Rna构建体的制作方法

专利名称：Rna构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。更具体而言，本发明涉及通过(i)靶向多重靶序列和/或通过(ii)表达被保护免受RNA加工的dsRNA来设计用于在dsRNA沉默中更有效的遗传构建体。这些构建体尤其可用于dsRNA介导的植物有害生物防治。
背景技术：
很多dsRNA构建体在本领域中已有描述。经典的dsRNA从DNA构建体产生，所述DNA构建体包含两个收敛启动子，其位于与需要下调的靶序列互补的序列的旁侧(见，如WO00/01846)。随着dsRNA介导的基因沉默技术的发展，出于多种目的设计新型构建体来改进dsRNA。
为了更高效地生产dsRNA，开发了茎-环-茎结构或“发夹”。例如，如文件WO99/53050所述，该发夹允许从一个单RNA转录物形成dsRNA。该RNA转录物包括互补序列的正义和反义版本，它们被非互补的环结构分开，这使得RNA转录物回折，使碱基对进入dsRNA茎部分。
为了生产在基因沉默中更有效的dsRNA，将与靶序列互补的序列的多重拷贝掺入一个构建体并转变为一个dsRNA。文件WO99/49029更详细描述了包含多重结构基因序列的合成基因，其中每一结构基因序列与靶基因基本一致。
文件WO2004/001013描述了专门设计用来临床应用于预防或治疗疾病或感染的构建体，并且不产生由于dsRNA诱导毒性的有害副作用。已描述过有些dsRNA可诱导能导致细胞死亡的干扰素应答(Jaramillo et al.，Cancer Invest.13327-338，1995)。这些构建体特征在于对RNA加工敏感的部分，以改善介导基因沉默的短干扰RNA(siRNA)的形成，同时避免由于长(大于30个碱基对)dsRNA引起的dsRNA毒性。短干扰RNA(siRNA)介导特异性单链靶RNA的切割。这些siRNA的长度通常在21nt左右，这表明siRNA在宿主中的表达引起高效且特异的基因表达下调，导致靶基因的功能失活。
已发现dsRNA基因沉默的在很多不同领域的用途，如，例如在植物中dsRNA介导的基因沉默。也发现了dsRNA基因沉默在植物有害生物防治领域中的用途(WO00/01864)。通常，通过摄入能沉默靶基因表达的dsRNA根除有害生物，所述靶基因的表达对有害生物的存活、生长和/或发育是必需。可通过多种途径实现dsRNA与有害生物的接触，一个实例是在有害生物感染的植物细胞中生产dsRNA。在植物中表达dsRNA时的一个问题是它可以被植物细胞的RNA加工机制所加工(Susi et al，2004.PMB 54157-174，Baulcombe，2004.Nature 431356-363)。

发明内容
尽管为了基因沉默需要形成约21nt的短干扰RNA(siRNA)，本发明人现已发现，为了能被有害生物所高效吸收，dsRNA的最短长度至少需要在80-100nt。已经指出在无脊椎动物如秀丽隐杆线虫(C.elegans)或植物寄生线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)中这些更长的片段在基因沉默中更有效，这可能是因为无脊椎动物能更高效地吸收这些长dsRNA。
本发明通过提供在dsRNA介导的基因沉默方面高效同时保持足够长度的dsRNA构建体解决这一问题。
此外，本发明还提供串联体dsRNA设计，允许在一个更长dsRNA构建体中合并多个短片段，并允许增加控制有害生物活力、生长和/或发育的功效。
作为替代或除此之外，本发明提供在宿主细胞中保护dsRNA免受RNA加工的稳定dsRNA构建体。
此处所述的以及适用于高效的dsRNA介导有害生物防治的构建体，被设计为符合以下至少部分要求(1)dsRNA构建体在生产dsRNA的宿主细胞中有良好的稳定性(2)dsRNA被有害生物吸收(3)dsRNA在有害生物中有良好稳定性和/或(4)dsRNA在有害生物中可有效控制有害生物的活力、生长和/或发育。
这些dsRNA构建体设计有如下的一或多种优势(1)本发明的串联体和/或稳定化构建体允许掺入同时靶向多重靶序列或靶基因的多重dsRNA片段。这些多重靶序列或靶基因可源于相同或不同有害生物物种。这些多重靶序列或靶基因可以是异种同源物(ortholog)或同源物(homolog)或不相关的。作为替代，所述串联体和/或稳定化构建体允许掺入对抗靶基因的一个或多个部分的多重dsRNA片段；(2)本发明的构建体允许发生dsRNA，所述dsRNA的长度和/或大小和/或形状与有害生物充分吸收相容；(3)现有技术将dsRNA构建体设计成快速加工成较小片段，与其相反，现在本发明目的之一是设计在宿主细胞或生物中(例如在植物中和/或植物有害生物中)更稳定的dsRNA。通过将能保护dsRNA免受RNA加工的序列掺入dsRNA内来实现该目的；(4)本发明的构建体有在生产dsRNA构建体的宿主生物中稳定的优点。例如，在植物细胞中表达时，如本发明所提供的dsRNA构建体得到保护免受植物中RNA加工。以此方式，所述dsRNA更少被宿主机制切割，并且当植物有害生物以植物为食物或其食物来自植物时，所述dsRNA能以更完整(如更大)的形式被植物有害生物吸收。
本发明还涉及编码根据本发明的dsRNA构建体的DNA构建体，涉及包含该DNA构建体的载体的表达以及包含该dsRNA、DNA或表达载体的宿主细胞。
本发明还包括生产这种dsRNA构建体的方法、生产DNA表达构建体的方法、生产宿主细胞的方法、在基因沉默中应用这些构建体的方法、生产转基因生物的方法以及控制有害生物的方法。
具体实施例方式
串联体构建体根据第一实施方案，本发明涉及在RNAi基因沉默中有效的分离的(如基本纯)双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA(部分或片段)包含多重dsRNA片段，每个片段包含退火的互补链，其中之一与待沉默的靶序列或感兴趣靶基因的至少部分核苷酸序列互补；所述dsRNA能形成双链RNA部分或片段。
根据本发明的串联体构建体在一个dsRNA茎内包含多重dsRNA片段。这种串联体构建体可“原样(per se)”使用，以下称作“原样串联体构建体”，或可以用作如此处所述稳定化RNA构建体中的dsRNA茎。因此，在一个dsRNA茎中包含多重dsRNA片段的本发明RNA构建体也通常称为“串联体(concatemers)”。作为“串联体”的非限定性实例列表，本发明提供三叶草形串联体、哑铃形串联体、发夹串联体、茎形dsRNA串联体。所有这些串联体任选地可以用此处所述的锁来稳定化并且任选地可提供有此处所述的连接子。
因此本发明涉及包含双链RNA(也作dsRNA分子)的串联体和/或稳定化RNA构建体，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中之一具有与有害生物靶基因的至少部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，存在与同一靶基因的不同(如截然不同的)序列互补的多重RNA片段。在另一个实施方案中，本发明还涉及如上所述的串联体和/或稳定化RNA构建体，其包含与不同(如截然不同的)靶基因的序列互补的多重RNA片段。在一个实施方案中，所述dsRNA片段被连接子序列或锁分开。优选地所述连接子序列是双链的并且所述链是互补的，因此还形成双链区。所述连接序列可以包含不与靶序列互补的短随机核苷酸序列。
本发明文中术语“多重”表示至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、等......直至至少10、15、20或至少30。
因此本发明涉及此处所述的分离的dsRNA或dsDNA构建体，其中所述dsRNA包含一个dsRNA片段的至少一次重复。如此处所用，一次重复表示相同dsRNA片段的两个拷贝。
在另一个实施方案中，本发明涉及此处所述的分离的dsRNA或dsDNA构建体，其中所述dsRNA包含dsRNA片段系列的至少一次重复。因此如此处所述，一次重复表示dsRNA片段系列的两个拷贝。
本发明还涉及如上所述的分离的dsRNA，其中所述dsRNA包含一个dsRNA片段或dsRNA片段系列的至少两个或三个拷贝，优选至少四个、五个或六个拷贝，更优选至少七个、八个、九个、十个或更多拷贝。换言之，所述多重dsRNA片段是单个dsRNA片段或dsRNA片段系列的重复。
应该清楚，表述“多重dsRNA”还包括包含一个或更多dsRNA片段的拷贝以及还包含其他dsRNA片段的dsRNA，所述其他dsRNA片段不同于重复的或多拷贝的或多聚化的dsRNA片段。因此本发明还涉及包含dsRNA片段的一个或更多重复以及还包含至少一个不同于所述重复片段的dsRNA片段的分离dsRNA。
如此处所用术语“互补”涉及DNA-DNA和RNA-RNA互补以及DNA-RNA互补。按此类推，术语“RNA对等物”表示在DNA序列中的碱基“T”可被通常出现在核糖核酸中的对应碱基“U”替换。
