专利名称：使用被提供有经纯化金属硫蛋白(mt)的膜从受污染样品中除去重金属的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于从受污染样品中除去重金属的组合物和方法。更具体地，本发明涉及利用具有结合到其上的金属硫蛋白的固体支持物从受污染样品除去重金属。
背景技术：
由于金属污染物对人类健康造成的毒性和潜在风险以及珍贵重金属的经济价值，金属回收和金属补救(remediation)以及对清除金属废物的高效安全方法的相关需求持续受到环境和商业方面的关注。事实上，随着来自农业、工业和其它商业运作的毒性污染排放的持续，对有效、安全且低成本的金属补救方法的需求也在增加。在United States EnvironmentalProtection Agency(US EPA)的近来的报告中，金属污染在很多受污染点已经成为人们重点关注的问题(US EPA Work Assignment#011059，Mar.5，1997，Contract#68-W5-0055)。此外，有大量公开的报导，涉及来自受污染土壤或废料的金属中毒对野生动物、牲畜、植物生命的危害以及对人类健康的威胁(Impact of Lead-Contaminated Soil on Public Health by Xintaras，C.May 1992，见http://www.atsdr.cdc.gov/cxlead.html)。例如，针对人类的主要关注问题是铅(Pb)污染造成的对健康的危害。对铅的暴露可发生于多种不同的过程中，例如，通过从食物、水、土壤摄入铅或者甚至从灰尘中吸入。铅中毒非常危险并且可能致命，其症状包括，痉挛(seizure)、意识迟缓以及行为紊乱。因此，用于金属补救的方法对于保护我们的环境以及对于针对疾病提供保护而言非常有价值。
从多种废物、弃物或再循环物品回收金属的努力提供了非常大的经济价值以及加强的环境污染控制。金属回收可来自无数的、变化的来源，例如来自废的电子设备(晶体管、芯片、变压器、汇流条、阴极以及微处理器、计算机电路板PCB、主板)。不进行金属收回时，与工业废物的处置相关的成本非常大。因此，金属再利用或对从废料或丢弃的含金属物品提取的金属的再次利用，不仅减少了需要特别的处置及操作付出的金属废物的占地和成本，并且收回的金属还可重新售卖，或者再次用于提供另外的经济价值。
现有技术对于处理金属污染的手段传统上使用下述清除技术，该技术主要由物理去除以及之后对受污染物质的处置构成。该方法不仅劳动强度大、效率低，并且还造成与对大量受污染废料的去除和处置相关的高昂费用。金属污染尤其难于补救，因为与其它类型废物(例如化学或有机物质)不同，金属不能直接被破坏或转化。例如，目前用于补救被金属污染的土壤的技术主要是通过对金属污染物的物理或化学分离来进行垃圾掩埋或土壤挖掘。对受污染地下水的处理通常涉及冲洗、过滤或化学提取，以去除污染性金属。结果，土壤或地下水补救的成本很高，在每个位置进行五年的成本在数亿至数十亿不等。
此外，重金属污染对人类和环境的风险并不局限于土壤或地下水，其还包括其它来源，例如工业废物、矿泥废物、废水、放射性废物(例如来自研究和医疗废物的放射性核)以及采矿废物。取决于待去除的金属污染物的物理和化学形式，以及对特定补救手段的成本效益分析，对特定位置来说现有技术中哪种更合适将有所不同。但是，由于传统清除技术的高成本，人们仍很需要较不昂贵的、安全且有效的重金属回收和清除技术。
目前有很多技术可用于对受重金属污染的废物的回收或补救。通常，这些技术组合下述常见手段的一种或多种分离、固定、毒性降低、物理分离或从废品中提取金属污染。分离技术利用封闭策略，企图限制受污染的位置或区域，以防止毒性金属废物的进一步散播。固定技术能减少金属污染物的移动性，其包括下述系统，所述系统提供不可透过的屏障，用于将土壤下层(含有金属污染物)与上层土壤分开。还使用物理屏障，其能限制未受污染的地下水流经受污染位置。此外，还有一些毒性降低方法，其通常使用化学或生物技术，用于降低金属污染物的毒性或移动性。毒性降低方法还包括应用较新生物技术手段的生物处理技术。
金属补救是生物处理技术的相对新的应用，其包括下述方法，例如生物积累、植物补救(phytoremediation)、植物提取(phyotextraction)以及根际过滤(rhizofiltration)。所有这些生物处理都使用某些植物和微生物，用于通过吸附、吸收或浓缩污染型金属离子来对金属加以补救。例如，在生物积累中，植物或微生物主动从受污染环境中吸取并积累金属。
在植物补救中，使用已具有选择性地从土壤去除金属离子的能力的特定植物。此类植物包括某些“超积累”物种，例如阿尔卑斯菥蓂(alpinepennycrass)植物，其能在展示出毒性症状之前，以大多数植物260倍高的水平积累金属。但是大多数超积累植物生长非常慢，而且具有特定的生长需求。这些生长需求中的一些不利于在需要金属回收或补救的位置或状态使用这些植物。此外，对于回收或补救用途而言，仅已知或仅可获得非常少的植物物种。因此，考虑到在环境中和在废物位置金属污染持久且较高的发生率(在Superfund位置的大约75％含有处于污染形式的金属离子，U.S.EPA，1996)，人们仍然需要更高效的方法和手段用于从受污染来源除去重金属。
更近年来，在一种企图满足这些需求的尝试中，人们使用了生物技术手段，作为替代性策略，用于金属回收和补救。这些生物技术手段包括使用已被改造成能表达金属硫蛋白基因的烟草植物(Maiti et al.Seed-transmissible expression of mammalian metallothionein in transgenic tobacco，Biochem Biophys Res Commun.150(2)640-7，1988)。金属硫蛋白(MT)是动物界普遍分布的小的金属结合蛋白。它们具有高的金属结合亲和性，人们相信它们对于控制游离金属离子的细胞内水平是重要的。但是，除此之外，对于它们的功能或生物学目的知之甚少。金属硫蛋白于1957年在马的组织中首次发现。从那以来，它们已在从真菌和水母到小鼠和人类范围的物种中得到了鉴定。
MT的结构特征包括高半胱氨酸组成，并且缺乏芳香族氨基酸。半胱氨酸残基负责蛋白高亲和性的金属离子结合能力。通常，MT具有高度的氨基酸序列相似性。但是，蛋白或编码蛋白的已知基因序列主要用于研究情形或者用于疾病治疗方法。
因此，本发明的一个目的是提供新颖的金属结合蛋白，用于从多种底物中除去金属。该技术将允许高效、经济、安全且简单地从环境废物或者被重金属污染的其它材料中除去重金属。
发明内容
金属硫蛋白(MT)通常大小为大约60-68个氨基酸残基，其在不同物种间具有高度的序列保守性。相反，来自丰年虾(brine shrimp)(Artemia)的MT大小小很多(大约48个氨基酸残基)，并且具有明显独特的氨基酸和DNA序列。本发明的金属结合蛋白能高容量并且高亲和性地结合金属。这使得它们特别适合用于污染控制、金属再利用、金属开采以及其它金属回收和金属补救技术。
这些和其它目的是通过本发明的组合物和方法来获得的，其提供了从多种来源高效可信地螯合重金属的方法，这是使用由至少一种被固定于固体支持物上的金属结合蛋白构成的再生性金属结合支持物来实现的。金属结合蛋白可容易地表达和生产，并用于下述目的，例如金属补救、金属再利用、金属开采或其中需要结合一种或多种重金属的其它类型的方法。
根据本发明的教导，提供了至少一种高度纯化的结合蛋白。在本发明的一种实施方式中，金属结合蛋白来自丰年虾(Artemia)，其具有SEQID NO.2或SEQ ID NO.4的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2MET ASP CYS CYS LYS ASN GLY CYS THR CYS ALA PRO ASN CYS LYS 15CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS CYS LYS GLY CYS GLU CYS LYS SER 30ASN PRO GLU CYS LYS CYS GLU LYS ASN CYS SER CYS ASN SER CYS 45GLY CYS HIS 48SEQ ID NO.4MET ASP CYS CYS LYS ASN GLY CYS THR CYS ALA PRO ASN CYS LYS 15CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS 22在本发明的另一种实施方式中，金属结合蛋白序列包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的一种或多种保守氨基酸取代。应当注意，虽然将在金属回收以及金属补救的上下文中讨论金属结合蛋白，但是所述蛋白可以容易地应用于其中需要除去、回收或简单地结合重金属或重金属复合物的多种其它用途。
进一步根据本发明的教导，新颖的金属结合蛋白可作”裸”的组合物使用，或可与支持物或其它运送系统联合提供，以协助金属结合蛋白在本文公开的金属回收、金属补救或金属结合过程中的的分散、操作、包装或发挥作用。因此，本发明的任何金属结合蛋白可与支持物例如膜过滤器偶联，形成再生性金属结合支持物，含金属的流体经其发生接触。
