专利名称：细胞的冷藏的制作方法
技术领域：
本申请要求于2004年11月5日递交的美国临时申请系列号60/625,401的优先权。
发明领域本发明涉及转化和非转化细胞的冷藏方法。还通过本发明提供已冷藏细胞的恢复方法。并提供从冷藏成功恢复的细胞培养物。
背景技术：
用于生物药品和生物农用化学品生产的“万能种子”原理利用活生物体作为制备方法的部分并基于一些基本原则1)起源和传代史确定的单一培养物被保藏，所述培养物具有限定特征的细胞表型和期望的制备特征；2)长期的(跨越几年或更多)保藏(特别是冷藏)；3)细胞可以被恢复、扩增、无限传代成为“工作种子”并用于另一轮的冷藏(该原理需要细胞强壮)；和4)在限定数目的传代之后，细胞未丢失在初始冷冻状态之前具有的限定特征的细胞表型和期望的制备特征。
涉及植物细胞的冷藏技术缺乏关于在生物药品制备环境中使用生物物质所需特征的教导。特别是为延长保存活生物物质设计的任何技术应该优选地符合以下原则1)保藏方法必须提供长期(数年)稳定的生物物质；2)保藏条件不应改变制备方法所需要的生物物质；和3)一旦从保藏中移出，该物质应该容易地得到再生并且能够增殖为可再生的工作种子。
在现有技术中很少提供关于冷藏时间长度(通常以月或甚至小时计)的信息，并且关于细胞是否能够在普通培养条件下无限生长或至少生长至期望的代数的信息有限。此外，几乎没有数据揭示靶基因或基因产物(均来自初始的万能种子贮备物和经扩增并重新冷藏的工作种子贮备物)经过长期保藏或从保藏中移出之后长期培养，其遗传和生产的稳定性。
因此，需要提供植物细胞的长期保藏方法或系列处理技术用于以万能种子原理生物制备目标成分的长期生长、重新冷藏和稳定性。
发明概述本发明涉及转化和非转化细胞的冷藏方法。还通过本发明提供已冷藏细胞的恢复方法。并提供从冷藏成功恢复的细胞培养物。
图1A-2B.细胞转移频率对恢复百分数(图1B)和健康愈伤组织百分数(黄色愈伤组织；图1A)的影响。
发明详述本发明提供转化或非转化细胞的冷藏方法。在本发明的某些实施方案中，所述方法提供形成冷藏组合物以及冷藏转化或非转化的真核细胞的方法。
因此，本发明的一个实施方案提供形成包含转化(或非转化)真核细胞的冷藏组合物的方法。这些方法包括步骤a)在选择培养基上/中生长转化(或非转化)细胞；b)用所述细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物，并对所述转化(或非转化)细胞的液体培养物传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢复所述传代细胞；和d)将所述恢复细胞加至冷藏培养基形成冷藏组合物。
本发明的另一实施方案提供冷藏转化(或非转化)真核细胞的方法，包括步骤a)在选择培养基上/中生长转化(或非转化)细胞；
b)用所述细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物，并对所述转化(或非转化)细胞的液体培养物传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢复所述传代细胞；和d)将所述恢复的转化(或非转化)细胞加至冷藏培养基形成冷藏组合物；和e)冷藏所述冷藏组合物。
本发明的又一实施方案提供冷藏转化(或非转化)细胞的方法，其包括a)在选择培养基上/中生长转化(或非转化)细胞1-10天；b)用所述细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物；c)培养所述液体培养物至约对数中期生长期；d)回收第一体积(VOL1)的所述液体培养物并将其接种于含有第二体积(VOL2)培养基的培养瓶；e)另外重复步骤d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次(传代所述细胞)；f)恢复所述传代细胞；g)将所述传代细胞悬浮于一定体积的第二培养基；h)将冷藏培养基加入步骤g)中提供的悬浮细胞以形成冷藏组合物；i)冷却所述冷藏组合物；和j)冷冻所述冷藏组合物。
