新颖的食物制造方法

专利名称：新颖的食物制造方法
技术领域：
本发明涉及制造食物、宠物食物或饲料制品的方法和由此方法获得的食物、宠物食物或饲料制品，所述方法涉及至少一个加热步骤。此外，本发明涉及适合于根据本发明的方法的新颖的酶。
对丙烯酰胺进行商业生产已经有数年了。因此，人们已对其毒性学背景进行了很好的评价。丙烯酰胺主要用于生产聚丙烯酰胺，后种化合物被应用于多种应用，诸如饮用水生产、土壤稳定、工业废水处理和油开采以及实验室应用。
丙烯酰胺被认为可能对动物和人类致癌。1991年，食品科学委员会(Scientific Committee on Food)已调查过接触食物材料的单体丙烯酰胺，在其评价中，丙烯酰胺被认为是遗传毒性致癌物。Bergmark et al.(Chem.Res.Toxicol.，10.78-84(1997))指出，丙烯酰胺是烟草的烟的一种成分，这是丙烯酰胺的形成和对生物材料进行的加热之间的第一个联系。近来，丙烯酰胺在多种煎炸食物和烤箱制备的食物中的存在被公开(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522.(2000))，这引起了世界范围内的关注。进一步的研究揭示，在多种不同的烘焙、煎炸和烤箱制备的大众食物中都可检测到丙烯酰胺，并且表明食物中丙烯酰胺的存在是加热过程的结果。
英国对于食物制品中丙烯酰胺污染的官方限制被设定为10ppb(每千克10微克)。对很多制品来说，文献报道的值都超过了这个设定值，尤其是谷物、面包制品、咖啡、薯条(法式薯条)和炸薯片。
在试验中已观察到了丙烯酰胺的服用剂量和肿瘤发生率之间的关系，其中，通过饮用水向大鼠喂饲丙烯酰胺，两年内大鼠死亡(Friedman et al.，Fundam.Appl.Pharmacol.85154-168；1986；Johnson et al.Toxicol.Appl.Pharmacol.85154-168，1986)。Tareke et.al.研究了大鼠中与血红蛋白结合的丙烯酰胺(作为N-(2-氨基甲酰乙基)缬氨酸)与含有丙烯酰胺的膳食的关系。组合这些数据，计算得出，1.6mg/kg的丙烯酰胺每日吸收量对应于人类一生遭受的癌症风险为7×10-3。
已提出了从氨基酸和还原性糖来形成丙烯酰胺的途径(Mottram et al.Nature 419448，2002)。根据此假设，丙烯酰胺可以在Maillard反应期间形成。烘焙(baking)、煎炸(frying)和烘烤(roasting)期间，Maillard反应主要用于产生制品颜色、气味和味道。与Maillard反应相关的是胺基酸的Strecker降解，并且到丙烯酰胺的途径也被提出了。当温度超过120℃时，丙烯酰胺的形成就可以检测到了，在大约170℃时观察到最高的形成速率。当天冬酰胺和葡萄糖都存在时，可以观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量的丙烯酰胺。
就公众健康方面而言，人们急需具有充分更低的丙烯酰胺水平或者优选完全没有丙烯酰胺的食物制品。第一个方面，已经开始了一些研究活动，以揭开食物制品中丙烯酰胺形成的机制。迄今为止，其结果还不能产生对该问题的满意解决方案。目前，食物公司正在调查通过降低烤箱烹制及焙烤过程的温度来避免丙烯酰胺形成的可能性。但是，上述改变肯定将导致食物制品具有改变的口味(较少的Maillard产物)或改变的组成(更高的脂肪含量)。
专利申请US 2004/0058046和US 2004/0058054提供了预防丙烯酰胺形成的方法，这通过用能破坏丙烯酰胺形成过程涉及的氨基酸(特别是天冬酰胺)的酶对食物制品的中间产物形式加以处理来实现。在产品质量角度来看，对氨基酸的修饰可能是不想要的，例如当相关氨基酸在产品重量中占到主要成分时。这例如对马铃薯来说是这样的，其中，相对马铃薯干重存在有大约0.1wt％的天冬酰胺。在薯片上形成的丙烯酰胺大约100ppb，这表示马铃薯中存在的天冬酰胺仅有一小部分形成了丙烯酰胺。但是，应用上述专利申请的方法，将使得需要对存在的营养相关氨基酸天冬酰胺的全部或至少大部分加以修饰。
此外，在某些情况下，该方法难于应用，例如当加热步骤之前，不存在足够潮湿以允许外源提供的酶发挥作用的食物制品中间产物形式。最后，尽管采取了用来避免这种情况的一切手段，丙烯酰胺的形成仍有可能发生。
本发明的一个目的是提供新颖的食物生产方法，所述方法能降低食物制品中丙烯酰胺的水平，同时保持高水平的营养相关氨基酸，所述方法适用于食物制品或其中间产物或其原材料。
本发明的目的是通过包括下述步骤的食物生产方法达到的-将食物制品加热至丙烯酰胺形成的温度，-接着加入能修饰丙烯酰胺的酶。
令人吃惊地，向食物应用能修饰丙烯酰胺的酶，获得理想的丙烯酰胺低水平，同时保持高水平的营养相关氨基酸(例如天冬酰胺)是可能的。
除非在说明书中有不同的明确指示，措辞“食物”在此处和下文中被定义为包括用于人类消耗的食品以及用于动物消耗的食品，包括宠物食物和饲料。食物包括饮料。此外，除非在说明书中有不同的明确指示，措辞“食物制品”被定义为包括原材料、食物中间产物和即食食物制品。本发明提供了一种用于生产食物制品的方法，所述方法涉及至少一个加热步骤，所述方法包括在所述加热步骤之后加入能修饰丙烯酰胺的酶。应用该酶的食物制品的形式不一定要是最终制品——在酶加入之后可进行其它加工步骤。优选的食物制品是在干燥条件下被热处理从而含有待被降低至更低水平的丙烯酰胺的量的食物制品。干燥条件包括少于20wt％，优选少于15wt％。咖啡豆、咖啡粉、咖啡饮品或者含咖啡的饮品是待处理的最优选食物。咖啡豆在干燥条件下被“烘烤”以产生它们的香气。在该烘烤或加热条件下，将形成丙烯酰胺。
非常难用例如天冬酰胺酶来预处理这些豆以防止丙烯酰胺形成。WO2004/037007公开了此类预处理。
在WO 2004/037007中，通过使外源加入的酶与或多或少呈固态的基质中的化合物相接触，来尝试解决丙烯酰胺的形成。
WO 2004/037007中的方法需要在烘烤步骤之前进行进一步的大量额外加工，包括干燥、水化、降低颗粒大小等。这通常与咖啡加工不兼容。
所用的方法相当耗费劳动力和时间，而丙烯酰胺的降低也不大。
此外，用失活的酶浸泡也是有效的(见WO 2004/037007的实施例3)，所以该效果的至少部分仅是简单地由水从咖啡豆提取出天冬酰胺导致的，而并非是酶活性导致的。采用该提取方法，还会导致有价值的咖啡香气化合物损失。
在本发明的方法中，加热步骤是如下这些其中，中间食物制品的一部分被暴露于促进丙烯酰胺形成的温度下，例如，105℃或更高，120℃或更高。通常，食物制造方法中加热步骤的温度最高为250℃，更通常为高达220℃或200℃。根据本发明的方法中的加热步骤可在如下情况下进行在烤箱中，例如，在150-250℃之间的温度，例如，用于对面包和其它烘焙制品的烘焙；油中，例如油炸法式薯条、薯片或豆腐，例如，在150-200℃之间；扁平烤盘(hotplate)中或在被加热的烤架上或下进行。
优选的加热步骤是烘烤或烧烤。
所述食物制品可制自至少一种植物来源的原材料，例如，块茎，诸如马铃薯，红薯或木薯；豆类，诸如豌豆或大豆；香料植物，诸如烟草、咖啡或可可；坚果；或谷物，诸如小麦、黑麦、玉米、苞谷、大麦、去壳麦粒(groat)、荞麦、水稻和燕麦。从超过一种原材料制得的食物制品也被包括于本发明的范围内，例如包含玉米和马铃薯二者的食物制品。
食物制品还可包含至少一种动物来源的原材料。
食物制品还可包含至少一种真菌来源的原材料，例如，从蘑菇或真菌蛋白质获得的原材料。
根据本发明的方法可适用的食物制品的一个例子是烘烤制品和/或从烘烤制品制得的粉、混合物和/或提取物。烘烤制品的例子是咖啡或可可豆；坚果；例如花生、杏仁、核桃、山核桃、榛子；谷物，例如经烘烤的玉米；根类，例如菊苣；经分离的物质，例如用于焦糖的糖。根据本发明的方法特别适用于咖啡或可可豆。
本发明还涉及从经烘烤材料获得的制品。从经烘烤材料获得的制品的例子是煮好的咖啡、咖啡提取物、咖啡浓缩速溶咖啡、液体咖啡饮品、经碾磨的咖啡、这些咖啡制品的无咖啡因形式、可可粉、巧克力、速溶巧克力饮品、坚果糊、啤酒、威士忌、麦芽、麦芽提取物、酱油。
本发明极其适用于经烘烤的食物制品，因为在这些制品的生产过程中，在加热步骤之前通常不包括包含足够水分以允许对制品中间产物进行酶作用的步骤。
特别优选的方法是下述这些其在加热步骤之后涉及液体或潮湿环境，例如对经烘烤或加热材料的液体提取，或将经碾磨的经烘烤或加热材料与另一种潮湿的材料或与水混合。用此类方法制备的制品的例子是咖啡、可可饮品、巧克力、杏仁香料(spice)、酱油或焦糖。
根据本发明的方法还可用于包含丙烯酰胺的其它食物制品，而不仅仅偏向于上述的方法。
当在100-120摄氏度及更高的温度下对食物加热时，丙烯酰胺通过天冬酰胺和葡萄糖的反应在食物中形成。丙烯酰胺的形成随着提高的温度增加。在将形成丙烯酰胺的温度下对若干种食物进行处理，例如，在225摄氏度的烤箱中烘焙的面包、当在大约160至180摄氏度的油中煎炸的法式薯条或在180℃及更高的温度下烘烤的咖啡豆。
在若干专利申请中都描述了防止丙烯酰胺形成的可能性。其一个例子是使用天冬酰胺酶对天冬酰胺进行酶处理。该处理显示非常成功。例如在面包、法式薯条和薯片中，形成的丙烯酰胺的量大大减少。在这些情况下，在加热之前将酶加入到食物中。在烘焙之前将酶加入到面团中。可用酶溶液对法式薯条或薯片进行喷雾。对法式薯条和面包而言，仅食物的外表面暴露给高于100摄氏度以上的温度。在面包中，内部不会被加热至高于80或90摄氏度，因为存在有水。此外，法式薯条的内部将不会被加热至高于水的沸腾温度，在内部基本没有丙烯酰胺形成，因此仅对法式薯条的外表面进行酶处理就足以防止丙烯酰胺形成了。
我们已经发现，在下述食物制品中使用该天冬酰胺酶效果较小，所述食物制品被热处理的方式使得整个食物制品都将具有高于120摄氏度的温度，从而没有可以以具有商业吸引力的方式将酶包括进整个食物制品的方法。通常，这些食物制品是固体并且不能揉捏(不像面包面团)，具有至少3mm的厚度，并且仅含少量的水，通常少于20wt％，优选少于12wt％的水。其一个好例子是咖啡豆。这些豆被烘烤，以产生适于制造咖啡的咖啡豆。在烘烤期间，整个豆子将具有超过150摄氏度的温度。丙烯酰胺将不像法式薯条或面包那样仅在外层形成，在整个豆子中都将形成丙烯酰胺/
在最常见的方法中，对咖啡果(coffee berry)进行捡选、脱壳、熟化(“发酵”)、洗涤和干燥(暴露于开放的空气或通过强制性的热空气来进行)。这些步骤在咖啡生产商处(在生产国家)进行。得到的产品是生咖啡豆，水分含量在9.8至12.5％之间(推荐为11-12)。在该阶段，豆子是可被良好保存的。
对于“正常”咖啡而言，需要对豆子进行简单烘烤。小设备在大约260℃运行(内部温度变得高于200℃)。工业设备可能使用更高的空气温度(但更短的驻留时间)。
本发明因此优选用于生产下述食物的方法，所述食物是咖啡制品，优选地，咖啡豆、经碾磨的咖啡、速溶咖啡、液体咖啡饮品、咖啡提取物和咖啡制品的无咖啡因形式。
对于无咖啡因形式而言，至少有4种方法(都在生咖啡豆上进行)1.用CO2进行超临界萃取。此情况下酶不发挥作用。
2.二氯甲烷萃取。此情况下首先对咖啡豆施以蒸汽。
3.乙酸乙酯萃取。此情况下，用水从咖啡豆中提取咖啡因(以及大量其它(香的)化合物)，然后用乙酸乙酯除去咖啡因，将洗涤水加回到咖啡豆中，还原香味。
4.Swiss水方法。这类似于3，但用活性炭吸附代替乙酸乙酯。
虽然本发明可用于所有生产无咖啡因形式的方法，但本发明的方法最有利地用于制造常规咖啡制品。