本发明特别适用于金属回收、金属补救、金属再利用的过程和方法。这些方法包括将具有与来自丰年虾(Artemia)的至少一种金属结合蛋白序列类似的氨基酸序列的本发明的金属结合蛋白与具有一定浓度的至少一种重金属的底物或材料接触，从而将金属结合至金属结合蛋白；以及接着将结合的金属与底物或材料分离。
例如，本文公开的金属结合蛋白以及包含它们的设备可用于对具有一定浓度的至少一种金属(例如重金属)的任何底物的处理。本领域技术人员应当知道，此类含重金属的底物可以是含有一定浓度金属的任何环境或工业材料，例如地下水、饮用水、受污染的土壤、废物等。类似地，本发明的方法同样可用于处理含有需要被去除的金属的工业或城市废物。该广阔的应用范围使得本发明的组合物及相关方法在很大范围的各种不同环境中都特别有用。
本发明的金属结合蛋白在多种条件下保持对重金属的高结合亲和性，使得它们特别适用于当人们想从底物或含金属或受金属污染的任何来源去除或回收重金属的情况。本发明的金属结合蛋白及相关方法提供了对从多种不同的底物高效、经济及安全的去除和回收重金属的方法。
在本发明的设备的一种实施方式中，用于从底物去除重金属的设备包括再生性金属结合支持物，其中包含与之相连接的聚合物膜，以及至少一种高度纯化的金属硫蛋白(MT)或其一部分，所述金属硫蛋白(MT)或其一部分来自选自哺乳动物、鱼类、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、爬行动物、线虫类、谷物和酵母构成的组的生物；其中再生性金属结合支持物结合重金属，由此从底物除去重金属；重金属与再生性金属结合支持物的结合是可逆的，并且其中再生性金属结合支持物可重复使用。
在本发明的设备的其它实施方式中，哺乳动物是人、猴或兔；鱼是鲶鱼；软体动物是贻贝；棘皮动物是海胆；爬行动物是青蛙，谷物是水稻或小麦，甲壳动物是丰年虾(Artemia)。
在本发明的设备的另一种实施方式中，MT蛋白具有选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.23构成的组的氨基酸序列。
在本发明的设备的又一种实施方式中，所述聚合物膜是尼龙。
在本发明的设备的再一种实施方式中，所述底物是液体。
在本发明的设备的另一种实施方式中，所述重金属是重金属复合物。
在本发明的方法的一种实施方式中，提供了用于从底物除去金属的方法，所述方法包括将其中含有重金属的底物与再生性金属结合支持物接触，所述支持物包含聚合物膜，所述膜连接有至少一种高度纯化的金属硫蛋白(MT)或其一部分，所述金属硫蛋白(MT)或其一部分来自选自哺乳动物、鱼类、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、爬行动物、线虫类、谷物和酵母构成的组的生物；使重金属与再生性金属结合支持物结合，由此产生其中含有较少重金属的底物。
在本发明的方法的另一种实施方式中，所述聚合物膜是尼龙。
在本发明的方法的再一种实施方式中，所述重金属是重金属复合物。
在本发明的方法的又一种实施方式中，所述底物是液体。
在本发明的方法的另一种实施方式中，所述方法还包括从再生性金属结合支持物释放出结合的重金属；以及使再生性金属结合支持物的金属结合能力再生。
图1是本发明的示例性金属结合蛋白的洗脱曲线，其展示了金属结合蛋白与重金属锌的共洗脱。
图2是根据本发明教导的示例性克隆盒的图谱，其含有金属结合蛋白基因的基因序列。
图3是根据本发明的教导能选择性结合溶液中重金属的金属硫蛋白(MT)。
图4展示了根据本发明的教导与固体支持物偶联的MT蛋白。
图5展示了根据本发明的教导从水中对重金属的去除。
图6展示了根据本发明的教导从涂布有MT蛋白的膜上对被去除的金属的回收。
图7展示了本发明用于结合重金属的选择性和亲和性。
图8描述了从不同物种分离的金属硫蛋白之间半胱氨酸金属结合基元的序列同源性。
发明详述已知从多种物种(例如人、小鼠、细菌物种、螃蟹、鱼类、酵母和鸡)分离的金属结合蛋白(例如金属硫蛋白)具有非常相似的结构特征，例如相似的大小(大约6.0-6.8kDa)，高氨基酸序列保守性以及蛋白质的整个氨基酸组成中半胱氨酸残基的高百分比。这些MT的半胱氨酸组成赋予蛋白对于重金属的结合亲和性，所述重金属包括但不限于砷、锌、铜、镉、汞、钴、铅、镍、铬、铀、铂、银和金。除非另有说明，术语蛋白表示蛋白、多肽和肽。本发明的金属结合蛋白也结合重金属复合物，其中重金属与蛋白或其它分子结合。
例如，本文公开的金属结合蛋白及包含它们的设备(被称为再生性金属结合支持物)可用于对具有一定浓度的至少一种金属(例如重金属)的任何底物的处理。本领域技术人员应当知道，此类含重金属的底物可以是含有一定浓度金属的任何环境或工业材料，例如地下水、饮用水、受污染的土壤、废物等。类似地，本发明的方法同样可用于处理含有需要被去除的金属的工业或城市废物。该广阔的应用范围使得本发明的组合物及相关方法在很大范围的各种不同环境中都特别有用。
本发明的金属结合蛋白和再生性金属结合支持物可用于对来自含金属底物的金属，特别是珍贵金属加以回收。例如，本发明的金属结合蛋白可用于金属开采过程，用于分离和移出珍贵金属，例如金、铂和银。这样做消除了在从矿石进行金属纯化的最终阶段使用其它毒性材料(例如氰化物)的需要。这些同样的新颖技术可用于从工业或城市废物中回收金属。随着对一次性电子设备和其它电子设备的日益增长的使用，此类废物来源日益充满此类金属，使得回收的努力变得有价值。
本发明的金属结合蛋白可从天然来源容易且高效地分离，或者可按照本文公开的来合成生产，用于金属回收、金属开采、金属再利用、金属补救、污染控制或包括金属螯合在内的任何方法。因此，本发明的金属结合蛋白及相关方法提供了通用的、容易实现的、高效且可信的办法，用于金属结合相关方面的任何方法。
在本发明的一种实施方式中，金属结合蛋白分离自丰年虾(Artemia)。Artemia MT是被称为“异构体(isomer)”的金属结合蛋白家族。对这些蛋白的独特氨基酸组成的分析显示，每种同源异构体(isoform)都是基本等同的。根据本发明的教导，已鉴定出了至少五种个体Artemia MT同源异构体。与来自其它生物的、共享高度序列同源性或相似性的MT不同，Artemia金属结合蛋白具有出人意料的不同的结构特征，并且具有互相之间的高度序列同源性。
下述技术被用于提供编码Artemia金属结合蛋白的核酸序列。首先，来自丰年虾(Artemia)的金属结合蛋白被分离和纯化。在经分离的金属结合蛋白上进行N末端氨基酸序列分析。氨基酸序列分析显示，Artemia金属结合蛋白的首六个半胱氨酸残基的金属结合基元较之兔和人的MT是保守的，这暗示了这些氨基酸残基在蛋白的金属结合功能中的重要性(Hamer DH，Metallothionein.Ann.Rev.Biochem.55813-51，1986)。富含半胱氨酸的金属结合基元的这种保守性在多种不同的物种中都存在(图8)。
使用该N末端氨基酸序列信息，按照本领域所已知的，构建出对应于N末端氨基酸序列的寡核苷酸引物。这些寡核苷酸引物被用于通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增针对下述MT基因序列的候选者，所述MT基因序列编码来自丰年虾(Artemia)的至少一种目标金属结合蛋白。使用QiaPrep旋转柱(Qiagen，Inc.)来纯化PCR产物，使用厂商的方案，将其克隆进TA克隆载体CR 2.1(Invitrogen)。用重组载体转化电感受态Escherichia coli(来自Invitrogen的Sure Shot细胞)，将其涂布到含有氨苄青霉素(100μg/ml)和1％葡萄糖的LB琼脂平板上。在37℃使平板放置过夜。挑出个体菌落，将其用于接种补充有氨苄青霉素和1％葡萄糖的5ml LB培养基。培养物在旋转式温育箱中于37℃温育过夜。按照厂商的方案(Qiagen)，使用QiaPrep旋转柱从2mL细胞悬浮液中分离出质粒。然后再使用M13通用正向和反向引物，在Li Cor4200L上对质粒进行测序。一旦验证和确定为编码金属结合蛋白的序列，将丰年虾MT基因亚克隆进细菌表达载体pTMZ。基于鉴定出的MT编码序列，确定了本发明的第一种新颖的金属结合蛋白的氨基酸序列。
图1详细描述了使用本发明的示例性金属结合蛋白的洗脱曲线。该曲线是用下述示例性方案获得的。用在pTMZ中含有SEQ ID NO.1的MT基因序列的质粒表达载体转化E.coli(菌株ER 2566)。细菌于37℃被培养于含有1％葡萄糖的LB培养基，培养至0.6的A600。收集细菌细胞，将其重新悬浮于含有0.1％葡萄糖的LB培养基中，在同样的温度下培养45分钟。加入异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM。对细菌细胞进行大约16小时的培养。未转化细胞被用作为对照。通过离心收集细胞，将其在10mM Tris，pH8.0，5mM二硫苏糖醇(DTT)和0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)中进行超声波处理。在4℃，以150,000×g对均质物进行1小时的离心。收集上清液，与2μCi的109Cd在室温下一起孵育。然后将经放射标记的上清液应用于G-50分子排除柱，用50mMTris，pH8.0洗脱。收集5ml的级分，针对放射活性(CPM)和锌(Zn)进行检验，锌是与经转化细菌表达的外源金属结合蛋白连接的内源金属。通过ICPMS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy)针对Zn对从柱上洗脱下来的每个级分加以检验。编码功能性金属结合蛋白(其包括但不限于SEQ ID NO.3)其它核苷酸序列也可以使用，如本发明的教导提供和公开的。