根据本发明的一个实施方案提供植物细胞的冷藏。根据本发明可以冷藏来自单子叶或双子叶的细胞。因此，可以使用这里教导的多种方法冷藏转化和非转化的单子叶或双子叶细胞。在这里教导的本发明的多种实施方案中，冷藏、贮存和恢复转基因和非转基因的烟草细胞和稻细胞，以建立保留原始培养物基因型和表型的生长细胞培养物。
因此，本发明提供转化植物细胞的冷藏方法(任选地，依据万能种子原理)。在本发明的某些实施方案中，将所述方法以万能种子原理用于烟草(Nicotiana tabacum)(NT-1和BY-2)细胞以及T309稻细胞的冷藏。见Biotechnology in Agriculture and Forestry，T.Nagata、S.Hasezawa和D.Inze编辑；Springer-Verlag；Heidelberg，Germany；2004。
使用标准植物组织培养技术从可商购的稻T309品种制备T309稻细胞系。适于本发明操作的其它转化和非转化的植物细胞列于表1。
本发明的另一实施方案提供形成冷藏组合物的方法，所述冷藏组合物包含转化的植物细胞。这些方法包括步骤a)使愈伤组织上的转化的植物细胞在选择培养基中生长；b)用来自所述愈伤组织的所述植物细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物，并对所述转化植物细胞的液体培养物传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢复所述传代的植物细胞；和d)将所述恢复的转化植物细胞加至冷藏培养基形成冷藏组合物。
本发明的另一实施方案提供转化植物细胞的冷藏方法。这些方法包括a)使愈伤组织上的转化的植物细胞在选择培养基中生长；b)用来自所述愈伤组织的所述植物细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物，并对所述转化植物细胞的液体培养物传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢复所述传代的植物细胞；d)将所述恢复的转化植物细胞加至冷藏培养基形成冷藏组合物；和e)冷藏所述冷藏组合物。
冷藏转化的植物细胞的又一方法包括a)使愈伤组织上的转化的植物细胞在选择培养基中生长1-10天；b)用来自所述愈伤组织的所述细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物；c)培养所述液体培养物至约对数中期生长期；d)回收生长至约对数中期的第一体积(VOL1)所述液体培养物，将所述第一体积接种于含有第二体积(VOL2)培养基的培养瓶以形成传代培养物，并培养所述传代培养物至约对数中期生长期；
e)任选地，另外重复步骤d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；f)从所述传代培养物恢复植物细胞；g)将所述植物细胞悬浮于一定体积的第二培养基(CULT)；h)将一定体积的冷藏培养基(CRYO)加入步骤g)中提供的悬浮植物细胞以形成冷藏组合物；i)冷却所述冷藏组合物；和j)冷冻所述冷藏组合物。
术语“传代”可与“短周期条件”一词交换地使用。传代或短周期条件是描述在指数中期(对数中期)生长期收获(回收)细胞；在指数中期生长期用新鲜培养基稀释或分传细胞，并培养稀释的(分传的)细胞培养物至指数中期生长期。