如此处所用术语“互补区”表示与靶基因的至少部分核苷酸序列互补的区域。当“互补”在本发明中用于dsRNA时，表示具有与靶序列其中一条链基本一致的序列。在实施本发明时，互补区通常包含与靶基因相应序列具有大于约75％序列一致性的核苷酸序列；然而，更高的同源性可对靶基因的表达产生更高效的调节。优选地序列一致性约80％、85％、90％、95％，甚至更优选大于约99％。本发明中，表述“大于约”和“至少”意思相同。
优选地，互补区是对靶生物以外的生物无害的片段。优选地，所述片段不具有与靶生物以外生物的序列一样的超过20个连续核苷酸。例如，当靶生物是植物病原体，如植物寄生线虫或昆虫，所述片段不具有与植物或哺乳动物(尤其是人)的核苷酸序列一样的20个连续核苷酸。
此处所用术语“双链RNA(dsRNA)”和“能形成dsRNA的RNA”可互换。如此处所用术语“dsRNA构建体”包括所有能形成双链RNA的构建体，如此处所述的任何串联体或稳定化构建体。如进一步所述，所述dsRNA或dsRNA构建体可包含不与靶基因互补的其他序列或有其他功能的序列。
术语“双链RNA片段”或“双链RNA区”表示与(部分)靶基因对应的双链RNA的小实体。如此处所用，表述“与......对应”表示“与......互补”。
在一个实施方案中，在本发明的dsRNA中，所述多重dsRNA片段不被非互补区分开。这表示在独立的dsRNA片段之间不存在非杂交RNA区。
根据本发明dsRNA中的其他实施方案，dsRNA片段不被如进一步所述的间隔区或锁序列分开。
在所述串联体构建体中，每个dsRNA片段的长度可以是至少17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或更多，例如约30bp、约40bp、约50bp、约60bp、约70bp、约80bp、约90bp、约100bp、约110bp或约120bp。串联体构建体中的优选dsRNA片段的长度是17至2000bp，优选21至1000或500或250bp，优选40至150bp，更优选50至120bp或之间的任意数字。
此处所用“靶基因”表示在靶物种中需要被沉默的基因。靶基因包括启动子区、5’非翻译区、其中可存在内含子的编码序列、和3’非翻译区。靶基因可以选自此处所述的任何靶物种的基因组。根据一个实施方案，靶序列选自这种生物的基因组，该生物不同于表达所述dsRNA的生物。这表示dsRNA在一个细胞或生物中表达，并且随后被转移或吸收至含靶基因的另一个细胞或生物。根据本发明的一个具体实施方案，dsRNA在植物或植物细胞中表达，并且靶基因选自细菌、病毒、病毒粒子、无脊椎动物的基因组，更具体地选自植物有害生物物种，如病毒粒子、病毒、线虫、真菌或昆虫的基因组。
dsRNA从植物“转移”至有害生物物种表示dsRNA在植物细胞中生产并被有害生物吸收、重新定位或与之接触。例如植物寄生线虫或昆虫可通过摄食植物从植物细胞质吸收植物中产生的dsRNA。与dsRNA接触的真菌细胞可以是处于植物细胞外生活阶段的植物病原体真菌细胞，例如菌丝、萌发管、附着胞、分生孢子(无性孢子)、子囊果、闭囊壳或子囊孢子(植物外的有性孢子)的形式。作为替代，与dsRNA接触的真菌细胞可以是处于植物细胞之内生活阶段的植物病原体真菌细胞，例如病原体形式，如侵染钉(penetration peg)、菌丝、孢子或吸器。
根据本发明的另一些实施方案，dsRNA可充分接触有害生物细胞或有害生物物种，该情况下dsRNA转移表示与包含dsRNA或dsRNA构建体的组合物接触。
根据另一个实施方案，dsRNA在细菌或真菌细胞中表达，并且细菌或真菌细胞被有害生物物种吸收或摄食。根据另一个实施方案，从表达dsRNA的细菌或真菌细胞中分离或纯化dsRNA，并且将dsRNA作为杀虫剂或以杀虫制剂的形式提供给有害生物物种。
特别适合的靶基因是参与靶物种中必需生物通路的基因，这表明所述靶基因是靶物种的必需基因并且所述靶基因的基因沉默对靶物种的活力、生长和/或发育有不利作用。适合的靶基因包括与宿主中有害生物物种的感染、繁殖或发病相关的基因。
被串联体构建体靶向的靶基因的选择单个串联体构建体所靶向的靶基因的选择，有赖于靶生物中待沉默的靶基因的选择，以获得期望的有害生物防治作用。对于此处如下设计的串联体，从一种或多种以下类型基因中选择靶基因1.“必需”基因，包括对一或多种靶生物关键的基因，并且当其沉默时导致致死性或严重的(如运动、摄食、瘫痪、饮食、生育力)表型。选择强的致死性靶基因导致强效的RNAi作用。本发明的串联体构建体中，将靶向相同或不同的非常有效的致死基因的多重dsRNA片段联合来进一步增加dsRNA在有害生物防治中的效力、作用或速度。
2.“致病性基因”，是参与有害生物致病性或侵染性的基因。靶向所述基因可降低有害生物的致病性或侵染性，因而保护被感染的生物对抗有害生物侵染。
3.“弱”基因，包括具有特别关注功能的靶基因，但当其单独沉默时导致弱的表型作用。靶向具体的但是弱的靶基因导致特异性RNAi作用，表明该作用模式非常集中且可控的。例如，令人关注却弱的基因可以是严格物种特异性的、或甚至是物种限定性的基因，但是当其被独立地靶向时不产生有效的RNAi作用。本发明的串联体构建体中，联合靶向单个或不同弱基因的多重dsRNA片段可以获得更强的RNA作用。
4.“有害生物特异性”基因，包括在非有害生物中没有基本同源的对应部分的基因，这可以通过生物信息学同源性搜索确定，例如通过BLAST搜索。选择有害生物特异性靶基因导致物种特异性RNAi作用，在非靶生物中没有作用或基本没有(不利)作用。
5.“保守基因”，包括在靶生物和非靶生物之间(氨基酸水平)保守的基因。一些靶基因可能是非常RNAi有效的，但可能在生物之间很保守。为了降低对非靶物种的可能作用，分析这些有效但保守的基因，并选择这些保守基因的可变区被此处示范的本发明串联体构建体中dsRNA片段所靶向。在此，在核酸序列水平评价保守性。这些可变区因而包括所述保守靶基因的最小保守部分。
6.“保守通路”基因包括参与相同生物通路或细胞过程的基因，或包括在不同物种中有相同功能的基因。
a.这些“保守通路”靶基因的优选实例是参与重要细胞通路或功能的基因，所述通路或功能是RNAi敏感的，如，但不限于内吞作用、细胞骨架、细胞内和细胞间转运、钙结合、核输入和输出、核酸结合、信号肽酶-蛋白质结合、蛋白酶体、蛋白质翻译、囊泡运输、神经-传递、水平衡、离子平衡、基因转录、剪接、有丝分裂、减数分裂、染色体结构、稳定性或完整性、微RNA、siRNA、翻译后蛋白质修饰、电子转运、代谢(合成代谢或分解代谢)、凋亡、膜完整性和细胞粘附。
b.在一个实施方案中，根据本发明的串联体构建体靶向相同生物通路中的多个基因，导致特异性和强效的RNAi作用以及更高效的有害生物控制。
c.作为替代，根据本发明的串联体构建体靶向不同生物通路的多个基因，导致广泛的细胞RNAi作用以及更高效的有害生物控制。
d.作为替代，b)和c)联合。
被串联体构建体中dsRNA片段靶向的靶序列的选择靶基因一经选定(或选择多个靶基因)，从这个或这些靶基因中选择要被串联体构建体中dsRNA片段靶向的一个和更多特定靶序列。本发明的串联体构建体中，这些靶序列的选择基于如下的一种或多种选择标准1.串联体构建体中dsRNA片段所靶向的靶序列与非靶生物不具有实质性核苷酸序列同源性。优选标准是靶序列与人类序列不具有实质同源性和/或与宿主植物序列以及在植物内共生的生物(如植物共生细菌)不具有实质同源性。根据本发明的宿主植物的非限定性列表包括例如玉米、棉花、番茄、马铃薯、香蕉、油菜(canola)、向日葵、苜蓿、小麦、水稻、高粱、粟和大豆。
2.串联体构建体中dsRNA片段所靶向的靶序列选自包含最优预测siRNA的靶基因的区域，所述预测例如可以根据“Tuschl法则”(Yuan et al.“siRNASelection Serveran automated siRNA oligonucleotide prediction server”，W130-W134，Nucleic acid research，2004，vol.32，Web server issue)。基本上该标准涉及确定DNA的％GC含量相对％AT含量。优选地，本发明串联体构建体中dsRNA片段所靶向的靶序列具有从约40％到约60％的GC含量，更优选地，GC含量约50％。作为替代，选择siRNA序列的预测可发现于Strom and Snve 2004(“A comparison of siRNA efficacypredictors”，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol 321(1)247-253)；Chalket al.2004(“Improved and automated prediction of effective siRNA.”，Biochem.Biophys.Res.Commun.319(1)264-74)；Levenkova et al.2004(“Gene specific siRNA selector.”，Bioinformatics.20(3)430-2)；Reynolds etal.2004(“Rational siRNA design for RNA interference.”，Nat Biotechnol.22(3)326-30)；Henschel et al.2004(“DEQORa web-based tool for thedesign and quality control of siRNA.”，Nucleic Acids Res.(Web Serverissue)W113-20)。
