专利名称：用肠杆菌科的细菌产生l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵产生L-氨基酸的方法，更具体地涉及有助于此发酵的基因。这些基因可用于改进L-氨基酸的生产，例如，L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产。
背景技术：
传统上，利用由天然来源获得的微生物菌株或其突变体通过发酵方法工业化生产L-氨基酸。通常，修饰所述微生物以提高L-氨基酸的产品收率(production yield)。
已经报导了许多提高L-氨基酸产品收率的技术，包括用重组DNA转化微生物(参见，例如，美国专利4,278,765)。其它提高产品收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对所得L-氨基酸的反馈抑制脱敏(desensitize)(参见，例如，WO 95/16042或美国专利4,346,170、5,661,012和6,040,160)。
用于通过发酵生产L-苏氨酸的菌株是已知的，包括涉及L-苏氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(美国专利5,175,107、5,661,012、5,705,371和5,939,307；EP 0219027)、对化学品如L-苏氨酸及其类似物有抗性的菌株(WO01/14525A1、EP 301572 A2、美国专利5,376,538)、具有对生产的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制脱敏的目标酶的菌株(美国专利5,175,107和5,661,012)、以及具有失活的苏氨酸降解酶的菌株(美国专利5,939,307和6,297,031)。
目前，已知的生产苏氨酸的菌株VKPM B-3996(美国专利5,175,107和5,705,371)是最好的已知的苏氨酸生产菌之一。为构建菌株VKPM B-3996，如下所述，将几个突变和质粒导入到亲本菌株大肠杆菌K-12(VKPM B-7)中。突变的thrA基因(突变thrA442)编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸的反馈抑制有抗性。突变的ilvA基因(突变ilvA442)编码活性降低的苏氨酸脱氨酶，其导致异亮氨酸生物合成速率降低和异亮氨酸饥饿的渗漏表型。在包含ilvA442突变的细菌中，thrABC操纵子的转录不被异亮氨酸所抑制，因此对于苏氨酸生产是非常有效的。编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因的失活阻止苏氨酸降解。将蔗糖同化的遗传定子(genetic determinant)(scrKYABR基因)转移到所述菌株。为增加控制苏氨酸生物合成的基因的表达，将包含突变的苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒pVIC40导入中间菌株TDH6中。在菌株发酵期间累积的L-苏氨酸的量能够多达85g/l。
通过优化所需化合物的主要生物合成途径，借助于为细菌补充更大量的糖例如葡萄糖作为碳源，可以完成对L-氨基酸生产菌株的进一步改善。不考虑PTS的葡萄糖转运效率，在高产菌株中获取碳源仍然可能是不充足的。
已知糖和其它代谢物向细菌细胞中的主动运输由几种转运系统完成。其中，来自大肠杆菌的XylE蛋白是D-木糖通透酶，大肠杆菌中两种系统的其中一个负责吸收D-木糖；另一个是ATP-依赖性ABC转运蛋白XylFGH。已显示克隆的xylE基因在体内补充xylE突变体(Davis，E.O.and Henderson，P.J.，J.Biol.Chem.，262(29)；13928-32(1987))。在整个细胞中XylE-介导的转运由质子载体(protonophore)所抑制，并引发碱性pH改变(Lam，V.M.等，J.Bacteriol.143(1)；396-402(1980))。利用xylE和xylF突变体的试验已证实对于D-木糖，XylE蛋白具有63-169μM的KM(Sumiya.M.等，Receptors Channels，3(2)；117-28(1995))。XylE蛋白是转运蛋白主要促进剂超家族(major facilitatorsuperfamily)(MFS)的成员(Griffith，J.K.等，Curr.Opin.Cell Biol. 4(4)；684-95(1992))，看起来作为D-木糖/质子同向转运蛋白(symporter)起作用。xylE基因可能构成单顺反子操纵子，其表达由D-木糖所诱导。输入的木糖在XylA(木糖异构酶)和XylB(木酮糖激酶)酶的作用下异化为5-磷酸木酮糖。在合适的条件下，由xylA基因编码的木糖异构酶还有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的转化(Wovcha，M.G.等，Appl Environ Microbiol.45(4)1402-4(1983))。
然而，迄今还没有利用肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的细菌增加L-氨基酸的生产的报导，所述肠杆菌科的细菌具有增强的D-木糖通透酶活性。
发明内容
本发明的目的是增加产生L-氨基酸的菌株的生产力，以及提供用这些菌株生产非芳族或芳族L-氨基酸的方法。
通过发现增加编码D-木糖通透酶的xylE基因的表达能增强L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生产而实现了该目标。由此完成了本发明。
本发明的目的是提供肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中所述细菌经改造以增强D-木糖通透酶的活性。
本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述D-木糖通透酶的所述活性通过增加编码D-木糖通透酶的基因的表达而增强。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中通过修饰编码D-木糖通透酶的基因的表达控制序列以增强基因表达，或者通过增加编码D-木糖通透酶基因的拷贝数，而增强D-木糖通透酶的所述活性。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强葡糖激酶的活性。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强木糖异构酶的活性。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌经修饰而增加了xylABFGHR位点的表达。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌选自下组菌属埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、和摩根氏菌属(Morganella)。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述基因编码选自下组的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质；和(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶的活性。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述编码D-木糖通透酶的基因包含选自下组的DNA(a)包含SEQ ID NO1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA；和(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO1中核苷酸1-1476的核苷酸序列或由所述核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质的DNA。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述严紧条件包括其中在60℃在1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下洗涤15分钟的条件。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-苏氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了选自下组的基因的表达-编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I并对苏氨酸的反馈抑制有抗性的突变thrA基因，-编码高丝氨酸激酶的thrB基因，-编码苏氨酸合酶的thrC基因，-编码推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意组合。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌经修饰增加了所述突变thrA基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表达。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-赖氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-组氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-苯丙氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-精氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供上述细菌，其中所述细菌为产生L-谷氨酸的细菌。
本发明的又一目的是提供产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌，使L-氨基酸在培养基中积累，并从培养基分离L-氨基酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述培养基包含木糖。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。
本发明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。
图1显示大肠杆菌染色体中xylE基因上游区域的结构，和包含cat基因和杂合PL-tac启动子的整合DNA片段的结构。
图2显示在含葡萄糖的培养基上生长的大肠杆菌菌株MG1655、MG1655ΔptsHI-crr和MG1655PL-tacxylE的生长曲线。图例MG＝大肠杆菌MG1655；MG Δpts＝大肠杆菌MG1655 ΔptsHI-crr；MG Δpts P xylE＝大肠杆菌MG1655ΔptsHI-crr PL-tacxylE。
本发明的优选实施方案本发明中，“产生L-氨基酸的细菌”指当在培养基中培养所述细菌时，具有在培养基中生产和分泌L-氨基酸的能力的细菌。可以通过培育而赋予或增强L-氨基酸生产能力。如本文所用的术语“产生L-氨基酸的细菌”还指能够以大于大肠杆菌如大肠杆菌K-12的野生型或亲本菌株的量生产并导致L-氨基酸在培养基中积累的细菌，优选指所述细菌能够导致在培养基中积累不少于0.5g/L量的，更优选不小于1.0g/L的目标L-氨基酸。术语“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、和L-谷氨酸是特别优选的。