出于本发明的目的，普通技术人员将理解术语“对数中期”和“指数中期”并非指精确的指数生长中点，而指在数学中点左右的范围。至指数中期生长期的每轮培养被认为是一个细胞世代。可以成功冷藏具有仅1个短周期(世代)或高达20个短周期的来自悬液的待冷藏细胞。优选3-6个短周期，最优选6个短周期。发明人已显示6个短周期(世代)使细胞能够从冷藏状态优异地恢复用于重培养。此外，只要在1-6次短周期条件下将细胞置于悬液中，在培养后可以多次冷藏细胞。在稀释或分传步骤中加于新鲜培养基体积(VOL2)的细胞体积(VOL1)可以以VOL1相对VOL2的比率改变，其中VOL1和VOL2各自独立地范围从1至至少20；1至至少10；或1至至少5(包括任意这些数值之间的分数值)。在一个实施方案中，VOL1∶VOL2为1∶3。
还应指出的是，以下教导的每一方法可以包括另外的方法步骤。例如，可以解冻冷藏的转化植物细胞、在培养基中悬浮冷藏细胞(或在固体选择培养基上生长该细胞以形成愈伤组织)并使其生长用于生物制备方法(如，将细胞培养在生长容器，例如发酵罐、搅拌釜反应器等等)。来自生物制备方法的细胞可以用于本发明的冷藏方法并根据万能种子原理贮存。
适用于非转化和转化的单子叶和双子叶细胞生长的选择培养基是本领域技术人员已知的，并且可以由个人容易地使用(见，例如DifcoTM和BBLTM手册，微生物培养基手册)。
当欲形成冷藏组合物时，可以将含有悬浮细胞的多种体积的培养基(CULT)与多种体积的冷藏培养基(CRYO)混合。这些混合物是以CULT∶CRYO的比率混合，其中CULT范围从1至100(包括其间的分数值)且CRYO范围从1至100(包括其间的分数值)。在一些实施方案中，CULT和CRYO范围从1至10。在其它实施方案中，将等体积的CULT和CRYO混合形成冷藏组合物。
本发明还提供由任何的上述冷藏方法产生的冷藏细胞或细胞系。
在本发明的多种实施方案中，并未如在美国专利号5,965,438或6,127,181提出的教导的那样(其公开在此被完整引入作为参考，特别是美国专利号5,965,438的第6栏第16行至第7栏第34行和美国专利号6,127,181的第6栏第60行至第9栏第22行)，使用物质(如稳定剂)对所述将欲冷藏的细胞进行“预处理”或“预培养”，从而通过移去由细胞分泌至培养基的有害物质增加细胞的存活力。如在‘438专利所讨论，稳定剂预处理涉及移去在细胞生长或死亡期间分泌的有害物质。此外，本发明可以排除使用一种或多种“渗压剂”、乙烯抑制剂和/或膜稳定剂在培养条件下加入细胞的预处理。具体而言，在细胞培养时，未将稳定剂、渗压剂、乙烯抑制剂和/或膜稳定剂加入预处理方案中本发明已制备的培养基，尽管在‘438或‘181专利中鉴定的物质可能是根据本发明预先制备用于细胞培养的培养基的组分。因此，在细胞培养期间未如在‘438或‘181专利所提出的那样将稳定剂、渗压剂、乙烯抑制剂和/或膜稳定剂加入培养基(或作为必需的补充)(见，例如美国专利号5,965,438的第7栏第7-16行和美国专利号6,127,181的第9栏第36-47行)。
相应的，在细胞培养时，下列物质未被加入培养基或不作为需要的补充稳定剂如还原的谷胱甘肽、1，1，3，3-四甲基脲、1，1，3，3-四甲基-2-硫脲、硫代硫酸钠、硫代硫酸银、甜菜碱、n，n-二甲基甲酰胺、n-(2-巯基丙酰基)甘氨酸、β-巯基乙胺、硒代甲硫氨酸、硫脲、没食子酸丙酯、二巯基丙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸钠、精胺、亚精胺、阿魏酸、芝麻酚、间苯二酚、没食子酸丙酯、mdl-71，897、尸毒素、腐胺、1，3-和1，2-二氨基丙烷、脱氧葡萄糖、尿酸、水杨酸、3-和4-氨基-1，2，4-三唑、苯甲酸、羟胺和这些物质的组合及衍生物；妨碍或完全阻止乙烯生物合成和/或乙烯作用的物质如根瘤菌毒素(rhizobitoxin)、甲氧胺盐酸盐、羟胺类似物、α-副刀豆氨酸、DNP(2，4-二硝基苯酚)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Triton