3.串联体构建体中dsRNA片段所靶向的靶序列在靶基因的保守区中(核苷酸水平)。这些保守区通过比较相同和/或不同物种的同源基因序列来确定。同样地，在同一和多物种中多个基因家族成员可被下调。
4.作为替代，串联体构建体中dsRNA片段所靶向的靶序列是靶基因的非保守区(理由如此前所解释)。
将多重dsRNA片段并入一个串联体构建体中的方式所有以上给出的针对靶基因选择和靶序列选择的选项可容易地互相组合。靶向这些靶基因和靶序列的相应dsRNA片段(或区)可以多种方式组合入串联体构建体中。本发明的串联体构建体中，使用了以下一种或多种组合dsRNA片段的方式(另见

图1和20)
1.当结合靶向单个靶基因的多重dsRNA片段时，可以在串联体构建体中按原始次序(即，片段在靶基因中出现的次序)组合，2.作为替代，可忽略片段的原始次序，打乱它们的次序，并随机或以任意排列次序组合在串联体构建体中，3.作为替代，单个片段可以在串联体构建体中重复多次，例如，1到10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或4.可以按正义或反义方向组合dsRNA片段(靶向单个或不同靶基因)。
串联体构建体中组合dsRNA的可能性特别利于避免与串联体构建体中多重dsRNA片段连接处非靶序列的偶然重叠。例如，当组合两个与非靶生物没有同源性的超过20个连续核苷酸的片段时，可能在连接处出现可能与非靶生物有同源性的超过20个连续核苷酸范围的新序列。在此情况下，此处所述的串联体设计允许将dsRNA片段转变为另一个方向(如从正义转变为反义)和/或允许改变片段的次序(如在串联体构建体中从A-B转变为B-A)来克服该问题。
此外，有利的是，在最终串联体构建体的核苷酸序列中，没有产生植物剪接受体和剪接供体位点。还建议在最终串联体构建体的核苷酸序列中不含大的ORF。
在串联体构建体中组合dsRNA片段的可能性还有利于克隆目的，因为独立的片段可以互相随机连接。
本发明的dsRNA构建体可以从包括自我互补区的单个RNA多聚核苷酸分子形成，使得当折叠时它能形成包括一个或更多个在RNAi基因沉默中有效的双链部分的结构。所述构建体还可以由两个或更多独立的多聚核苷酸链形成，所述多聚核苷酸链一起形成双链、折叠或组装的结构，其包括至少一个在RNAi基因沉默中有效的双链部分。如附图所示，当折叠或组装时，所述RNA构建体可包括双链和单链区。RNA构建体可包括非天然碱基和/或非天然骨架连接。
包含多重dsRNA片段的dsRNA或dsRNA构建体在本文中通常可称作串联体。呈双链的具体片段还称作“部分”。所述部分含有一个或多重dsRNA片段。
本发明的串联体和/或稳定化构建体以及方法尤其可用于同时组合多重靶序列。这些多重序列可源自一个靶基因。作为替代，所述多重靶序列可源自多个靶基因。这些多个靶基因可源自一个和相同的有害生物物种。作为替代，这些多个靶基因可源自相同或不同目的不同有害生物物种。这些多个基因可以是相关的，例如可以是同源物或异种同源物，或不相关的。因此，本发明的一个串联体dsRNA构建体，例如以茎形串联体、发夹串联体或三叶草形串联体的形式，可同时靶向源自相同有害生物物种的多重序列，或可同时靶向来自相同有害生物物种的多重靶基因，或可同时靶向相同或不同目的多种有害生物物种的多重靶基因。
本发明因此包括包含至少两个dsRNA片段的分离的dsRNA或dsRNA构建体，其中每个dsRNA片段包含与不同(如截然不同)靶序列的至少部分核苷酸序列互补的链。在一个实施方案中，所述不同的靶序列源自单个(或相同)靶基因。另一个实施方案中，所述不同的靶序列源自不同(如截然不同)靶基因。
根据本发明的一个具体实施方案，所述串联体靶向源自多个物种的多重靶基因。例如，一个串联体可以靶向来自多种植物有害生物的多个基因，并且通过在植物中表达所述串联体，所述植物同时获得对多种植物有害生物的抗性。相似地，可以用包含dsRNA串联体的组合物(等)喷洒对有害生物侵染易感的植物或表面或物质，从而保护所述植物或表面或物质抵抗多种有害生物的侵染。例如，植物获得抗线虫和昆虫的抗性，或抗线虫、昆虫和/或真菌的抗性。所述串联体构建体还允许植物获得抗不同属、科、目或纲的多种线虫的抗性，和/或抗不同属、科或目的昆虫的抗性，和/或抗不同属、科或目的真菌的抗性。
本发明的另一个实施方案中，所述串联体靶向源自相同目不同物种的多重靶基因。例如，靶向不同细菌、病毒、真菌、昆虫或线虫物种的基因的串联体可用作有效且广谱的细菌、病毒、真菌、昆虫杀虫剂或广谱线虫杀虫剂。将靶向来自不同有害生物物种的多重靶序列的dsRNA片段组合到根据本发明的一种串联体构建体中有利于扩大所述dsRNA分子RNAi作用的有害生物物种谱。
本发明的另一个具体实施方案中，所述串联体靶向源自相同生物例如来自相同有害生物物种的多个靶基因。这些构建体提供一种优点来自相同生物的多个弱靶基因可以被一起沉默以便高效控制所述有害生物，而分开沉默一个或更多个弱靶基因不能有效控制所述有害生物。并且，为进一步改进有害生物控制的效果，或避免因突变引起的有害生物抗性，可同时沉默来自相同生物的几个强靶基因。
本发明因此包括如上述的分离的dsRNA或dsRNA构建体，其中所述不同靶基因源自单个靶(或有害生物)物种，或其中所述不同靶基因源自截然不同的靶(或有害生物)物种；例如属于相同(一个实施方案中)或不同(另一个实施方案中)属、科、目或甚至门的有害生物物种。
此处所述并靶向多个靶基因的dsRNA构建体，特征在于积累了多重RNAi能力，导致协同作用，并且能在靶细胞或靶生物中激发多重RNAi作用。
图3显示本发明的不同dsRNA核心类型，其形成此处所述的串联体和/或稳定化dsRNA构建体的一部分。在dsRNA核心类型A中，重复的单基因片段可以与靶基因序列或非靶基因序列互补。在dsRNA核心类型B中，所述多基因片段可以以正义或反义方向存在，并且源自单个靶基因或源自不同靶基因，例如来自相同物种或来自不同物种。dsRNA核心类型B因此代表茎形式的基本串联体。
在dsRNA核心类型C中，正义或反义链例如在每～21bp片段中包含5至7个突变。这些突变例如可以是C到T突变。反义或正义链不包含突变并且与靶基因mRNA 100％互补。该类构建体将提供保护免受所述转基因的转录性基因沉默。在该类构建体中可以包括单和多基因片段。
稳定化构建体根据本发明的另一个实施方案，提供能形成在RNAi基因沉默中有效的双链RNA(dsRNA)部分的基本纯的核糖核酸(RNA)构建体，所述RNA构建体包含至少一个能保护所述dsRNA(部分)免受RNA加工的序列。
更具体地，本发明涉及包含至少一个dsRNA片段的分离的RNA构建体，其中所述dsRNA包含退火的互补链，其中之一与靶序列的至少部分核苷酸序列互补，所述RNA构建体还包含至少一个保护所述dsRNA免受RNA加工的序列。本发明还包括包含上述任意(串联体)dsRNA分子的分离的RNA构建体，所述RNA构建体还包含至少一个保护所述dsRNA(或dsRNA部分)免受RNA加工的序列。
“免受RNA加工”表示阻止或阻碍或抑制RNA加工。根据本发明的一个实施方案，构建体在宿主细胞中被保护，尤其是在植物细胞和/或植物有害生物物种中被保护。
每当描述稳定化或受保护的构建体时，术语“核心”表示dsRNA部分，所述核心可以包含至少一个dsRNA片段或可以包含多重dsRNA片段，例如，如上详细描述的串联体。
本发明还涉及分离的RNA构建体，其中所述至少一个(能)保护dsRNA免受RNA加工的序列选自富含GC的夹、4至100个核苷酸之间(例如4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90个核苷酸)的短非互补环、错配锁和蛋白质结合RNA结构。
在本发明的一个实施方案中，能保护dsRNA部分免受RNA加工的序列还称作“锁”(lock)。
根据本发明的锁的实例如下给出1.“富含GC”的夹(见图2A)，是具有与包含多个(连续)C残基的互补链碱基配对的多个(连续)G残基的一段核苷酸。富含GC的夹的碱基对组成可以变化并且富含GC的夹的长度可以在约5bp至约1000bp变化。
2.能保护RNA免受RNA加工的“非互补环”(见图2B)，是例如长度为约3nt至约100nt，优选小于9nt，更优选约4nt或约5nt。所述序列可随机选择或者与特异性序列如(保守)miRNA同源。
