专利名称：用于质粒dna发酵的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及共价闭合环状(ccc)重组DNA分子如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂交体的生产，特别是一种在发酵培养中高水平地生产所述DNA分子的方法。
背景技术：
本发明涉及共价闭合环状(ccc)组合DNA分子的生产。这种分子在生物技术、转基因生物体、基因治疗、治疗性接种、农业和DNA疫苗中是有用的。
考虑到本发明，对现有技术进行了检索。大肠杆菌质粒早已经成为研究人员和业界使用的、唯一最重要的重组DNA分子来源。如今，随着下一代生物技术产品(基因药物和DNA疫苗)进入临床试验并最终进入医药市场，质粒DNA正变得愈发重要。质粒DNA疫苗可能寻求应用为用于病毒性、细菌性或寄生虫性疾病的预防疫苗；用于制备高免疫球蛋白产品的免疫剂；用于感染性疾病的治疗疫苗；或者作为癌症疫苗。质粒也可用于基因治疗或基因替换应用，其中，在对患者给药后从该质粒表达想要的基因产品。
现今，除了基本形式之外尚未规定FDA标准(参见FDA关于用于预防感染性疾病适应症的质粒DNA疫苗的意见，1996)。但是，在某一天，质粒DNA纯度的国际标准可能相同于或非常相似于用于类似从大肠杆菌发酵生产的重组蛋白产品的那些，而且这样的标准超出了从已建立方法可获得的当前纯度。更引人注目地，可接受的标准——每剂量＜100pg宿主基因组的DNA(参见FDA关于用于生产生物的细胞系表征的意见，1993)低于当前可得到的纯化质粒制品的水平(每1mg剂量100pg相当于每一千万分之一)。
用于获得质粒(通过细菌发酵)及其纯化(例如，通过碱裂解法(Birnboim，HC，Doly J.1979，Nucleic Acids Res.71513-1523))的基本方法是众所周知的。初始地，将已发酵的细菌细胞膏再悬浮和裂解(应用氢氧化钠和十二烷基硫酸钠的组合)，然后通过加入酸的盐(例如，醋酸钾)来中和该溶液，使细菌DNA和多数细胞碎片沉淀。大量的超螺旋质粒DNA保留在溶液中，并带有污染的细菌RNA、DNA和蛋白质，以及大肠杆菌内毒素(脂多糖，或LPS)。然后通过过滤分离到可溶的部份并进行各种纯化步骤，其可包括核糖核酸酶消化；色谱法(离子交换凝胶过滤，羟基磷灰石，凝胶过滤，疏水作用，反相，HPLC，等)；渗滤；有机提取，选择性沉淀，等等。
明显地，提高原料的纯度和获得较好下游纯化是产业规模化制造临床级别DNA的基本目标。
发酵培养基的考虑平衡培养基的设计是基于细胞能量要求和元素组成。一般地，以基本培养基或半合成培养基来满足营养的要求。
半合成培养基含有复合成分如酵母提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨。复合成份的添加供给了生长因子、氨基酸、嘌呤和嘧啶且经常支持更高的细胞密度。
碳占一半的细胞组成。因此，碳属于最高的数量。碳源提供能量和生物量，而且常常被用作限制性营养物。葡萄糖是常规的碳源。它被非常有效地代谢，并因此给予更高的细胞产率。但是，由于代谢溢流(称为克雷布特里效应)，高浓度的葡萄糖导致不想要的醋酸盐产物。也可使用甘油，而且在分批培养基中它经常是优选的碳源。尽管从甘油获得的细胞产量略为少于从葡萄糖获得的，但是甘油不会引起那么高水平的醋酸盐产物，而且可以较高浓度使用而无抑制性。甘油还支持降低最大特异性生长速率。
用无机或有机氮源可以满足氮的要求。氨水和铵盐(例如，NH4Cl，(NH4)2SO4)可用于基本培养基。半合成培养基从复合成份，包括酵母提取物、酪蛋白氨基酸和蛋白胨，部分或者全部地提供氮。
矿物质是生长、代谢和酶反应所必需的。一般镁、磷、钾和硫作为独特的培养基成份而被添加。磷酸二钾和单钾盐提供了钾和磷，而且还具有一定比例的缓冲剂功能。硫酸镁七水合物常被用作镁和硫的来源。其它基本矿物质包括钙、铜、钴、铁、锰、钼和锌。这些都需要较小的数量，而且常通过添加痕量矿物质溶液来提供，尽管它们通常作为主成分中杂质而存在。用氯化钠调节摩尔渗透压(osmolarity)。
由于朊病毒(prion)或病毒污染的风险，在质粒生产中使用动物源产品尤其是牛源产品是不可接受的。所有的培养基成份必须是证明无动物产品的。许多有动物起源的成份已经有蔬菜源替代品(例如，蔬菜甘油，大豆蛋白胨)。
质粒发酵工艺生长速度应用降低生长速度是高质量、高产量质粒发酵中统一的原则。高生长速度是与醋酸盐产物、质粒不稳定性和较低百分比超螺旋质粒相关的。通过提供用于质粒复制以同步细胞分裂的时间，降低生长速度减轻了生长速度依赖性的质粒不稳定性。
生长条件发酵使我们有能力控制和监视许多影响质粒质量和产量的参数。已知超螺旋受氧气和温度的影响(Dorman CJ等1988 J.Bacteriol 1792816-2826)，(Goldstein E，Drlica K.1984 Proc Natl Acad Sci USA.814046-4050)。氧气已表现出在质粒稳定性方面发挥作用。一项研究(HopkinsDJ，Betenbaugh MJ，Dhurjati P.1987 Biotechnol Bioeng.2985-91)发现，一滴溶解氧气浓度达到5％空气饱和度导致质粒稳定性的快速丧失。另一项研究(Namdev PK，Irwin N，Thompson BG，Gray MR.1993 Biotechnol Bioeng.41666-670)表明，在氧气输入方面的波动导致质粒的不稳定性。而且，缺口质粒和多聚体的形成可由许多参数影响，包括温度、pH、溶解氧、营养物浓度和生长速度(Durland RH，Eastman EM.1998 Adv Drug Deliver Rev.3033-48)。大肠杆菌生长的最佳温度为37℃。但是，在分批发酵中可应用较低的温度(30-37℃)以产生降低最大特异性生长速度。还可应用较高温度(36-45℃)以诱导带有一些复制源起点如pUC和pMM1的选择性质粒扩增(Wong EM，Muesing MA，Polisky，B.1982 Proc Natl Acad Sci USA.793570-3574)，(Lin-Chao S，Chen WT，Wong TT.1992 Mol Microbio.63385-3393)以及失控复制子R质粒。Hamann等2000年(Hamann CW，Nielsen J，Ingerslev E.2000世界专利申请WO0028048)报道了一种R质粒的生产工艺，其中将质粒生产维持于低水平(借助应用低温)以避免因质粒DNA合成的生长迟滞；一旦宿主细胞种群较高，质粒生产由移位的温度诱导。