X-100、吐温20、精胺、亚精胺、ACC类似物、α-氨基异丁酸、没食子酸正丙酯、苯甲酸和其衍生物、阿魏酸、水杨酸和其衍生物、水杨酸、芝麻酚、尸毒素、氢醌、alar、amo-1618、BHA(丁化羟基苯甲醚)、苯乙胺、油菜素类固醇、对氯高汞苯甲酸、n-乙基马来酰亚胺、碘乙酸盐、氯化钴和其它钴盐、双吡啶、氨基(羟基乙)酸、氯化汞和其它汞盐、水杨醇、水杨苷、氯化镍和其它镍盐、儿茶酚、间苯三酚(pffloroglucinol)、1，2-二氨基丙烷、去铁胺、吲哚美辛、1，3-二氨基丙烷、异硫氰酸苄酯、8-羟基喹啉硫酸盐、8-羟基喹啉柠檬酸盐、2，5-降冰片二烯、正乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉、反式环辛烯、7-溴代-5-氯代-8-羟基喹啉、顺丙烯磷酸、重氮环戊二烯、甲基环丙烷、2-甲基环丙烷、羧酸、甲基环丙烷羧酸酯、环辛二烯、cyclooctodine、(氯甲基)环丙烷和/或银盐如硫代硫酸银、硝酸银、氯化银、乙酸银、磷酸银、柠檬酸三银盐、苯甲酸银、硫酸银、氧化银、亚硝酸银、氰酸银、乳酸银盐、五氟丙酸银、六氟磷酸银、甲苯磺酸银盐以及它们的组合；膜稳定剂如插入脂双层的化合物(如，固醇、磷脂、糖脂、糖蛋白)或二价阳离子。
实施例1冷藏在本实施例中使用的培养基和组分陈列于表2-4。供应商提供的组分也被列出。待冷藏的细胞生长在25℃含有NT1培养基的摇瓶中；在对数中期(指数中期)生长期(接种培养瓶后3-4天)以1∶3分传细胞(或30％接种)，传代至少1-10代(一个实施方案为至少6代)。在转移至无菌生物安全柜之前使用1％高氯酸钠溶液清洁培养瓶外表面，在将细胞转移至无菌的225ml离心管之前再用无菌酒精垫擦拭培养瓶外表面。细胞以1000RPM于4℃离心1分钟，用无菌吸管移去上清液。用合适的培养基将细胞以初始体积重悬并转移至无菌的1升三角瓶，向悬液加入等体积的冷藏培养基并轻轻混旋。
接着，冷藏细胞如下，于2-7℃定轨摇床中轻轻摇动细胞悬液(130RPM)1小时，继而在冰上转移至生物安全柜并用无菌酒精垫擦净。在无菌条件下使用自动移取器将细胞立即分散至冷冻管。每管容纳2.5ml细胞悬液并被立即置于液氮保藏用的盒子中；装载盒子应该保持在2-7℃直至冷冻。接着将盒子转移至速度控制冷冻机。冷冻程序以4℃15分钟起始，继之温度以每分钟-0.5℃速度从4℃连续下降至-40℃。接着取出盒子并置于在干冰上预冷的贮存架中；一旦全部盒子装于贮存架时，将该支架立即放入利用气相的液氮贮存罐。
为了从冷藏恢复细胞用于多种生物过程，将冷冻管从液氮贮存罐移出，迅速从储存盒取出冷冻管并放入45℃水浴。混旋管子约2.5分钟，并通过颠倒管子悬浮细胞。当细胞被完全悬浮时，将管子转移至防生物柜，用无菌酒精垫擦拭管子并将内容物倒至培养皿中的10层Whatman纸上；盖上培养皿，使冷藏培养基吸收细胞至少2分钟。将上层滤纸转移至含有NT1琼脂培养基的有盖培养皿(确保在Whatman纸与琼脂之间没有气泡)，使用3M手术带包裹NT1琼脂板一次并将其保存于25℃。在4-5天之后应该可检测到愈伤组织的最小生长。表1显示NT-1细胞的几个不同的转基因细胞系，所述细胞表达来自新城疫病毒的血凝素/神经氨酸酶(HN)蛋白、禽流感病毒(AIV)的血凝素(HA)、大肠杆菌的热不稳定毒素和感染性法式囊病毒(IBDV)的VP2蛋白。无论其表达的基因或使用的启动子系统如何都获得了成功。此外，数据证明与使用塑料带或膜(如NESCO膜)相比，使用3M手术带对NT1细胞的生长具有显著影响。
实施例2-冷藏烟草细胞的解冻可以解冻单管细胞或多管细胞的集合。将管子从贮存单元中移出置于干冰上。将其浸没于45℃水浴中，轻轻移动水浴中的管架以帮助促进管子迅速且一致的解冻。约2.5分钟之后(至刚刚解冻时)，轻轻颠倒管子3次以混合沉在管底的细胞。在层流柜中，从多管的集合或单个管子中吸出2ml细胞置于无菌培养皿中的8-10层无菌的70mm 4号Whatman滤纸上，盖上盖子使排液2分钟。