3.“错配锁”(见图2C)，是其中有些核苷酸未碱基配对的dsRNA。在错配锁中，仅有足够允许正确dsRNA配对的匹配包括在所述dsRNA中(优选约67％至74％的碱基是配对的)。错配主要由相对于另一条链在一条链上的插入或缺失组成。类病毒(例如来自马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、鳄梨日斑类病毒科(avsunviroidae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnavirus family)、丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus)、马铃薯纺锤形块茎类病毒(potato spindle tuber viroid)、鳄梨日斑类病毒(avocadosunblotch viroid)或柑桔裂皮病类病毒(citrus Exocortis Viroid))可用作设计减缓dsRNA在宿主物种中加工的错配锁的天然的优异实例。
错配锁的一个实例是包含如Chang et al.(J Virol.2003Nov；77(22)11910-7)中所述序列的锁，该文件作为参考并入此处。这些序列来源于马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)、鳄梨日斑类病毒(ASBVd)或人丁型肝炎病毒(HDV)RNA，分别有70％、67％和74％的预测分子间碱基配对，并且是抗dicer活性的。这些序列在Chang et al.的图4中有描述，并且每个可独立地、或相互组合作为本发明构建体中的锁。因此，本发明还包括适用于RNA沉默的dsRNA构建体，作为能保护所述dsRNA免受RNA加工的序列，所述构建体包含上述HDV序列、PSTVd序列、ASBVd序列或者HDV-PSTVd-ASBVd或HDV-ASBVd-PSTVd的组合。这些单个错配锁的实例如图2C所示，以及组合的错配锁的实例。
错配锁的另一个实例是与靶物种的靶序列互补的dsRNA，其包含约70％的分子间碱基配对。例如，反义链不包含突变并且与靶序列100％互补，而正义链包含引起dsRNA中错配的约30％突变。
4.锁的另一个类型是蛋白质结合RNA结构。这些RNA序列被蛋白质所识别并被蛋白质结合，优选表达根据本发明的dsRNA构建体的宿主细胞的内源性蛋白质。当这些锁被结合蛋白所占据时，它们保护dsRNA部分免受RNA加工。这些“蛋白质结合RNA锁”的实例是IRES；病毒基因组的5’区；IRE；植物dsRNA结合结构域(如Hyl-1-样结构域)；内源性ssRNA结合蛋白(或结构域)(如转录因子、翻译因子、核糖体组分、SRP、PTB结构域等)；及其他；前提是它们以不干扰野生型蛋白质功能的方式被转基因表达。
“IRES”是内部核糖体进入位点。包含dsRNA构建体的IRES的一般代表如图2E所示。SEQ ID Nos1至7所示序列表示CrPV-样病毒的IRES序列。蟋蟀麻痹病毒样(CrPV-样)IRES序列HTH是IRES的一个合适实例。包封的核苷酸来源于如下病毒genbank核苷酸序列PSIVAB006531、nt6005-6204；HiPVAB017037，nt 6286-6484；DCVAF014388，nt6078-6278；RhPVAF022937，nt 6935-7121；TrVAF178440，nt 5925-6123；CrPVAF218039，nt 6029-6228；BQCVAF183905，nt 5647-5848(Kanamoriand Nakashima，RNA.20017(2)266-74)。识别标题汇编如下<Genbank登记号><起始位置><终止位置><物种名称>。
本领域技术人员可以发现其他适合的IRES序列。优选IRES序列可被不同生物的核糖体识别，优选被来自植物或植物有害生物物种的核糖体识别。植物IRES序列的实例是文件WO03/020928所述的拟南芥(Arabidopsisthaliana)、金灯藤(Cuscuta japonica)、葫芦藓(Funaria hygrometrica)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)或玉米(Zea mays)的IRES序列，该文件，包括所述IRES序列，通过参考一道并入此处，如同完全列出一样。IRES序列掺入本发明的构建体中，如SEQ ID No18至21所示的构建体中。
用作本发明构建体中锁的病毒5’区或其片段的一个实例在Miller et al.(1998.J.Mol.Biol.284(3)591-608)中得以描述和说明。本发明包括的IRES序列的其他实例在例如Spahn et al.(2004.Cell 20118(4)465-475)中得以描述和说明。此外，病毒的3’区或其片段也可用作锁。
“IRE”表示铁调控元件。适用于本发明构建体中锁的一种IRE是Kaiseret al.(Plant J.2003，35(3)，295-304)所述的来源于大豆NRAMP同源物GmDMT1的IRE元件。该文件通过参考并入此处并且所述IRE的序列如SEQ ID NO8所示。
蛋白质结合RNA锁的其他实例是RNA结合蛋白识别的RNA序列，描述于例如Lorkovic和Barta(Nucleic Acids Res.2002 Feb 1；30(3)623-35)中。在此描述来自开花植物拟南芥的RNA-结合蛋白，其具有RNA识别基序(RRM)或K同源(KH)结构域。这些蛋白质识别的相应RNA序列可以通过本领域技术人员公知的技术进行克隆，例如通过单杂交技术图4表示根据本发明的优选构建体。
根据另一个具体实施方案，本发明涉及如前所述的分离的RNA构建体，其包含选自脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入序列(IRES)和N-ras上游(UNR)的至少一个保护序列。在一个实施方案中，包含至少部分EMCV-IRES序列的序列如SEQ ID NO13所示。包含至少部分EMCV-IRES序列的构建体如SEQ ID Nos18和19所示。另一个实施方案中，包含至少部分UNR-IRES序列的序列如SEQ ID NO14所示。包含至少部分UNR-IRES序列的构建体如SEQ ID Nos20和21所示。
EMCV病毒基因组的IRES序列如Genbank登记号NC_001479所示；人UNR基因组的IRES序列如Genbank登记号NM_001007553所示。因此本发明涉及全IRES序列或其功能片段在上述包含dsRNA片段的RNA构建体中的用途。
本发明范围内包括任何上面提及的锁互相组合来形成复合锁。这些复合物的具体实例是如图所示的封闭GC夹或封闭错配锁。
锁的长度，在双链锁情况下可以从约3个碱基对至约10000碱基对变化，或在单链锁情况下从3nt至约10000nt。锁的额外优点在于对宿主细胞的RNA加工系统造成立体阻碍。
本发明构建体中锁的位置可以位于dsRNA极端的末端位置或者嵌在dsRNA中(之内)某处。因此，所述锁的位置和数目可以变化。在茎形(或串联体)RNA核心的情况下，优选在dsRNA部分的极端(边缘)存在2或4个锁。在多茎“三叶草”dsRNA核心类型的情况下，优选存在一个锁或锁的组合作为第四茎(参见例如图5的构建体1和2)。
保护dsRNA免受RNA加工的另一个机制是，将在基因沉默中有效的dsRNA片段嵌入天然存在的更大RNA结构中，并且所述更大RNA结构一般不被加工或者在其天然环境下表现较少被加工。这种天然的、不加工的RNA的实例是miRNA、tRNA、核糖体RNA、剪接体组分或从RNA聚合酶I、II或III启动子转录的其他非编码RNA。因此，本发明范围内包括包含与靶序列例如植物有害生物靶序列互补的dsRNA片段的天然的、未加工的RNA，并且其能沉默靶基因的表达。有利地，这些构建体可以为能沉默基因的dsRNA提供伪装，并且有助于在宿主细胞中稳定所述dsRNA片段。该方法可以与此处示例的任何dsRNA核心类型和/或此处示例的任何能保护dsRNA免受RNA加工的其他序列和/或此处示例的任何连接子相组合。
根据本发明的保护dsRNA免受RNA加工的另一个机制是所谓的“三重RNA”构建体。所述三重RNA构建体包含由两个独立RNA链编码的3条平行RNA链，其中第一条RNA链从5’到3’包含(a)与靶序列对应的正义RNA核心链(核心)，随后是(b)第二正义RNA区(B)，随后是(c)长的非互补环，所述环a.比所述核心RNA、(B)RNA区和(A)RNA区一起的长度还长，以及b.任选地包含以上所述的锁，如IRES，c.随后是(b)第三正义RNA区(A)，并且其中第二条RNA链从5’到3’包含(a)与正义RNA区(A)互补的反义RNA区(A)，(b)与所述靶序列对应并且与所述正义核心RNA互补的反义RNA核心链，(c)与正义RNA区(B)互补的反义RNA区(B)保护dsRNA免受RNA加工的另一个机制是将dsRNA核心嵌入类病毒样dsRNA结构中，这描述和举例说明于例如Navarro和Flores(2000EMBOJournal 19(11)p 2662)中。所述dsRNA可以掺入如此的类病毒中，或掺入突变以避免内部切割(例如被核酶)或避免翻译的类病毒中。突变可以基于出自Dais et al.(1991，NAR 19(8)，p 1893)的信息。这些类型的构建体可以转运至叶绿体，在此其可以获得免受dsRNA加工的额外保护。