肠杆菌科包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、Photorhabdus、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)等的细菌。具体地，可以使用依据NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)中所用分类法归类于肠杆菌科的那些。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”指依据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属的细菌。如用于本发明的属于埃希氏菌属的微生物的例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)。
可用于本发明的属于埃希氏菌属细菌没有特别限制；然而，例如Neidhardt，F.C.等描述的细菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，1208，表1)包括在本发明中。
术语“属于泛菌属的细菌”指依据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类于泛菌属的细菌。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)的一些菌种最近已被重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等等。(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。
本发明的细菌包括具有生产L-氨基酸的能力的肠杆菌科菌株，其经修饰增强了D-木糖通透酶的活性。此外，本发明的细菌包括具有生产L-氨基酸的能力而不具有D-木糖通透酶天然活性，并且已经用编码D-木糖通透酶的DNA片段转化的肠杆菌科的菌株。
短语“D-木糖通透酶的活性”指将糖如木糖和葡萄糖转运到细胞中的活性。可以通过补偿具有破坏的糖转运PTS-系统的细菌的生长延迟(参见，例如，实施例中描述的ΔptsHI-crr突变体)或者通过体内补偿xylE突变(Davis，E.O. and Henderson，P.J.，J.Biol.Chem.，262(29)；13928-32(1987))来检测D-木糖通透酶的活性。
短语“细菌经修饰增强了D-木糖通透酶的活性”指每个细胞的活性高于非修饰菌株例如野生型菌株的活性。这种修饰的例子包括增加每个细胞的D-木糖通透酶分子的数目，增强每个D-木糖通透酶分子的比活等。另外，可用于对比目的的野生型菌株包括例如大肠杆菌K-12。本发明中，作为增强D-木糖通透酶的胞内活性的结果，可以增加培养基中积累的L-氨基酸例如L-苏氨酸或L-精氨酸的量。
可以通过增加编码D-木糖通透酶的xylE基因的表达获得细菌细胞中D-木糖通透酶活性的增强。源自属于埃希氏菌属的细菌的任何xylE基因以及源自其它细菌如棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)的任意xylE基因可以用作本发明中的D-木糖通透酶基因。源自属于埃希氏菌属的细菌的xylE基因是优选的。
短语“增加基因的表达”指基因的表达量高于非修饰的菌株例如野生型菌株的表达量。这种修饰的例子包括增加每个细胞中基因的拷贝数，提高(一个或几个)基因的表达水平等等。例如，通过限制性处理染色体DNA，然后利用基于基因序列的探针进行Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等测定基因的拷贝数。基因表达水平可以用多种方法包括Northern印迹、定量RT-PCR等测定。另外，可以当作对照的野生型菌株包括例如大肠杆菌K-12或Pantoea ananatis FERM BP-6614(US2004180404A1)。Pantoea ananatis FERM BP-6614于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology))，给予保藏号FERM P-16644。然后依据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日将其转为国际保藏，给予保藏号FERM BP-6614。虽然该菌株在其被分离时被鉴定为成团肠杆菌，但如上所述，基于16S rRNA的核苷酸序列分析，已经将其重新归类于Pantoea ananatis。
作为增强D-木糖通透酶胞内活性的结果，提高了L-氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸或L-谷氨酸在培养基中的积累。
已经阐明了来自大肠杆菌的编码D-木糖通透酶，即D-木糖/质子同向转运蛋白的xylE基因(GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990的序列中的核苷酸编号4240277至4238802)。xylE基因位于大肠杆菌K-12染色体上yjbA ORF和malG基因之间。也阐明了另一个编码D-木糖通透酶的xylE基因(AAN45595.xylose-proton sym...[gi24054686]，AAM41050.MFS transporter...[gi21112853]野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XCC1759)。本发明中，来自大肠杆菌的xylE基因由SEQ IDNO.1表示。
一旦被转运到细胞中，葡萄糖就由葡糖激酶磷酸化，所述葡糖激酶由glk基因所编码。因此也希望改造所述细菌以使之具有增强的葡糖激酶活性。已经阐明了编码大肠杆菌葡糖激酶的glk基因(GenBank登录号NC_000913.1，gi16127994的序列中核苷酸编号2506481至2507446)。glk基因位于大肠杆菌K-12染色体上b2387和b2389ORFs之间。
在合适的条件下，由xylA基因编码的木糖异构酶也有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的转化(Wovcha，M.G.等，Appl Environ Microbiol.45(4)1402-4(1983))。因此也希望修饰所述细菌以使之具有增强的木糖异构酶活性。已经阐明了编码大肠杆菌木糖异构酶的xylA基因(GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990的序列中核苷酸编号3728788至3727466)。xylA基因位于大肠杆菌K-12染色体上xylB和xylF基因之间。
当培养基包含作为附加碳源的木糖时，增加木糖利用酶的活性是必需的。“木糖利用酵”包括木糖转运、木糖异构化和木糖磷酸化的酶、以及调节蛋白。这种酶包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖转运蛋白、和木糖转录激活因子(xylose transcriptionalactivator)。木糖异构酶催化D-木糖到D-木酮糖的异构化的反应。木酮糖激酶催化利用ATP磷酸化D-木酮糖产生D-木酮糖-5-磷酸(D-xylulose-5-phosphate)和ADP的反应。木糖利用酶如木糖异构酶和木酮糖激酶活性的存在分别通过相应木糖异构酶阴性或木酮糖激酶阴性大肠杆菌突变体的补偿来测定。
编码上述木糖利用酶的基因位于大肠杆菌染色体上xylABFGHR基因座中。编码木酮糖激酶(EC编号2.7.1.17)的基因是已知的，已被命名为xylB(GenBank登录号NC_000913.1，gi16131435的序列中核苷酸编号3725546至3727000)。编码木糖结合蛋白转运系统的基因是已知的，已被命名为xylF(GenBank登录号NC_000913.1，gi16131437的序列中核苷酸编号3728760至3729752)。编码木糖转运系统推定的ATP结合蛋白的基因是已知的，已被命名为xylG(GenBank登录号NC_000913.1，gi16131438的序列中核苷酸编号3729830至3731371)。编码ABC型木糖转运系统的通透酶成分的基因是已知的，已被命名为xylH(GenBank登录号NC_000913.1，gi16131439的序列中核苷酸编号3731349至3732530)。编码xyl操纵子的转录调节子的基因是已知的，已被命名为xylR(GenBank登录号NC_000913.1，gi16131440的序列中核苷酸编号3732608至3733786)。
因此，可以利用基于所述基因的已知核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，TJ.等.，Trends Genet.，5，185(1989))获得xylE、glk和xylABFGHR基因座的基因。编码其他微生物的D-木糖通透酶的基因可以按照类似的方式获得。
用编码下述蛋白(A)或(B)的DNA例示源自大肠杆菌的xylE基因(A)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶活性。
如本发明中所用的短语“变体蛋白”指其序列有改变的蛋白质，无论是氨基酸的缺失、插入、添加、还是取代，但其仍然保留了可用水平的所需活性，例如可用于增强L-氨基酸的生产。变体蛋白中改变的数目依赖于蛋白质三维结构中氨基酸残基的位点或类型。对于蛋白质(A)来说可以是2至30个，优选2至15个，更优选2至5个。所述变体中的这些改变可能发生在对于蛋白质的功能来说不重要的蛋白质区域中。这是因为一些氨基酸彼此具有高度的同源性，这样三维结构或活性不受这种改变的影响。所述变体蛋白中的这些改变可能发生在对于蛋白质的功能来说不重要的蛋白质区域中。因此，所述蛋白质变体(B)可以是相对于SEQ ID NO.2所示的D-木糖通透酶的完整氨基酸序列来说具有不小于70％，优选80％，更优选90％，最优选95％的同源性的变体，只要保留了D-木糖通透酶的活性。可以用熟知的方法例如计算机程序BLAST 2.0测定两个氨基酸序列之间的同源性，BLAST 2.0计算三个参数分数、同一性和相似性。
编码与上述D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA可以例如通过修饰编码D-木糖通透酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)来获得，例如以定点诱变方法，使特定位点包含一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入、或添加。如上所述修饰的DNA可以由常规已知的突变处理获得。这种处理包括羟胺处理编码本发明蛋白质的DNA，或者用紫外线照射或试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理包含所述DNA的细菌。
一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加应当是保守性突变，以保留所述活性。代表性保守性突变是保守性取代。保守性取代的例子包括Ser或Thr取代Ala，Gln、His或Lys取代Arg，Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，Asn、Glu或Gln取代Asp，Ser或Ala取代Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，Leu、Met、Val或Phe取代Ile，Ile、Met、Val或Phe取代Leu，Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，Ile、Leu、Val或Phe取代Met，Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，Thr或Ala取代Ser，Ser或Ala取代Thr，Phe或Tyr取代Trp，His、Phe或Trp取代Tyr，以及Met、Ile或Leu取代Val。