此刻对少量细胞(～0.5ml)进行TTC存活力染色。排液2分钟后，将带有细胞的顶层滤纸转移至无双丙磷(bialaphos)选择的半固体NTB1培养基。接着使用3M胶带包裹培养板并在25℃黑暗中孵育3天。3天之后，用Nesco膜代替3M胶带。在第7天将带有细胞的滤纸转移至新的NT1培养板并用Nesco膜包裹。在约7天内细胞生长明显。另外7天之后，将细胞从滤纸转移至带有双丙磷选择剂的新的半固体NT1平板。一旦累积足够的细胞量，则按照需要开始悬浮培养。
第一组试验测试冷藏后铺板细胞的再生产性和最佳解冻后处理。为了测试再生产性，将八管细胞解冻、混合细胞并置于8个平板上，做三组重复。测试的其它参数为含有细胞的滤纸向新鲜平板转移的频率。参考文献表明更频繁的转移可以提高细胞的恢复(通过移去冷冻保护剂中的组分)；然而，冷冻保护剂的一些组分也提供保护效果。测试的三个转移方案包括“1天转移”(在前三天每天转移，3天之后转移和接着每周转移)、“3天转移”(以三天为间隔转移两次，接着每周转移)和“7天转移”(每周转移)。两周后，基于细胞的恢复水平和颜色对试验结果评分(图1)。
来自测试不同时间排液的全部处理的细胞恢复非常迅速(5天)。对平板的主观评估表明排液1或2分钟的细胞恢复好于其它处理，尽管差异不大。
放大试验方案为了测试放大试验，将操作中的步骤成比例放大。在小规模和大规模之间的基本差异为冷冻保护剂中大体积的细胞可能限制空气交换，并且方法中每个步骤需要更长的时间。在放大试验中短周期和长周期细胞都得到测试。将细胞解冻、汇集5管并铺于5个平板上或解冻15管并分别铺平板。短周期细胞在5天之内以100％恢复率恢复。尽管需要更长的时间恢复(两周)，来自长周期细胞的平板也全部恢复。还检测了在冷藏溶液中保留细胞延长的时间(由于分配大量管子所需时间)的可能影响。在这一试验中，将细胞转移至管子中并在第一组样品之后冷冻约2小时。来自两次冷冻的细胞恢复之间没有明显差异。
1Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS)2Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)3Meiji Seika(Kaisha，Japan)
*加至体积并调至pH 5.81Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS)2Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)3Meiji Seika(Kaisha，Japan)
权利要求
1.制备冷藏植物细胞的方法，包括a)传代细胞至约对数中期生长期至少1代；b)浓缩所述传代细胞；和c)将冷藏培养基加至所述浓缩的传代细胞以形成冷藏组合物。
2.根据权利要求1的方法，还包括冷却所述冷藏组合物。
3.根据权利要求1的方法，还包括冷冻所述冷藏组合物。
4.根据权利要求2的方法，还包括冷冻所述冷藏组合物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是经转化的。
6.根据权利要求1的方法，其中所述细胞选自表1中的细胞。
7.形成冷藏组合物的方法，包括步骤a)使转化或非转化细胞在选择培养基中或之上生长；b)用所述细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物，并传代所述转化或非转化细胞的液体培养物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢复所述传代细胞；和d)将所述恢复细胞加至冷藏培养基以形成冷藏组合物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述细胞是单子叶或双子叶植物细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中所述细胞是经转化的。