我们惊奇地发现，可不对咖啡豆进行处理，而是对这些咖啡豆制成的提取物进行处理，来降低咖啡中的丙烯酰胺的量。
因此本发明公开了一种方法，用于通过处理食物来降低食物中丙烯酰胺的量，所述食物在高于100摄氏度的温度下被热处理，优选高于120摄氏度，最优选高于150摄氏度，随后所述食物在水性条件下与酰胺酶接触。
优选的水性条件通过加入含水液体或糊状物质来获得。液体或糊状物质可含有酶，但是液体或糊状物质也可与酶分开加入。在加入液体或糊状物质之后，食物制品可以处于水性状态(例如咖啡提取物或巧克力或可可饮品)、糊状状态(例如花生酱或杏仁香料)、乳液形式(例如花生酱)，只要经酶处理的食物含有至少15wt％，优选至少25wt％，更优选至少40wt％以及最优选至少60wt％的水。本发明的食物制品优选是煮好的咖啡、液体咖啡饮品、咖啡提取物、可可饮品或巧克力饮品。酶处理之后，食物制品可被干燥或部分干燥。所以，用酰胺酶进行过酶处理的经浓缩的咖啡提取物、速溶咖啡、速溶巧克力饮品或速溶可可饮品也是本发明的一部分。
如果必要的话，可对酰胺酶加以失活。这可以通过例如在合适的温度例如90℃短暂加热来进行。
我们首次成功地以工业规模从咖啡豆或咖啡粉制得了包含小于50ppb，优选小于30ppb，最优选小于10ppb丙烯酰胺(微克丙烯酰胺/kg干咖啡)的咖啡。
因此，本发明提供了经烘烤咖啡豆、咖啡提取物、经浓缩咖啡饮品、咖啡饮品、煮好的咖啡，其中基于干物质咖啡含有小于50ppb，优选小于30ppb，最优选小于10ppb的丙烯酰胺。
本发明还包含包装(例如密封锡纸包装(可选地，真空密封地)，用金属、玻璃或聚合物等制造的罐(jar)或壶(pot))，其中包含50克，优选至少100克的经烘烤咖啡豆、咖啡提取物、经浓缩咖啡饮品、咖啡饮品、煮好的咖啡，所述烘烤咖啡豆、咖啡提取物、经浓缩咖啡饮品、咖啡饮品、煮好的咖啡含有小于50ppb，优选小于30ppb，最优选小于10ppb的丙烯酰胺(基于干物质咖啡)，最优选小于10ppb的丙烯酰胺(基于干物质咖啡)。
通常，这些包装将含有小于1000kg，优选小于100kg，更优选小于10kg，最优选小于1kg的经烘烤咖啡豆、咖啡提取物、经浓缩咖啡饮品、咖啡饮品、煮好的咖啡，所述烘烤咖啡豆、咖啡提取物、经浓缩咖啡饮品、咖啡饮品、煮好的咖啡含有小于50ppb，优选小于30ppb，最优选小于10ppb的丙烯酰胺(基于干物质咖啡)。
用于本发明的方法中的酶是能修饰丙烯酰胺的酶。“酶”用于表示“一种酶”以及“超过一种酶的组合”。优选地，该酶能修饰短链非环状酰胺。通常，短链非环状酰胺在它们的脂肪链中包含至多6个C原子，更优选至多5个，进一步更优选至多4个，最优选至多3个。脂肪链可以是线性或带支链的。更优选地，该酶能修饰丙烯酰胺、乙酰胺和/或丙酰胺。对丙烯酰胺的优选修饰通过酰胺酶的作用来进行。
优选地，用于本发明方法中的酶制剂从微生物获得，或者通过本领域已知的发酵方法获得。微生物可以是细菌、真菌或酵母。
酶可从多种来源获得，例如从植物、动物和微生物获得，所述微生物例如Alcaligenes、Arthrobacter、Brevibacterium、Escherichia、Klebsiella、Mycobacterium、Streptomyces、Saccharomyces、Pseudomonas、Rhodococcus、Xanthomonas、Aspergillus和Bacillus的种，优选地，Aspergillus、Baccillus或Saccharomyces，更优选地，Aspergillus。合适的Escherichia菌株的例子是Escherichia coli。合适的Rhodococcus菌株是Rhodococcus rhodochrous。合适的Pseudomonas菌株的例子是P.aeruginosa、P.cepacia和P.chloroapis。合适的Streptomyces菌株的例子是Streptomyces lividan。合适的Saccharomyces菌株的例子例如是Saccharomyces cerevisae、Saccharomyces uvarum、Saccharomycesbayanus、Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces paradoxus。合适的Aspergillus菌株的例子是Aspergillus oryzae、Aspergillus nidulans(Emericella nidulans)或Aspergillus niger。合适的Bacillus菌株的例子是Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacilluscirculans、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacilluslicheniformis、Bacillus megateruim、Bacillus stearothemophilus、Bacillussubtilis或Bacillus thuringiensis。
优选地，酶从食物级别的微生物，例如Aspergillus niger、Saccharomyces cerevisiae或Bacillus subtilis获得，最优选是Aspergillusniger。
优选地，酶作为稳定形式提供，通常以液体、粉末、颗粒或胶囊形式提供。不管酶的配方是什么，本领域中已知可用于提高和/或保持酶活性的任何添加剂和稳定剂都可应用。当酶以液体形式被含有时，其可通过任何可想象到的方法应用于产品，例如通过浸泡、喷雾或混合来进行。酶例如还可添加至食物中间产物的液体提取物、乳液或悬浮液。或者，可通过能生产所述酶的微生物对酶进行原位制造。
酶可以以大约100-0.1U/L之间的量加入，更优选地，低于50U/L，进一步更优选地，至多10U/L，或者在5至1U/L之间(其中，1U被定义为每分钟水解1μmol酰胺)，见实施例8。
酰胺酶(或酰胺水解酶)是能水解酰胺C-N化学键由此产生氨和相应的酸的酶。例如，乙酰胺酶将乙酰胺转化为氨和乙酸，丙烯酰胺酶将丙烯酰胺转化为氨和丙烯酸(acrylic acid)(丙烯酸(propenoic acid))。
酰胺酶是已被很好研究过的酶的类，其被分类为“水解碳-氮键，而非肽键的酶”(EC 3.5)。特别有兴趣的是作用于线性酰胺的组(3.5.1)。催化相似反应的另一组酶是beta-内酰胺酰基转移酶(EC 3.5.1.11)，其中C和N也都被取代，例如戊二酰酰基转移酶，其中C是戊二酸的一部分，N是beta-内酰胺环的一部分。以类似方式作用的其它酶是天冬酰胺酶(3.5.1.1)、谷氨酰胺酶(3.5.1.2)、6-氨基己酸酯-环-二体水解酶(EC3.5.2.12)、脂肪酸酰胺水解酶、几丁质脱乙酰酶(3.5.1.41)、谷氨酰-tRNA(Gln)-酰胺转移酶。它们催化的水解反应类似于肽酶(EC 3.4)，但在肽酶的情况下，被水解的键的C和N被包含于氨基酸中。
注意，使用根据本发明的酰胺酶用于修饰丙烯酰胺(一旦其形成了)与使用例如天冬酰胺酶破坏氨基酸以防止丙烯酰胺形成的用途(如现有技术所述，例如US 2004/0058046或US 2004/0058054.)本质上不同。
这些酶中的许多但非全部共享共有的结构基元富含甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基的保守区域。已有报道称，酰胺酶有三个主要的家族酰胺酶标识组(例子A.oryzae、S.typhimurium)；腈水解酶组(例子P.aeruginosa、R.erythropolis、H.pylori、B.stearothermophilus)；脲酶组(例子M.smegmatis)(Novo，et al.，Biochem.J.365731-738，2002)。酰胺酶的底物包括乙酰胺、吲哚乙酰胺、苯乙酰胺、para-硝基-乙酰苯胺、para-硝基-N-乙酰苯胺、氯乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺、琥珀酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯甲酰胺和烟酰胺。
现有技术中已报道过使用来自多种来源的酰胺酶水解丙烯酰胺的用途，该用途用于从聚丙烯酰胺产品中除去单体丙烯酰胺，以允许对聚合物的更安全的使用。例如，美国专利4,925,797描述了来自Methylophilusmethylotrophus的酰胺酶用于该目的的用途。该专利的作者关注了可能与食物接触的聚合物中丙烯酰胺的存在，他们提供了一种方法用于从聚合物中去除丙烯酰胺，以避免对食物的污染。在美国专利5,962,284中，来自Rhodococcus sp.的酰胺酶被用于降低聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺的水平。美国专利6,248,551中描述了来自Helicobacter pylori的丙烯酰胺酶。其它作者已使用被固定的酶来获得对丙烯酰胺的破坏，例如，在美国专利6,146,861中，Rhodococcus rhodochrous细胞被用于该目的。
这些应用并不涉及包含丙烯酰胺的食物本身，也没有暗示这些酰胺酶用于食物制品自身上以降低丙烯酰胺水平的用途，更没有暗示酰胺酶用于食品应用的适合性。
上述应用还涉及使用细菌的酰胺酶。但是，丙烯酰胺水解活性还从真菌已知。在分子遗传学领域中，Emericella乙酰胺酶被用作选择标记，用于对真菌细胞进行遗传转化。但是，较之底物范围、特异性和细菌酰胺酶偏好方面的知识，人们对真菌酶的性质知之甚少。此外，真菌酰胺酶还没有被用于有效去除丙烯酰胺。此外，还没有获得丙烯酰胺水解酶在食物中成功将丙烯酰胺降低至可接受水平的成功应用。这并非无足轻重的问题，因为将获得的水平(由此地，酶底物的浓度)非常之低，在ppb的范围内，例如低于200ppb，更优选地，低于100ppb，进一步更优选地，低于50ppb，最优选地，低于20ppb。
令人吃惊地，我们已发现，丝状真菌Aspergillus niger含有编码能水解丙烯酰胺的酶的多个基因。此外，我们已发现，这些酶中的一些会分泌进液体培养物，这将增加生产和分离它们的容易程度。此外，我们已发现，这些酶中的一些能从食品，特别是在加热步骤期间已形成丙烯酰胺的食品中有效地去除丙烯酰胺。
在第二个方面，本发明提供了新鉴定出来的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括编码新颖的酰胺酶的基因，所述的酰胺酶例如是能从Aspergillus niger来制造的。所述新颖的酰胺酶可被用于本发明的食物制造方法，例如用于生产咖啡提取物。
多核苷酸本发明还提供了编码新颖的酰胺酶的新颖的多核苷酸。本发明提供了编码暂时被称为AMID01、AMID02、AMID03、AMID04、AMID05、AMID06、AMID07、AMID08、AMID09、AMID10和AMID11(下文中称为AMID01-11)的酰胺酶的新颖的多核苷酸，所述酰胺酶具有选自下述组的氨基酸序列，所述组分别由SEQ ID NO23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33(下文中称为SEQ ID NO23-33)或其中任何序列的功能等同物构成。编码AMID01-11的基因序列是通过对从Aspergillusniger获得的基因组克隆进行测序来确定的。本发明提供了包含编码AMID01-11酰胺酶的基因的多核苷酸序列，以及包含其全长cDNA序列的多核苷酸序列和包含其编码序列的多核苷酸序列。因此，本发明涉及经过分离的包含下述核苷酸序列或其功能等同物的多核苷酸，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11构成的组(下文中称为SEQ ID NO1-11)或选自SEQ ID NO12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22构成的组(下文中称为SEQ ID NO12-22)。