编码与D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA可以通过在合适的细胞中表达具有上述突变的DNA，并研究任何表达产物的活性而获得。编码与D-木糖通透酶基本相同的蛋白质的DNA也可以通过分离DNA获得，所述DNA可在严紧条件下与具有核苷酸序列的探针杂交并编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质，所述核苷酸序列包含例如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。此处所指“严紧条件”是在此条件下形成所谓的特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。可以举例说明所述严紧条件，例如，在所述严紧条件下，具有高度同源性的DNAs，例如具有不小于50％同源性，优选80％，更优选90％，最优选95％的DNAs能够互相杂交，而具有低于上述同源性的DNAs不能互相杂交。或者，可以举例说明严紧条件，在所述严紧条件下，DNA能够于Southern杂交中，在相当于常规洗涤条件的盐浓度下杂交，即1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS、60℃。洗涤的持续时间依赖于用于印迹的膜的类型，通常是制造商所推荐的。例如，在严紧条件下，洗涤HybondTMN+尼龙膜(Amersham)的推荐的持续时间是15分钟。优选地，洗涤可以进行2至3次。
核苷酸序列SEQ ID NO1的部分序列也可以用作探针。可以利用基于核苷酸序列SEQ ID NO1的引物，和包含核苷酸序列SEQ ID NO1的DNA片段作为模板，通过PCR制备探针。长约300bp的DNA片段用作探针时，洗涤的杂交条件包括，例如50℃、2×SSC和0.1％SDS。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、或添加还包括例如由于细菌的种或属中的多样性而天然发生(突变体或变体)并且包含D-木糖通透酶的突变。
“用编码蛋白质的DNA转化细菌”指例如用常规方法将DNA导入细菌中。该DNA的转化将导致编码本发明蛋白质的基因表达的增加，并将增强细菌细胞中所述蛋白质的活性。转化方法包括迄今报导的任何已知方法。例如，对于大肠杆菌K-12，已经报导了用氯化钙处理受体细胞以增强细胞对DNA的通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，并可以使用该方法。
基因表达增强的方法包括增加基因拷贝数。将基因导入到能够在肠杆菌科细菌中发挥作用的载体中来增加基因的拷贝数。优选使用低拷贝载体。低拷贝载体的例子包括但不限于pSC101、pMW118、pMW119等。术语“低拷贝载体”用于其拷贝数多达每个细胞5个拷贝的载体。
也可以通过将多拷贝基因导入到细菌染色体中来实现基因表达的增强，例如通过同源重组、Mu整合等方法导入。例如一次Mu整合作用允许向细菌染色体中导入多达3个拷贝的基因。
增加D-木糖通透酶基因的拷贝数也可以通过向细菌的染色体DNA导入多拷贝的D-木糖通透酶基因而实现。为了将多拷贝基因导入到细菌染色体中，利用其多拷贝在染色体DNA中作为靶物(target)存在的序列实施同源重组。在染色体DNA中具有多拷贝的序列包括但不限于重复DNA，或存在于转座元件(transposable element)末端的反向重复序列(inverted repeat)。还有，如美国专利5,595,889中公开的，可以将D-木糖通透酶基因掺入到转座子中，并使其转移以将多拷贝基因导入染色体DNA中。
基因表达的增强也可以通过将本发明的DNA置于强启动子的控制之下而实现。例如，将lac启动子、trp启动子、trc启动子、和lambda噬菌体的PR或PL启动子称为强启动子。基因表达的增强还可以通过将强终止子置于本发明的DNA下游而实现。强启动子和/或终止子可以与基因拷贝的增加组合使用。或者，例如可以通过向启动子导入突变以提高位于启动子下游的结构基因(基因的编码区)的转录水平，从而增强启动子的效果。类似地，例如可通过向终止子导入突变以提高位于终止子上游基因转录的周转(turnover)，从而增强终止子的效果。
另外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区，尤其是恰位于起始密码子上游的序列中几个核苷酸的取代深刻地影响mRNA可译性。例如，发现了20倍范围的表达水平，这依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的性质(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。先前，已表明rhtA23突变是相对于ATG起始密码子来说在-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTSof 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457)。因此，可表明rhtA23突变增强了rhtA基因表达，结果增加了对苏氨酸、高丝氨酸和转运出细胞的一些其它物质的抗性。
另外，也可能向细菌染色体上的D-木糖通透酶基因的启动子或终止子区导入核苷酸取代，这导致更强的启动子或终止子功能。例如，可以利用温度敏感性质粒以与基因取代相同的方式进行表达控制序列的改变，如国际专利公开WO 00/18935和日本专利申请公开No.1-215280中公开的。
制备质粒DNA的方法包括但不限于DNA的消化和连接、转化、选择寡核苷酸作为引物等、或者本领域技术人员熟知的其他方法。例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述了这些方法。
可以通过将前述DNA导入到本身具有产生L-氨基酸的能力的细菌中而获得本发明的细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予已包含所述DNA的细菌而获得本发明的细菌。
生产L-苏氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括，但不限于属于埃希氏菌属的产生L-苏氨酸的细菌，如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利Nos.5,175,107和5,705,371)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等.，Genetika(俄语)、1978，14947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(EP 1149911 A)等。
菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，并且是蔗糖同化的，且ilvA基因具有渗漏(leaky)突变。该菌株在rhtA基因中也有突变，其赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996包含质粒pVIC40，其通过将包括突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入到RSF1010衍生载体中而获得。该突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对于苏氨酸反馈抑制基本上脱敏。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏号RIA 1867保藏在All-Union ScientificCenter of Antibiotics(Nagatinskaya Street 3-A，117105莫斯科，俄罗斯联邦)。所述菌株还于1987年4月7日以保藏号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM；Dorozhny proezd.1，莫斯科117545，俄罗斯联邦)。
优选本发明的细菌经额外修饰增强下述基因中一个或多个的表达-突变thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；已经阐明了编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(核苷酸位置337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因(核苷酸位置2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrA和thrC基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因(核苷酸位置3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。这三个基因都作为单一苏氨酸操纵子起作用。
编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因，可以从熟知的质粒pVIC40作为一个操纵子获得，质粒pVIC40存在于生产苏氨酸的大肠杆菌VKPM B-3996中。质粒pVIC40详细描述于美国专利No.5,705,371。
rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上靠近glnHPQ操纵子的18min处，其编码谷氨酰胺转运系统的组件。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，位置764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白质的单元已被命名为rhtA基因(rht抗高丝氨酸和苏氨酸)。另外，揭示了rhtA23突变是相对于ATG起始密码子来说-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with theAnnual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology，SanFrancisco，California，August 24-29，1997，abstract No.457，EP 1013765 A)。
已阐明大肠杆菌的asd基因(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi16131307)，并可以利用基于所述基因的核苷酸序列的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，T.J.等，Trends Genet.，1989，5185)获得。其它微生物的asd基因可以以类似的方式获得。
还阐明了大肠杆菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi16128895)，并可以通过PCR获得该基因。其它微生物的aspC基因可以以类似的方式获得。
产生L-赖氨酸的细菌属于埃希氏菌属的产生L-赖氨酸的细菌的例子包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。所述L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但当L-赖氨酸共存于培养基中时，该抑制是完全或部分脱敏的。L-赖氨酸类似物的例子包括但不限于氧代赖氨酸、赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等等。对这些赖氨酸类似物有抗性的突变体可以通过对属于埃希氏菌属细菌进行常规人工诱变处理而获得。可用于产生L-赖氨酸的菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442 (FERM BP-1543，NRRL B-12185；参见美国专利4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的反馈抑制是脱敏的。