10.根据权利要求9的方法，其中所述细胞是植物细胞。
11.根据权利要求10的方法，其中所述细胞是烟草细胞。
12.根据权利要求10的方法，其中所述细胞是稻细胞。
13.根据权利要求7的方法，其中所述冷藏培养基是在水中配制并含有342.27g蔗糖/L、46.06g甘油/L、35.5mL DMSO/L和226.64mL的培养基，所述培养基选自NT1 VP培养基、VP培养基或T309培养基。
14.冷藏转化植物细胞的方法，包括步骤a)使愈伤组织上的转化植物细胞在选择培养基中生长；b)用来自所述愈伤组织的所述植物细胞接种含有培养基的培养瓶以形成液体培养物；c)培养所述液体培养物至约对数中期生长期；d)回收生长至约对数中期的第一体积(VOL1)的所述液体培养物，将所述第一体积接种于含有第二体积(VOL2)培养基的培养瓶以形成传代培养物并培养所述传代培养物至约对数中期生长期；e)任选地另外重复步骤d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；f)从所述传代培养物恢复植物细胞；g)将所述传代细胞悬浮于一定体积的第二培养基(CULT)；h)将一定体积的冷藏培养基(CRYO)加入步骤g)中提供的悬浮植物细胞以形成冷藏组合物；i)冷却所述冷藏组合物；和j)冷冻所述冷藏组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中另外重复步骤d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
16.根据权利要求14的方法，其中所述植物细胞为烟草或稻。
17.根据权利要求15的方法，其中所述植物细胞为烟草或稻。
18.根据权利要求14、15、16或17的方法，其中VOL1和VOL2各自独立地范围从1至至少20；1至至少10；或1至至少5，包括任何这些数值之间的分数值。
19.根据权利要求18的方法，其中VOL1∶VOL2为1∶3。
20.根据权利要求18的方法，其中以CULT∶CRYO的比率添加在一起，并且CULT范围从1至100而CRYO范围从1至100。
21.根据权利要求20的方法，其中CULT∶CRYO为1∶1。
22.根据权利要求15的方法，其中以CULT∶CRYO的比率添加在一起，并且CULT范围从1至100而CRYO范围从1至100。
23.根据权利要求22的方法，其中CULT∶CRYO为1∶1。
24.根据权利要求14的方法，还包括解冻所述冷藏组合物的步骤。
25.根据权利要求24的方法，还包括从所述冷藏组合物恢复和培养细胞的步骤。
26.根据权利要求18的方法，还包括解冻所述冷藏组合物的步骤。
27.根据权利要求26的方法，还包括从所述冷藏组合物恢复和培养细胞的步骤。
28.根据权利要求20的方法，还包括解冻所述冷藏组合物的步骤。
29.根据权利要求28的方法，还包括从所述冷藏组合物恢复和培养细胞的步骤。
30.根据权利要求22的方法，还包括解冻所述冷藏组合物的步骤。
31.根据权利要求30的方法，还包括从所述冷藏组合物恢复和培养细胞的步骤。
32.根据权利要求14的方法，其中重复步骤d)6次。
全文摘要
本发明涉及转化和非转化细胞的冷藏方法。还通过本发明提供已冷藏细胞的恢复方法。也提供从冷藏成功恢复的细胞培养物。
文档编号C12N5/04GK101048494SQ200580036431
公开日2007年10月3日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月5日
发明者W·M·爱因雷, J·R·博林格尔, C·M·L·拉尔森, M·卢, L·Y·沈, P·S·亚佳库马尔, R·J·佳里森, D·R·帕雷迪 申请人:美国陶氏益农公司