因此，本发明提供了经高度纯化的金属结合蛋白，用于将金属从含金属的底物上除去，这是通过金属与固定于固体支持物上的金属结合蛋白的可逆结合来实现的。术语“经高度纯化的”在本文中使用时指已从其天然环境移出、分离或分开的核酸、氨基酸或蛋白质，并且它们不含其天然连接的其它组分的至少60％，优选75％，90％或更多。
根据本发明的教导的经高度纯化的金属结合蛋白具有类似于SEQ ID NO.2MET ASP CYS CYS LYS ASN GLY CYS THR CYS ALA PRO ASN CYS LYS 15CYS ALA LYS ASP CYS LYS CYS CYS LYS GLY CYS GLU CYS LYS SER 30ASN PRO GLU CYS LYS CYS GLU LYS ASN CYS SER CYS ASN SER CYS 45GLY CYS HIS 48的氨基酸序列。
本发明的范围内还包括下述经高度纯化的金属结合蛋白，它们是上述SEQ ID NO.2的序列的变体，并且保留有该蛋白的金属结合亲和性。特别地，在本发明范围内的保守氨基酸取代可包括下述任何取代(1)异亮氨酸取代亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸取代异亮氨酸以及缬氨酸取代亮氨酸或异亮氨酸中的任何取代；(2)天冬氨酸取代谷氨酸以及谷氨酸取代天冬氨酸中的任何取代；(3)谷氨酰胺取代天冬酰胺以及天冬酰胺取代谷氨酰胺中的任何取代；以及(4)丝氨酸取代苏氨酸以及苏氨酸取代丝氨酸中的任何取代。
“保守氨基酸取代”在本文中使用时指通过用具有相似结构或化学性质的氨基酸进行取代造成的对氨基酸序列的改变。本领域技术人员将能确定何种氨基酸残基可被取代、插入或改变，而不会影响本发明蛋白的金属结合属性。
其它取代也可能被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境。例如，甘氨酸和丙氨酸可互换使用，丙氨酸和缬氨酸也同样如是。相对疏水的甲硫氨酸常常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，一些时候可以与缬氨酸互换。赖氨酸和精氨酸在下述位置可互换使用，该位置处，氨基酸残基的显著特征是其电荷和这两个氨基酸残基的不同的pK，并且该处它们不同的大小并非关键的。在特定环境下，其它变化也可能被认为是保守的，这是本领域已知的。
例如，如果蛋白质表面的氨基酸不涉及与另外的分子(例如另外的蛋白亚基或蛋白结合的配体)之间的氢键或盐桥相互作用，那么带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)可被带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)取代，反之亦然。比精氨酸或赖氨酸碱性更弱、在中性pH下部分带电荷的组氨酸一些时候也可取代这些更偏碱性的氨基酸。此外，酰胺(谷氨酰胺和天冬酰胺)一些时候可取代它们的羧酸同源物(谷氨酸和天冬氨酸)。
本发明的Artemia金属结合蛋白以及其相关生产方法和用途，是具有多种异构形式的金属结合蛋白家族。结果，本发明包括适合用于除去或回收重金属的、Artemia金属结合蛋白的至少五种异构形式。异构体是具有相同化学组成但结构形式不同的两种或多种化合物。本发明的“异构体”具有将它们分类为金属结合蛋白的必不可少的结构特征。这些特征包括它们的高半胱氨酸含量，这赋予它们金属结合能力。异构体在两个或多种氨基酸残基上有所不同，导致对于个体异构体而言不同的pl。该pl差异允许对异构体容易的分离和分析。因此，本发明的金属结合蛋白可高效且容易地表达和生产。
除了它们的金属结合性质之外，这些金属结合蛋白还展示出令它们特别适用于多种不同的金属回收和金属补救情形的特征。例如，这些金属结合蛋白能在一定范围的条件下与重金属结合，例如在中等至高温条件下。金属结合蛋白能在室温下结合重金属，因此对于很多应用来说特别理想。金属结合蛋白还能在宽广的温度范围内结合重金属，例如，大约4℃至大约100℃的温度范围内。本领域技术人员将知道，取决于其中将利用金属结合蛋白的特定应用或操作，基于操作或经济原因，特定的温度范围可能是优选的。例如，“原位”使用或在环境污染的位置(这规定了在可接受的成本内可获得的特定温度范围)使用金属结合蛋白可能更为实用。另一方面，对于某些底物的更为有效的金属提取可通过在相对高的温度条件下使用本发明的金属结合蛋白来获得。因此，根据本发明的教导，用于实践本发明的合适的温度范围是大约4℃至大约100℃的范围。该温度条件范围使得本发明的金属结合蛋白更为通用及有用。
此外，根据本发明的教导，金属结合蛋白可作”裸”的组合物使用，或可与支持物或其它运送系统联合提供，以协助金属结合蛋白在金属回收、金属补救或金属结合过程中的的分散、操作、包装或发挥作用。此类金属结合蛋白特别适用于金属回收、金属补救或金属结合过程，因为它们较之将使用者暴露给毒性或潜在危险的其它类型化学物质的其它方法(例如化学提取)更为容易和安全。
用于协助对新颖的金属结合蛋白的操作或分散的大量固体支持物都可使用，其包括亲水性膜、部分亲水性膜、复合膜、多孔有机固体支持物、无孔有机固体支持物、多孔无机固体支持物、无孔无机固体支持物及其组合。如果固体支持物是膜，例如U.S.Pat.Nos.5,618,433和5,547,760(它们都通过引用整体并入本文)所述的膜是示例性的。如果固体支持物是无机或有机颗粒固体支持物，那么优选的固体支持物包括沙子、二氧化硅、硅酸盐、硅胶、玻璃、玻璃珠、玻璃纤维、氧化铝、氧化锆、氧化钛、氧化镍聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、多酚以及U.S.Pat.Nos.4,943,375、4,952,321、4,959,153、4,960,882、5,039,419、5,071,819、5,078,978、5,084,430、5,173,470、5,179,213、5,182,251、5,190,661、5,244,856、5,273,660和5,393,892中描述的其它物质，这些文献都通过引用并入本文。特定的例子包括弹性的膜、珠粒或颗粒、过滤器或本领域已知可用于分离的任何其它固体支持物。
在一种示例性实施方式中，固体支持物以膜的形式存在。优选地，膜是聚合物，更优选地，是选自氟化聚合物、聚烯烃、聚苯乙烯、被取代的聚苯乙烯、聚砜(polysulfone)、聚酯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯；乙烯基聚合物、丁二烯和苯乙烯的共聚物、氟化的乙烯-丙烯共聚物、乙烯氯三氟乙烯共聚物、尼龙及其混合物构成的组的成员。
本发明的金属结合蛋白与支持物(例如聚合物膜)通过金属结合蛋白与聚合物之间的共价键合或通过非共价结合(例如但不限于，静电引力、分散力、溶剂介导的力)相连。
在本发明的一种实施方式中，至少一种金属结合蛋白与与固体支持物相连，使得再生性金属结合支持物得以提供，其中，所述再生性金属结合支持物能结合来自底物的重金属，重金属可从再生性金属结合支持物释放，该再生性金属结合支持物可重复使用以结合重金属。
通常，将其中待除去一种或多种金属种类的底物与结合到固体支持物上的金属结合蛋白相接触，其中所述金属结合蛋白具有针对重金属的亲和性。固体支持物形成对金属结合蛋白的支持，其可以是膜、珠粒或固体支持颗粒的形式，或者通常用于生物化学或化学分离的任何其它形式。如果用膜作为固体支持物，金属结合蛋白-固体支持组合物可被引入下述接触设备，所述设备包括容纳区(housing)，例如装药管(cartridge)，其含有本发明的物质的组合物，通过将含有想要的离子的溶液流经该装药管由此与本发明的组合物接触来实现。在一种实施方式中，膜的构型是有褶皱的膜，虽然其它膜的构型，例如扁平薄片、堆叠的盘或中空纤维也可使用。但是，多种接触装置可代替装药管使用，其例如但不限于盒、注射器、单元(unit)、罐筒(canister)、多孔板或过滤器架(filter holder)。如果使用固体支持物，可以使用本领域已知的分离柱。
应当注意，金属结合蛋白的其它特征是，它们还能进行可逆的重金属结合。例如，可以使用酸性条件或通过瞬时交换反应或无机螯合剂来从金属结合蛋白上洗脱下或洗脱出结合的金属。例如，在对金属结合蛋白与放射性Cd的孵育期间，109Cd金属与金属结合蛋白结合的内源金属发生交换。在大约pH10.0时，金属从蛋白上释放。将溶液pH调节至大约8.0使得蛋白产生金属结合活性。因此，由于新颖的金属结合蛋白的可逆结合特性，本发明还提供了下述组合物、配方、粉末、液体、设备或装置，它们包含可利用不止一次的经高度纯化的金属结合蛋白。
现在来对本发明的金属结合蛋白的遗传工程改造进行示例性的讨论，如前文所述，鉴定出了来自丰年虾(Artemia)的金属结合蛋白异构体之一的核苷酸序列。通常，分离过程包括(1)制备含有来自丰年虾(Artemia)的核酸的一种或多种样品；(2)从Artemia分离总RNA；(3)从总RNA制备cDNA；(4)扩增金属结合蛋白的基因序列；以及(5)对作为来自丰年虾(Artemia)的金属结合蛋白基因(MT)的经分离的核酸序列进行克隆、测序和验证。