更具体地，本发明涉及在严谨条件下，更优选在高度严谨条件下，能与选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的多核苷酸杂交的经过分离的多核苷酸。有利地，此类多核苷酸可以从丝状真菌获得，特别是从Aspergillus niger中获得。更具体地，本发明涉及下述经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核苷酸序列。
本发明还涉及下述经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码选自SEQID NO23-33构成的组或它们中任何序列的功能等同物的多肽的至少一个功能结构域。
在本文中使用的术语“基因”和“重组基因”指下述核酸分子其可以从染色体DNA中分离出来，并包括编码蛋白质例如A.niger的天冬酰胺酶的开放阅读框。基因可以包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。此外，基因表示如本文中定义的经过分离的核酸分子。
使用标准的分子生物学技术和本文中提供的序列信息，可以分离出本发明的核酸分子，例如，具有选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQID NO12-22构成的组的核苷酸序列或其功能等同物的核酸分子。例如，用选自SEQ ID NO1-11构成的组的核酸序列或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核苷酸序列的全部或部分作为杂交探针，使用标准的杂交和克隆技术(例如，见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述)可以分离出根据本发明的核酸分子来。
此外，使用根据选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的序列中含有的序列信息设计出来的合成寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，可以分离出下述核酸分子，其包括选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核酸序列的全部或部分。
可以用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，用适当的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术，来扩增出本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析来表征。
此外，可以通过标准的合成技术来制备对应于根据本发明的核苷酸序列或者可以与根据本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸，例如，用自动DNA合成仪。
在一种优选的实施方式中，本发明的经过分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO12-22构成的组的核苷酸序列。选自SEQ ID NO12-22构成的组的序列分别对应A.niger的AMID01-11 cDNA的编码区域。该cDNA包含编码分别根据SEQ ID NO23-33的A.niger AMID01-11多肽的序列。
在另一种优选的实施方式中，本发明的经过分离的核酸分子包含如下核酸分子，所述核酸分子是下述核苷酸序列或其中任何序列的功能等同物的互补体，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ IDNO12-22构成的组。
与另一条核苷酸序列互补的核酸分子是与所述的另外的核苷酸序列高度互补的，以至于其可以与所述的另外的核苷酸序列杂交，进而形成稳定的双链体。
本发明的一个方面涉及编码本发明的多肽或其功能等同物(例如生物活性片段或结构域)的经过分离的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴别编码本发明的多肽的核酸分子的核酸分子，和适于用作对核酸分子进行的扩增或突变的PCR引物的此类核酸分子的片段。
“经过分离的多核苷酸”或“经过分离的核酸”是这样的DNA或RNA在从其中得到所述DNA或RNA的生物体的天然存在的基因组中，所述DNA或RNA与两条(5’端的一条和3’端的一条)编码序列直接相邻，而对“经过分离的多核苷酸”或“经过分离的核酸”而言，所述DNA或RNA与这两条编码序列并不直接相邻。因此，在一种实施方式中，经过分离的核酸包括与编码序列直接相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。该术语因此包括，例如，被包括进载体、自主复制的质粒或病毒、原核生物或真核生物的基因组DNA等的重组DNA，或者作为独立于其它序列的独立分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA)而存在的重组DNA。该术语还包括作为杂种基因(hybrid gene)一部分的重组DNA，所述杂种基因编码另外的多肽，所述的多肽基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术进行生产时)，或化学前体或其它化学制品(当化学合成时)。此外，“经过分离的核酸片段”是下述核酸片段，其并非是天然就作为片段存在的，而且也不能在自然状态被发现。
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意在包括DNA分子(例如cDNA和基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物生产出的DNA或RNA类似物。所述的核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链的DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，次黄苷或硫代磷酸核苷酸)来合成所述的核酸。例如，此类寡核苷酸可被用于制备碱基配对能力有所改变或对核酸酶抗性增加的核酸。
本发明的另一种实施方式提供了经过分离的核酸分子，所述核酸分子反义于选自AMID01-11构成的组的核酸分子中的至少任何一种，例如，AMID01-11的编码链。本发明的范围内还包括了本文中描述的核酸分子的互补链。
测序错误本文中提供的序列信息不应被狭义地解释为需要将非正确鉴别的碱基包括在内。可以很容易地用本文公开的特定序列从丝状真菌中分离出完整的基因，特别是从Aspergillus niger中；然后可以很容易地对所述基因进行进一步的序列分析，从而鉴别出测序的错误来。
除非另外指明，本文中所有通过对DNA分子进行测序测定出的核苷酸序列都是用自动DNA测序仪来测定的，所有由此处所确定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来预测的。因此，如本领域内所已知的那样，对任何通过该自动手段来测定的DNA序列而言，本文中测定的任何的核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动操作测定的核苷酸序列与被用来测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更典型地，至少约95％到至少约99.9％相同。可通过其它手段更精确地测定所述的实际序列，所述手段包括本领域中公知的手工DNA测序方法。如本领域中还已知的那样，如果测定出的核苷酸序列较之实际序列有一个插入或缺失，在该核苷酸进行翻译时就会导致移码(frame shift)，从插入或缺失点开始，预测得到的测定出的核苷酸序列所编码的氨基酸序列就将完全不同于被用于测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
本领域内的技术人员能够鉴别出此类非正确鉴别的碱基，而且知道如何改正此类错误。
核酸片段、探针和引物本发明的核酸分子可以仅仅包含选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核酸序列的片段或一部分，例如，可以被用作探针或引物的片段，或编码AMID01-11蛋白质的一部分的片段。对AMID01-11基因以及cDNA的克隆测定出的核苷酸序列可用来产生探针和引物，所述探针和引物是为鉴定和/或克隆AMID01-11家族的其它成员以及来自其它物种的AMID01-11的同源体而设计的。典型地，所述探针/引物包含经过充分纯化的寡核苷酸，典型地，所述寡核苷酸包含优选在高度严谨条件下，与选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核苷酸序列或它们中任何一条的功能等同物的至少约12或15个，优选约18或20个，优选约22或25个，更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多的连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
基于AMID01-11核苷酸序列的探针可被用于检测例如在其它生物中编码同样的蛋白质或同源蛋白质的转录物或基因组AMID01-11序列。在优选的实施方式中，所述探针进一步地包含连接到其上的标记基团，例如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。此类探针还可被用作诊断试验试剂盒的一部分，用于鉴别表达AMID01-11蛋白质的细胞。
同一性(identity)和同源性(homology)术语“同源性”或“百分比同一性(percent identity)”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，本着最优比较的目的(例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口(gap)，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的对齐)，将所述序列进行对齐(align)。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数×100)。优选地，该两条序列长度相同。