菌株WC196可以用作大肠杆菌的产生L-赖氨酸的细菌。通过将AEC抗性赋予菌株W3110来培育该细菌菌株，菌株W3110来源于大肠杆菌K-12。所得菌株称为大肠杆菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到登录号FERM P-14690。之后，依据布达佩斯条约的规定，于1995年9月29日转为国际保藏，得到登录号FERM BP-5252(美国专利5,827,698)。
产生L-组氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-组氨酸的细菌，如大肠杆菌菌株24(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRLB12116-B12121(美国专利4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP 1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利6,258,554)等。
产生L-苯丙氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；含有pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、和NRRL B-12147(美国专利4,407,952)。另外，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)、和命名为AJ 12604(FERM BP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]可以用作亲本菌株(EP 488424 B1)。另外，也可以使用属于埃希氏菌属的产生L-苯丙氨酸的细菌，其中由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质具有增强的活性(美国专利申请2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。
产生L-精氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于产生L-精氨酸的细菌如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/0058315 A1)及其含有突变的N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869)、大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926)(EP 1170358 A1)、具有在其中导入的编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的产生精氨酸的菌株(JP 57-5693A)等等。
产生L-谷氨酸的细菌用于衍生本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的产生L-谷氨酸的细菌如大肠杆菌VL334thrC+(EP1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突变(美国专利No.4,278,765)。利用培养在野生型大肠杆菌K12(VKPM B-7)细胞上的噬菌体P1，通过普通的转导方法转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。该菌株能够产生L-谷氨酸。
用于衍生本发明的产生L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的突变体或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变体。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌以及获得它们的方法在美国专利5,378,616和5,573,945中描述。具体地，这些菌株包括下述大肠杆菌W3110sucA::Kmr大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)大肠杆菌W3110sucA::Kmr通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(以下称为“sucA基因”)而获得。该菌株是α-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
产生L-谷氨酸的细菌的其它例子包括属于泛菌属的突变菌株，其为α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的或者具有减小的α-酮戊二酸脱氢酶活性，并可以如上所述获得。这样的菌株包括Pantoea ananatis AJ13356。(美国专利6,331,419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日以登录号FERMP-16645保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of International Trade and Industry)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary)，Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)。之后依据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日转为国际保藏，得到登录号FERM BP-6615。Pantoea ananatis AJ13356是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，这是破坏αKGDH-E1亚基基因(sucA)的结果。上述菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌，并保藏为成团肠杆菌AJ13356。然而，最近根据16S rRNA的核苷酸测序等将其重新分类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在前述保藏机构保藏为成团肠杆菌，但在本说明书中，将它们描述为Pantoea ananatis。
L-氨基酸的生产草酰乙酸(OAA)作为导致合成Thr和Lys的反应的底物。OAA由于PEP与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的反应而得到，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为催化剂起作用。因此，细胞中PEPC浓度的升高对于这些氨基酸的发酵生产可能是非常重要的。当葡萄糖用作发酵中的碳源时，葡萄糖被葡萄糖-磷酸转移酶(Glc-PTS)系统内在化(internalize)。此系统消耗PEP，而且PTS中的蛋白质由ptsG和ptsHIcrr编码。内在化期间，从一个分子葡萄糖产生一个分子PEP和一个分子丙酮酸(Pyr)。
在蔗糖而非葡萄糖中培养时，已被修饰而具有利用蔗糖的能力(Scr-PTS)的产生L-苏氨酸的菌株和产生L-赖氨酸的菌株具有更高的生产这些氨基酸的能力(EP 1149911 A2)。相信由一个分子蔗糖通过Scr-PTS产生三个分子PEP和一个分子Pyr，提高PEP/Pyr的比例，由此促进由蔗糖合成Thr和Lys。此外，已报导Glc-PTS受到几种表达控制(Postma P.W.等.，Microbiol Rev.，57(3)，543-94(1993)；Clark B.等.J.Gen.Microbiol.，96(2)，191-201(1976)；PlumbridgeJ.，Curr.Opin.Microbiol.，5(2)，187-93(2002)；Ryu S.等.，J.Biol.Chem.，270(6)2489-96(1995))，因此有可能葡萄糖自身的掺入在氨基酸发酵中可能是限速步骤。
通过在产生苏氨酸的菌株、产生赖氨酸的菌株、产生组氨酸的菌株、产生苯丙氨酸的菌株和/或产生谷氨酸的菌株中增加xylE基因的表达而进一步提高PEP/Pyr的比例将进一步增加氨基酸生产。因为从两个分子葡萄糖产生四个分子PEP，预期PEP/Pyr的比例将大大提高。由于xylE基因表达增加，预期将去除glc-PTS的表达控制。
本发明产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的细菌，使L-氨基酸在培养基中积累，并从培养基收集L-氨基酸的步骤。此外，本发明的方法包括产生L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养本发明的细菌，使L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸积累在培养基中，并从培养基收集L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸。
在本发明中，从培养基培养、收集、和纯化L-氨基酸等可通过常规发酵方法进行，其中用微生物生产L-氨基酸。
所述培养基可以是合成的或天然的，只要所述培养基包括碳源和氮源以及矿物质，并且必要时还包括微生物生长所需的适量营养物。碳源可以包括多种碳水化合物如葡萄糖、蔗糖和木糖，以及多种有机酸。取决于所选微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油。作为氮源，可以使用多种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物和经消化的发酵微生物。作为矿物质，可以使用钾单磷酸盐(potassiummonophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。硫胺、酵母提取物等可以用作维生素。必要时可以向培养基添加附加营养物。例如，如果微生物生长需要L-氨基酸(L-氨基酸营养缺陷型)，则可以向培养基添加足量的L-氨基酸。
培养优选在需氧条件下进行，例如在20至40℃，优选30至38℃的温度振荡培养，以及通气搅拌培养。培养的pH通常在5到9之间，优选6.5到7.2之间。可以用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱、和缓冲液调整培养的pH。通常，培养1至5天导致目标L-氨基酸在液体培养基中积累。
培养后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基中去除固体如细胞，然后可以通过离子交换、浓缩和/或结晶方法收集并纯化目标L-氨基酸。
实施例以下将参考下述非限制性实施例更具体地解释本发明。