上述过程产生了针对一种金属结合蛋白基因，即金属硫蛋白(MT)，的整个编码序列。该序列是SEQ ID NO.15′-ATG GAC TGC TGC AAG AAC GGT TGC ACC TGT GCC CCA AAT TGC AAA45 TGT GCC AAA GAC TGC AAA TGC TGC AAA GGT TGT GAG TGC AAAAGC 90 AAC CCA GAA TGC AAA TGT GAG AAG AAC TGT TCA TGC AACTCA TGT 135 GGT TGT CAC TGA-3′147不同的物种(诸如人类和小麦这种差异程度的物种)都表达出了具有针对重金属的相似的结合亲和性的金属硫蛋白。这些MT蛋白含有12至22个半胱氨酸残基，它们在不同物种间保守。这些半胱氨酸残基组成了负责蛋白的金属结合功能的金属结合基元(Hamer DH，Metallothionein.Ann.Rev.Biochem.55813-51，1986)。因此，本发明的一种实施方式提供了固定在固体支持物(例如，膜)上的MT蛋白，其中，MT从下述生物分离得到，所述生物包括但不限于哺乳动物、鱼类、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、爬行动物、线虫类、谷物和酵母。这些生物的非限制性离子包括但不限于丰年虾(Artemia)、兔(Oryctolagus cuniculus)、绿猴(Cercopithecus aethiops)、人(Homo sapiens)、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、蓝贝(Mytilus edulis)、有色海胆(Lytechinus pictus)、果蝇(Drosophila melanogaster)、蛔虫(Caenorhabditis elegans)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticumaestivum)和酵母(Canduda glabrata)。
本发明的一种实施方式提供了编码经高度纯化的下述金属结合蛋白的一种或多种核酸序列，所述金属结合蛋白具有与来自下述生物的至少一种金属硫蛋白类似的氨基酸序列，所述生物包括但不限于Artemia、哺乳动物和海洋物种，或具有下述金属硫蛋白的其它物种，所述金属硫蛋白较之Artemia MT，在半胱氨酸残基(例如金属结合基元)中具有保守的氨基酸序列同源性(图8)。
本发明的另一种实施方式提供了编码经高度纯化的下述金属结合蛋白的一种或多种氨基酸序列，所述金属结合蛋白与来自下述生物的至少一种金属硫蛋白类似，所述生物包括但不限于Artemia、哺乳动物和海洋物种，或具有下述金属硫蛋白的其它物种，所述金属硫蛋白较之ArtemiaMT，在半胱氨酸残基(例如金属结合基元)中具有保守的氨基酸序列同源性(图8)。示例性的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NOs.11-23的序列(图8)。
或者，经分离的核酸可包含足以允许功能性金属结合蛋白翻译的最小程度的DNA序列。功能性金属结合蛋白无须是整个的活性金属结合蛋白，但其可以是SEQ ID NO.1中编码能与重金属结合的蛋白的那些部分或区域。因此，本发明还包括经分离的核酸，所述核酸包括与具有SEQ IDNO.1的1-66位核苷酸的序列的DNA分子具有至少80％序列同一性的DNA。
编码本发明中任何新颖的金属结合蛋白的核酸序列也在本发明范围内。此类新颖的金属结合蛋白可具有大约5,800道尔顿的分子量，其能以高亲和性与重金属(例如，砷、锌、铜、镉、汞、钴、铅、镍、铂、银和金)离子结合。新颖的金属结合蛋白在本文中包括选自下述组的氨基酸序列，所述组由SEQ ID NO.2和包括对SEQ ID NO.2的一处或多处保守氨基酸取代的序列构成，其中所述保守氨基酸取代是下述中的任何(1)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的任何一种取代任何这些氨基酸；(2)天冬氨酸取代谷氨酸，反之亦然；(3)谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；以及(4)丝氨酸取代苏氨酸，反之亦然。使用标准遗传编码可以确定替代性的核酸序列；对于该序列中的每个氨基酸，可以容易地确定替代性的密码子。
应当注意，虽然本文提供的经分离的核酸可用于生产或表达新颖的金属结合蛋白，它们还特别有用于分离和鉴定编码本发明的新颖的金属结合蛋白的额外的金属结合蛋白基因。例如，使用本发明提供的策略、示例性方法和核酸序列，可以获得编码任何金属结合蛋白异构体的DNA序列。因此，本发明包括编码本发明金属结合蛋白的任何及全部异构体或替代形式的核酸。此外，经分离的核酸无须包含MT异构体的整个编码序列，其包括下述核酸序列即可，所述核酸序列编码编码MT异构体的编码序列的部分或结构域，例如本发明金属结合蛋白异构体的功能性或金属结合区域。
本发明的另一方面是载体，其包含根据本发明的核酸序列，所述核酸序列与至少一种控制序列可操作地相连，所述控制序列控制所述核酸序列的表达或调控。此类控制序列是本领域公知的，其包括操纵子、启动子、增强子、启动子相邻元件和复制起点。载体构建的技术，包括克隆、连接、填充缺口、使用聚合酶链式反应(PCR)、固相寡核苷酸合成，以及其它技术是本领域公知的，在本文中无须赘述。本发明的载体特别有用于通过经修饰的生物、宿主细胞或其它类型的表达系统来生产新颖的金属结合蛋白。本发明的金属结合蛋白可在细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中生产。用于在这些物种中的每一种中生产金属结合蛋白的合适载体和细胞是本领域技术人员公知的。
下面转而讨论本发明金属结合蛋白的用途。这些蛋白的示例性用途包括污染控制应用，例如金属补救、污染控制、金属再利用或金属开采。例如，金属结合蛋白可用于降低环境物质中重金属的浓度。所述物质可以是流体，例如地下水、泥浆、废水等。此外，金属结合蛋白可被引入用于污染控制的一种或多种组合物或设备。例如，金属结合蛋白可以以絮状或粉末形式用于现场应用，或者可在处理装备中作为膜过滤设备或其它类型的固体支持物设备的一部分用于从受污染底物去除重金属。
用于这些金属结合方法的金属结合蛋白可以作为从其天然来源纯化的产品提供，或者可通过生物工程技术来生产。例如，可通过转基因或经修饰的生物来生产金属结合蛋白。经修饰的生物包括转基因动物、细菌或植物。例如，经修饰的生物可以是转基因烟草植株，其基因组已被遗传改造为能表达本发明的一种或多种金属结合蛋白。经修饰的生物还可包括能在需要金属补救的受污染位置处或其中生长的生物物质或植株。通过经修饰的生物对金属污染物的提取还可从受污染的位置对毒性金属进行浓缩。这提供了额外的好处将重金属转化为更小的量，以及提供了更容易和更安全地操作以处置或进一步加工的最终产品。
用于降低底物中重金属浓度的方法包括将本发明的金属结合蛋白与具有重金属的底物相接触。在一种非限制性的实施例中，具有与来自丰年虾(Artemia)的至少一种金属结合蛋白序列类似的氨基酸序列的金属结合蛋白可与具有一定浓度的至少一种重金属相接触，以使重金属与金属结合蛋白结合。随后，可从底物分离结合的重金属，从而降低了原来的底物中重金属的浓度。
如前文所提到的，本发明的金属结合蛋白的额外有益特征包括它们释放结合的重金属的能力，这是使用酸提取、无机螯合剂和/或交换反应技术来实现的。这允许使用者在需要时从金属结合蛋白上洗脱下结合的重金属。一旦从本发明的金属结合蛋白上洗脱下重金属，金属结合蛋白就可被再生(或再利用)，以再次用于金属提取。因此，本发明还提供了使用包含金属结合蛋白的可重复使用的组合物、设备和装置来降低底物中重金属浓度的方法。
用于降低底物中金属浓度的方法中时，本发明的金属结合蛋白可以以下述方式提供，所述方式是适合其中将要使用金属结合蛋白的特定用途、状况、施予模式或环境的。例如，当用于金属补救或污染控制时，金属结合蛋白可与支持物(例如粉末)偶联并使用，例如，作为絮状以方便高效地使金属结合蛋白分散。
或者，金属结合蛋白可与膜、半透膜、过滤器或适于将金属结合蛋白足够暴露给含重金属底物的任何其它装置偶联，以结合或螯合来自底物的重金属。包含金属结合蛋白的膜或过滤器提供了处理地下水或废水的特别高效的手段，因为受污染的水可流经该膜或过滤器而被纯化，无须化学提取过程中所需的进一步清除过程。将金属结合蛋白与支持物或支持基质偶联还使得对金属结合蛋白的操纵更为容易，尤其是以大规模使用或工业应用时。
本发明的金属结合蛋白的用途不仅限于其中需要除去重金属的这些方法，其还包括其中需要获得从物质中回收或浓缩重金属的场合。例如，金属结合蛋白可用于金属开采，例如在对珍贵金属(包括金、铂和银)的回收中，或者可用于在有害条件下浓缩金属，例如含有放射性金属的有害废物。此类有害金属废物可来自大量的研究、商业或工业。
金属结合蛋白在从废物中浓缩放射性金属的用途还能减少将被处置的有害废物的量。减少有害金属废物的量还能降低某些个体将被暴露给的放射活性的水平。