技术人员会知道有若干不同的计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的对齐和对两条序列间百分比同一性的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman andWunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的百分比同一性，所述算法已被包括进GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到上述的所有不同参数将产生有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体百分比同一性不会有显著改变。
在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的百分比同一性，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，411-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的百分比同一性，所述算法已被包括进ALIGN程序(2.0版) (可从http//vega.igh.cnrs.fr/bir/align-guess.cgi获得)中，其中使用PAM 120加权残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来开展对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用NBLAST程序，在分数(score)＝100，字长(word length)＝12的情况下来开展BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的AMID01-11核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，在分数＝50，字长＝3的情况下来开展BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的AMID01-11蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的对齐，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
杂交本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50％、至少约60％、至少约70％、更优选为至少约80％、进一步优选为至少约85％到90％、更优选为至少95％的核苷酸序列保持相互杂交的状态。
对此类杂交条件而言，其中一个优选的非限制的例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(sodium chloride/sodium citrate，SSC)中，大约45℃下杂交，随后在1×SSC、0.1％SDS中，50℃下进行一次或多次洗涤，优选在55℃下，优选在60℃下，进一步优选在65℃下。
高度严谨条件包括例如，在68℃下于5×SSC/5×Denhardt’s溶液/1.0％SDS中进行杂交，室温下于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42℃展开。
本领域技术人员知道何种条件适用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中容易获得其它关于此类条件的指导，例如，在Sambrook ctal.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley&Sons，N.Y.)中。
当然，仅与poly A序列(例如mRNA的3’末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如，几何任何双链的cDNA克隆)杂交。
获得来自其它生物的全长DNA采用典型手段，可以对从其它生物，例如从丝状真菌，特别是从Aspergillus的种所构建的cDNA文库进行筛选。
例如，可以通过Northern印迹分析来对Aspergillus的菌株进行筛选，以获得同源的AMID01-11多核苷酸。在检测到与根据本发明的多核苷酸同源的转录物之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者，可以使用能与根据本发明的AMID01-11多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。
例如，可以通过使用两套简并的寡核苷酸引物组(primer pool)开展PCR，来分离出同源的基因序列，所述引物组是基于本文所教导的核苷酸序列而设计的。
用于所述反应的模板可以是通过对mRNA进行反转录所获得的cDNA，所述mRNA是从已知能表达或被推测能表达本发明多核苷酸的菌株中制备得到的。PCR产物可被用于亚克隆或测序，以确保扩增出的序列代表新的AMID01-11核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可以通过一系列已知方法，用所述的PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，可对扩增出的片段进行标记，并将其用于对噬菌体cDNA文库或粘粒cDNA文库的筛选。或者，经过标记的片段可被用于筛选基因组文库。
PCR技术还可被用于从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以遵循标准工序，从适当的细胞源或组织源分离出RNA。用寡核苷酸引物对所述RNA进行反转录反应，所述引物特异于扩增片段的最靠近5’末端的序列，用于引导第一链合成。
然后可以用标准的末端转移酶反应，给得到的RNA/DNA杂交体(hybrid)“加上尾巴”(例如，用鸟嘌呤)，所述的杂交体可被RNaseH消化，然后第二链合成得以被引导(例如，用poly-C引物)。因此，可以很容易地分离出处于扩增片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见例如前述的Sambrook et al.和前述的Ausubel et al.。
同源DNA片断是否编码AMID01-11功能蛋白质，可以使用本领域公知的方法方便地检测。
载体本发明的另一个方面是关于载体的，优选为表达载体，所述载体含有如上文所述编码AMID01-11蛋白质的核酸或其功能等同物。在本文中用到的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，“质粒”指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体以及游离的哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离的哺乳动物载体)在被引入宿主细胞之后就被整合到了宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。此外，某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也将包括能提供等同功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体可包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达。重组表达载体例如可包括一段或多段调控序列，所述序列是基于被用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。根据本发明的载体优选包含根据本发明的多核苷酸序列，其与适合用于在合适的宿主细胞中表达所述多核苷酸的调控序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”被用来表示人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，其连接方式允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或在载体被引入的宿主细胞中)。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如，在Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能依赖于以下因素对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，以生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如，AMID01-11蛋白质，AMID01-11蛋白质的突变形式，其片段、变异体或功能等同物等)。
为了在原核细胞或真核细胞中表达AMID01-11蛋白质，可以对本发明的重组表达载体加以设计。例如，AMID01-11蛋白质可在细菌细胞(例如是E.coli)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对合适的宿主细胞进行了进一步的讨论。或者，所述的重组表达载体可在体外进行转录及翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、有丝真菌、酵母游离体、酵母染色体元件的载体，源自病毒，例如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
DNA插入应当被可操作地连接到合适的启动子上，例如噬菌体的lambda PL启动子，E.coli的lac启动子、trp启动子和tac启动子，SV40的早期启动子和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。技术人员已知其它合适的启动子。在一种具体的实施方式中，优选的启动子是能指导天冬酰胺酶在丝状真菌中高水平表达的启动子。此类启动子为本领域所已知。表达构建体可以含有用于转录起始和终止的位点，还在转录区域含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分包括处于起点的用于起始翻译的AUG以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。
可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入原核细胞或真核细胞。在此使用的“转化”和“转染”指一系列本领域内已知的用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。
对哺乳动物细胞的稳定转染而言，人们已知，仅有一小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中，这取决于所用的表达载体和转染技术。为鉴别和选择出上述整合体，通常将编码选择性标记(例如对抗生素的抗性)基因与人们感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。优选的选择性标记包括赋予对药物抗性的标记，所述药物例如是G418、潮霉素和甲氨蝶呤(methatrexate)。编码选择性标记的核酸可以在与编码AMID01-11蛋白质的载体相同的载体上被转移到宿主细胞中，或者，所述核酸可以在单独的载体上被转移进去。经过被引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴别(例如，已经插入了选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞则会死亡)。