保护dsRNA免受加工的另一个机制是传递dsRNA的信号至宿主细胞的细胞内区隔。例如在dsRNA转移至靶宿主细胞前，可以先将其区隔化在中间宿主细胞中。具体而言，在dsRNA构建体转移至植物有害生物物种例如植物有害生物线虫或昆虫以前，可以先区隔化在植物细胞中，例如其可以位于叶绿体、线粒体或质体中。可以多种方式实现区隔化，如，例如通过使用类病毒结构，或通过使用信号序列，例如叶绿体、线粒体或质体信号序列。这些细胞器是原核起源的，并且可提供免于植物RNA加工机制的保护性环境。
保护dsRNA免受RNA加工的另一个机制是分别表达正义和反义，并且将它们靶向到表达所述正义和反义链的宿主内的不同位置。在这个实施方案中，与特定有害生物物种的选定基因对应的正义和反义mRNA片段被克隆在不同启动子之后，驱动在以下定位处的表达(i)独立的植物组织或(ii)在相同细胞内但是在独立的细胞区隔中。这些启动子是组织或细胞器特异性的，并且允许在不同细胞区隔或临近组织中同时大量表达。
例如，所述正义和反义链可以靶向到不同的植物组织、不同的细胞类型，或不同的亚细胞细胞器或不同的亚细胞定位。例如，在叶子中，正义链可以在神经细胞中表达，而反义链在栅栏组织中表达。该技术的优势在于，在植物细胞中正义和反义链从不在一起，因此在植物中不会发生Dicer引起的降解或自我沉默或RNA干扰。当有害生物摄食所述植物时，所述链被释放并混合，允许dsRNA在内脏腔内退火，并且可以发生正义和反义链之间的碱基配对而形成长dsRNA。随后该dsRNA可被高效吸收并导致期望的RNAi反应，导致靶mRNA在有害生物中降解以及有害生物的死亡。
该方法可以通过将两个细菌株喂给有害生物物种来实施，例如它们存在于组合物中，一株产生正义链，另一株产生反义链。
根据本发明的另一个实施方案，包括此处所述任何dsRNA分子或RNA构建体，其能形成可有效用于基因沉默的dsRNA部分，还包含至少一个连接子；例如所述连接子选自条件性自我-切割RNA序列，如PH敏感连接子或疏水敏感的连接子，以及内含子。
在本文所述锁存在时，所述连接子的功能可以是在基因沉默之前将锁释放，导致dsRNA构建体被中间宿主细胞或靶宿主细胞进行RNA加工。当锁不存在时，例如在串联体构建体自身内不存在时，连接子的功能可以是使多重dsRNA片段解偶联并且将长dsRNA分成在基因沉默中有效的片段。有利地，在该情况下，连接子序列可以促进长dsRNA在特定条件下分成片段，导致独立的dsRNA片段在这些条件下释放并且通过这些更小的dsRNA片段导致更高效的基因沉默。
本发明提供dsRNA构建体的不同连接子类型。
“条件性自我切割连接子”是在某些条件下能被加工的RNA序列。
1.合适的条件性自我切割连接子的一个实例是在低pH条件下自我切割的RNA序列。Jayasena和Gold(Proc Natl Acad Sci USA.1997 Sep 30；94(20)10612-7)描述了这种RNA序列的合适实例，该文件通过参考并入此处。这些是通过克隆随机序列获得并通过SELEX方案(systematicevolution of ligands by exponential enrichment；Gold et al.，1995.Ann.Rev.Biochem.64763-797)筛选的合成序列。
2.合适的条件性自我切割连接子的其他实例是在高pH条件下自我切割的RNA序列。Borda et al.(Nucleic Acids Res.2003 May 15；31(10)2595-600)描述了这种RNA序列的合适实例，该文件通过参考并入此处。一种合适的连接子序列源自锤头形核酶HH16的催化核心。根据本发明的一个具体实施方案，上面提及的pH依赖性的自我切割连接子用在设计用于在植物中生产来控制有害生物的构建体中。此处所述连接子可用于在有害生物中隔开稳定化构建体的锁或隔开串联体构建体的多重dsRNA片段。根据一种具体实施方案，有害生物物种有内脏(gut)系统，如，例如线虫和昆虫，并且所述连接子在这些有害生物物种，如植物有害生物物种，的内脏中是自我切割的。内脏中的pH范围从极酸到极碱可变。用于该技术的特别感兴趣的有害昆虫物种是二化螟(stem borer)或例如烟草蚜虫。
3.作为替代，连接子在内体中自我切割。这在本发明的构建体通过内吞或转胞吞作用被有害生物吸收，并因而被区隔化到有害生物物种的内体中时是有利的。内体可以有低pH环境，导致连接子的切割。
4.合适的条件性自我切割连接子的其他实例是在疏水条件下自我切割的RNA序列。Riepe et al.(FEBS Lett.1999 Aug 27；457(2)193-9)中描述了这些RNA序列的合适实例，该文件通过参考并入此处。高度特异性自我切割反应发生在胶团的疏水内部。这些RNA序列来源于锤头和发夹形核酶。
当用于通过细胞壁转运从一个细胞转移到另一细胞时，例如跨过植物有害生物的细胞壁时，上面提及的疏水条件下自我切割的连接子尤其可用于本发明的dsRNA构建体。用于该技术的特别感兴趣的昆虫有害生物物种是植物寄生真菌和植物寄生病毒和细菌。
内含子也可用作连接子。此处所用的“内含子”可以是信使RNA的任何非编码RNA序列。用于本发明构建体中特别合适的内含子序列(1)是富含U的(35-45％)；(2)平均长度为100bp(在约50至约500bp之间变化)，其碱基对可随机选择或可基于已知内含子序列；(3)从具有-AG:GT-或-CG:GT-的5’端开始和/或(4)在其3’端具有-AG:GC-或-AG:AA。
根据本发明，连接子序列可存在于dsRNA片段之间或不存在。例如，当存在时，连接子可包括不与靶序列互补的短随机核苷酸序列，但这是由于克隆造成的。在其他实施方案中，例如当包括dsRNA片段的dsRNA是化学合成的时，dsRNA片段可以彼此紧挨着，不存在非靶序列。
自身非互补RNA序列也可用作连接子，其可以是从约1个碱基对至约10000个碱基对，例如至少10、20、30、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、1500、2000、3000、10000个碱基对，或之间的任何数目。
连接子可位于dsRNA构建体的边缘。作为替代，连接子可位于嵌在dsRNA中的不同dsRNA片段之间。此外，如图6所举例说明，多重连接子和多重锁可位于dsRNA构建体的边缘或之内。
根据一个具体实施方案，连接子邻接或靠近锁序列，更优选地连接子邻接或靠近每个锁序列。
本发明串联体和/或稳定化构建体的一个特征是在一个串联体和/或稳定化构建体之内可以组合多重dsRNA核心类型和/或可以组合多重锁类型和/或可以组合多重连接子类型。例如在三叶草结构中4个dsRNA茎的任何一个和多个可以包含GC夹或错配锁，此外四个dsRNA的任何一个或多个可以包含能保护RNA构建体免受RNA加工的非互补环。这还适用于根据本发明的哑铃结构，其中dsRNA茎的至少一个边缘包含能保护RNA构建体免受RNA加工的非互补环(见图7)。SEQ ID No9至12表示用于此处所述实例的不同DNA序列。这些序列代表具有对抗源自南方根结线虫(M.incognita)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、跳蚤(hopper)和稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的β-微管蛋白靶基因的正义和反义片段的哑铃构建体。这些构建体还包含pH敏感连接子(下划线)和短环(框)。本发明的哑铃RNA构建体还可以，在dsRNA茎的至少一个边缘，包含GC夹或错配锁。包含连接子和蛋白质结合RNA序列的dsRNA构建体的进一步实例如图8所示。
根据另一个实施方案，茎间碱基配对模块可包括在本发明的构建体中。这些茎间碱基配对模块有助于dsRNA在宿主细胞中的稳定性，并且允许复杂的dsRNA构建体紧密折叠。
根据另一个实施方案，在本发明的构建体内，可以包括能向有害生物物种递送dsRNA的部分。申请人的专利申请中描述了这种构建体，其以整体并入此处。在一个实施方案中，此处所述的dsRNA构建体还包含至少一个适配子(aptamer)。
术语“适配子”或“适配序列”，或“适配结构域”用在此处是同义的，并且是本领域技术人员公知的。这些术语涉及能够特异性结合广范围的靶分子如蛋白质或代谢物的合成核酸配体。如此处所用，适配子是能够以高亲和力和特异性识别几乎任何类型靶分子的寡聚核苷酸序列。在一个优选实施方案中，适配子特异性结合植物组织中的结构或有害生物物种中的结构。