用于降低物质中重金属浓度的方法包括在经修饰的生物中生产金属结合蛋白。经修饰的生物包括，例如，转基因生物或转基因宿主。例如，可使用本领域公知的分子和遗传工程技术，来修饰宿主或生物，例如虾、植物、细菌、酵母或藻类。使用例如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(New YorkCold Spring Harbor Press，2001)、Ausubel etal.Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers，1995)、US Dept Commerce/NOAA/NMFS/NWFSC Molecular BiologyProtocols(URLhttp://research.nwfsc.noaa.gov/protocols.html)或ProtocolsOnline(URLwww.protocol-online.net/molbio/index.htm)中描述的这些技术，提供了基因组被修饰以导致金属结合蛋白表达的生物。本发明的金属结合蛋白包括具有与来自丰年虾(Artemia)的至少一种金属结合蛋白序列类似的氨基酸序列的金属结合蛋白。可制备经修饰的生物，将其用于生产这些金属结合蛋白以及可用于本文提供的方法中的金属结合蛋白。
生产本发明的金属结合蛋白的经修饰的生物包括下述经修饰的生物，岂能生产具有与来自丰年虾(Artemia)的金属结合蛋白高度相似的氨基酸序列的至少一种金属结合蛋白。经修饰的生物还包括能生产下述金属结合蛋白的生物，所述金属结合蛋白具有与SEQ ID NO.2高度相似的氨基酸序列或其保守氨基酸取代。
或者，从经修饰的生物对本发明的金属结合蛋白的生产或表达不局限于金属结合蛋白的基因组表达，其还包括金属结合蛋白从经修饰的生物的表观遗传学(epigenetic)表达。用于从经修饰的生物获得表观遗传学表达的方法和技术包括，例如，本领域已知的腺病毒、腺相关病毒、质粒和瞬时(transient)表达技术。
本发明包括用于生产本发明金属结合蛋白的方法。例如，用于生产具有与来自丰年虾(Artemia)的至少一种金属结合蛋白类似的氨基酸序列的金属结合蛋白的方法包括提供表达系统，使用该表达系统来生产金属结合蛋白，纯化或分离金属结合蛋白以获得本发明的金属结合蛋白。
表达系统可以是下述系统，例如，传统制造装备。例如，可培养生物(例如丰年虾)，以及从丰年虾的组织纯化或提取本发明的金属结合蛋白。或者，使用能生产金属结合蛋白的遗传工程生物(如前文所述生产的)的生物制造系统可用于生产金属结合蛋白。例如，可以以大规模或小规模(取决于特定的需要)培养含有金属结合蛋白表达载体的细菌。然后可从细菌培养液中纯化出金属结合蛋白，将其用于金属结合过程。
因此，可通过在经修饰的生物活宿主细胞中表达编码金属结合蛋白的核酸序列，来生产本发明的金属结合蛋白。此类核酸序列包括，例如，MT基因(例如SEQ ID NO.1)，或编码MT基因的片段或功能性金属结合结构域的序列。
使用标准技术来纯化被表达的金属结合蛋白。用于纯化克隆的蛋白的技术是本领域公知的，因此无须再加详述。一种特别合适的纯化方法是使用被固定抗体(针对金属结合蛋白)的亲和层析。其它的蛋白纯化方法包括在离子交换树脂上进行的色谱、凝胶电泳、定点聚焦和凝胶过滤等。或者，可通过例如用试剂(例如，硫酸铵、丙酮或硫酸鱼精蛋白，以及本领域已知的其它方法)沉淀等方法，在本发明的金属结合蛋白从经修饰的生物表达之后，对其进行纯化。
本领域技术人员将从下述非限制性实施例对本发明进一步理解。
应当强调，这些实施例仅用于阐述本发明的原理和教导，不用于将本发明的范围限制为仅仅是示例性的丰年虾(Artemia)金属结合蛋白。
实施例1根据本发明的教导，下述示例性的方案描述了用于生产、纯化和分析本发明金属结合蛋白的方法。
样品制备作为分离金属结合蛋白的预先步骤，将Artemia丰年虾培养于人工海水(422.7mM NaCl、7.24mM KCL、22.58mM MgCl2·6H2O、25.52mMMgSO4·7H2O、1.33mM CaCl2·2H2O和0.476mM NaHCO3)中。在250ml补充有抗生素的AS中，于30℃和125rpm旋转下，对Artemia胞囊(cyst)(2.5g)进行48小时的培养。24小时后，收集向光性Artemia，再培养24小时，然后通过滤布过滤来收集。对虾进行称重，如果不立即使用的话，贮藏于-80℃。
然后在均质缓冲液(HB)(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.1mM DTT、0.5mM PMSF和10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)中对Artemia进行均质，并将其以4mL/gm虾湿重重新悬浮于HB中。将均质物流经Yamato LH-21均质仪(设定为800rpm)三次，经Miracloth(Calbiochem)过滤，在Sorvall SA-600旋转仪上于14300rpm，4℃对滤出物进行30分钟的离心。通过真空抽吸从上清液上层移出脂层，收集下层的上清液层，在Beckman50.2TI旋转仪上于40Krpm，4℃进行90分钟的离心。再次移出上面的脂层，在150K(150K sup)对较低的上清液进行离心。然后将150K sup立刻使用，或贮藏于-80℃。如果立刻使用的话，然后按照下文所述对该产物进行凝胶过滤。该凝胶过滤研究验证了金属结合蛋白结合重金属的能力。
凝胶过滤研究在Sorvall SA-600旋转仪上于8500rpm和4℃对150K sup进行30分钟的离心。然后将得到的上清液滤经HPLC鉴定过的0.45微米LC13Acrodisc过滤器(Gelman Sciences)。取20mL一份的经过滤150K sup，将其与2μL109Cd(0.066μCi)在4℃孵育20分钟，以对金属结合蛋白进行放射性标记。然后将样品应用到Sephadex G-50分子量排除柱(2.6cm×94cm)上，该柱预先用经N2饱和的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡过。在上样之前将一摩尔DTT(2μL)加入到级分60-100中，以在含有低分子量金属结合蛋白的级分中保持还原条件。用50mM Tris(pH8.0)以20mL/小时的流速对柱进行洗脱，同时在280nm监测洗出物。在洗脱期间，连续用N2吹扫缓冲液容器。用于氨基酸分析的样品不被放射性标记。
用Auto-Logic gamma计数器(ABBOTT Laboratories)来测定柱的级分的109Cd含量(CPM)。通过火焰式或炉式原子吸收光谱来测量锌的含量，并将其表示为PPB锌/级分。以前的研究表明，存在有两组金属结合蛋白，一组是高分子量的级分。但是，109Cd的大部分随着含锌金属结合蛋白的低分子量组洗脱下来。如图1所示，放射性金属结合蛋白具有对应于锌的峰的洗脱峰(大致而言，#50号的级分)。用BCA总蛋白试验试剂盒(Pierce)，按照厂商的方案来测定Sephadex G-50级分的蛋白浓度。然后在下述研究中鉴定本发明的金属结合蛋白的明显结构特征。
金属结合蛋白特征分析进行色谱和分子量研究，以确定金属结合蛋白的结构特征。使用的所有方案都如B.Harpham，″Isolation of Metal Binding Proteins From Artemia″，Master′s Thesis，California State University，Long Beach Library，1998之前所述。使用本领域公知，并且例如前文B.Harpham″Isolation of MetalBinding Proteins From Artemia″描述过的阴离子交换和反相色谱技术，对来自Artemia的金属结合蛋白进行纯化，其被测定为具有出人意料小于其它已知金属结合蛋白的分子量和氨基酸序列长度。在SDS-PAGE条件下，Artemia金属结合蛋白展示出大约5.8kDa的分子量，与之相反来自其它哺乳动物的金属结合蛋白具有6-7kDa的分子量。Artemia金属结合蛋白的蛋白分析表明其具有48个氨基酸的序列长度。Artemia MT氨基酸序列的长度出人意料并且显著地比其它已知的金属结合蛋白(范围为60至68个氨基酸残基)更短。
实施例2 对编码Artemia金属结金蛋白的基因进行克隆和测序使用RNAzol方法，从48小时的无节幼体(Artemia的幼虫阶段)提取总RNA。按照实施例1所述来制备48小时的无节幼体样品。然后用PolyTract Procedure(Promega，WI)从总RNA样品中分离出mRNA。使用Superscript和3′RACE试剂盒方案(目录号18373，Gibco/BRL，W1)，从mRNA产生cDNA，将其用于下述合成反应。
cDNA合成反应Artemia mRNA25μl(500ng)DEPC H2O 30μl10μM AP5μl将上述混合物在70℃孵育10分钟，然后在冰上放置1-2分钟。通过在10000rpm离心10秒来收集挥发的液体。将下述物质加入到上述RNA混合物中，以产生cDNA溶液10x PCR缓冲液10μl25mM MgCl210μl10mM dNTP5μl0.1mM DTT10μl然后混合上述得到的cDNA溶液，将其在42℃孵育5分钟。加入5μl的Superscript II RT，将混合物在42℃孵育50分钟，用于cDNA合成。通过将溶液在70℃孵育15分钟来终止逆转录反应，然后加入5μl RNase，将溶液在37℃孵育20分钟。然后将含有Artemia cDNA的终溶液贮藏于-20℃，直到用于下文所述的PCR扩增。