分批发酵分批发酵具有简易性的重要优点。在整个培养周期中用于细胞生长和质粒生产的所有营养物存在于接种期。分批发酵包括迟缓期、指数生长期和静止期。应用合适的接种物(1-5％的培养基容量)将减少迟缓期的长度。在指数期，所用的营养成分都是过量的；因此特异性生长速率基本上是最大的特异性生长速率，μmax，如用Monod动力学所测算的。如上所述，降低生长速率是质粒生产所希望的。在分批发酵中，生长速率可以仅通过减少μmax而降低。这种情况已通过在较低温度生长和通过在代替葡萄糖的甘油上生长而取得。在30℃应用甘油的分批发酵一般导致μmax≤0.3h-1，这足以防止有害的醋酸盐积蓄以及与质粒不稳定性相关的生产速率(Thatcher DR，Hitchcock A，Hanak JAJ，Varley DL.2003美国专利号6503738)。还可以比葡萄糖更高的浓度且没有抑制性地使用甘油，产生更高的生物量产量。通常，用分批发酵可以获得高达60g/L DCW的生物量产量。
补料分批发酵补料分批发酵对质粒生产是非常有用的。控制限制性营养物的添加使得生长速率控制为速率＜μmax。此外，补料分批发酵产生较高的产量。补料分批发酵的关键是以完全消耗掉的速率来供应底物。结果是，残留的底物浓度约为零并且获得底物的最大转化。避免从过量底物产生的代谢溢流，减少抑制性醋酸盐的形成。
补料分批发酵以分批期开始。将细胞接种至初始量的培养基，该培养基含有所有的非限制性营养物以及初始浓度的限制性底物。一旦细胞已消耗了初始量的底物，就开始控制限制性营养物的进料。
一种最简单且最有效的进料策略是指数性进料。这种方法使得培养物以小于μmax的预定速率生长而无需反馈控制。该发酵以含有非抑制性浓度底物的分批方式开始。细胞以μmax生长直至底物被消耗尽，此时开始营养物的进料。
DO-stat和pH-stat方法是非常易于实施的，因为多数标准发酵罐系统包括了溶解氧和pH的监测。溶解氧(DO)和pH的趋势可说明是否有底物可供给细胞。底物的耗尽引起氧气摄取降低和培养基DO浓度升高。由于代谢酸的消耗，pH也升高。当DO或pH升高并高于设定的阈值时，启动进料。通过改变DO或pH的阈值可调节生长的速率。
示例性质粒发酵工艺检查当前的产量揭示出，一般的实验室振荡瓶培养产生从1-5mg的质粒DNA/每L培养物，而计算机控制发酵罐可产生，一般情况下，从10-250mg/L。
Lahijani等(Lahijani R，Hulley G，Soriano G，Horn NA，Marquet M.1996Human Gene Therapy 71971-1980)曾报道，在指数进料以及温度从37℃至42-45℃转换的发酵中，应用带有温度灵敏单点突变(pUC起点)的源自pBR322的质粒。他们在10L发酵罐中取得了220mg/L的质粒产量。在30℃分批发酵(pBR322衍生的起点)中没有突变的相同质粒仅产生了3mg/L质粒。Friehs等(Friehs K，Flaschel E，Schleef M，Schmidt T.2003美国专利号6664078)描述了一种补料分批工艺，应用了具有DO-stat反馈控制进料的甘油酵母提取物培养基。发酵以7.5L的初始批量开始。增加搅拌以保持DO在30％之上。当DO达到阈值设定点的45％时，泵入进料培养基。在41小时后培养物达到静止期，产生60g/LDCW和230mg/L质粒。Chen(Chen，W.1999美国专利号5955323)在半合成培养基中应用了补料分批工艺，并联合了DO-stat和pH-stat反馈控制。DO和pH阈值设定点分别为50％和7.2。由于高代谢活性，当DO下降低于30％时，以早期速度的百分比增加搅拌速度。在一个7L发酵罐中，这种策略导致0.13h-1特异性生长速率和82-98mg/L质粒产量。Durland和Eastman，同上，1998年报道了在专用培养基中37℃的分比发酵。他们的工艺一般产生130mg/L而实际产生250mg/L那么高的产率。
即使考虑了现有技术，仍然存在需要一种用于高纯度质粒DNA生产的经济有效的方法。上述的发酵培养基和工艺结合目前现有技术中已知的已改善质粒生产率，例如较低生长速率和高温诱导的质粒复制数量。这些工艺处于约200-250mg质粒DNA/L。这种的产率对质粒DNA生产工艺的商业化增加了成本和纯度负担。尽管规模化经济未来将显著地降低DNA的成本，但是需要这种问题的更节省方案以实现理想的成本。而且，质粒DNA纯度的国际标准可能相同于或非常相似于用于类似从大肠杆菌发酵生产的重组蛋白产品的那些，而且这样的标准超出了从已建立方法可获得的当前纯度。提高发酵中的产率(mg DNA/g细胞膏)势必降低成本并且提高DNA的纯度(因为它减少了被处理材料的数量)。
发明内容
本发明是一种用于生产DNA复制子的方法，利用了用于质粒生产的改进的分批和补料分批工艺。更具体地说，本发明公开了一种补料分批发酵的方法，其中在补料分批期的期间含质粒的大肠杆菌是在降低温度的条件下生长的，在该期间限制生长速率，然后在升温的条件下温度向上转换并继续生长以积蓄质粒，籍此温度转换和限制生长速率改善质粒的产率和纯度。在优选的实施方案中，测定降低的生长速率以维持质粒的产率低于大约2mg/L/OD。在另一种优选的实施方案中，降低的温度为30℃左右。在另一种优选的实施方式中，温度向上转换是至约36-45℃。在另一种优选的实施方案中，质粒包括Co1E1衍生的复制子起点。在另一种优选的实施方案中，质粒包括含有pUC G至A突变的、pMB1复制起点。在另一个优选的实施方案中，质粒衍生自VR1012骨架。在一种非常优选的实施方案中，发酵培养基基本上是半合成甘油培养基。在最终优选的实施方案中，在补料分批发酵中将源自pBR322的质粒生长于大肠杆菌，其中在分批进料期的时候限制生长速率并且继续生长以积蓄质粒产物。总之，这些工艺的特点是高细胞密度培养策略，结合了新的生长和诱导期温度转换。在含有DNA复制子的源自pBR322起点的生产中，在限制细胞生长速率的条件下进行补料分批发酵。在温度诱导DNA复制子(例如含有pUC或pMM1起点的质粒)的生产中，以限制细胞生长速率以及在生长期的时候降低温度来进行补料分批发酵；然后由温度向上转换来诱导质粒生产。相对于现有技术中描述的工艺，这些工艺大大地改善了质粒DNA发酵产率，同时保持或改善质粒完整性。