蛋白质在原核生物中的表达通常是在E.coli中开展的，这用含有能指导蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。
如本文所指出的，所述表达载体将优选含有选择性标记。此类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性以及用于在E.coli和其它细菌中进行培养的四环素抗性或氨苄青霉素抗性。合适的宿主的代表性例子包括细菌细胞，例如E.coli、Streptomyces和Salmonellatyphimurium；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，例如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的合适的培养基和培养条件都是本领域内已知的。
载体中优选用于细菌的是可从Qiagen获得的pQE70、pQE60和pQE-9，可从Stratagene获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、oNH18A、pNH46A，可从Pharmacia获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Stratagene获得的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG，以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
用于本发明的已知的细菌启动子包括E.coli的lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，lambda PR、PL启动子和trp启动子，HSV胸苷激酶启动子，SV40的早期启动子和晚期启动子，逆转录病毒LTR的启动子(例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的启动子)以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠的金属硫蛋白-I启动子。
将增强子序列插入到载体中可以增强编码本发明多肽的DNA在高等真核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常从10bp至300bp，其在特定的宿主细胞类型中发挥作用，以增加启动子的转录活性。增强子的例子包括处于复制起点晚期一侧(late side)第100bp至270bp处的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、处于复制起点晚期一侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。
为使翻译的蛋白质能分泌到内质网的腔、胞质间隙或胞外环境中，可以将适当的分泌信号插入到表达的多肽中。所述的信号对该多肽而言可以是内源的，也可以是异源信号。
多肽可以以经修饰的形式表达，并且其不仅可以包括分泌信号，还可以包括其它的异源功能区域。因此，例如，可以将其它氨基酸特别是带电荷的氨基酸区域加入到所述多肽的N-末端，以增加其在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的操作及贮藏期间的稳定性和持久性(persistence)。此外，还可以将肽部分(moieties)加入到所述多肽上，以协助进行纯化。
本发明的多肽本发明提供了具有选自根据SEQ ID NO23-33的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列的经过分离的多肽，可通过在合适的宿主中分别表达SEQID NO1-11的多核苷酸而获得的氨基酸序列，以及可通过在合适的宿主中分别表达SEQ ID NO12-22的多核苷酸序列而获得的氨基酸序列。此外，包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也被包含于本发明中。上述多肽被共同包含于术语“本发明的多肽”中。
当上下文中需要指出通过肽键结合起来的至少两个氨基酸的链时，术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常所承认的一样)，两个术语可以互换使用。“多肽”这个词在本文中被用于指含有超过七个氨基酸残基的链。本文中所有寡肽和多肽的分子式或序列都是从左至右书写的，而且是从氨基端到羧基端的方向。本文中使用的单字母氨基酸代码在本领域中是公知的，其可以在Sambrook，et al.(Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中找到。
“经过分离的”多肽或蛋白质被用于指从其天然的环境中移出来的多肽或蛋白质。例如，出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的经重组生产的多肽和蛋白质被认为是经过分离的；已用任何合适的技术进行了充分纯化的天然或重组多肽也被认为是经过分离的，所述技术例如是在Smith andJohnson，Gene 6731-40(1988)中公开的一步纯化法。
可通过公知的方法从重组细胞培养物中回收及纯化根据本发明的AMID01-11酰胺酶，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交换色谱或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选地，使用高效液相色谱(HPLC)来进行纯化。
本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成工序的产物以及从原核或真核宿主中通过重组技术生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的多肽可以是经过了糖基化的，或者可以是未经过糖基化的，这取决于在重组生产工序中所使用的宿主。此外，本发明的多肽还可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况下作为宿主介导的过程的结果。
蛋白质片段本发明还公开了根据本发明的多肽的具有生物活性的片段。
本发明多肽的具有生物活性的片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与AMID01-11蛋白质的氨基酸序列充分相同或来自AMID01-11蛋白质的氨基酸序列(例如分别选自由SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸序列)，所述片段包括的氨基酸较之所述的全长蛋白质要少，其显示了相应全长蛋白质的至少一种生物活性。典型地，具有生物活性的片段包含具有AMID01-11蛋白质的至少一种活性的结构域或基元(motif)。
本发明蛋白质的具有生物活性的片段可以是多肽，所述多肽的长度例如为10、25、50、100或更多个氨基酸。此外，可以通过重组技术来制备其它具有生物活性的部分，所述部分中被去除了所述蛋白质的其它区域；对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性而言，可以对所述部分进行评估。
本发明还公开了编码上述AMID01-11蛋白质的具有生物活性的片段的核酸片段。
功能等同物术语“功能等同物”和“功能变异体”在本文中可以互换使用。AMID01-11 DNA的功能等同物是经过分离的DNA片段，所述片段对展示了本文中定义的AMID01-11 A.niger酰胺酶特定功能的多肽进行编码。本发明的AMID01-11多肽的功能等同物是展示了本文中定义的A.niger酰胺酶的至少一种功能的多肽。因此，功能等同物也包括具有生物活性的片段。
蛋白质或多肽的功能等同物可以含有仅对选自SEQ ID NO23-33构成的组的一个或多个氨基酸进行的保守替代或仅对非关键氨基酸进行的替代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是选自SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸中可被改变的残基，但所述改变基本不会改变生物功能。例如，对本发明的AMID01-11蛋白质而言是保守的氨基酸残基，就被预测为是尤其不能进行改变的残基。此外，对根据本发明的AMID01-11蛋白质和其它酰胺酶而言是保守的氨基酸，也不太可能易于改变。
术语“保守替代”用来指一种替代，其中，所述的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。上述族系已为本领域所已知，其包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β支链形式的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
典型地，核酸的功能等同物可以含有沉默突变或不改变被编码多肽的生物功能的突变。因此，本发明提供了编码AMID01-11蛋白质的核酸分子，所述蛋白质含有氨基酸残基的改变，所述氨基酸残基对特定的生物活性来说是非必要的。此类AMID01-11蛋白质与选自SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸序列不同，但所述的蛋白质仍然保留有至少一种生物活性。在一种实施方式中，所述经过分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸分子，其中，所述蛋白质包含与选自SEQ ID NO23-33构成的组的任何氨基酸序列所示的氨基酸序列具有至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的基本同源的氨基酸序列。
例如，在Bowie，J.U.et al.，Science 2471306-1310(1990)中提供了关于如何制造表型沉默的氨基酸替代的指导，其中，作者指出，有两种主要的手段可以用于研究氨基酸序列对改变的容忍度(tolerance)。第一种方法依赖于进化过程，其中，突变或者被自然选择所接受，或者被其拒绝。第二种方法则是利用遗传工程向被克隆基因的特定位点引入氨基酸改变，然后进行选择或筛选，以鉴别出保留了功能性的序列。如作者所言，上述研究已揭示，蛋白质对氨基酸替代有着惊人的容忍度。作者还进一步指出了哪些改变可能被允许进行于蛋白质的特定位置上。例如，大多数隐蔽的(buried)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面上的侧链通常很少是保守的。在前述的Bowie et al和本文引用的参考文献中，描述了其它的表型沉默替代。