使用的最初PCR引物序列如下5’引物(N末端侧)被命名为“MT-Not I”(SEQ ID NO.5)，3’引物(C末端测)被命名为“dT-Spe I”(SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9)SEQ ID NO.5 5′-ACC TAT GCG GCC GCA AAT GGA CTG CTG CAA GAA C-3′SEQ ID NO.6 5′-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT A-3′SEQ ID NO.7 5′-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT C-3′SEQ ID NO.8 5′-GCA CCA ACT AGT GCC TTT TTT TTT TTT TTT G-3′.
然后将上述5’和3’引物用于下述扩增混合物。
PCR反应混合物10x PCR缓冲液 5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP 1μl10μM dT-SpeI 1μl10μM dT-NotI 1μl向上述PCR反应混合物中，加入Gem 50蜡珠至小管，将小管在80℃孵育2-3分钟。让蜡在室温硬化10-15分钟后，在硬化的蜡的顶部加入下述物质形成层灭菌H2O 36.5μlArtemia cDNA混合物 2μl
Taq聚合酶0.5μl然后将最终的混合物用于下述PCR扩增程序。
PCR程序最初在95℃变性3分钟，接着是29个如下循环94℃，1分钟49℃，1分钟72℃，1分钟72℃，10分钟保持于4℃。
扩增之后，在1.2％琼脂凝胶上对PCR产物验证扩增是否成功。然后使用Qiagen QIAquick Gel Extraction(Qiagen，CA)，对PCR产物进行纯化，用于随后的克隆。下述引物(其含有引入其序列的修饰性限制位点)被用于扩增和亚克隆含有丰年虾Artemia金属结合蛋白基因序列的经纯化PCR产物。
MT Nco I(含有Nde I位点的5’引物)SEQ ID NO.9 5′-GCT ACA CAT ATG TCC ATG GAC TGC TGC AAG AAC-3′MT Sal I(含有Sal I位点的3’引物)SEQ ID NO.10 5′-ACG AAC GTC GAC GCC TTT TTT TTT TTT TTT A-3′使用MT Nco I和MT Sal I引物，采用72℃的温度退火1分钟，扩增出Artemia MT核苷酸序列，随后将其克隆进pGEM3载体的Eco RI位点。亚克隆之后，可以容易地对克隆的金属结合蛋白基因加以修饰或进一步加工，用于表达、生产或者需要使用编码金属结合蛋白的经分离核酸的其它方法。
然后使用LiCor 4200L DNA测序仪来测定MT基因的整个编码序列。对来自Artemia的MT基因的序列比较显示其出人意外地具有与其它已知金属结合蛋白基因不同的序列。当将Artemia的MT基因序列与马和人MT进行比对时，在金属结合半胱氨酸残基位置处观察到了同源性。然后在下述研究中证实了本发明的示例性金属结合蛋白结合重金属的能力。
实施例3 Artemia MT的转基因烟草表达下面提供了示例性研究，其可在本发明的任何新颖的金属结合蛋白上进行，以协助对蛋白是否金属结合蛋白的验证。例如，本发明的金属结合蛋白能结合重金属，例如锌、镉和铜。经分离的蛋白结合重金属的能力被描述和详细阐述于本文公开的用本发明的示例性MT对E.coli进行的转化中，其如图1所示。
如前文所述，可按照本文提供的教导，来制造用于生产本发明的新颖的金属结合蛋白的经修饰生物。示例性的经修饰生物包括转基因烟草植株，其特别有用于本文所述的方法。
用于克隆进TOPO.CR2载体的MT的cDNA被称为pARTmt。针对MT的编码序列被克隆进基于pUC18的质粒，该质粒含有TMV衣蛋白的omega 5’非翻译区域，其与多克隆位点同框(in frame)(见图2)。这通过使用在5’引物上含有Nco I限制性位点以及在3’引物上含有Sal I位点的PCR引物，对来自pARTmt1的MT编码序列加以扩增来完成的。用Nco I和Sal I对PCR产物和载体每种都进行限制性处理，并进行纯化。然后使用T4 DNA连接酶将PCR产物连接进载体。通过电穿孔，用连接混合物转化DH5α细胞。用个体菌落接种LB培养基，培养过夜。分离出质粒，测序，以验证MT编码序列的存在和完整性。
移出Eco RI/Xba I盒，将其克隆进植物表达载体pSS上的相应位点。pSS载体含有组成型CMV启动子和转录终止子序列，它们与多克隆位点同框。将得到的pSSmt构建体在DH5α细胞中增殖、对其进行分离和测序，以按照前文所述验证MT基因的存在和完整性。
MT在烟草叶片中的表达用胞质pSSmt构建体通过电穿孔来转化A.tumefaciens，将其在含有抗生素的YEB培养基，pH7.4中于27℃培养过夜。收集细胞，将其重新悬浮于诱导培养基(YEB，pH5.8，抗生素和20μM乙酰丁香酮)中，在27℃培养过夜。第二天早晨，通过离心收集细胞，将其重新悬浮于渗透培养基(MMA缓冲液，含有抗生素和200μM乙酰丁香酮)中，至A600为1.5，在室温孵育2小时。将烟草(Nicotiana tabacum)叶片深浸于细菌悬浮液，放置在真空干燥器中。在30-40mbar的真空下对叶片加以渗透(infiltrate)。将叶片在室温下放置72小时，然后在液氮中碾磨为细粉，用10mM Tris pH8.0，0.05mM DTT，1mM PMSF来抽提。通过在30000xg离心来使溶液澄清，使用109Cd金属结合试验对上清液进行MT检验。在含有针对Artemia MT的基因的叶片中，金属结合活性是明显的(表1)。
表1处理 结合的Cd(CPM)缓冲液747未处理的叶片 5052经渗透的叶片I 12874经渗透的叶片II12763对烟草的稳定转化按照前文所述，对用pSSmt转化的A.tumefaciens的悬浮液进行培养。将烟草叶片切为小片(没有中央叶脉)，将其转移进灭菌的weck容器，其中含有50-100mL的细菌悬浮液(A600为大约1.0)，在室温下孵育30分钟。然后将叶子的小片转移到塑料培养皿中灭菌过的Whatman 3MM滤纸上，该滤纸已用灭菌水预先润湿过。用莎纶膜密封培养皿，将其在黑暗中于26-28℃培养两天。然后用含有抗生素的灭菌水洗叶子的小片，将其转移到MS II琼脂平板上。将这些小片在25℃培养3-4周，采用16小时的光周期。当芽开始形成时，移出芽，将其转移到MS III琼脂平板上，在25℃培养，采用16小时的光周期，直到根开始形成。将小的植株转移进含有MS III培养基的weck玻璃容器，在25℃培养大约两周，采用16小时的光周期。然后将幼植株种植进土壤。收集来自植株的幼叶片，按照上文所述针对MT活性对其进行检验，以确定转基因植株。
实施例4 用于从水中除去毒性金属的聚合物膜按照前文所述，从Artemia胚胎提取金属硫蛋白。将蛋白提取物(80mL)放置于沸水浴中，15分钟。在30000×g(16000rpm，SA600旋转仪中)、4℃下对溶液进行离心30分钟。将含有金属硫蛋白的上清液转移到含有60μL109Cd(Amersham Biosciences)的干净管中。将溶液混合良好，令其在室温静置5分钟。这允许放射性镉交换到金属硫蛋白上，并且给我们提供了在其纯化期间探测蛋白的方法。然后将溶液应用到100×4.8cm G-50分子排除柱上，用经50mM Tris，pH8.0饱和过的氮来洗脱。将15毫升的级分收集进含有25μL 1M DTT的管中。合并峰位置的金属结合活性物质，贮藏于4℃。溶液被称为MT。(见图3至图7)在中性pH下的金属结合将Pall Biodyne膜(Biodyne A和Biodyne B，0.45μm，Lot号分别为002245和035241)用作为固体支持物，用于这些实验。将1cm2的膜片放置在10ml Millipore玻璃过滤单元中。取10ml MT在真空下以大约100mL/分钟的流速流经该膜(见图4)。收集经过的流体用于蛋白分析。接着，取10mL镉溶液(0.1μg/mL CdCl2和10μL109Cd，在50mL水中)，在真空下流经该膜(图5)。然后洗两次膜，每次用10mL PBS来洗。对5ml合并的洗脱物进行放射活性分析。将膜从过滤单元移开，放置在12×75mm离心管中，在LKB gamma计数器中针对放射活性加以分析。作为对照，用未经MT处理的第二张膜重复进行该方案。该膜被称为“空白”。结果显示于表2中。
表2样品 MT膜空白Biodyne A 152,876 3768Biodyne B 158,762 1774结果显示，与膜结合的MT能从流经膜的金属溶液去除镉(作为109Cd)。没有MT的膜几乎不能(如果认为能的话)从溶液除去金属。
在变动的pH下的金属结合下面一系列的实验用于测定pH极端情况对蛋白在膜上的金属结合活性的影响。制备新鲜的MT样品用于这些研究。按照下文所述来制备用于这些实验的镉溶液将2μL109Cd加入1mL CdCl2水溶液(1ppm)。然后将100μL该放射性镉溶液加入到10mL下述每种溶液中PBS、10mM甘氨酸、150mM NaCl，pH 3.0，以及10mM H2CO3/HCO3、150mMNaCl，pH 10.1。仅Biodyne A膜被用于该研究。不用MT处理、用含有放射性镉洗的膜被用作为对照。膜被放置于Millipore过滤单元中，按照下文所述进行处理膜#1(空白)，用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#2，先用10mL MT溶液洗，接着用5mL含放射性镉的PBS洗。然后用非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#3，用10mL MT溶液洗，然后用5mL含有放射性镉的10mMH2CO3/HCO3、150mM NaCl，pH 10.1洗。然后用非放射性的、不含金属的10mM H2CO3/HCO3、150mM NaCl，pH 10.1洗两次膜，每次10mL。