发明概述本发明的目的和/或目标是提供用于质粒DNA生产的发酵工艺。本发明的另一个目标和/或目的是改善在发酵培养物中质粒DNA的生产产率。本发明的另一个目标和/或目的更是改善在发酵培养物中质粒DNA的质量。本发明的另一个目标和/或目的更是减少在纯化质粒DNA中的杂质。另一个公开是改进的发酵工艺，与现有技术中确定的工艺相比，其改进为在生物量生产之后通过诱导质粒的水平来提高质粒的产率；在生物量生产过程中通过维持低质粒水平来改善产率和带有有毒或不稳定质粒的完整性；通过减少缺口(开环的)或线性类型质粒的水平来提高质粒的质量；通过增加单体质粒的百分数来提高质粒的质量；应用机器人、自动控制参数和进料来简化生产；由于生产控制而简化了规模放大并且减少了在生长期间需要的氧气补充；由于在进料游中浓缩水平的质粒进入下游处理而降低了质粒纯化后的杂质水平；以及通过消除所有动物源产品的成分而改善法规依从性。
此外，从考虑附图和随后的说明角度而言，本发明的目的和优点就变得显然。
附图的简要描述
图1.表示在大肠杆菌中用NTC3019培养基的源于pBR322质粒的补料分批发酵。
图2.表示在大肠杆菌中用NTC3018培养基的pUC质粒的分批发酵。
图3.表示在大肠杆菌中用NTC3019培养基的gWiz GFP质粒补料分批发酵。
图4.表示在大肠杆菌中用NTC3019培养基的gWiz GFP诱导的补料分批发酵(37℃或42℃诱导)。
图5.说明诱导补料分批发酵工艺。
发明详述现在说明附图，图1表示了在大肠杆菌中用NTC3019培养基的源于pBR322质粒的补料分批发酵，表明(a)在大肠杆菌中用NTC3019培养基的补料分批发酵过程中，源于pBR322质粒的一般生长和生产率的情况；和(b)通过NTC3019培养基的补料分批发酵工艺而生产的质粒DNA是高度超螺旋的，而且没有缺口和开环的异构体。
在图2中，表示的是在大肠杆菌中用NTC3018培养基的pUC质粒(pW2.0)分批发酵的质粒生长和生产率情况。在分批发酵中的pW2.0达到57OD600的细胞密度并且产率为230mg质粒/L。
在图3中，表示的是在大肠杆菌中用NTC3019培养基的gWiz GFP质粒补料分批发酵(a)gWiz GFP补料分批发酵状况的生长和控制参数情况(溶解氧、温度、搅拌)；(b)被SYBR Green I染色的细胞荧光显微镜图显示了在坪阶段(左)的发酵，然而当温度降至33℃(右)时，生长重新开始并且成丝减少。
在图4中，表示的是在大肠杆菌中用NTC3019培养基的gWiz GFP诱导的补料分批发酵(37℃或42℃诱导)a()揭示了在35小时具有30→37℃转换的gWiz-GFP/大肠杆菌DH5α发酵的生长和质粒生产率情况，质粒产率达到670mg/L；和(b)表明了在35小时具有30→42℃转换的gWiz-GFP/大肠杆菌DH5α发酵的生长和质粒生产率情况。质粒产率达到1100mg/L。
在图5中，说明了诱导的补料分批发酵。
定义ccc共价闭合环状源于Co1E1的起点通过缺失(例如，源自pBR322的起源)和/或碱基变化(例如来自pMB1的pUC，来自pMM1、pMM5的Co1E1，等)从Co1E1类型质粒(例如pMB1，Co1E1)衍生的复制起点。
DNA复制子质粒，粘粒，细菌人工染色体(BAC)，噬菌体，病毒载体及其杂种。
NTC3018发酵培养基甘油半合成分批发酵培养基NTC3019发酵培养基甘油半合成补料分批发酵培养基pDNA质粒DNA源自p322起点自pBR322的pMB1起点，其中rop(引物的抑制物)基因已被缺失。
质粒质粒，粘粒，细菌人工染色体(BAC)，噬菌体，病毒载体及其杂种。
pUC起点源自pBR322的起点，在升温时具有增加复制数的G到A转换半合成甘油培养基含有复合氮源(例如酵母提取物，大豆提取物)和甘油碳源的发酵培养基本发明涉及在细菌生产宿主中、应用机械发酵容器生产共价闭合环状(ccc)重组DNA分子如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂种(这里通称为质粒)的方法。
在现有技术中描述的发酵工艺并非最佳的，其具有非最佳的质粒产率、质量(例如，质粒的缺口或线性化)、较差的可规模性(例如，由于过量的氧气补充要求)以及受限的应用(例如，没有能力使用含有不稳定或毒性序列的质粒)。本发明是一种在发酵培养过程中改善质粒DNA产率和纯度的方法。已经开发了一种经济有效的高产率发酵方法，利用了诱导补料分批发酵的工艺来改善质粒产率和纯度。
质粒生产工艺和培养基优选的实施方案在一种用于源于pBR322质粒生产的优选实施方案中，补料分批发酵是以受限细胞生长速率进行的。相对于现有技术中描述的工艺，这种工艺极大地提高了质粒DNA发酵产率，同时维持或改善质粒的完整性。
这种工艺使用了中等的复制质粒(例如，带有缺失ROP基因的pBR322复制起点，这里被称为源于pBR322的质粒)，用自动补料分批发酵工艺、于37℃控制进料以维持特定的生长速率0.12h-1已经实现250-450mg/L的质粒产率和120OD600的细胞密度。这比报道的产率(Lahijani等，同上，1996)提高了100倍。这种全新的巨大改进的分子基础还不清楚。无论何种机理，将本发明应用于其它质粒的生产将增加发酵的生产率，而不丧失质粒的质量。