编码与根据选自SEQ ID NO23-33构成的组的任何蛋白质同源的AMID01-11蛋白质的经过分离的核酸分子，可以通过下述方法来制造向选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替代、增加或缺失，从而向被编码的蛋白质中引入一个或多个的氨基酸替代、缺失或插入。可以通过标准技术来引入此类突变，所述技术例如是定点诱变和PCR介导的诱变。
术语“功能等同物”还包括A.niger的AMID01-11蛋白质的直向同源体(orthologue)。A.niger的AMID01-11蛋白质的直向同源体是可以从其它菌株或物种中分离得到的蛋白质，且所述蛋白质具有相似或相同的生物活性。此类直向同源体包含与选自SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，因此所述同源体不难被鉴别出来。
如本文所定义，术语“基本同源”指第一条氨基酸或核苷酸序列与第二条氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的或最低要求数目的相同或等同(例如，具有相似侧链)的氨基酸或核苷酸，从而，所述的第一条和第二条氨基酸或核苷酸序列具有共同(common)结构域。例如，含有具有约40％，优选为65％，更优选为70％，进一步优选为75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性的共同结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中就被定义为基本相同。
此外，编码AMID01-11家族其它成员的，因此具有与SEQ ID NO1-11构成的组或SEQ ID NO12-22构成的组不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的AMID01-11蛋白质的，因此具有与SEQ ID NO1-11构成的组或SEQ ID NO12-22构成的组不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。
使用本文中公开的cDNA或其合适的片段作为杂交探针，优选在高度严谨杂交条件下，按照标准的杂交技术，可以分离出与本发明AMID01-11DNA的变异体(例如，天然的等位基因变异体)及同源体相应的核酸分子，所述分离基于所述核酸分子与本文中公开的AMID01-11核酸分子的同源性。
除AMID01-11序列的天然存在的等位基因变异体之外，技术人员将知道通过突变向选自SEQ ID NO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核苷酸序列引入改变，由此可以导致AMID01-11蛋白质的氨基酸序列改变，但AMID01-11蛋白质的功能却没有实质性变化。
在本发明的另一个方面，提供了经过改进的AMID01-11蛋白质。改进的AMID01-11蛋白质是其中至少一种生物活性经过了改进的蛋白质。此类蛋白质可以通过向AMID01-11编码序列的全部或一部分上随机引入突变来获得，例如通过饱和诱变来获得，得到的突变体可被重组表达，并针对生物活性被筛选。例如，本领域提供了用于测量酰胺酶酶活性的标准检测方法，因此可以很容易地选出经过改进的蛋白质。
在一种优选的实施方式中，AMID01-11蛋白质具有根据SEQ ID NO3的氨基酸序列。另一种实施方式中，AMID01-11多肽与选自SEQ IDNO23-33构成的组的氨基酸序列基本同源，并且保留有选自SEQ IDNO23-33构成的组的多肽的至少一种生物活性，但因为上述的天然变异或诱变，其氨基酸序列仍有不同。
在另外一种优选实施方式中，AMID01-11蛋白质具有由经过分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述核酸片段能与分别选自SEQ ID NO1-11或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核酸杂交，所述杂交优选于高度严谨的杂交条件下进行。
因此，AMID01-11蛋白质是包含与分别选自SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸序列具有至少约40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白质，并且其还保留有选自SEQ ID NO23-33构成的组的多肽的至少一种功能活性。
根据本发明的蛋白质的功能等同物还可以通过多种方式被鉴定出来，例如通过对本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合(combinatorial)文库针对天冬酰胺酶活性进行筛选。在一种实施方式中，通过核酸水平上的组合诱变产生了变异体的杂色文库(variegatedlibrary)。变异体的杂色文库可以通过多种方式来产生，例如，通过用酶将合成的寡核苷酸混合物连接到基因序列上，使得一套可能是蛋白质的简并序列可作为单个的多肽表达。有很多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列来生产可能是本发明多肽变异体的文库。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域中是已知的(见例如，Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura etal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura et al.(1984)Science 1981056；lke et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，本发明的多肽编码序列的片段的文库也可用于制造多肽的杂色群(variegated population)，以在随后对变异体的选择中进行筛选。例如，编码序列片段的文库可以通过如下方法来生成在其中对每个分子而言，切口(nick)仅出现大约一次的处理条件下，用核酸酶处理人们感兴趣的编码序列的双链PCR片段；对所述双链DNA进行变性；对所述DNA进行复性，以形成双链DNA，所述双链DNA可能包括来自不同切口产物的同义/反义对；通过S1核酸酶处理，从重新形成的双链体中除去单链的部分；将得到的片段文库与表达载体连接起来。通过此种方法，可以得到一种表达文库，所述文库编码人们感兴趣的蛋白质的多种不同大小的N-末端片段及内部片段。
本领域中已知的若干技术都可用于筛选组合文库的基因产物及筛选cDNA文库，以得到具有选定属性的基因产物，所述组合文库是通过截短点突变来制造的。典型地，使用最广泛的用于筛选大基因文库并适用于高通量分析的技术包括将所述基因文库克隆到可复制表达载体中；用得到的载体文库去转化合适的细胞；在一定条件下表达所述的组合基因，在所述表达条件下，对人们想要的活性进行的检测，有助于分离出编码其产物被检测到的基因的载体。递归总体诱变(recursive ensemble mutagenesis，REM)技术能增强功能突变体在文库中出现的频率，所述技术可与筛选试验一起使用，以鉴定出本发明蛋白质的变异体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave et al.(1993)ProteinEngineering 6(3)327-331)。
除SEQ ID NO1-11中分别示出的AMID01-11基因序列之外，在给定的群中，可能存在DNA序列多态性，其可能导致AMID01-11蛋白质氨基酸序列的改变，这点对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类遗传多态性可能由于天然的等位基因变异而存在于来自不同群的细胞中，或者存在于一个群中。等位基因变异体还可以包括功能等同物。
根据本发明的多核苷酸的片段还可以包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可以用作探针或用作PCR反应的引物。
对根据本发明的核酸而言，不管其编码功能多肽或非功能多肽，都可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。不编码具有AMID01-11活性的多肽的本发明的核酸分子的用途包括(1)从cDNA文库中分离编码AMID01-11蛋白质的基因，或其等位基因变异体，例如，来自其它生物而不是A.niger的cDNA文库；(2)如Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述，对中期染色体扩展(spreads)进行的原位杂交(例如FISH)，以提供对AMID01-11基因的精确染色体定位；(3)Northern 印迹分析，用于检测AMID01-11的mRNA在特定组织和/或细胞中的表达；以及(4)可作为诊断工具使用的引物和探针，以分析能在给定的生物(例如组织)样品中与AMID01-11探针杂交的核酸是否存在等。
本发明中还包括一种方法，所述方法用于获得AMID01-11基因或cDNA的功能等同物。该方法需要获得经过标记的探针，所述探针包括经过分离的核酸，所述核酸编码选自SEQ ID NO23-33构成的组的序列或其变异体的全部或一部分；用所述经过标记的探针对核酸片段文库进行筛选，其中，筛选是在允许探针与文库中核酸片段杂交的条件下进行的，从而形成核酸双链体，并且由任何经过标记的双链体中的核酸片段制备出全长基因序列，以获得与AMID01-11基因相关的基因。
在一种实施方式中，本发明的AMID01-11的核酸与选自SEQ IDNO1-11构成的组或选自SEQ ID NO12-22构成的组的核酸序列或它们中任何序列的互补序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在另一种优选的实施方式中，本发明的AMID01-11的多肽与选自SEQ ID NO23-33构成的组的肽序列所示的氨基酸序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
宿主细胞在另一种实施方式中，本发明描述了含有本发明中包括的核酸的细胞，例如经过转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经过转化的细胞”或“重组细胞”是通过重组DNA技术，向其中(或其祖代中)引入了根据本发明的核酸的细胞。原核细胞和真核细胞都被包括在内，例如，细菌、真菌、酵母等，特别优选的是来自丝状真菌的细胞，特别是Aspergillusniger。
可以对宿主细胞加以选择，选出能调节插入序列表达的宿主细胞或能以特异性的、令人期待的方式对基因产物进行修饰或加工的宿主细胞。此类对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以促进蛋白质的机能最优化。
多种宿主细胞都具有特征性的及特异性的用于对蛋白质及基因产物的翻译后加工和修饰的机制。可以选出分子生物学和/或微生物学领域的技术人员熟悉的合适的细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的修饰和加工是令人期望的及正确的。为达成此目标，可以使用具有胞内加工机制(machinery)的真核宿主细胞，所述加工机制用于对初级转录物的正确加工、对基因产物的糖基化和磷酰化。此类宿主细胞是本领域中公知的。