膜#4，用10mL MT溶液洗，然后用5mL含有放射性镉的10mM甘氨酸、150mM NaCl，pH 2.0洗。然后用非放射性的、不含金属的10mM甘氨酸、150mM NaCl，pH 2.0洗两次膜，每次10mL。
按照上文所述，针对放射性对每种膜加以分析。结果显示于表3中。
表3样品 CPM膜1(空白) 174膜2 pH 7.5 33380膜3 pH 10.16890膜4 pH 2.0 651本实验展示，结合膜的MT能在7.5至10.1范围内的PH结合金属，但在pH 2时不行。一旦金属与MT结合，其可以通过将膜暴露给酸(pH＝2)来被回收(见图6)。通过将所有溶液直接加到膜上来进行这些实验。为评估在加入MT之前用缓冲液预平衡膜的效果，即，生效的金属结合的效率，按照下文所述来处理膜(Biodyne B)
膜#1(空白)，用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#2，先用10mL MT溶液洗，接着用5mL含放射性镉的PBS洗。然后用非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#3，预先用10mL不含金属的10mM H2CO3/HCO3、150mMNaCl，pH 10.1洗，接着用10mL MT溶液洗，然后用5mL含有放射性镉的10mM H2CO3/HCO3、150mM NaCl，pH 10.1洗。最后，用非放射性的、不含金属的10mM H2CO3/HCO3、150mM NaCl，pH 10.1洗两次膜，每次10mL。
结果显示于表4中。
表4样品 CPM膜#1 190膜#2 4218膜#3 7431在pH 10.1对膜进行平衡导致更好的蛋白与膜结合效率。
MT金属结合的特异性测量针对牛血清清蛋白(含有若干半胱氨酸残基，已知能结合重金属的蛋白)的结合亲和性/特异性。Biodyne A膜用于该实验。MT溶液的浓度被发现为大约7μg/mL。流经物的浓度等同于起始材料，这表明，与膜结合的量为ng(纳克)级的，因此表明蛋白的金属结合能力是显著的。因此，使用来自Pierce Chemical，Inc的2mg/mL BSA标准物，在D-PBS中制造7μg/mL和100μg/mL的BSA溶液。按照下述来制备镉结合溶液将1.5mL 1ppm CdCl2水溶液与3μL109Cd混合。溶液贮藏于4℃。试验按照如下所述来进行膜#1(空白)，用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#2，先用5mL MT溶液洗，接着用5mL含放射性镉的PBS洗。然后用非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#3，用5mL BSA溶液(7μg/mL)洗，然后用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#4，用10mL BSA溶液(100μg/mL)洗，然后用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
这些实验的结果显示于下表5中。
表5样品 CPM膜1 无MT 174膜2 MT(5mL) 1171膜3 BSA(5mL的7μg/mL) 77膜4 BSA(5mL的100μg/mL) 151**以不同的方式对该膜加以检验，其中，MT结合活性高于3000CPM。
在这些实验条件下，BSA不能从水溶液中除去金属，甚至使用MT浓度10倍高的BSA来制备膜都不行。该实验展示了与膜结合的MT用于从水或其它水性底物对金属进行补救的用途(见图7)。
温度对膜结合活性的影响这些结合实验用Biodyne A膜来进行。
膜#1(空白)，用5mL含有放射性镉的PBS洗。然后用非放射性、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#2，用10mL MT溶液洗，接着用预热至60℃的5mL含放射性镉的PBS洗。然后用预热至60℃的、非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
膜#3，用10mL MT溶液洗，接着用冷却至4℃的5mL含放射性镉的PBS洗。然后用冷却至4℃的、非放射性的、不含金属的PBS洗两次膜，每次10mL。
这些实验的结果显示于下表6中。
表6
样品 CPM膜#1 139膜#2 3886膜#3 2672实施例5 对兔和Artemia MT的比较用本发明的金属结合蛋白进行的金属补救可使用来自多种来源的金属硫蛋白来完成。兔肝MT作为冻干蛋白(Sigma)获得，其被溶解于400μL 50mM Tris，pH8.0，0.001M DTT中，至终浓度2.5mg/mL(兔MT贮液)。按照前文实施例4所述来纯化Artemia MT。
按照前文实施例4所述，通过将含MT溶液流经膜，来制备具有结合的Artemia MT或兔肝MT的膜。然后将这些膜(空白、结合有ArtemiaMT的膜以及结合有兔肝MT的膜)放置在13mm scintered玻璃过滤单元中，使10mL金属结合溶液(9000cpm的109Cd的贮液/25μL稀释至75μL/10mL PBS，以形成金属结合溶液)在真空下通过膜。然后在PBS中洗三次膜，在Packard gamma计数器中测量膜结合的放射性。在第二次实验中，更大量的Artemia MT与膜结合。这两次实验的结果见表7和表8。
表7样品 CPM膜1 空白 351膜2 Artemia(20mL与膜结合的)685膜3 兔(25μL的2.5mg/mL溶液)985表8样品 CPM膜1 空白 231膜2 Artemia(25mL与膜结合的)980与膜结合的金属硫蛋白，无论其来源，都提供了从水溶液除去金属的功能。此外，金属结合活性是应用到膜上的蛋白的量的函数，增加膜上的MT蛋白的量使得膜的金属结合活性增加。
最后，应当理解，本文公开的本发明的实施方式仅为阐述本发明的原理之用。本发明范围内的其它改动可被采用，因此，本发明不限于本说明书精确显示和描述的那些。
除非另有指明，在所有情况下，用于本申请文件和权利要求中的表示成分的量、性质的所有数字，例如分子量、反应条件等应被理解为是被术语“大约”修饰的。因此，除非有相反指示，下述申请文件和所附权利要求中示出的数字参数是约数，其可根据将由本发明获得的想要的性质而变动。至少，并且不企图限制权利要求范围的等同物原则的应用，每个数字参数应当至少按照报道的有效数字的数以及通过普通凑整技术来理解。尽管示出本发明的宽广范围的数字范围和参数是约数，但是特定实施例中示出的数值被尽可能精确地报道。但是，任何数值本身固有性地含有某些错误，这是在它们各自的试验测量中发现的标准偏差一定会导致的。
用于描述本发明(特别是在所附权利要求中)的术语“一个”、“这个”、“所述”和“该”及类似指代应被理解为包括单数和复数，除非本文另有指明或者上下文明显矛盾。本文中对数值范围的表示方法仅意欲用作为分别提到落入该范围的每个单独的值的简便表示法。除非本文另有指明，每个单独的值都被包括进申请文件，与它们在本文中被单独叙述一样。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序来进行，除非本文另有指明或者上下文明显矛盾。对本文提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅用于更好的阐述本发明，而不是对本发明的范围加以限制，除非另有要求保护。申请文件中没有任何语言应被理解为表示对于本发明来说必要的任何不要求保护的元件。
对本文公开的本发明的实施方式或替代性元件的分组不应被理解为限制。每个组成员可单独被提到或被要求保护，或者可以与本文中找到的其它元件或该组的其它成员任意组合。应当考虑到，为着方便和/或可专利性的理由，组的一个或多个成员可被包括进组或从中删除。当任何这类包括或删除发生时，本申请文件在本文中被认为含有经修改的组，由此满足对所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本发明的优选实施方式在本文中已被描述，其包括发明人已知用来开展本发明的最佳模式。当然，在阅读前述说明书之后，对这些优选实施方式的变化对于本领域普通技术人员来说将是明显的。本发明的发明人预期技术人员能适当利用此类变化，发明人意欲使本发明得以实施，除非本文另有说明。因此，本发明包括在适用法律允许的情况下，本文所附的权利要求叙述的主题的所有改变和等同物。此外，上述元件以其所有可能的变化进行的任何组合被包括在本发明内，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。
此外，在本申请文件全文中，大量专利和印刷文献被用作参考文献。上述引用的参考文献和印刷文献各自通过引用整体并入本文。