在一个温度诱导DNA复制子(例如，含有pUC或者pMM1起点的质粒)生产的优选实施方案中，在生长期过程中以受限的细胞生长速率和降低的温度来进行补料分批发酵；然后用温度向上转换来诱导质粒生产。相对于现有技术报道的工艺，本工艺极大地提高了质粒DNA发酵的产率，同时维持或改善质粒的完整性。
这里所公开的这种全新的策略，用于含有高复制起点(例如，pUC起点)的质粒的高产率质粒生产，导致预料不到的高质粒生产率和质粒质量。此外，在补料分批阶段过程中降低了生长速率。该工艺表示在图5中。这种全新的因素组合尚未被应用到源自Co1E1起点质粒的生产，并且当检验时产生了新的且预料不到的改进生产率的结果。因此，我们教导了一种新的用途(改进生产率)，用于降低生产速度与1)生长和生物量生产的降低温度，和2)质粒生产诱导升高温度的组合。
初始降温生产阶段与随后的高温生产阶段的组合导致改善的全部的生长、生物量和质粒产率，该发现是全新的且预料不到的，并且在现有技术中没有教导的。Hamann等，同上，2000年使用了温度诱导发酵以在生长过程中特别地减少与R质粒相关的代谢负荷。该策略被用于R质粒的生产，而没有被教导用于含有Co1E1起点的质粒。Hamann等，同上，2000年也没有涉及用这种策略提高总的生产率。因此，在现有技术中还没有建议这种因素的组合来提高产率。如通过提高生产率所揭示的，在这种组合之中有协同作用，该组合大于各部分之和。该高产率发酵还满足了长期渴望但没有解决的需要，因为在过去十几年中描述的众多早期工艺没有教导高产率发酵。总之，我们教导了一种新的因素组合，用于含有Co1E1起点的质粒的生产，包括与温度诱导相组合的慢生长，这证实了预期不到而且令人惊奇的、改进质粒生产率的新用途。
将诱导补料分批发酵工艺应用于高复制质粒的生产，结果是产率为1100mg/L质粒DNA，以及OD600为100。这是超过现有技术中所述发酵工艺获得产率的五倍提高。从所有这些工艺纯化的DNA是高质量的，基本上是100％超螺旋。我们考虑了这里所述的分批和补料分批发酵工艺的用途以提高质粒的生产率。
这里所述的诱导补料分批工艺在整个工艺的生物量生产阶段中保持了较低的质粒水平(对于源于VR1012的载体，＜2mg/L/OD600)，并且有利于在生物量生产之后预料不到的且前所未有的超高质粒生产(对于源于VR1012的载体，＞6mg/L/OD600)。高的特定产率是非常理想的，因为提高每克细菌的质粒产量直接导致较高的最终产品纯度。我们考虑了利用本发明的温度转换来整个生长中保持质粒水平较低(对于源于VR1012的载体，＜2mg/L/OD600)，促使在生物量生产之后质粒生产至高水平(对于源于VR1012的载体，＞3mg/L/OD600)。这些水平是生产源于VR1012载体的准则。在生产阶段，可允许其它质粒以高于或低于2mg/L/OD600的水平。对于本领域的普通技术人员而言，任一新的质粒在生长阶段最大的质粒水平，即维持可接受的代谢负荷、质粒稳定性以及在温度转换之后提高生产率的水平，可实验上确定。
发酵培养基的可选择实施方式在实施本发明中，可以利用示例性不含动物产品的发酵培养基制剂、NTC3018(分批)、NTC3019(补料分批)。这些培养基优化为半合成生长培养基，含有甘油碳源、酵母提取物氮源、和微量金属、盐以及缓冲剂。可以预见的是，应用这里所述的发酵工艺，现有技术中描述的那些用于这种培养基的替代品为也可产生提高的质粒生产率。
本发明考虑了用于NTC3018和NTC3019培养基中的可选择的非动物源的氮源。作为一种复合培养基成份，酵母提取物提供了氮、氨基酸、维生素和碳。在质粒生产过程中对于细胞代谢非常重要的、复合培养基(例如，酵母或大豆的提取物)的可能成份包括限制的氨基酸、维生素、微量矿物质和可选择的碳源。通过实施例的方式，我们考察了可选择的酵母提取物制品、大豆制品(例如，来自BD Biosciences的精制大豆胨(selectsoytone)或者植物蛋白胨(phytone peptone))或者其它的植物制品(例如，来自Oxoid的豌豆花蛋白胨)在NTC3018和NTC3019培养基中的用途。
本发明也考虑了培养基限定元素中变化。例如，本发明考虑了增加磷酸盐或镁，在分批培养基成分中增加，或者在补料分批发酵中加至进料。发酵领域技术人员根据系统成分的评价可进行所述培养基的进一步优化。
当利用某些营养缺陷细胞系时，本发明考虑了培养基的添加剂。例如，含有proAB缺失的细胞系如Stb12(InVitrogen公司)需要氨基酸补充，或富有脯氨酸的可选择氮源，以取得最大的生长。这种修饰可由发酵领域中普通技术人员来确定。
我们还考虑了这里所述分批和补料分批发酵工艺与现有技术中描述的质粒发酵培养基一起使用。这包括合成培养基诸如Soubrier所公布的(Soubrier F.2004美国专利申请2004/0142452)。与本发明补料分批发酵工艺一起使用的、优选的培养基是甘油培养基制剂，其具有半合成饲料，如NTC3019和在Lahiiani等，同上，1996年，Friehs等，同上，2003年，Chen同上，1999年和Urthaler等(Urthaler J，Roman N，Ascher C，WoehrerH.2005美国专利申请2005/0026177)中所公布的那些。
发酵工艺可选择的实施方式这里公开了用于质粒生产的、改进的补料分批和分批工艺。这些工艺具有指数进料策略的特点，结合了全新的生长和诱导阶段温度转换。
在实施本发明的补料分批工艺中，我们考虑了各种进料策略以降低生长速率，包括反馈、前馈和营养物进料的预定控制。例如，根据碳限制指数进料策略，添加营养物饲料。我们预料了这种进料策略的变化来将生长速率控制在可接受的范围内。优选的生长速率范围为μ＝0.05至0.3hr-1。优选的目标生长速率为μ＝0.12hr-1。可接受的生长速率范围是质粒特异性的，而且可由本领域技术人员实验上确定。
在实施本发明的补料分批工艺中，我们考虑了各种分批策略以减少生产时间。可以调节在分批阶段中包括的半合成营养物，以使分批阶段进行至更高的或生物量的浓度。在更高的生物量浓度的情况下，总发酵时间被减少，因为与补料分批阶段相比，在分批阶段中的生长更快。我们预期了这种分批策略的变化，以控制工艺的补料分批阶段的开始。开始补料分批阶段的优选OD600范围为从1至60。可接受的补料分批开始的OD600范围可以是质粒特异性的，并且可由本领域技术人员实验上确定。