根据一个实施方案，本发明提供包含适配子的dsRNA构建体，所述适配子将dsRNA靶向有害生物物种中的高亲和性结合位点。这些可以位于摄食有害生物的内脏上皮细胞，位于摄食有害生物体内的其他细胞或甚至位于例如以植物组织为食的真菌的相互作用细胞表面。
在本发明的某些实施方案中，dsRNA构建体因此可包含允许细胞内吞入有害生物内脏细胞如肠细胞的适配子。在另一个实施例中，适配子允许(或促进或使之能够)有害生物中从内脏内腔到体液(coelumic fluid)或血淋巴的转胞吞作用。在本发明的另一些实施方案中，dsRNA构建体可包含允许有害生物中细胞内吞入组织细胞，如，例如但不限于肌肉细胞、性腺细胞、神经细胞，的适配子。在另一个实施例中，适配子允许(或促进或使之能够)有害生物中从器官的内皮细胞衬里到所述器官内腔的转胞吞作用。在本发明的另一些实施方案中，dsRNA构建体包含至少两个适配子，例如一个允许(或促进或使之能够)有害生物中从内脏内腔到体液或血淋巴的转胞吞作用的适配子，另一个允许(或促进或使之能够)有害生物中细胞内吞入组织细胞的适配子。
作为替代，dsRNA可以与由不同模块组成的RNA递送分子共表达。这种递送模块可以由例如多肽序列组成，所述多肽序列包含(i)至少一个RNA-结合结构域，(ii)至少一个能够与细胞内吞和/或转胞吞受体分子结合的靶向多肽以及(iii)任选地至少一个肽连接子和/或至少一个纯化标签。
这种递送促进分子被用于促进双链RNA吸收和正确递送至以植物为食的有害生物中的合适靶位用于RNA干扰。术语“RNA递送模块”、“RNA递送分子”和“RNA递送载体”在此处用作同义词，表示结合至dsRNA介导的沉默分子的多结构域或多模块蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，由不同模块组成的RNA递送分子，包含至少一个RNA结合模块、至少一个能被内吞和/或转胞吞或能与细胞内吞和/或转胞吞受体分子结合的靶向模块、任选地至少一个用于将dsRNA结合模块和靶向模块连接的连接子、以及任选地包含纯化标签的模块。
所述RNA递送分子的一个模块是RNA结合结构域。
此处所用的“RNA结合结构域”可以一般地或特异地结合双链RNA，一般地或特异地结合单链RNA。所述RNA结合分子可以结构特异地结合dsRNA和/或ssRNA。
RNA结合蛋白的优选实例包括但不限于大肠杆菌噬菌体HK022 NUN蛋白、枯草杆菌(Bacillus subtilis)LicT蛋白，或噬菌体MS2衣壳蛋白或关键部分、或其同源物。
所述RNA递送分子的第二模块包含靶向模块。术语“靶向模块”和“靶向蛋白”在此处用作同义词，并且表示能够将所述RNA递送分子靶向至活的有害生物中靶向位点的蛋白质、或其关键部分、或同源物。
所述靶向模块优选包含能被内吞和/或转胞吞到有害生物细胞中的蛋白质，或能与有害生物细胞或组织上存在的内吞和或转胞吞受体分子结合的蛋白质，或其任意组合。
茎-环-茎结构dsRNA或能形成dsRNA的RNA的一个实例是发夹构建体。发夹或“茎-环-茎”结构是核酸分子，优选RNA核酸，按照5’至3’顺序包含第一链、环和第二链，其中所述第一和第二链在生理条件下互相杂交，并且所述环将所述第一链和所述第二链相连形成至少一个双链RNA区。
当一个dsRNA分子中存在不同的茎-环-茎结构时，所述茎-环-茎结构间的连接可以通过多种方式。
例如，它们可以被化学交联形成RNA复合物。作为替代，所述多重茎-环-茎结构用上述提及的连接子被遗传学相互连接。
在一个优选实施方案中，2至20个茎-环-茎结构可彼此连接成“球”结构。在一个更优选实施方案中，4个茎-环-茎结构彼此连接成三叶草结构，其中所述RNA构建体的5’和3’边缘形成第四个dsRNA茎部分。另一个实施方案中，本发明的三叶草结构可包含至少一个GC夹或错配锁或此处所述的其他类型锁。
根据本发明的串联体和/或稳定化构建体尤其可用于防治植物有害生物，更具体地，在选择性吸收dsRNA的植物有害生物中。例如，线虫对待吸收dsRNA的长度有选择性。已证明100个碱基对的片段不如200至500个碱基对的片段那样被高效吸收。而且真菌和昆虫也在dsRNA吸收方面有选择性。考虑到有些有害生物的dsRNA选择性吸收，此处所述dsRNA构建体的全部长度，当折叠或装配时，通常在17至20000个碱基对间，优选在21至1000个碱基对间。更优选地，所述长度至少是17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp或700bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或1500bp。更优选地，所述长度是约50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、或500bp。更为优选地，此处所述的任何dsRNA串联体和/或稳定化构建体的总长度是150bp、250bp或350bp。
因此，本发明涉及此处所述的任何分离的dsRNA或RNA构建体，其中dsRNA部分的长度在约17至2000个碱基对间，优选在约50至1000个碱基对间，更优选在约80至500个碱基对间。
靶物种和有害生物本发明所用的“靶物种”可以是任何物种。适合的靶物种选自包含以下的组病毒粒子、病毒、细菌、酵母、真菌、昆虫、原生动物、后生动物(包括线虫)、藻类、植物、动物(包括哺乳动物，包括人)。更为适合本发明方法的靶物种是有害生物，更具体的是植物有害生物，如线虫、昆虫、真菌、细菌和病毒。
根据一个具体实施方案，本发明涉及所述的任何分离的dsRNA或RNA构建体，其中靶序列或靶基因是植物有害生物(即靶物种)的。
此处所用的“线虫”包含线虫目(Nematoda)的物种。线虫的很多物种是寄生的并且引起人和动物(例如蛔目(Ascaradida)、尖尾目(Oxyurida)、圆线虫目(Strongylida)、类圆线虫目(Stronglyloides)以及毛首目(Trichocephalida)的物种)、以及植物和真菌(例如滑刃目(Aphelenchida)、垫刃目(Tylenchida)以及其他目的物种)的健康问题。优选地，此处所用“线虫”表示植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于，外寄生虫如剑线虫(Xiphinema spp.)、长针线虫(Longidorus spp.)、以及毛刺线虫(Trichodorus spp.)；半寄生虫如垫刃线虫(Tylenchulus spp.)；迁移性内寄生虫如腐线虫(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫(Radopholus spp.)、以及盾线虫(Scutellonerna.spp.)；定居寄生虫如胞囊线虫(Heteroderaspp.)、球胞囊线虫(Globodera spp.)、以及根结线虫(Meloidogyne spp.)、以及茎和叶内寄生虫如茎线虫(Ditylenchus spp.)、刃线虫(Aphelenchoidesspp.)、以及Hirshmaniella spp.。最优选地，此处所用“线虫”表示根寄生土壤线虫如胞囊线虫和球胞囊线虫属的成胞囊线虫以及根结线虫属的根结线虫。本发明的RNA构建体尤其适用于控制有害物种如黄瓜根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆根结线虫(Heterodera glycines)(大豆根结线虫)以及马铃薯胞囊线虫(Globodera rostochiensis)(马铃薯胞囊线虫)。然而根据发明的dsRNA构建体的用途决不限于这些属和种，还以相同方式扩大到其他线虫。
此处所用“真菌”包括真菌分类的所有物种。根据本发明的一个优选实施方案，所述靶基因源自植物寄生真菌如稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)(稻瘟病，之前称Magnaporthe grisae；anamorph Pyricularia oryzae Cay.以及Pyricularia grisae)；丝核菌(Rhizoctonia spp.)，尤其是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)以及稻丝核菌(Rhizoctonia oryzae)；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)；铁锈真菌(Sclerotinium spp.)；歧曲长蠕孢菌(Helminthosporium sigmoideum)；腐霉(Pythium spp.)；链格孢霉属(Alternaria spp.)，尤其是早疫病链格孢霉(Alternaria solani)；镰刀菌(Fusarium spp.)，尤其是腐皮镰刀菌(Fusarium solani)以及Fusariumgerminearum；小枝顶孢属(Acremoniella spp.)；稻小球腔菌(Leptosphaeriasalvinii)；柄锈菌属(Puccinia spp.)