实施例1用杂合PL-tac启动子取代大肠杆菌中xylE基因的天然启动子区为了取代xylE基因的天然启动子区，利用Datsenko K.A.and Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的方法，将携带杂合PL-tac启动子和由cat基因编码的氯霉素抗性标记(CmR)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655(ATCC 700926)的染色体中，代替天然启动子区，所述方法也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”。具有热敏复制子的重组质粒pKD46(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)用作由噬菌体λ衍生的基因的供体，所述基因负责Red-介导的重组系统。包含重组质粒pKD46的大肠杆菌菌株BW25113可由大肠杆菌GeneticStock Center，Yale University，New Haven，USA获得，其登录号为CGSC7630。
化学合成杂合PL-tac启动子。取代的启动子的核苷酸序列显示于序列表中(SEQ ID NO3)。包含杂合PL-tac启动子的合成DNA片段在其5’端包含BglII识别位点，其对于进一步连接到被导入以进一步整合到细菌染色体中的cat基因和与xylE基因5’末端同源的36个核苷酸来说是必需的。
使用商业上可获得的质粒pACYC184(GenBank/EMBL登录号X06403，“Fermentas”，Lithuania)为模板，和引物P1(SEQ ID NO4)和P2(SEQID NO5)通过PCR获得包含由cat基因编码的CmR标记的DNA片段。引物P1在其5’端包含BglII识别位点，其对于进一步连接到杂合PL-tac启动子是必需的，引物P2包含与位于xylE基因起始密码子上游217bp的区域同源的36个核苷酸，其被导入到引物中用于进一步整合到细菌染色体中。
利用“TermoHybaid PCR Express”扩增仪实施PCR。反应混合物(总体积-50μl)由含15mM MgCl2的5μl 10×PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)、200μM的每种dNTP、25pmol的每种所用引物和1U的Taq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)组成。将大约5ng的质粒DNA添加到反应混合物中作为模板DNA用于PCR扩增。温度曲线(temperature profile)如下在95℃初始DNA变性5min，接下来是95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸30sec的25个循环；和在+72℃最终延伸7min。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。
用BglII限制酶处理上述两种DNA片段并连接。用引物P2(SEQ ID NO5)和P3(SEQ ID NO6)通过PCR扩增连接产物。引物P3在其5’端包含36个核苷酸，这36个核苷酸与被导入用于进一步整合到细菌染色体中的xylE基因的5’末端同源。
通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。获得的DNA片段用于电穿孔和Red-介导整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中。
将MG1655/pKD46细胞于30℃在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的液体LB-培养基中培养过夜，然后用添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(阿拉伯糖用于诱导Red系统的质粒编码基因)的SOB-培养基(酵母提取物，5g/l；NaCl，0.5g/l；胰蛋白胨，20g/l；KCl，2.5mM；MgCl2，10mM)1∶100稀释，在30℃培养以使细菌培养物的光密度达到OD600＝0.4-0.7。来自10ml细菌培养物的培养细胞用以冰预冷的去离子水洗涤3次，然后悬浮在100μl水中。将溶解在去离子水中的10μl DNA片段(100ng)添加到细胞悬浮液中。依照厂商的说明，用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(No.165-2098，2-89版本)进行电穿孔。将电击过的(shocked)细胞添加到1-ml SOC培养基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))，在37℃温育2小时，然后将其涂布到含25μg/ml氯霉素的L-琼脂上。用引物P4(SEQ ID NO7)和P5(SEQ ID NO8)通过PCR测试24小时内生长的菌落的CmR标记而非xylE基因的天然启动子区的存在。为此目的，将新分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl获得的悬浮液用于PCR。使用下述温度曲线在95℃初始DNA变性10min；然后是95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸1min的30个循环；在72℃最终延伸7min。所测试的少量CmR菌落包含所需的～2000bp DNA片段，这证实了CmR标记DNA而不是xylE基因的192bp天然启动子区的存在(参见图1)。这些菌株中的一个通过在37℃培养来消除热敏质粒pKD46，并将所得菌株命名为大肠杆菌MG1655PL-tacxylE。
实施例2增加的xylE基因表达对具有破坏的PTS转运系统的大肠杆菌菌株生长的影响为了表明xylE基因表达增强对大肠杆菌菌株生长的影响，构建了具有破坏的PTS转运系统的大肠杆菌菌株。
为实现该目的，用Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的方法将携带卡那霉素抗性标记(KmR)的DNA片段整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的染色体中，代替ptsHI-crr操纵子，该方法也称为“Red-介导的整合”和/或“Red-驱动的整合”，实施例1也描述了该方法。
已经阐明了ptsHI-crr操纵子(GenBank登录号NC_000913.2，gi49175990的序列中，对于ptsH、ptsI和crr基因分别为核苷酸编号2531786至2532043、2532088至2533815和2533856至2534365)。ptsHI-crr操纵子位于大肠杆菌K-12染色体上cysK和pdxK基因之间。
利用商业上可获得的质粒pUC4KAN(GenBank/EMBL登录号X06404，“Fermentas”，Lithuania)作为模板，和引物P6(SEQ ID NO9)和P7(SEQ IDNO10)通过PCR获得携带KmR基因的DNA片段。引物P6包含与ptsH基因5`末端同源的36个核苷酸，引物P7包含与crr基因3’-末端同源的36个核苷酸。将这些序列导入到引物P6和P7中，用于进一步整合到细菌染色体中。
如实施例1所述进行PCR。
然后，用琼脂糖凝胶电泳浓缩扩增的DNA片段，通过以“GenElute SpinColumns”(“Sigma”，USA)离心从凝胶中提取，并用乙醇沉淀。所获得的DNA片段如实施例1所述用于电穿孔和Red-介导整合到大肠杆菌MG1655/pKD46的细菌染色体中，只是在电穿孔后将细胞涂布到含50μg/ml卡那霉素的L-琼脂上。
利用引物P8(SEQ ID NO11)和P9(SEQ ID NO12)通过PCR测试24小时内生长的菌落的KmR标记而非ptsHI-crr操纵子的存在。为此目的，将新分离的菌落悬浮在20μl水中，然后将1μl获得的悬浮液用于PCR。PCR条件如实施例1所述。所测试的少量KmR菌落包含所需的～1300bp DNA片段，这证实了KmR基因而非ptsHI-crr操纵子的存在。所获得的菌株中的一个通过在37℃培养而消除热敏质粒pKD46，并将所得菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔptsHI-crr。
然后，将来自上述大肠杆菌MG1655PL-tacxylE的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Lab.Press，Plainview，NY)转移到大肠杆菌MG1655ΔptsHI-crr，得到菌株MG1655ΔptsHI-crrPL-tacxylE。
检测三个大肠杆菌菌株MG1655、MG1655ΔptsHI-crr和MG1655ΔptsHI-crrPL-tacxylE在含有葡萄糖(4％)作为碳源的基本Adams上生长的能力。如图2所示，大肠杆菌MG1655ΔptsHI-crr不能在含葡萄糖的基本Adams培养基上良好地生长(μ～0.06)。增加xylE基因表达明显增强了受体菌株在含葡萄糖的基本Adams培养基上的生长特性。
实施例3增加的xylE基因表达对苏氨酸产生的影响为了测试在PL-tac启动子控制下的xylE基因增强的表达对苏氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655PL-tacxylE的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)转移到产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996。菌株VKPM B-3996于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(俄罗斯，117545莫斯科，1stDorozhny proezd，1)。
将大肠杆菌菌株B-3996和B-3996PL-tacxylE都在37℃在L-琼脂平板上培养18-24小时。为获得种子培养物，在旋转震荡器(250rpm)上，在32℃将所述菌株在含2ml具有4％蔗糖的L-培养液(L-broth)的20×200mm试管中培养18小时。然后，用0.21ml(10％)种子材料接种发酵培养基。在20×200mm试管中，在2ml用于发酵的基本培养基中进行发酵。细胞在32℃250rpm振动生长48小时。
培养后，用以下流动相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)通过纸层析测定培养基中积累的L-苏氨酸的量。将茚三酮的丙酮溶液(2％)用作显示试剂。切下含L-苏氨酸的斑点，在CdCl2的0.5％水溶液中洗脱L-苏氨酸，用分光光度法在540nm处评估L-苏氨酸的量。结果显示在表1中。由于导入PL-tacxylE，改进了苏氨酸生产。
发酵培养基的成分(g/l)如下葡萄糖80.0(NH4)2SO422.0NaCl 0.8KH2PO42.0MgSO47H2O 0.8FeSO47H2O 0.02MnSO45H2O 0.02硫胺素盐酸盐(thiamine HCl)0.0002酵母提取物1.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸镁分别灭菌。CaCO3在180℃干热灭菌2小时。pH调整到7.0。灭菌后将抗生素加到培养基中。
表1
实施例4增加的xylE基因表达对L-赖氨酸产生的影响大肠杆菌W3110染色体DNA的完整核苷酸序列是已知的(Science，277，1453-1474(1997))。基于所报导的核苷酸序列合成引物，并用如下PCR方法扩增xylE基因。
通过常规方法(Sambrook，J.，Fritsch E. F.and Maniatis T.(1989)MolecularCloningA laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)制备染色体DNA。将引物10(SEQ ID NO13)设计为其中将EcoRI识别位点添加到登录号AE000476的序列7479-7508的5’末端的序列，并将引物11(SEQ ID NO14)设计为与其中将SalI识别位点添加到登录号AE000476的序列8963-8992的5’-末端的序列互补的序列。利用这些引物，如“PCR protocols.Current methods and applications”(White，B.A.，ed.，HumanaPress，Totowa，New Jersey，1993)中所述标准条件扩增xylE基因。