在实施本发明的诱导补料分批和分批工艺中，我们考虑了从生长到诱导阶段的各种温度转换策略。该生长阶段可被完成于从25-37℃，优选地30-37℃的温度。对于高复制质粒，该生长阶段最优选的为30-32℃。该诱导阶段可被完成于从33-45℃，优选地37-42℃的温度。
在实施具有温度转换策略的诱导工艺中，我们考虑了使用营养物浓度、生物量浓度或光密度作为何时从生长阶段转换至诱导阶段的指示物。发酵培养的定期取样可提供材料以获得生物量或光密度测定，并且可在一定的生物量浓度实现温度转换。也可以使用在线传感器以提供生物量浓度的连续检测，而且可将发酵罐设为在特定的生物量浓度自动地实现温度转换。在实施具有温度转换策略的诱导补料分批工艺中，我们还考虑了一旦已加入了某一数量的加料营养物就实现温度转换。
在实施具有温度转换策略的诱导工艺中，我们考虑了在生长阶段应用较高的温度以最小化生产时间。这里所述的诱导补料分批工艺，在该工艺的整个生长阶段，都维持较低的质粒水平(＜2mg/L/OD600)。在生长阶段可应用的最高温度，即维持可接受的代谢负荷、质粒稳定性，以及在温度转换之后提高生产率的温度，是质粒特异性的而且在不同的质粒骨架之间变化。例如，在高于2mg/L/OD600的水平，有些质粒可以是允许的。质粒产率还可以在低温变化，这样，有些质粒可以不作为高水平的质粒而产生。在这些情况下，我们考虑了在生长阶段使用较高的温度。此外，在初始分批阶段，由于非限制生长和相应的较低质粒拷贝数量，所以提高最高温度可以是允许的(图5)。在生长阶段(分批和补料分批成份)可应用的最高温度，即维持可接受的代谢负荷、质粒稳定性，以及在温度转换之后提高生产率的温度，可由本领域的普通技术人员实验上确定。
质粒和宿主菌株我们考虑了本发明在带有各种复制起点的质粒的生产中的用途，该复制是高拷贝、低拷贝和中拷贝，并且是温度诱导的或者不是。在表1中概括了一些优选的复制起点及结合其的质粒。这些起点的修饰在现有技术中是已知的，而且也被考虑使用。
表1复制起点
pVC0396为优化的载体骨架，用于插入真核表达框。
本发明考虑了可选择的宿主菌株。大肠杆菌DH5α菌株已被广泛用作质粒生产的宿主。它的关键品质包括recA突变，其最小化克隆DNA的非特异性重组，和endA1突变消除由核酸内切酶I产生的质粒非特异性消化。除了DH5α，其它的各种菌株也适于质粒生产；表2中表示的是示例性大肠杆菌宿主菌株的非限制性列表。
表2宿主菌株
DH5α、XL1-Blue、DH10B、JM109和前十个已被很好地确立为质粒生产菌株。最近已开发了Mach1和ECOS101，而且它们是理想地质粒生产宿主。Stb12、GT116和Sure细胞已被用于生产含有不稳定DNA的质粒。不稳抖DNA含有如直接的(例如，逆转录病毒的长端重复)或反转重复(例如，shRNA回文对称)、Z DNA等的结构。在GT 116中dcm基因的缺失消除了免疫刺激的dam甲基化。因此，在GT 116中生产减少了质粒DNA的免疫原性。使用表达CpG甲基化酶的菌株观察到类似的减少免疫原性。
不稳定质粒的生产我们也考虑了本发明在含有不稳定序列质粒的生产中的应用。回文序列，直接的或反转的重复，以及形成Z DNA的序列是不稳定的和缺失的或者由大肠杆菌宿主重排。在一些实例中，治疗性用途的质粒必须含有不稳定的序列(病毒载体的反转的或直接的重复，该病毒载体如AAV和HIV、形成Z DNA的某些治疗性基因的片段或三倍重复)。维持含有不稳定序列的质粒的当前策略是使用带有稳定突变的宿主细胞系。几种宿主商业上可以获得，用于增殖这些质粒，例如Sure细胞(Stratagene)、GT115(Invivogen)或Stb12以及Stb14(Invitrogen)。Stb12和Stb14细胞系利用了未公开的突变，该突变增加了含有直接重复的载体如逆转录病毒载体的稳定性；在降低温度时这种作用被增强，大概是因为减少了拷贝数。修复突变的特异性组合可稳定质粒的增殖，特别是较低的温度时。Sure和Sure2细胞系使用了一种这样的组合，其具有UV修复(uvrC)和SOS修复(umuC)缺陷(来稳定LTR)、和SbcC(和recJ)与同源性重组缺陷(recB，recJ)联合以稳定Z DNA。GT 116细胞系使用了SbcC和SbcD来稳定回文序列。这些菌株仅在较低温度(即30℃)发挥稳定质粒的功能，大概是由于减少了质粒拷贝数。这种策略显然增加了生产成本。这里所述的诱导发酵工艺的用途允许在稳定化细胞系中在30℃增殖不稳定质粒，先于仅在收获前的较短持续时间增加拷贝数。这样将使不稳定质粒的产率和稳定性(即质量)最大化。
DNA和质粒的生产在诱导补料分批工艺中显著增加质粒DNA产量(＞6mg/L/OD600)的潜在机制是未知的。可能是由于在较慢生长和降低温度下生物量生产过程中DNA压缩(coompaction)剂(例如，组蛋白样蛋白或其它染色质结合蛋白，如dps基因产品)的诱导。
在诱导阶段，改变DNA缩合可通过提高可允许质粒的水平或拷贝数增加质粒产率。DNA的压缩程度是由两个相反的因素确定的；缩合染色质蛋白和脱缩合转录复合体。质粒压缩可被来自质粒启动子的转录水平影响。较少的转录是与较高的压缩、以及可能更高的携带能力相关的。
