)中的检测极限，并且对理想的分析物来说，微微微摩尔(10-18摩尔)的检测极限是可能的。为了监视对组织传感器的有毒损害的效果，已经识别了两个主要终点(primary end-point)细胞内NAD(P)H水平的下降和细胞膜完整性的丧失。
在由呼吸链的破坏引起的线粒体毒物(例如甲萘醌或氰化物)的情况下，观察响应毒素暴露的细胞内NAD(P)H的下降。经由与DNA相关的蛋白质的聚ADP核糖基化的过程，细胞内的NADH和NAD(P)H水平也响应核毒素(例如氮芥)而耗尽。如上所述通过现场荧光光谱学能够监视NAD(P)H的细胞池，以得到响应毒素或毒素原暴露的波动。
细胞膜完整性的丧失是所有细胞毒素途径(亦即坏死或凋亡)的共同终点，并且能够在对于基于组织的传感器的全部细胞致死性暴露之后观察到。细胞膜完整性的丧失伴随着细胞内的成分泄漏到灌注液中。利用这种细胞膜完整性的丧失的一种方法能够是用荧光素的聚酯化衍生物(例如钙黄绿素AM，Abs494 Em517)加载生物传感器的细胞。这些非荧光衍生物被动地进入细胞，其后，酯酶把它们水解成保留在细胞中的聚阴离子的荧光染料。由毒性损害引起的细胞膜渗透性的增加能够导致染料向灌注液的损耗。因此，监视被细胞保留的染料的荧光的降低能够提供细胞毒性的读出。
另一个通过膜完整性的丧失来量化细胞毒性的方法能够是观察释放到灌注液中的酶活性(例如碱性磷酸酶和γ-谷胺酰转肽酶)的增加。这能够通过在线酶检测器的LIF光谱学完成，该在线酶检测器由固定的在先荧光团或在先发色团酶基质(substrate)组成。
例如，这种方法能够用于监视在毒性损害之后通过细胞阵列释放到灌注液中的γ-谷胺酰转肽酶活性。若丹明衍生物已被设计为是非荧光的，直到γ-谷胺酰转肽酶的作用释放游离胺为止。由此得到的产物是高荧光的(Abs492 Em529)并保持结合到载体。与从在灌注液中循环的可溶性荧光团检测信号相比，在线固定基质的使用允许监视累积的信号并显著改进了灵敏性。使用固定荧光素二磷酸盐衍生物，能够利用相似的对策来监视碱性磷酸酯酶的活性。
在线检测器的一个构造包括将(一个或多个)在先荧光团和/或在先发色团酶基质固定到位于每个细胞下面的过滤器或多孔材料上，与从每个细胞发出的特定细胞响应起反应。这样的过滤器阵列能够被设计以包括以变化灵敏性对相同的细胞响应进行响应的基质和响应不同的细胞响应的基质。另外，冗余(亦即存在于阵列之内多于一个细胞之下的相同在先荧光团/发色团)能够遍及细胞阵列分布。在先荧光团/发色团被设计以响应无数的细胞响应，包括但不限于来自细胞的酶泄漏、流出物pH的波动、以及活性氧的释放。
通过每个过滤器或多孔材料产生的荧光信号与细胞反应的程度成比例。过滤器或多孔材料的阵列将表明特有荧光强度模式，其将指示细胞阵列的状态。使用以上在描述传感器的部分中列出的仪表装置，必要时能够在周期性的基础上收集来自阵列的荧光信号。从荧光团的阵列获得的数据能够由模式识别软件解释，以使荧光信号模式与细胞阵列的状态相关。感染的三种潜在的荧光读出，每个作为时程的函数，是胞质酶泄漏、胞质NAD(P)H减少、以及链接到内皮细胞或肝细胞中的应激诱导启动子的GFP的表达。其它的荧光读出包括半胱天冬酶的激活和线粒体的活性，如通过诸如若丹明123之类的标记报导的那样。
权利要求
1.一种装置，包括灌注生物反应器和储槽对的密集阵列，用于细胞或组织培养，以及阀和泵，它们经由共同的控制通道并行启动，并且通过生物反应器和储槽对的所述阵列再循环培养基。
2.如权利要求1所述的装置，其中，每个生物反应器包括井，其包括三维细胞/组织支撑结构。
3.如权利要求1所述的装置，其中，所述细胞支架或载体由多孔材料制成。