通过常规方法纯化PCR产物。用限制酶SalI和EcoRI消化所述产物，并用连接试剂盒连接到已经用相同限制酶处理过的载体pSTV29。用连接产物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Sambrook，J.，Fritsch E.F.and Maniatis T.(1989)Molecular CloningA laboratory manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，将细胞涂布在含10μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和50μg/ml氯霉素的L-平板(细菌培养用胰蛋白胨(Bacto-trypton)10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l、琼脂15g/l，pH7.0)上，培养过夜。挑取并分离出现的白色菌落，如此获得转化体。通过碱提取法由所述转化体制备质粒，获得质粒pSTV29-xylE，其中xylE基因以正向连接到lac启动子。
将大肠杆菌WC196用作属于埃希氏菌属的产生L-赖氨酸的菌株。
用质粒pSTV29-xylE或载体pSTV29转化WC196，获得WC196/pSTV29-xylE和WC196/pSTV29。将这些菌株中的每个都在37℃在含50mg/l氯霉素的L-培养基中培养，直到600nm处的最终OD达到约0.6。然后向培养物添加相同体积的40％甘油溶液，将所述混合物以合适的体积分装，储存在-80℃。以下将其称为“甘油储液(glycerol stock)”。
为了检验L-赖氨酸生产条件下增强木糖通透酶活性的影响，按照上述步骤用质粒pSTV29-xylE和pCABD2转化WC196。pCABD2为包含dapA基因、lysC基因、dapB基因、和ddh基因的质粒，所述dapA基因编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的二氢吡啶二羧酸合酶，lysC基因编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶III，dapB基因编码二氢吡啶二羧酸还原酶，ddh基因编码二氨基庚二酸脱氢酶(美国专利6,040,160)。作为对照，将WC196用质粒pSTV29和pCABD2转化。获得的每种转化体都在37℃在含50mg/l氯霉素和20mg/l链霉素的L-培养基中培养，直到600nm处的最终OD达到约0.6。然后向培养物添加相同体积的40％甘油溶液，将所述混合物以合适的体积分装，并储存在-80℃。
熔化WC196/pSTV29-xylE和WC196/pSTV29的甘油储液，将每种100μl在含50mg/l氯霉素的L-平板上均匀地涂布，并在37℃培养24小时。此外，将WC196/(pCABD2，pSTV29-xylE)和WC196/(pCABD2，pSTV29)在含50mg/l氯霉素和20mg/l链霉素的L-平板上均匀地涂布，并在37℃培养24小时。在500ml-烧瓶中，将平板上约八分之一量的细胞接种到含所需药物的20ml发酵培养基中。通过使用往复振荡器以115rpm的振荡速度在37℃培养16小时。培养后，用已知方法(Biotech-analyzer AS210，由Sakura Seiki Co.制造)测定培养基中L-赖氨酸和残留葡萄糖的量。然后，对于每种菌株，计算L-赖氨酸相对于消耗的葡萄糖的得率。
发酵培养基的成分(g/l)如下葡萄糖40(NH4)2SO424K2HPO41.0MgSO4x7H2O1.0FeSO4x7H2O0.01MnSO4x5H2O0.01酵母提取物2.0用KOH将pH调到7.0，并将培养基在115℃高压灭菌10min。葡萄糖和MgSO4x7H2O分别灭菌。添加30g/l的CaCO3，CaCO3已于180℃干热灭菌2小时。
结果如表2所示。与其中木糖通透酶的表达量不增加的WC196/pSTV29相比，WC196/pSTV29-xylE积累更大量的L-赖氨酸。此外，在WC196/pCABD2中也观测到增强木糖通透酶活性改进了L-赖氨酸的积累和得率，WC196/pCABD2生产更大量的L-赖氨酸。
表2
实施例5增加xylE基因表达对产生L-精氨酸的影响为了测试在PL-tac启动子控制下的xylE基因增强的表达对产生精氨酸的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655PL-tacxylE的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)转移到产生精氨酸的大肠杆菌菌株382。菌株382已于2000年4月10日以登录号VKPM B-7926保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(俄罗斯，117545莫斯科，1stDorozhny proezd，1)。
将所得菌株382PL-tacxylE和亲本菌株382分别在32℃在2ml LB营养培养基中培养18小时，将0.3ml所得的培养物接种到20×200mm试管中的2ml发酵培养基中，并在旋转震荡器上在32℃培养48小时。
培养后，用以下流动相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)通过纸层析测定培养基中积累的L-精氨酸的量。将茚三酮的丙酮溶液(2％)用作显示试剂。切下含L-精氨酸的斑点，在CdCl2的0.5％水溶液中洗脱L-精氨酸，在540nm用分光光度法评估L-精氨酸的量。
发酵培养基的成分(g/l)如下葡萄糖 48.0(NH4)2SO435.0KH2PO42.0MgSO4x7H2O1.0硫胺素盐酸盐0.0002酵母提取物 1.0L-异亮氨酸 0.1CaCO35.0葡萄糖和硫酸镁分别灭菌。CaCO3于180℃干热灭菌2小时。pH调到7.0。
10个独立试验的结果显示于表3。由表3可以看到，与其中D-木糖通透酶的表达量不增加的菌株382相比，菌株382PL-tacxylE积累更大量的L-精氨酸。
表3
实施例6用产生L-组氨酸的细菌通过葡萄糖和木糖的混合物的发酵产生L-组氨酸产生L-组氨酸的大肠杆菌菌株80用于通过葡萄糖和木糖的混合物的发酵产生L-组氨酸。大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270)详细描述于俄罗斯专利RU2119536。菌株80于1999年10月15日以登录号B-7270保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM；Dorozhny proezd.1，莫斯科117545，俄罗斯联邦)。之后，依据布达佩斯条约的规定于2004年6月12日将其转为国际保藏。
为了测试在PL-tac启动子控制下的xylE基因表达的增强对产生组氨酸的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655PL-tacxylE的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)转移到产生组氨酸的大肠杆菌菌株80。通过常规方法用pMW119mod-xylA-R质粒转化菌株80和所得菌株80PL-tacxylE，产生菌株80/pMW119mod-xylA-R和80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R。从大肠杆菌菌株MG1655的染色体克隆xylABFGHR基因座在俄罗斯专利申请RU2005106720中描述。
为获得种子培养物，将菌株80/pMW119mod-xylA-R和80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R均在40ml试管(18mm)中在27℃在旋转震荡器(250rpm)上培养6小时，所述试管中包含含有1g/l链霉素和100mg/l氨苄青霉素的2mlL-培养液。然后，将2ml(5％)的种子材料接种到发酵培养基中。发酵在含有2ml发酵培养基的40ml试管中在27℃在旋转震荡器(250rpm)上进行50小时。
培养后，通过纸层析测定累积在培养基中的L-组氨酸的量。流动相的成分如下丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。将茚三酮的丙酮溶液(0.5％)用作显示试剂。结果显示于表4中。
发酵培养基的成分(g/l)如下碳水化合物(合计) 100.0豆浓(Mameno)(大豆水解产物)0.2的总氮L-脯氨酸 0.8(NH4)2SO425.0K2HPO42.0MgSO4x7H2O 1.0FeSO4x7H2O 0.01MnSO4x5H2O 0.01硫胺素盐酸盐 0.001甜菜碱(Betaine) 2.0CaCO36.0链霉素1.0碳水化合物(葡萄糖，木糖)、L-脯氨酸、甜菜碱和硫酸镁分别灭菌。CaCO3于110℃干热灭菌30min。灭菌前用KOH将pH调到6.0。
表4
由表4可见，与其中D-木糖通透酶的表达不增加的菌株80/pMW119mod-xylA-R相比，在含有葡萄糖和木糖混合物的培养基中，菌株80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R导致累积更大量的L-组氨酸。
虽然已经参考本发明的优选实施方案详细描述了本发明，然而对于本领域熟练技术人员来说显而易见的是，能够进行各种改变，和所使用的等同物，而不脱离本发明的范围。
工业实用性本发明提供通过发酵生产非芳族或芳族L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的方法。根据本发明，可以增强肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌的生产力。
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>使用肠杆菌科的细菌产生L-氨基酸的方法<130>C3490PC5252<150>RU2004130954<151>2004-10-22<150>US60/673807<151>2005-04-22<160>14<170>Patent In version 3.1<210>1<211>1476<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1476)<400>1atg aat acc cag tat aat tcc agt tat ata ttt tcg att acc tta gtc 48Met Asn Thr Gln Tyr Asn Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ile Thr Leu Val1 5 10 15gct aca tta ggt ggt tta tta ttt ggc tac gac acc gcc gtt att tcc 96Ala Thr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser20 25 30ggt act gtt gag tca ctc aat acc gtc ttt gtt gct cca caa aac tta144Gly Thr Val Glu Ser Leu Asn Thr Val Phe Val Ala Pro Gln Asn Leu35 40 45agt gaa tcc get gcc aac tcc ctg tta ggg ttt tgc gtg gcc agc gct192Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ser Leu Leu Gly Phe Cys Val Ala Ser Ala50 55 60ctg att ggt tgc atc atc ggc ggt gcc ctc ggt ggt tat tgc agt aac240Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Asn65 70 75 80cgc ttc ggt cgt cgt gat tca ctt aag att gct gct gtc ctg ttt ttt288Arg Phe Gly Arg Arg Asp Ser Leu Lys Ile Ala Ala Val Leu Phe Phe85 90 95att tct ggt gta ggt tct gcc tgg cca gaa ctt ggt ttt acc tct ata336Ile Ser Gly Val Gly Ser Ala Trp Pro Glu Leu Gly Phe Thr Ser Ile100 105 110aac ccg gac aac act gtg cct gtt tat ctg gca ggt tat gtc ccg gaa384