在大肠杆菌中，已经鉴别了许多染色质蛋白，它们涉及DNA压缩。这些基因产品结合质粒和基因组DNA。在基因组DNA的情况中，它们将DNA压缩至类核(综述于(Robinow C，Kellenberger E.1994 MicrobiolReview 58211-232))。该类核的主要成份是组蛋白样蛋白HU、IHF和HN-S、StpA(相关于HN-S，以大约1/10水平表达)和Dps，其被均匀地分布于该类核中，而其它的蛋白，如SeqA、CbpA、CbpB、Fis和IciA，数量较少，表现为非均匀的分布于类核中，并且可具有调节功能。一种被分离的R质粒蛋白复合体包括三个主要蛋白，23％HN-S、23％RNA聚合酶和5％HU。这可能改变对生长期的依赖，原因是基因产品相关的染色质在不同培养基、不同细胞密度以及处于生长与静止期被差别地调节。Fis、HU、HF-I通常在对数阶段被更高地表达，而IHP和Dps则在静止期处于较高的水平。Dps在静止期将DNA缩合至脂质生物结晶复合体，以改善应激抗性。HN-S在生长期的过量表达导致DNA缩合以及生命力丧失。当DNA被高度压缩时，细胞可具有更高的质粒容量。在NTC诱导发酵工艺中，生长期细胞比诱导期细胞具有更低的生产质粒DNA的能力。这是由于在存在于诱导期的染色质蛋白组合中的不同，该诱导期比生长期允许更高水平的可容许质粒。在诱导期改变染色质蛋白的比率可增加质粒的压缩性，以及携带能力。
在诱导期改变染色质蛋白的比率还可增加质粒的复制率。例如，来自pl5A起点RNAII启动子的表达，而不是pMB1(pBR322)RNAII启动子的，用IHF表示；在IHF突变体中增加了pl5A RNAII转录。Dps和HU是非特异性DNA结合物，HN-S、CbpA和CbpB结合弯曲DNA。StpA是与HN-S相关的，以更高的亲合力结合DNA，而且还结合弯曲DNA。Fis、IHF、IciA和seqA是序列特异性的。HN-S抑制从含有弯曲DNA的许多启动子转录。pMB1(pUC和pBR322)的RNAII启动子包含聚A和聚B轨迹；这些序列形成弯曲DNA。在静止期抑制转录(例如，HN-S)的弯曲DNA结合染色质蛋白的降低水平是与RNAII至RNAI转录的增加比率相关，而且记录的静止期在质粒拷贝数方面增加。在NTC发酵工艺的生产阶段中存在的染色质蛋白组成变更(例如，在HN-S中进一步减少)可导致质粒拷贝数随着pMB1质粒如pUC而增加。
异源性DNA压缩子，例如杆菌属的酸溶性孢子蛋白，当被表达在大肠杆菌时，也可以是有用的DNA压缩子以提高质粒产率。例如，纤小杆菌(B.subtilis)的小酸溶性蛋白在大肠杆菌中的表达产生DNA(Setlow B，Hand AR，and Setlow P.J Bacteriol.1731642-1653)。
工艺变更还可通过在DNA缩合中的作用提高产率。由镁(Mg++)浓度调节Dps；Dps的存在并不导致DNA缩合；当Mg++浓度降低至阈值之下时紧密压缩的结晶DNA:Dps复合体形成]综述于(Frenkiel-Krispin D，Levin-Zaidman S，Shimoni E，Wolf SG，Wachtel EJ，Arad T，Finkel SE，KolterR，Minsky A.2001 EMBO J.201184-1191)]。形态学上，该复合体类似于在静止期由加入氯霉素诱导的。在不存在Dps的条件下，将0.2mM亚精胺加至在生长的培养物，加速DNA缩合。磷酸盐饥饿具有相同的作用，可能是通过增加从苏氨酸和精氨酸降解至亚精胺(FrenMel-Krispin等，同上，2001)。在诱导期对发酵组成或条件的改变，以改变二价阳离子的水平(例如，Mg++，通过外源性添加或者缺失)，或改变带正电的聚胺水平(例如，亚精胺，通过外源性添加或者控制细菌合成)可提高质粒产率并且可被视为对培养基的变更。
我们考虑了进一步的产率增加可通过质粒DNA的进一步压缩而获得。这可以通过如下方式而取得，在发酵工艺中，将DNA压缩剂加至补料(例如聚乙撑亚胺、亚精胺、精胺)或者提高宿主菌株DNA压缩剂生产如精胺生长或dps蛋白生产的菌株修饰。这种菌株修饰可以是在发酵工艺中使相关基因产品被诱导的变更。
在实施诱导工艺中，我们考虑了使用替换策略以在生长阶段维持质粒拷贝数为较低的水平。例如，除了在较低温度生长之外，可存在能够结合至生长阶段的其它机理以减少拷贝数。例如，发酵期间减少溶氧能减少质粒拷贝数(Carnes AE，2005 BioProcess International 39，在出版中)。
对最终产品纯度的改进我们考虑了从示例性的质粒纯化工艺中的所述发酵培养物利用质粒富积补料流。这种工艺是现有技术中熟知的。高产率发酵和示例性纯化工艺的组合可提供经济有效的方法学以进一步将基因组DNA减少至可接受的水平用于基因治疗和DNA疫苗应用。
实施例在下面的实施例中进一步说明本发明的方法。这些是通过说明的方式来提供的，并非要以任何方式来限制本发明的范围。
实施例1NTC3018和NTC3019发酵培养基确立下列的标准用于评价制造质粒DNA的优化发酵工艺
1)质粒的高特异性产率(mg质粒DNA每g细胞质量)；2)高生物量产率；3)它将保留高程度的超螺旋质粒；4)它在下游处理中引起最小的问题；5)它符合法规的要求；和6)它保留质粒的结构(例如，无缺失或其它重排)。
配制培养物的培养基以支持高特异性质粒产率、高生物量产率以及高质粒质量。设计分批发酵培养基以降低特异性生长速率。降低生长速率的使用是与较高质粒拷贝数以及较好的质粒稳定性相关的。在补料分批发酵过程中，由限制营养物补料控制生长速率在0.12hr-1。宿主菌株，DH5α，具有endA1、recA和relA突变，对于质粒生产都非常重要。此外，用于培养基的所用成份可以很好地表征且证明不含动物产品。
NTC3018(分批)和NTC3019(补料分批)培养基对于分批和补料分批工艺培养基的许多成份都是优化的。例如，甘油被用作碳源而不是葡萄糖，以降低生长速率。酵母提取物被用作氮源。微量金属和MgSO4浓度已被优化，基于大肠杆菌生产菌株的规定要求。
实施例2具有源于pBR322质粒的NTC3019培养基补料分批培养在New Brunswick BioFlo 110发酵罐中于37℃完成补料分批发酵。通过自动添加30％氢氧化铵或10％磷酸控制pH。校准溶氧探针，氮气喷射为0％和空气饱和为100％。以1VVM对容器充气并通过比例-积分控制搅拌将溶氧维持在30％。当细胞密度高于约20OD600时，还需要O2补充以维持30％饱和度。
种子培养始于单个分离菌落接种至LB加50μg/ml卡那霉素，并在37℃生长。在中间-指数阶段(0.5-1.5OD600)，将种子培养用于为发酵罐提供1％接种物。