宿主细胞还包括但不限于哺乳动物细胞系，例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。
如果需要的话，可通过稳定转染的细胞系来生产根据本发明的多肽。大量适于对哺乳动物细胞进行稳定转染的载体都是公众可获得的，构建此类细胞系的方法也为公众所已知，例如在(前述的)Ausubel et al.中。
在另一个方面，本发明提供了可通过前文所述的本发明的方法或者可通过使用前文所述的用于制造食物制品的新颖的天冬酰胺酶所获得的食物制品。通过将上述食物制品与下述生产方法获得的食物制品进行比较，上述食物制品的特征在于显著降低的丙烯酰胺水平，所述生产方法中不包括以能有效降低所述加热步骤期间涉及丙烯酰胺形成的氨基酸的水平的量添加一种或多种酶。根据本发明的方法可用于使生产出的食物制品中丙烯酰胺的含量较之用传统方法获得的食物制品降低优选超过50％，更优选为超过70％，进一步优选为80％，最优选为超过90％。
实施例1克隆酰胺酶使用两种类型的构建体。第一种类型含有“标准”amdS选择标记，其允许在选择性底物以酰胺上对经转化的菌株进行直接选择。这相当适合用于分泌的酰胺酶，但对细胞内的酶来说，其具有下述缺点将存在标记乙酰胺酶的背景活性。因此，对于被预测为细胞内的大量酰胺酶来说，使用第二种类型的构建体，其使用标记较少的构建体，通过与携带腐草霉素抗性标记的第二种载体共转化来引入。
基因分离1.空的表达盒，作为背景/阴性对照2.A.niger amdS乙酰胺酶(SEQ ID NO11)3.E.nidulans amdS乙酰胺酶4.新的酰胺酶见表1表1.根据本发明的来自Aspergillus niger的新颖的酰胺酶
这些基因的预测的氨基酸序列在本文末尾的序列表中给出，其按照上文所述的编号。
寡核苷酸引物被设计为能从A.niger CBS513.88的基因组扩增出编码感兴趣的基因的基因。如前文所述，适合用于捡选出根据本发明的基因的引物可按照本领域技术人员已知的方法来制造。表2展示了用于扩增根据本发明的某些酰胺酶基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
表2引物序列
对于被扩增的所有基因来说，这些寡核苷酸引物的结构是相似的。
在上游引物的5’末端，定位有PacI限制性位点，用于协助克隆程序。在中间，加上与起始密码子的连接子。上游引物的3’末端与感兴趣基因的5’末端(包括ATG起始密码子)互补。所有上游序列的结构是5’-CCCTTAATTAACTCATAGGCATCATG-基因特异性序列-3’，其中，ATG起始密码子以下划线表示。
在下游引物的5’末端，定位有AscI限制性位点，用于协助克隆程序。上游引物的3’末端与感兴趣的基因的3’末端，终止密码子的大约100个碱基对下游反过来互补。所有下游引物的结构是5’-TTAGGCGCGCC基因特异性序列-3’。
引物中基因特异性序列的长度为20-25个核苷酸，这取决于引物互补部分的GC含量。
按照标准方案，从A.niger CBS 513.88分离出基因组DNA，将其用于PCR反应，该反应中，使用用于扩增编码感兴趣酰胺酶的基因的上游和下游引物。本领域技术人员将知道如何针对每种基因和引物组合来优化PCR条件。
将PCR片断克隆进pCR2.1(Invitrogen)载体，在E.coli中扩增。用PacI和AscI对质粒进行消化之后，将酰胺酶基因亚克隆进Aspergillus表达载体。
对基因ZDK和ZDN来说，方案是不同的。从按照″Molecular CloningA Laboratoy Manual，Sambrook et al.，New YorkCold Spring Harbour Press，1989″所述的方法构建的Aspergillus niger cDNA文库分离出这些基因。对20000个克隆进行高通量测序之后，我们鉴定出了作为酰胺酶同源体的这些基因，再通过亚克隆进下述表达载体之一，针对在A.niger中的表达对它们加以选择。
在使用amdS选择标记的情况下，表达载体是pGBFIN5(WO9932617)。还用PacI和AscI对表达载体进行消化。通过用合适的限制性酶进行消化以及对插入基因的测序分析来检查得到的质粒中插入的正确定向。该克隆方案将酰胺酶基因定位于Aspergillus niger glaA启动子的下游以及glaA终止子的上游。此外，Aspergillus nidulans amdS基因存在于该质粒上，用于在A.niger中进行方便的选择(WO 9846772)。这些表达质粒的结构示于

图1中。
在使用腐草霉素选择标记的情况下，表达载体是pGBFINGFP-2(图2)。还用PacI和AscI对表达载体进行消化。通过用合适的限制性酶进行消化以及对插入基因的测序分析来检查得到的质粒中插入的正确定向。该克隆方案用感兴趣的基因代替了pGBFINGFP-2中的GFP基因，将酰胺酶基因定位于Aspergillus niger glaA启动子的下游以及glaA终止子的上游，得到pGBFINAAA-1(图3)。此外，腐草霉素抗性基因存在于该质粒上，用于在A.niger中进行方便的选择。
在Aspergillus niger中的过量表达A.niger CBS 513.88已被用作为宿主，用于过量表达天冬氨酸蛋白酶基因。因此，将表达载体转化至该真菌。转化方案如WO 9846772中所详细描述的。其还描述了如何选择转化子以及被定位的多拷贝整合子(integrant)。优选地，针对样品材料的生产，对含有多拷贝表达盒的A.niger转化子加以选择。
含有多拷贝表达盒的A.niger菌株被用于生产样品材料，这是通过将菌株培养于摇瓶培养物中来实现的。用于培养A.niger菌株和从培养液中分离菌丝体的有用方法见WO 9846772所述。随后将培养液用于纯化酰胺酶和对酰胺酶活性进行测量。
实施例2 Aspergillus niger的发酵和对培养物提取物的制备通过按照下述方法培养经转化的A.niger菌株来获得酰胺酶。
在20ml CSL-培养基(100ml烧瓶，挡板)中培养A.niger菌株的新鲜孢子(106-107)，在34℃和170rpm下培养20-24小时。将5-10mlCSL预培养物接种到100ml下述培养基(500ml摇瓶，挡板)中之后，在30℃和250rpm下对菌株进行5天的发酵，所述培养基为150g/l麦芽糖、60g/l大豆胨、1g/l Na2HPO4、15g/l(NH4)2SO4、1g/l MgSO4·4H2O、0.08g/l Tween 80、0.02g Basildon、20g码啉乙磺酸(MES)、1g L-精氨酸。
通过用50ml Greiner管进行离心(30分钟，5000rpm，4℃)，收集生物物质。所有后续步骤都在冰上进行。为分离和测定细胞内的酶，通过在液氮中将沉淀部分中的生物物质磨碎成粉来制备不含细胞的提取物。为分离和测定分泌的酶，不含细胞的上清液通过下述方法获得在GF/AWhatman Glass微纤维过滤器(150mm)上进行第一次过滤，以去除大颗粒，接着用4N KOH将pH调至5(如果必要的话)，在带有泵吸的0.2μm(带盖)过滤器上进行过滤灭菌，去除真菌物质。上清液被贮藏于4℃(或-20℃)。
实施例3 通过NMR检测酰胺酶活性将细胞提取物粉末(按照前文所述制备的)冻干，以50mg/ml的浓度重新溶解于用磷酸盐缓冲的D2O(pD＝7.0)中。离心之后，将上清液与酰胺底物(D2O中，10mg/ml)混合为1∶1(v/v)，在37℃温育。足够的温育时间后(见进一步的实施例)，对温育混合物加以离心(终浓度5mg/ml的底物和25mg/ml的提取物)。按照厂商说明书，通过核磁共振来测量乙酰胺酶活性。在Bruker DRX-600(运行于600MHz的质子频率以及300K的探针温度下)上记录1H NMR谱。使用5mm三共振探针和自保护(self-shielded)梯度。获得所有对照化合物的1H NMR谱，以表明，涉及的所有的化合物都具有独特的NMR信号，基于此它们能被鉴定和定量(未示出)。为对每种相关化合物都产生完美的对照谱，在D2O中制备每种化合物的贮液(Cambridge Isotope Laboratories)。通过称量底物或对照化合物，以及加入D2O，制备出浓度为10mg/ml的贮液。从这些贮液中取500μl，与500μl 0.5M的磷酸盐缓冲液(pH 6.96)(KH2PO4/K2HPO4)混合。随后在27℃，D2O中，于600MHz收集每种化合物(即，丙烯酰胺、丙烯酸、乙酰胺、乙酸、丙酰胺和丙酸)的1HNMR谱(D2O中，终浓度5mg/ml的底物或对照化合物)。针对每种化合物，鉴定出不与其它化合物导致的信号重叠的独特的化学位移。此外，检测每种对照的纯度，验证可能污染物的不存在。
化合物具有下述特征信号丙烯酰胺(目录号8.00830，lot 4202056，Merck NJ USA)5.82(dd，Hb，J＝10.3Hz，1.2Hz)，6.22(dd，Hc，J＝17.2Hz，1.2Hz)，6.28(d，Ha，J＝10.3Hz)，6.31(d，Ha，J＝10.3Hz)ppm。
丙烯酸(目录号14，723-0，lot S17163-034，Aldrich，W1 USA)5.65(dd，Hb，J＝10.4Hz，1.6Hz)，6.01(dd，Hc，J＝17.4Hz，1.6Hz)，6.11(d，CH2＝CH，3J＝10.3Hz)，6.14(d，CH2＝CH，3J＝10.3Hz)。
乙酰胺(目录号12，263-7，lot16813BA-453，Aldrich，W1 USA)1.99(s，CH3)ppm。
乙酸(目录号1.00063，lot K31668363，Merck NJ USA)1.90(s，CH3)ppm。
丙酰胺(目录号14，393-6，lot 25009JB-413，Aldrich，W1 USA)1.10(t，CH3)，2.27(q，CH2)ppm。
丙酸(目录号P-1386，lot 083 K3404，Sigma，St Louis，Mo USA)1.09(t，CH3)，2.37(q，CH2)ppm。
实施例4 通过比色测定来检测酰胺酶活性活性测定基本按照Skouloubris et al.[Mol.Microbiol.40596-609，2001]所述来进行。反应在含有100mM磷酸盐(pH＝7.4)和10mM EDTA的缓冲溶液(PEB)中进行。在PEB中制备酰胺底物的100mM溶液。将200ml该底物溶液与50ml细胞提取物混合，在30-37℃温育混合物30分钟。通过测定已被释放出的氨的量来对酶活性定量。为达到此目的，加入400ml苯酚-硝普盐和400ml碱性次氯酸盐，将混合物在50-55℃温育6至10分钟。在625nm测量吸光度，从校正曲线(使用0-25ml 5mM(NH4)2SO4，用PEB调节至50ml)来计算形成的氨的量。一个单位的酰胺酶被定义为水解1μmol酰胺/分钟/mg总蛋白所需要的酶的量。
我们发现，用于温育中的细胞提取物的量会影响比色试验。如果将加入的A.niger细胞提取物的量增加至校正曲线的最高浓度(25ml 5mM(NH4)2SO4)，吸光度从0.44一直降到0(图4)因此，必须在存在适当的量的细胞提取物的情况下来制作校正曲线。此外，我们发现，细胞提取物的性质也有影响。如果用20ml A.niger提取物或20ml K.lactis提取物来制作校正曲线，第一条线将有明显更低的斜率(图5)。