Asn Pro Asp Asn Thr Val Pro Val Tyr Leu Ala Gly Tyr Val Pro Glu115 120 125ttt gtt att tat cgc att att ggc ggt att ggc gtt ggt tta gcc tca 432Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile Gly Gly Ile Gly Val Gly Leu Ala Ser130 135 140atg ctc tcg cca atg tat att gcg gaa ctg gct cca gct cat att cgc 480Met Leu Ser Pro Met Tyr Ile Ala Glu Leu Ala Pro Ala His Ile Arg145 150 155 160ggg aaa ctg gtc tct ttt aac cag ttt gcg att att ttc ggg caa ctt 528Gly Lys Leu Val Ser Phe Asn Gln Phe Ala Ile Ile Phe Gly Gln Leu165 170 175tta gtt tac tgc gta aac tat ttt att gcc cgt tcc ggt gat gcc agc 576Leu Val Tyr Cys Val Asn Tyr Phe Ile Ala Arg Ser Gly Asp Ala Ser180 185 190tgg ctg aat act gac ggc tgg cgt tat atg ttt gcc tcg gaa tgt atc 624Trp Leu Asn Thr Asp Gly Trp Arg Tyr Met Phe Ala Ser Glu Cys Ile195 200 205cct gca ctg ctg ttc tta atg ctg ctg tat acc gtg cca gaa agt cct 672Pro Ala Leu Leu Phe Leu Met Leu Leu Tyr Thr Val Pro Glu Ser Pro210 215 220cgc tgg ctg atg tcg cgc ggc aag caa gaa cag gcg gaa ggt atc ctg 720Arg Trp Leu Met Ser Arg Gly Lys Gln Glu Gln Ala Glu Gly Ile Leu225 230 235 240cgc aaa att atg ggc aac acg ctt gca act cag gca gta cag gaa att 768Arg Lys Ile Met Gly Asn Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Gln Glu Ile245 250 255aaa cac tcc ctg gat cat ggc cgc aaa acc ggt ggt cgt ctg ctg atg 816Lys His Ser Leu Asp His Gly Arg Lys Thr Gly Gly Arg Leu Leu Met260 265 270ttt ggc gtg ggc gtg att gta atc ggc gta atg ctc tcc atc ttc cag 864Phe Gly Val Gly Val Ile Val Ile Gly Val Met Leu Ser Ile Phe Gln275 280 285caa ttt gtc ggc atc aat gtg gtg ctg tac tac gcg ccg gaa gtg ttc 912Gln Phe Val Gly Ile Asn Val Val Leu Tyr Tyr Ala Pro Glu Val Phe290 295 300aaa acg ctg ggg gcc agc acg gat atc gcg ctg ttg cag acc att att 960Lys Thr Leu Gly Ala Ser Thr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ile305 310 315 320gtc gga gtt atc aac ctc acc ttc acc gtt ctg gca att atg acg gtg1008Val Gly Val Ile Asn Leu Thr Phe Thr Val Leu Ala Ile Met Thr Val325 330 335gat aaa ttt ggt cgt aag cca ctg caa att atc ggc gca ctc gga atg1056Asp Lys Phe Gly Arg Lys Pro Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Gly Met340 345 350
gca atc ggt atg ttt agc ctc ggt acc gcg ttt tac act cag gca ccg1104Ala Ile Gly Met Phe Ser Leu Gly Thr Ala Phe Tyr Thr Gln Ala Pro355 360 365ggt att gtg gcg cta ctg tcg atg ctg ttc tat gtt gcc gcc ttt gcc1152Gly Ile Val Ala Leu Leu Ser Met Leu Phe Tyr Val Ala Ala Phe Ala370 375 380atg tcc tgg ggt ccg gta tgc tgg gta ctg ctg tcg gaa atc ttc ccg1200Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val Leu Leu Ser Glu Ile Phe Pro385 390 395 400aat gct att cgt ggt aaa gcg ctg gca atc gcg gtg gcg gcc cag tgg1248Asn Ala Ile Arg Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Val Ala Ala Gln Trp405 410 415ctg gcg aac tac ttc gtc tcc tgg acc ttc ccg atg atg gac aaa aac1296Leu Ala Asn Tyr Phe Val Ser Trp Thr Phe Pro Met Met Asp Lys Asn420 425 430tcc tgg ctg gtg gcc cat ttc cac aac ggt ttc tcc tac tgg att tac1344Ser Trp Leu Val Ala His Phe His Asn Gly Phe Ser Tyr Trp Ile Tyr435 440 445ggt tgt atg ggc gtt ctg gca gca ctg ttt atg tgg aaa ttt gtc ccg1392Gly Cys Met Gly Val Leu Ala Ala Leu Phe Met Trp Lys Phe Val Pro450 455 460gaa acc aaa ggt aaa acc ctt gag gag ctg gaa gcg ctc tgg gaa ccg1440Glu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Glu Pro465 470 475 480gaa acg aag aaa aca caa caa act gct acg ctg taa1476Glu Thr Lys Lys Thr Gln Gln Thr Ala Thr Leu485 490<210>2<211>491<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Asn Thr Gln Tyr Asn Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ile Thr Leu Val1 5 10 15Ala Thr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser20 25 30Gly Thr Val Glu Ser Leu Asn Thr Val Phe Val Ala Pro Gln Asn Leu35 40 45Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ser Leu Leu Gly Phe Cys Val Ala Ser Ala50 55 60Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Asn65 70 75 80