4.如权利要求2所述的装置，其中，所述细胞支架由微孔滤器或隔膜支撑的固体膜或片中的微通道阵列形成。
5.如权利要求2所述的装置，其中，所述支架能够从所述生物反应器井抽出。
6.如权利要求1所述的装置，其中，所述阵列的每个生物反应器包括生物反应器井及其自己的储槽井。
7.如权利要求6所述的装置，其中，通过允许再循环细胞培养基的流体通道连接所述生物反应器井和储槽井。
8.如权利要求1所述的装置，其中，所述阵列中的所有生物反应器/储槽对都由共同的可移动的盖子覆盖。
9.如权利要求1所述的装置，包括这样的装置，其用于细胞/组织种植、试剂添加或试样收集的人工或机器人移液操作。
10.如权利要求1所述的装置，其中，每个生物反应器/储槽对与所述阵列中的所有其他生物反应器/储槽对流体隔离。
11.如权利要求1所述的装置，其中，经由共同的液压或气压控制通道并行地启动所述阵列中所有生物反应器的所述阀和泵。
12.如权利要求1所述的装置，其中，在流体歧管中制造或微制造所述生物反应器/储槽对。
13.如权利要求1所述的装置，其中，在控制歧管中制造或微制造所述控制通道。
14.如权利要求1所述的装置，其中，通过在流体和控制歧管之间夹入单片弹性隔膜，制造隔膜阀。
15.如权利要求14所述的装置，其中，通过所述控制通道施加的液压或气压传动能够偏转所述控制和流体通道之间的隔膜。
16.如权利要求1所述的装置，其中，通过串联连接的所述阀的顺序传动泵送多个生物反应器中的细胞培养基。
17.如权利要求1所述的装置，进一步包括第一组细胞。
18.如权利要求17所述的装置，进一步包括第二组细胞，其在建立初始生物反应器组织之后引入。
19.如权利要求18所述的装置，其中，所述第二组细胞是肿瘤细胞。
20.如权利要求18所述的装置，其中，所述第二组细胞是干细胞。
21.如权利要求17所述的装置，包括肿瘤细胞，其在肝组织的环境中生长。
22.如权利要求17所述的装置，包括肿瘤细胞，其能够被研究用于肿瘤细胞行为。
23.如权利要求18所述的装置，其中，能够在肿瘤细胞生长期间观察分子活动。
24.如权利要求1所述的装置，其中，所述第一组细胞能够在引入到所述装置中之前或之后修改。
25.如权利要求1所述的装置，包括原发肿瘤细胞，其来自患者，用于诊断或预后测试。
26.如权利要求25所述的装置，其中，能够评估所述肿瘤细胞对试剂或基因治疗的敏感性。
27.如权利要求21所述的装置，其中，肿瘤细胞对试剂或基因治疗的敏感性被联系到试剂或基因治疗的肝代谢。
28.如权利要求20所述的装置，其中，所述引入的第二组细胞是干或祖细胞，并且所述干或祖细胞被成熟的组织诱导分化。
29.如权利要求17所述的装置，包括成熟细胞，其通过所述系统中流速或培养基成分的操纵可诱导复制。
全文摘要
已构造了这样的系统，其通过正常人类组织概括了毛细血管床的特征。所述系统有利于以毛细血管床的长度尺度的三维(3D)细胞单一培养和异型细胞共同培养的灌注。主要特征在于，能够在“多井板”格式之内利用所述系统，其适用于高处理量化验，适合于制药开发中通常使用的机器人技术的类型。所述系统提供了实施用于毒理学和新陈代谢的化验的方法，并且作为用于诸如包括肝炎的肝病、辐射相关的病理学以及癌症之类的人类疾病的模型。癌症应用包括原发性肝癌以及转移。所述系统也能够用作测试用于治疗疾病和先天遗传缺陷的基因疗法的方法。
文档编号C12Q1/68GK101061213SQ200580024328
公开日2007年10月24日 申请日期2005年5月19日 优先权日2004年5月19日
发明者卡雷尔·多曼斯基, 琳达·G·格里菲思, 史蒂文·R·坦嫩鲍姆, 艾伦·韦尔斯 申请人:麻省理工学院, 高等教育联邦体系所属匹兹堡大学