在补料分批培养中，根据碳限制指数加料策略，添加半合成补料营养物。简言之，在分批阶段，以特定生长速率μmax消耗碳底物的初始量。在耗尽碳底物后，补料分批阶段开始，并且自动添加补料营养物，以如下方程确定的速率(Carnes，同上，2005)F(t)=μXBVBSfYX/Seμi]]>这里μ＝在补料分批阶段想要的特定生长速率，XB＝在分批阶段结束时生物量浓度，gDCW/L，VB＝培养物的初始液体容积，L，Sf＝在营养物补料培养基中限制性底物浓度，g/L，YX/S＝来自底物的生物量产率系数，g/g，t＝自开始补料分批阶段的时间。
一般地，在带有几种独立卡那霉素抗性源于pBR322质粒的NTC3019培养基中补料分批发酵可达到100-120OD600、或55-65g干细胞重每升的细胞密度(图1)。质粒产率平均为260mg/L并已达到如430mg/L那么高。通过比较，用源于pBR322质粒的已公布发酵产率在3-4mg/L级别上(Lahijani等，同上，1996)。
非常重要地，特异性质粒产率是非常高的，一般在2.5和3.8mg/L/OD600之间，远超过了用其它发酵培养基/工艺使用更高的拷贝pUC起点质粒所观测到的水平(表3)。以特定产率mg/L/OD600表示质粒产率，这说明质粒数量与总细胞质量有关。高的特异性产率是非常想要的，因为增加每克细菌的质粒产率直接地就导致更高的最终产品纯度。
表3用已公布的高产率发酵工艺的特异性质粒产率的对比
这证明了，相对于现有技术中描述的培养基和工艺，NTC3019发酵培养基大大地提高了中等-拷贝数质粒(例如具有rop缺失的pBR322)的发酵产率。这种效果不是质粒特异性的。
从这些工艺纯化的DNA是高品质的，基本上是100％超螺旋，没有可检测到的缺失或其它重排。而且，利用这种工艺的细胞，已经实现了1克规模的DNA纯化。这证实了，在NTC3019补料分批培养基中进行的发酵有助于大规模下游处理。
实施例3具有高拷贝基因治疗质粒的NTC3018培养基分批发酵实施具有pUC起点质粒的NTC3018培养基分批培养。利用了下列含有pUC起点的质粒1)pW2.0，pUC19衍生物，具有改变的多接头(polylinker)序列。
2)pMaxGFP3)pEGFP-Cl在New Brunswick BioFlo 110发酵罐中于37℃完成分批发酵。通过自动添加30％氢氧化铵或10％磷酸控制pH。校准溶氧探针，氮气喷射为0％和空气饱和为100％。以1VVM对容器充气并通过比例-积分控制搅拌将溶氧维持在30％。当细胞密度高于约20OD600时，还需要O2补充以维持30％饱和度。
种子培养始于单个分离菌落接种至LB加50μg/ml卡那霉素或100μg/ml氨苄西林，并在37℃生长。在中间-指数阶段(0.5-1.5OD600)，将种子培养用于为发酵罐提供1％接种物。
所有的发酵都在37℃进行。对于pW2.0，质粒拷贝数是由发酵之后在42℃的生长来诱导。但是，特异性质粒产率结果是令人鼓舞的。pEGFP-Cl的最终产量为56OD600的细胞密度和产率为163mg质粒/L(2.9mg/L/OD600)，pMaxGFP细胞密度16OD600和产率为84mg质粒/L(5.3mg/L/OD600)，以及对于pW2.0细胞密度57OD600和产率为230mg质粒/L(4.0mg/L/OD600；图2)。
从这些工艺纯化的DNA是高品质的，基本上是100％超螺旋，没有可检测到的缺失或其它重排。而且，利用这种工艺的细胞，已经实现了0.5克规模的DNA纯化。这证实了，在NTC3018分批培养基中进行的发酵有助于大规模下游处理。
实施例4具有高拷贝基因治疗质粒的NTC3019培养基补料分批发酵选择质粒gWiz GFP(Gene Therapy Systems)用于补料分批发酵评估，所述质粒gWiz GFP是一种含有GFP基因的Vical VR1012载体。这是被广泛使用的卡那霉素抗性(kanR)含有pUC起点的DNA疫苗质粒，大小为5757bp。将质粒gWiz GFP(Gene Therapy Systems)转化进入大肠杆菌DH5α。在补料分批培养中还检验了pMaxGFP；获得了两种质粒的相似结果。
当使用NTC3019来生产这些质粒时遇到了两个问题。当37℃生长gWiz GFP质粒培养基时，如用源于pBR322质粒成功实现地取得的，发现了第一问题。用pUC质粒培养，细胞生长在大约15OD600时停止。荧光显微镜显示广泛的成丝，表示细胞分裂抑制。这是致命的，因为这些丝体最终裂解(Arends SJR，Weiss，DS.2004 J Bacteriol 186880-884)。例如，图3(A)表示的是用质粒gWiz GFP的补料分批发酵。细胞生长慢了下来，似乎在15OD600早熟地进入静止期。质粒产率分析表明，随着细胞生长开始要停止，特异性质粒产率提高为2.7mg/L/OD600。pUC质粒包含温度灵敏点突变，其可在拷贝数方面在42℃比在30℃表现30-40倍的增加(Lin-Chao等，1992)。然后将温度降至33℃，试图减少质粒拷贝数并因此减轻细胞上的代谢负荷，之后质粒降至1.6mg/L/OD600并且细胞生长重新开始。有趣的是，特异性质粒产率逐渐地再次上升，而且生长如所预料地在大约60OD600而不是生长至＞100OD600进入静止期，即使还在添加补料营养物。
图3(B)表示的是发生在37℃的细胞成丝。在温度降至33℃之后，生长细胞的样品显示较少的成丝。
可能的解释是，当37℃开始时细胞群体不能全部从成丝中恢复而且丧失了生命力。为了检验这种情况，在33℃完成了两个带有相同质粒的依次补料分批发酵。在两个发酵中，培养在细胞密度＜60OD600达峰。
来自这些发酵的生物量和质粒DNA产率数据表明，在抑制细胞生长之前在特异性生长速率方面降低了和在特异性质粒产率方面急速提高了。在质粒内容物方面突然提高至这样高的水平不是所预计的，并且在细胞群体上安置了代谢负荷，这可能是降低生长速率的起因。但是，它还表现了，在生长速率方面的降低常常导致在质粒拷贝数方面的增加(Satyagal VN，Agrawal P.1989 Biotechnol.Bioeng.331135-1144)、(Seo JH，Bailey JE.1985Biotechnol.Bioeng.271668-1674)。还不清楚，预计不到的特异性质粒产率提高是否引起生长速度的降低，反之亦然，或者一种是否以复合的方式引起另一种。