Arg Phe Gly Arg Arg Asp Ser Leu Lys Ile Ala Ala Val Leu Phe Phe85 90 95Ile Ser Gly Val Gly Ser Ala Trp Pro Glu Leu Gly Phe Thr Ser Ile100 105 110Asn Pro Asp Asn Thr Val Pro Val Tyr Leu Ala Gly Tyr Val Pro Glu115 120 125Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile Gly Gly Ile Gly Val Gly Leu Ala Ser130 135 140Met Leu Ser Pro Met Tyr Ile Ala Glu Leu Ala Pro Ala His Ile Arg145 150 155 160Gly Lys Leu Val Ser Phe Asn Gln Phe Ala Ile Ile Phe Gly Gln Leu165 170 175Leu Val Tyr Cys Val Asn Tyr Phe Ile Ala Arg Ser Gly Asp Ala Ser180 185 190Trp Leu Asn Thr Asp Gly Trp Arg Tyr Met Phe Ala Ser Glu Cys Ile195 200 205Pro Ala Leu Leu Phe Leu Met Leu Leu Tyr Thr Val Pro Glu Ser Pro210 215 220Arg Trp Leu Met Ser Arg Gly Lys Gln Glu Gln Ala Glu Gly Ile Leu225 230 235 240Arg Lys Ile Met Gly Asn Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Gln Glu Ile245 250 255Lys His Ser Leu Asp His Gly Arg Lys Thr Gly Gly Arg Leu Leu Met260 265 270Phe Gly Val Gly Val Ile Val Ile Gly Val Met Leu Ser Ile Phe Gln275 280 285Gln Phe Val Gly Ile Asn Val Val Leu Tyr Tyr Ala Pro Glu Val Phe290 295 300Lys Thr Leu Gly Ala Ser Thr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ile305 310 315 320Val Gly Val Ile Asn Leu Thr Phe Thr Val Leu Ala Ile Met Thr Val325 330 335Asp Lys Phe Gly Arg Lys Pro Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Gly Met340 345 350Ala Ile Gly Met Phe Ser Leu Gly Thr Ala Phe Tyr Thr Gln Ala Pro355 360 365Gly Ile Val Ala Leu Leu Ser Met Leu Phe Tyr Val Ala Ala Phe Ala370 375 380
Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val Leu Leu Ser Glu Ile Phe Pro385 390 395 400Asn Ala Ile Arg Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Val Ala Ala Gln Trp405 410 415Leu Ala Asn Tyr Phe Val Ser Trp Thr Phe Pro Met Met Asp Lys Asn420 425 430Ser Trp Leu Val Ala His Phe His Asn Gly Phe Ser Tyr Trp Ile Tyr435 440 445Gly Cys Met Gly Val Leu Ala Ala Leu Phe Met Trp Lys Phe Val Pro450 455 460Glu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Glu Pro465 470 475 480Glu Thr Lys Lys Thr Gln Gln Thr Ala Thr Leu485 490<210>3<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>杂合启动子<400>3ctagatctct cacctaccaa acaatgcccc cctgcaaaaa ataaattcat aaaaaacata 60cagataacca tctgcggtga taaattatct ctggcggtgt tgacaattaa tcatcggctc120gtataatgtg tggaattgtg agcgtcagaa tggtctaagg caggtctgaa tgaataccca180<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtaagatctc tcatgtttga cagcttatca tc 32<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5
ggcgctccac ggagcgcctt tttttctttc gtctgcctaa gctttctaga cg 52<210>6<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tgggtattca ttcagacctg ccttagacca ttctgacgct cacaattcca cacat 55<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gatcaccatc gtcttcttg 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gtagcgacta aggtaatcg 19<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cacaacacta aacctataag ttggggaaat acaatgtgaa gcctgctttt ttatactaag 60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>10gccgatgggc gccatttttc actgcggcaa gaattacgct caagttagta taaaaaagct 60<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11tcctggcatt gattcagcct gt 22<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12ccagcagcat gagagcgatg a21<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13cccgaattcg gacaggaaga ttacagcgta gcagtttgt 39<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14cccgtcgacg atcagaatgg tctaaggcag gtctgaatg 39
权利要求
1.肠杆菌科的产生L-氨基酸的细菌，其中所述细菌已经过修饰增强了D-木糖通透酶的活性。
2.根据权利要求1的细菌，其中所述D-木糖通透酶的活性通过增加编码D-木糖通透酶的基因的表达而增强。
3.根据权利要求1的细菌，其中通过修饰编码D-木糖通透酶的基因的表达控制序列，或者通过增加编码D-木糖通透酶基因的拷贝数而增强所述D-木糖通透酶的活性。
4.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了葡糖激酶的活性。
5.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了木糖异构酶的活性。
6.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增加了xylABFGHR位点的表达。
7.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌选自下组菌属埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、和摩根氏菌属。
8.根据权利要求2的细菌，其中所述基因编码选自下组的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质；和(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的变体蛋白质，其具有D-木糖通透酶活性。
9.根据权利要求2的细菌，其中所述编码D-木糖通透酶的基因包含选自下组的DNA(a)包含SEQ ID NO1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA；和(b)在严紧条件下可与SEQ ID NO1中核苷酸1-1476的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制备的探针杂交，并且编码具有D-木糖通透酶活性的蛋白质的DNA。
10.根据权利要求9的细菌，其中所述严紧条件包括其中在60℃在1xSSC和0.1％SDS的盐浓度下洗涤15分钟的条件。
11.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-苏氨酸的细菌。
12.根据权利要求11的细菌，其中所述细菌还经额外修饰而增强了选自下组的基因的表达-编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I并对苏氨酸的反馈抑制有抗性的突变thrA基因，-编码高丝氨酸激酶的thrB基因，-编码苏氨酸合酶的thrC基因，-编码推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意组合。
13.根据权利要求12的细菌，其中所述细菌经修饰增强了所述突变的thrA基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表达。
14.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-赖氨酸的细菌。
15.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-组氨酸的细菌。
16.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-苯丙氨酸的细菌。
17.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-精氨酸的细菌。
18.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌是产生L-谷氨酸的细菌。
19.生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1的细菌，使所述L-氨基酸在培养基中积累，并从培养基分离L-氨基酸。
20.根据权利要求19的方法，其中所述培养基含有木糖。
21.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
22.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
23.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-组氨酸。
24.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
25.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。
26.根据权利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。
全文摘要
本发明公开了利用肠杆菌科细菌产生L－氨基酸，例如L－苏氨酸、L－赖氨酸、L－组氨酸、L－苯丙氨酸、L－精氨酸或L－谷氨酸的方法，其中所述细菌经修饰增强了D－木糖通透酶的活性。
文档编号C12P13/04GK101044159SQ20058003622
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月21日 优先权日2004年10月22日
发明者康斯坦丁·V·赖贝克, 埃卡特里那·A·斯利文斯卡亚, 埃卡特里那·A·赛维拉索瓦, 瓦莱里·Z·阿克维迪安, 埃琳娜·V·克里亚奇科, 瑟奇·V·马什科, 薇拉·G·多罗申科, 拉里萨·G·埃里克, 塔特亚娜·V·里奥诺娃, 米克海尔·M·古斯亚蒂纳, 埃尔韦拉·B·沃罗什洛娃, 尤里·I·科兹洛夫, 原吉彦, 植田拓嗣 申请人:味之素株式会社