实施例5 Sigma酰胺酶从Sigma(St.Louis，MO，USA，E.coli中生产的酶，目录号A6691)购买来自Pseudomonas aeruginosa的酰胺酶。为测定酶对多种高浓度形式的酰胺底物的活性，将10μl酶溶液(含有0.47mg蛋白质)与500μl D2O中的磷酸盐缓冲液混合(0.5M，pD＝6.96)，随后加入500μl酰胺底物溶液(10mg/ml，D2O中)。酰胺底物的最终浓度为5mg/ml，这对应于70mM丙烯酰胺，85mM乙酰胺以及68mM丙酰胺。用酶的100倍和1000倍稀释液来进行额外的温育。
在t＝0时取样之后，在室温下将反应混合物与经浓缩的酶一起温育，以及在37℃与经稀释的酶一起温育。表3显示了在指定时间点酰胺底物的百分比转化率。
结果显示，P.aeruginosa的酶能水解全部三种底物，但是对丙烯酰胺的活性大大低于其它两种底物。针对丙烯酰胺的结果表明，最初转化率相当高，但是在一段时间后转化就停止了。
表3.用P.aeruginosa的酰胺酶温育之后的百分比转化率
实施例6 对Aspergillus niger中细胞外酰胺酶的检测和部分纯化通过一系列色谱步骤，从按照前文所述制备的培养物上清液中对细胞外酰胺酶ZDK和ZDO进行部分纯化。首先使用Biomax-10膜，通过超滤将上清液浓缩5至7倍，并将pH调节至第一个色谱步骤缓冲液的值。每个色谱步骤后，通过SDS-PAGE针对目标蛋白质的存在对收集的部分(包括未结合的流通(flow-through)部分)加以分析，含有目标蛋白的部分被合并，再次通过超滤浓缩，将它们的pH调节至随后的色谱步骤的pH。
首先用5倍柱体积的特定缓冲液来平衡柱。然后将样品上样到柱上，用另外的3倍体积的平衡缓冲液来洗柱子。然后用20倍体积的NaCl梯度从柱子上洗脱样品，所述梯度从平衡缓冲液到向其中加入1M NaCl的同样的缓冲体系。
表4.对色谱步骤的概括
表5.对色谱条件的概括
对ZDL纯化来说，省略了步骤3。
根据SDS-PAGe分析，最终制备物中的ZDK大约90％纯，而酰胺酶ZDO的类似制备物显示了一些额外的蛋白质条带(图6)。两份样品中的总蛋白质浓度为大约0.5mg/ml。
实施例7 测量不含细胞的提取物中的Aspergillus niger细胞内酰胺酶按照前文所述来制备不含细胞的提取物。这些提取物被用于通过实施例3的NMR方法测定在A.niger中表达的细胞内酰胺酶的活性。首先，使用来自E.nidulans的已知amdS酰胺酶及其来自A.niger的同源体(SEQID NO11)来检测试验条件。
表6.4天温育之后酰胺底物的转化百分比
明显地，空宿主菌株对于所有底物都显示了非常低的背景活性。还明显地，对这些酶而言，丙烯酰胺较之其它两种酰胺来说是差得多的底物，并且，表达A.niger amdS的转化子较之表达E.nidulans酶的转化子具有低得多的活性。
表7.4天温育之后酰胺底物的转化百分比
明显地，这些转化子的绝对活性比表6所示的那些低得多。但是，这可能是由于用于生产实验用酶的未经优化遗传构建体所导致的。但是还明显地，这些酶针对丙烯酰胺较之乙酰胺和丙酰胺的相对活性比已知的amdS酶要高得多。
实施例8 对培养物上清液中Aspergillus niger的分泌的酰胺酶的测量用比色方法来测定分泌的酰胺酶的制备物的活性，所述酰胺酶还被用于实施例6的SDS-PAGE。
表8.pH 7.5时通过分泌的酰胺酶从酰胺底物释放的NH3
可以看出，酰胺酶ZDO具有对丙酰胺作为底物的偏好。其对丙烯酰胺的相对活性与amdS酰胺酶的相当。
ZDK酶活性的明显不存在使得我们用丙酰胺作为底物检查了对于这些酶的最优pH，其中使用下述缓冲液系统(100mM强度)柠檬酸钠，用于pH 3.0-5.5；磷酸钠用于pH 6.0-7.0；TRIS-HCl，用于pH 7.5-8.8。结果示于图N和N中。
明显地，在pH＝7.5时探测ZDK活性的失败是由于该酶在酸性区域锐利的pH最优值导致的。相反，ZDO显示出宽广的、两极的pH最优值。这可与ZDO制备物中存在有两种不同的蛋白质关联起来。
在最优pH值(用丙酰胺作为底物测定的)重新检测了酶对多种底物的活性。结果示于表9中。
表9.在最优pH时进行的NH3分析中的光学密度值
在被检验的底物中，两种酶都对丙酰胺具有偏好性。但是，在ZDO的情况下，必须考虑到，这种偏好性是仅在两个pH最优值的其中之一的情况下测定的。如果由于两种不同酶的存在或者同一种酶的两种不同形式的存在导致出现两极pH活性关系，那么在另一个最优值处的底物偏好性就可能有所不同。
使用NH3校正曲线，可以从OD值推断出比活性以及估计得蛋白含量。ZDK和ZDO的比活性分别计算为0.7和0.2mmol·min-1·mg-1。
实施例9 Aspergillus niger和其它微生物中的酰胺酶这些新的酰胺酶的已知序列被用作为探针，以在其它微生物的基因组中发现另外的酰胺酶。在真菌和细菌中鉴定出了大量其它的同源酶。
实施例10 在食物样品中测量丙烯酰胺样品预处理使用5ml milliQ水对600mg经干燥均质样品进行提取。将溶液(CIL)中的1μg内标物13C3丙烯酰胺加入到提取物中。10分钟离心(6000rpm)之后，将3ml上层转到Extreluut-3BT柱(Merck)上。使用15ml乙酸乙酯，从柱上洗脱丙烯酰胺。在温和氮气流下蒸发乙酸乙酯，使得体积降至大约0.5ml。
色谱条件用气相色谱来分析该乙酸乙酯溶液。用5.4ml/分钟的持续氦气流作为载气，用CP-Wax 57(Varian)柱(长度为25m，内径0.32mm，薄膜1.2μm)来实现分离。不分流(split-less)注射3μl。烘箱温度在50℃保持1分钟，之后其按照30℃/分钟上升至220℃。220℃的温度持续12分钟之后，在下一次注射之前对烘箱进行冷却和稳定。
用甲烷作为电离气体，使用在线化学电离质谱仪，阳离子模式来进行检测。监测特征离子m/z 72(丙烯酰胺)和m/z 75(13C3丙烯酰胺)，以进行定量。
使用的设备GC HP6890(Hewlet Packard)
MSD(物质选择检测仪，mass selective detector) HP5973(Hewlet Packard)咖啡制备通过超滤制备ZDK和ZDO的经浓缩酶溶液，随后通过加入50％w/v(终体积)甘油、0.02％(w/v)CaCl2、0.1％(w/v)甲硫氨酸和0.1％(w/v)苯甲酸钠来进行稳定。这些经浓缩稳定的溶液显示出具有对ZDK而言，0.887U/mol的酰胺酶活性，以及对ZDO而言，18.5U/mol的酰胺酶活性，这作为从100mM丙酰胺每分钟释放的氨的μmol来测量。
将新鲜煮好的咖啡分为6ml的份，在30℃温育。随后，加入0.3ml酰胺酶溶液，在30℃继续温育。其中加入0.3ml水代替酶溶液的温育被用作为对照。
冻干样品，按照前文所述的方法对丙烯酰胺进行分析。
权利要求
1.一种食物生产方法，所述方法包括下述步骤-将食物制品加热至形成丙烯酰胺的温度，-接着加入能修饰丙烯酰胺的酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酶以足以将丙烯酰胺的量相对其中没有加入此类酶的食物而言降低50％，优选70％，更优选80％，最优选90％的量加入。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述食物包含经烘烤食物制品，优选地，经烘烤咖啡豆或经烘烤咖啡豆的部分或提取物。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述食物是咖啡制品，优选地，咖啡豆、经碾磨咖啡、速溶咖啡、液体咖啡饮品、咖啡提取物以及咖啡制品的无咖啡因形式。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的酶是酰胺酶。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述的酶能水解短链非环状酰胺。
7.一种经过分离的多核苷酸，其能与选自SEQ ID NO1至11构成的组或选自SEQ ID NO12至22构成的组的多核苷酸杂交。
8.如权利要求7所述的经过分离的多核苷酸，可从丝状真菌中获得。
9.一种编码酰胺酶的经过分离的多核苷酸，所述酰胺酶包含选自SEQID NO23-33构成的组的氨基酸序列或其中任何序列的功能等同物。
10.一种经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码下述酰胺酶的至少一个功能结构域，所述酰胺酶包含选自SEQ ID NO23至33构成的组的氨基酸序列或其中任何序列的功能等同物。
11.一种经过分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO1至11构成的组或选自SEQ ID NO12至22构成的组的核苷酸序列或其中任何序列的功能等同物。
12.一种载体，包含如权利要求7至11所述的多核苷酸序列。
13.一种方法，用于制造如权利要求7-11中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求12所述的载体的方法，所述方法包括以下步骤培养经过所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，从所述宿主细胞中分离出所述多核苷酸或所述载体。
14.一种经过分离的酰胺酶，其具有选自SEQ ID NO23-33构成的组的氨基酸序列或其中任何序列的功能等同物。
15.如权利要求14所述的经过分离的酰胺酶，可从Aspergillus niger获得。
16.一种经过分离的酰胺酶，可通过在适当的宿主细胞中，例如在Aspergillus niger中，表达如权利要求7-11中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求12所述的载体来获得。
17.重组的酰胺酶，其中包含如权利要求14-16中任意一项所述的任何酰胺酶的功能结构域。
18.一种用于制造如权利要求14-17中任意一项所述的酰胺酶的方法，所述方法包括以下步骤用如权利要求7-11中任意一项所述的经过分离的多核苷酸或如权利要求12所述的载体来转化合适的宿主细胞，在允许所述多核苷酸表达的条件下培养所述的宿主细胞，以及，可选地，从所述细胞或培养基中纯化出被编码的多肽。
19.一种重组宿主细胞，其包括如权利要求7-11中任意一项所述的多核苷酸或如权利要求12所述的载体。
20.一种重组宿主细胞，其表达如权利要求14-17中任意一项所述的多肽。
21.如权利要求14-17中任意一项所述的酰胺酶在用于如权利要求1-6中任意一项所述的食物制品生产方法中的用途。
22.一种食物制品，所述食物制品可通过权利要求1-6中任意一项方法或权利要求21所述的方法来获得。
全文摘要
本发明公开了一种食物或饲料制品制造方法，其中包括在将下述酶加入到所述食物或饲料制品的中间产物形式中之前的加热步骤，其中，所述酶能降低所述食物或饲料制品的丙烯酰胺水平。本发明还涉及从本发明的方法获得的食物或饲料制品。
文档编号A23L1/015GK101040046SQ200580034983
公开日2007年9月19日 申请日期2005年10月13日 优先权日2004年10月15日
发明者胡戈·斯特里科斯特罗 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司