实施例5用于以NTC3019培养基高产率生产高拷贝质粒的诱导补料分批工艺基于来自33℃和37℃发酵的结果(实例5)，设计了一种策略来克服在用pUC起点质粒的补料分批模式中观察到的、预料不到的质粒增加。在诱导补料分批工艺中应用了DH5α中的质粒gWiz GFP。进行NTC3019补料分批发酵，如在实施例5中所概述的，除了培养是在30℃生长直至60OD600，此时将温度转换为37℃。在图4A中显示了令人惊奇的结果。在30℃生长至60OD600消除了生长停止的问题，并且培养最后超出了100OD600，总质粒产率为670mg/L。来自这种工艺样品的纯化DNA是高品质的，基本上是100％超螺旋，没有可检测到的缺失或其它重排。
在温度转换前的质粒产率在整个生长期保持较低，保持在2mg/L/OD600。这对比与从33℃或37℃发酵得到的结果。显然地，在温度转换后的特异性质粒产率是非常高的，达到6.5mg/L/OD600，远远地超出了用其它发酵培养基/工艺所观测到的水平(表3)。在30℃直至生长阶段然后转换至42℃的gWiz GFP发酵产生了1.1gm/L(11mg/L/OD600)的生产率产率(图4B)。生产率坪与大量的细胞死亡不相关，因为多数的细胞是有生命力的。
为了减少补料分批阶段持续的时间(通过将分批阶段延至更高的OD600)而对NTC3019培养基的修饰(在分批培养基中甘油、酵母提取物和镁增加四倍)在42℃诱导之后也产生了相似高的质粒产率，说明补料分批阶段可以开始于较高的OD600而无质粒诱导的丧失。
已经生产了带有各种pUC起点骨架的多重不同质粒，其包括不同的抗生素抗性基因以及原核元素的定向，在NTC3019中产率大于0.5gm/L，应用了在DH5α中30℃至42℃的诱导工艺。这些结果证明，诱导工艺对特定质粒不是特异性的。
还生产了gWiz-GFP质粒，在NTC3019中产率大于500mg/L，应用了在DH1细胞系中30℃至42℃的诱导工艺。这个结果证明了，诱导工艺对特定大肠杆菌菌株不是特异性的。
此外，利用来自这种工艺的细胞，已实现了1克规模的DNA纯化。这证明了，在NTC3019补料分批培养基中进行的诱导发酵有助于大规模下游的处理。
以特定的产率(mg/L/OD600)表示质粒的产率，表明质粒的数量相关于总细胞质量。这里所述的诱导补料分批工艺在整个工艺的生长阶段都维持较低(＜2mg/L/OD600)的质粒水平，而且有助于在生物量生产之后生产前所未有的超高质粒(6-11mg/L/OD600)。高的特定产率是非常理想的，因为提高每克细菌的质粒产量直接导致较高的最终产品纯度。
这些结果证明了本发明的补料分批和分批发酵工艺的一般实用性以改进质粒DNA的生产率和质量。
因此，读者应理解，本发明的生产工艺提供了用于改进质粒生产的方法。
尽管上面描述含有许多特定性，这些不应当被解释为本发明的限制，而是作为它们的一种优选实施方式的示例。许多其它的变化是可能的。例如，诱导补料分批工艺可以与分批工艺整合，这样，在NTC3018分批培养基中进行发酵直至营养无缺失，因此，源自NTC3019的补料分批培养基和诱导同时启动。在这种实施方式中，使用了一些质粒，可以高达37℃进行生长阶段，因为质粒拷贝数将随着更高的生长速率而被减少。本领域的技术人员可以确定，在生长阶段使细胞分裂的优化温度，以及在补料分批阶段保持质粒的诱导性。因此，本发明的范围不应当由举例的实施方式确定，而由附后的权利要求和它们法定等同物确定。
权利要求
1.一种用于补料分批发酵生产共价闭合超螺旋质粒DNA的方法，它包括如下步骤A)在补料分批阶段，以降低的温度生长含有质粒、粘粒或细菌人工染色体复制子的细菌细胞；和B)在补料分批阶段限制生长速率；和C)用温度向上转换诱导质粒生产；和D)在升高温度的条件下继续生长以累积质粒产物；籍此所述的方法提高质粒的产率。
2.如权利要求1所述的方法，其中在所述补料分批阶段所述降低的温度确保维持所述质粒产率低于大约2mg/L/OD600。
3.如权利要求1所述的方法，其中在所述补料分批阶段所述降低的温度约为30℃。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述温度转换是在36-45℃的范围。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述质粒含有源于ColE 1的复制起点。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述质粒含有包括pUC G到A突变的pMB1复制起点。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述质粒衍生自VR1012骨架。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基基本上是半合成甘油培养基。
9.一种用于发酵生产共价闭合超螺旋质粒DNA的方法，它包括如下步骤A)在补料分批发酵培养基中生长含有源于pBR322的质粒、粘粒或细菌人工染色体复制子的细菌细胞；和B)在补料分批阶段限制生长速率；和C)继续生长以累积质粒产物；籍此所述的方法提高质粒的产率。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述发酵培养基基本上是半合成甘油培养基。
全文摘要
为了确保未来DNA疫苗和DNA治疗法的经济可行性，需要改进质粒DNA生产技术。本发明描述了通用的方法，藉此可在发酵罐中显著地增加质粒DNA的生产率。这些工艺以补料分批发酵策略为特征，结合了新的生长和诱导阶段温度转换。
文档编号C12P19/34GK101076597SQ200580034956
公开日2007年11月21日 申请日期2005年8月16日 优先权日2004年8月19日
发明者亚伦·E·卡奈斯, 詹姆士·A·威廉姆斯 申请人:自然科技公司