，尤其是小麦叶锈菌(Puccinia recondita)以及小麦条锈菌(Puccinia striiformis)；颖枯壳针孢(Septoria nodorum)；大麦网斑病菌(Pyrenophora teres)；Rhincosporium secalis；多囊丝壳属(Erysiphe spp.)，尤其是禾白粉菌(Erysiphe graminis)；芽枝霉菌属(Cladosporium spp.)；核腔菌属(Pyrenophora spp.)；腥黑粉菌属(Tilletiaspp.)；疫霉属(Phytophthora spp.)，尤其是致病疫霉(Phytophthorainfestans)；葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)；葡萄白粉病菌(Uncinulanecator)；灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；黑腐病菌(Guiguardia bidwellii)；C.viticola；苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)；Erwinia armylovora；白叉丝单囊壳菌(Podosphaera leucotricha)；梨黑星病菌(Venturia pirina)；层锈菌属(Phakospora sp)(大豆锈病)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米黑粉病)。
此处所用“昆虫”包括所有昆虫物种。根据本发明的一个优选实施方案，所述昆虫是破坏植物的昆虫。通过本发明方法防治的重要植物有害生物昆虫包括鞘翅目(coleoptera)的昆虫，例如选自非限制性列表稻水象甲(Lissorhopterus oryzophilus)、稻象甲(Echinocnemus squamos)、稻负泥虫(Oulema oryzae)、根萤叶甲属(Diabrotica spp.)(玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera virgifera)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctatahowardi)、北美玉米根叶甲(Diabrotica barberi))、玉米跳甲(Chaetocnemapulicaria)、玉米象(Sitophilus zeamais)、墨西哥棉铃象甲(Anthonomusgrandis)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、Cerotoma trifurcata、科罗拉多金花虫(Leptinotarsa decemlineata)。作为替代，待用本发明方法防治的植物有害昆虫属于同翅目。更具体地，所述同翅目昆虫选自以下非限定性列表褐飞虱(Nilaparvata lugens)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、二点黑尾叶蝉(Nephotettix virescens)、玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)、蚜虫属(Aphis spp.)、(棉蚜(Aphisgossypii)，大豆蚜(Aphis glycines))、小绿叶蝉属(Empoasca spp.)(蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，南方浮尘子(Empoasca solana))、烟粉虱(Bemisiatabaci)、桃蚜(Myzus persicae)、大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)。待用本发明方法防治的植物有害昆虫也可以属于Leptidoptera，例如选自以下非限定性列表实夜蛾属(Heliothis spp.)、铃夜蛾属(Helicoverpa spp.)、灰翅夜蛾属(Spodoptera spp.)、秆野螟属(Ostrinia spp.)、Pectinophora spp、地老虎属(Agrotis spp.)、Scirphophaga spp.、纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocisspp.)、蛀茎夜蛾属(Sesamia spp)、陲夜蛾属(Chilo spp.)、干煞夜蛾属(Anticarsia spp.)、Pseudoplusia spp.、Epinotia spp.、和Rachiplusia spp.，优选烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、Helicoverpa punctera、Ostrinia nubilafis、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Scirphophaga incertulas、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、大螟(Sesamia inferens)、斑禾草螟(Chilopartellus)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、夜小卷蛾(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu。本发明的RNA构建体尤其适用于防治有害物种，如稻褐飞虱(褐飞虱)、稻斑纹二化螟(Chilo suppressalis)和科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa delineata)。
破坏植物并能用本发明的构建体和方法防治的“细菌”例如是农杆菌属(Agrobacterium ssp.)、蛛网菌属(Arachnia ssp.)、棒形杆菌属(Clavibacterssp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium ssp.)、欧文氏菌属(Erwinia ssp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium ssp.)、哈夫尼亚菌属(Hafnia ssp.)、假单胞菌属(Pseudomonas ssp.)、螺原体属(Spiroplasma ssp.)、链霉菌(Streptomycesssp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas ssp.)、XyIeIIa ssp.和嗜木质菌属(Xylophilus ssp.)。
破坏植物并能用本发明的构建体和方法防治的“病毒”例如是非洲木薯花叶病毒、苜宿花叶病毒、美洲离子线条病毒、安第斯马铃薯潜隐病毒、安第斯马铃薯斑驳病毒、苹果萎黄叶点病毒、苹果花叶病毒、苹果茎沟病毒、南芥菜花叶病毒、滇芎B病毒oca株、芦笋病毒2号、澳洲葡萄藤类病毒、鳄梨日斑病类病毒素、大麦和性花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、大麦黄矮病毒、大麦黄花叶病毒、菜豆普通花叶病毒、菜豆金色花叶病毒、菜豆卷叶病毒、菜豆荚斑驳病毒(缩写BPMV)、芸豆黄化花叶病毒、有芒鸢尾花叶马铃薯Y病毒、甜菜曲顶病毒、甜菜缩叶病毒、甜菜花叶病毒、甜菜坏死黄脉病毒、甜菜伪黄化病毒、Beet westem yellows virus、甜菜黄矮病毒、颠茄斑点病毒、Black rasberry latent virus、枯萎病(et analogues/enanaloge)、蓝莓叶条纹病毒、蚕豆萎蔫病毒、Bromoviruses、可可肿枝病毒、可可树黄花叶病毒、仙人掌X病毒、Cadan-cadang viroid、Camation crypticvirus、香石竹蚀环病毒、香石竹潜隐病毒、香石竹斑驳病毒、香石竹坏死斑点病毒、Camation ringspot virus、香石脉斑驳病毒、木薯普通花叶病毒、花椰菜花叶病毒、樱桃卷叶病毒、樱桃锉叶病毒、樱桃锉叶病毒(美洲)、Cherry rugose virus、菊花B病毒、Chrysanthenum stunt viroid、柑桔裂皮类病毒、柑桔曲叶病毒、柑桔花叶病毒、柑桔衰退病毒(欧洲分离株)、柑桔衰退病毒(非欧洲分离株)、Citrus variegation virus、Citrus veinenationwoody gall、Citrus viroids、芹菜黄脉病毒、Cocksfoot mild mosaic virusgroup、Cocksfoot streak virus、豇豆轻斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、Cucumberyellows virus、Cucumovirus satellites、兰花花叶病毒、大丽菊花叶病毒、芋头嵌纹病毒、Dianthoviruses、Echtes Ackerbohnenmosaic virus、Elderberry carlavirus、大戟花叶病毒、佛罗里达番茄病毒、阿尔及利亚葡萄潜隐病毒、保加利亚葡萄潜隐病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄金黄化病支原体、葡萄藤卷叶关联病毒(I至V)、Grapevine tunusian ringspot virus、葡萄病毒A、葡萄黄斑类病毒(I和II)、Grapewine chrome mosaic virus、Heracleurn latent virus、百子莲花叶病毒、忍冬潜隐病毒、Hop(American)latent virus、Hop latent virus、啤酒花花叶病毒、啤酒花矮化类病毒啤酒花病毒A、啤酒花病毒C、Hydrangea ringspot virus、Iliaviruses、鸢尾微斑花叶病毒、韭葱黄条纹病毒、Leprosis、莴苣传染性枯黄病毒、莴苣花叶病毒、Lilac chlorotic leafspot virus、Lilac ring mottle virus、Lilly symptomlessvirus、黄矮病毒卫星、玉米矮花叶病毒、玉米条纹病毒、Marafiviruses、甜瓜坏死斑病毒、Myrobolan latent ringspot virus、水仙潜隐病毒水仙花叶病毒、Narcissus tip necrosis virus、水仙黄条病毒、Oat golden stripe virus、燕麦花叶病毒、齿兰环斑病毒、橄榄潜隐环斑病毒、洋葱矮化病毒、番木瓜花叶病毒、番木瓜轮点病毒、欧防风黄点病毒、豌豆早枯病毒、豌豆肿突花叶病毒、豌豆种传花叶病毒、桃花叶病毒(美洲)、Pear declinemycoplasm、天竺葵卷叶病毒、辣椒轻型虎斑病毒、植物呼肠孤病毒、Plumline pattern virus(American)、李痘病毒、猩猩木花叶病毒、杨树花叶病毒病、马铃薯珊瑚状花叶病毒、马铃薯黑环病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯卷叶病毒(非欧洲分离株)、马铃薯帚顶病毒、马铃薯纺锤形块茎类病毒、马铃薯病毒A、马铃薯病毒A(非欧洲分离株)、马铃薯病毒M、马铃薯病毒M(非欧洲分离株)、马铃薯病毒S、马铃薯病毒S(非欧洲分离株)、马铃薯病毒T、马铃薯病毒X、马铃薯病毒X(非欧洲分离株)、马铃薯病毒Y、马铃薯病毒Y(非欧洲分离株)、马铃薯黄矮病毒、马铃薯黄花叶病毒、李矮缩病毒、李环斑病毒、覆盆子丛矮病毒、覆盆子卷叶病毒(美洲)、悬钩子环斑病毒、Raspberry vein chlorosis virus、Red clover mottle virus、红三叶草脉花叶病毒、长叶车前花叶病毒、水稻条纹叶枯病毒组、Rubus yeHownet virus、Saguro cacao virus Satellites(andere dan geciteerde)、蜜柑萎缩病毒、葱潜伏病毒、Sharka virus、Sobemoviruses、藜草花叶病毒、Sowthistleyellow vein virus、Spinach latent virus、南瓜曲叶病毒、Stolbur mycoplasm、草莓皱缩病毒、草莓潜伏C病毒、草莓潜隐环斑病毒、草莓轻性黄边病毒、草莓脉带病毒、Sugar beet yellows virus、Tater leafvirus、烟草蚀纹病毒、烟草花叶病毒、烟草坏死病毒、烟叶响尾病毒、烟草环斑病毒、烟草条纹病毒、烟草矮化病毒、番茄顶矮化类病毒、番茄不孕病毒、番茄黑环病毒、Tomato bunchy top viroid、番笳丛矮病毒、番茄花叶病毒、Tomato plantamacho viroid、番茄环斑病毒、番茄斑萎病毒、Tomato yellow leaf curf virus、土拉苹果花叶病毒、郁金香碎色病毒、芜菁皱缩病毒卫星、芜菁皱缩病毒、芜菁花叶病毒、芜菁黄花叶病毒、Tymoviruses、绒毛烟斑驳病毒、其他类病毒、西瓜花叶病毒2号、小麦矮缩病毒、土传小麦花叶病毒、小麦梭线条花叶病毒、小麦黄花叶病毒、白三叶草花叶病毒、薯芋花叶病毒、小西葫芦黄斑点病毒、和小西葫芦黄化花叶病毒。
重组DNA构建体根据本发明的另一方面，提供编码此处所述任何dsRNA或dsRNA构建体的分离的核酸(脱氧核糖核酸(DNA))。此外，本发明还提供包含所述核酸的重组DNA构建体，例如表达构建体。
所述表达构建体，也包括在表述“重组DNA构建体”中，有助于将编码根据发明的dsRNA构建体的核苷酸序列引入植物细胞和/或有助于其表达和/或有助于其维持。因此，提供包含编码此处所述dsRNA或RNA构建体的核酸的重组DNA构建体(如表达构建体)，其可操作性连接至一个或多个能驱动以上核酸表达的调控序列，和任选地转录终止序列。优选地，所述调控序列选自包含此处所述组成性启动子或组织特异性启动子的组。
因此，本发明还涉及编码此处所述的任何双链RNA或RNA构建体的转基因，它位于强的组成性启动子控制之下，如选自包含以下的组的任意启动子CaMV 35S启动子、双CaMV 35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、rubisco启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(FMV)34S启动子。
所述表达构建体可插入到商业可获得的质粒或载体中。根据本发明的一个实施方案，所述表达构建体是植物表达载体，其适于向植物中转化并适于在转化的植物细胞中维持和表达根据本发明的RNA构建体。
此处所用术语“调控序列”应以广义理解，表示能驱动和/或调节与其连接和/或可操作性连接的序列的表达的调节性核酸序列。前述术语包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或合成融合分子或其衍生物，称作激活子或增强子。此处所用术语“可操作性连接”表示启动子序列与感兴趣基因之间的功能性连接，使得启动子序列和感兴趣基因，使得启动子序列能启动dsRNA构建体的转录。根据本发明的一个实施方案，调控序列在植物中可操作；优选调控序列来源于植物序列。术语“调控序列”包括启动子或能在细胞、组织或器官中激活或增强核酸分子表达的序列。
通过实施例的方式，可将编码双链RNA或RNA构建体的转基因核苷酸序列置于诱导性或生长或发育阶段特异性的启动子控制之下，加入诱导型启动子的诱导剂或到达生长或发育的特定阶段时，启动子允许开启dsRNA的转录。
此外，当本发明的方法用于开发抗有害生物的转基因植物时，将编码根据本发明的双链RNA的核酸置于组织特异性启动子控制之下可以是有利的。为了改进dsRNA从植物细胞到有害生物的转移，植物可优选在植物有害生物首先接触或破坏的植物部分表达dsRNA。植物病原性有害生物情况下，表达dsRNA的优选组织是根、叶和茎。植物病原性吸虫的情况下，dsRNA可在指导表达的dsRNA定位到韧皮部的启动子控制下于韧皮部表达。因此，本发明的方法中，可以使用植物组织-优先的启动子，如根特异性启动子、叶特异性启动子或茎特异性启动子。根特异性启动子的合适实例是PsMTA(Fordam-Skelton，AP.，et al.，1997 Plant Molecular Biology34659-668.)和III型几丁质酶启动子。叶-和茎-特异性或者也被光活化的光合组织特异性启动子的实例是甜菜的两个叶绿素结合蛋白(cab1和cab2)的启动子(Stahl D.J.，et al.，2004BMC Biotechnology 2004431)、rbcS编码的核酮糖-二磷酸羧化酶(Rubisco)的启动子(Nomura M.et al.，2000Plant Mol.Biol.4499-106)、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)和B(gapB)亚基的启动子(Conley T.R.et al.1994 Mol.Cell Biol.192525-33；Kwon H.B.et al.1994 Plant Physiol.105357-67)、编码叶和茎特异性(ST-LS1)蛋白的马铃薯基因的启动子(Zaidi M.A.et al.，2005 Transgenic Res.14289-98)、茎调节的、防卫诱导基因的启动子如JAS启动子(专利
发明者马克·万·德·克雷恩, 格特·普莱廷克, 伊莎贝尔·韦尔科特朗, 马克·乔治斯·洛格厄, 蒂埃里·安德烈·奥利维耶·埃迪·博盖尔特, 理查德·兹瓦尔 申请人:德福根有限公司