最后，应当理解，本文公开的本发明的实施方式仅作阐述本发明的原理之用。在本发明的范围内可使用其它变化。因此，可以以示例性方式，而非以限制性地，根据本文的教导来使用本发明的替代性构造。因此，本发明不限于精确显示和描述的那些。
序列表<110>MGP生物工艺有限公司罗杰·A·艾斯<120>使用被提供有经纯化金属硫蛋白(MT)的膜从受污染样品中除去重金属的组合物和方法<130>51302-00003<150>60/620,528<151>2004-10-19<160>23<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>147<212>DNA<213>Artemia sp.
<400>1atggactgct gcaagaacgg ttgcacctgt gccccaaatt gcaaatgtgc caaagactgc 60aaatgctgca aaggttgtga gtgcaaaagc aacccagaat gcaaatgtga gaagaactgt 120tcatgcaact catgtggttg tcactga 147<210>2<211>48<212>PRT<213>Artemia sp.
<400>2Met Asp Cys Cys Lys Asn Gly Cys Thr Cys Ala Pro Asn Cys Lys Cys1 5 10 15Ala Lys Asp Cys Lys Cys Cys Lys Gly Cys Glu Cys Lys Ser Asn Pro20 25 30Glu Cys Lys Cys Glu Lys Asn Cys Ser Cys Asn Ser Cys Gly Cys His35 40 45<210>3<211>66<212>DNA<213>Artemia sp.
<400>3atggactgct gcaagaacgg ttgcacctgt gccccaaatt gcaaatgtgc caaagactgc 60aaatgc 66<210>4<211>22<212>PRT<213>Artemia sp.
<400>4Met Asp Cys Cys Lys Asn Gly Cys Thr Cys Ala Pro Asn Cys Lys Cys
1 5 10 15Ala Lys Asp Cys Lys Cys20<210>5<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>5′引物(N末端侧)，被命名为MT Not l，用于PCR扩增Artemia的金属结合蛋白序列<400>5acctatgcgg ccgcaaatgg actgctgcaa gaac 34<210>6<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>3′引物(C末端侧)，被命名为dT Not l，用于PCR扩增Artemia的金属结合蛋白序列<400>6gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt a 31<210>7<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>3′引物(C末端侧)，被命名为dT Not l，用于PCR扩增Artemia的金属结合蛋白序列<400>7gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt c 31<210>8<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>3′引物(C末端侧)，被命名为dT Not l，用于PCR扩增Artemia的金属结合蛋白序列<400>8gcaccaacta gtgccttttt tttttttttt g 31<210>9<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>5′引物，含有Nde l位点<400>9gctacacata tgtccatgga ctgctgcaag aac 33
<210>10<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>3′引物，含有Sal l位点<400>10acgaacgtcg acgccttttt tttttttttt a 31<210>11<211>48<212>PRT<213>Artemia sp.
<400>11Met Asp Cys Cys Lys Asn Gly Cys Thr Cys Ala Pro Asn Cys Lys Cys1 5 10 15Ala Lys Asp Cys Lys Cys Cys Lys Gly Cys Glu Cys Lys Ser Asn Pro20 25 30Glu Cys Lys Cys Glu Lys Asn Cys Ser Cys Asn ser Cys Gly Cys His35 40 45<210>12<211>61<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>12Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Arg Asp Ser Cys Ala Cys Ala1 5 10 15Ser Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser20 25 30Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Gly Cys Thr Lys Cys Ala Gln Gly Cys35 40 45Ile Cys Lys Gly Ala Leu Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala50 55 60<210>13<211>61<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser20 25 30
Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys35 40 45Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala50 55 60<210>14<211>61<212>PRT<213>Cercopithecus aethiops<400>14Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Thr Gly Val Ser Cys Thr Cys Ala1 5 10 15Asp Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser20 25 30Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys35 40 45Val Cys Lys Gly Ala Ser Glu Lys Cys Asn Cys Cys Ala50 55 60<210>15<211>60<212>PRT<213>Ictalurus punctatus<400>15Met Asp Pro Cys Glu Cys Ser Lys Thr Gly Thr Cys Asn Cys Gly Thr1 5 10 15Ser Cys Lys Cys Ser Asn Cys Gln Cys Ala Cys Cys Lys Lys Ser Cys20 25 30Cys Ser Cys Cys Pro Ser Gly Cys Ser Lys Cys Ala Ser Gly Cys Val35 40 45Cys Lys Gly Asp Thr Cys Asp Ser Lys Cys Cys Gln50 55 60<210>16<211>62<212>PRT<213>Xenopus laevis<400>16Met Asp Pro Gln Asp Cys Lys Cys Glu Thr Gly Ala Ser Cys Ser Cys1 5 10 15Gly Thr Thr Cys Ser Cys Ser Asn Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Ser Lys Cys Ser Gln Gly35 40 45Cys His Cys Glu Lys Gly Ser Lys Lys Cys Ser Cys Cys Asn50 55 60<210>17<211>71<212>PRT<213>Mytilus edulis<400>17Pro Gly Pro Cys Asn Cys Ile Glu Thr Asn Val Cys Ile Cys Gly Thr1 5 10 15Gly Cys Ser Gly Lys Cys Cys Arg Cys Gly Asp Ala Cys Lys Cys Ala20 25 30Ser Gly Cys Gly Cys Ser Gly Cys Lys Val Val Cys Lys Cys Ser Gly35 40 45Thr Cys Lys Cys Gly Cys Asp Cys Thr Gly Pro Thr Asn Cys Lys Cys50 55 60Glu Ser Gly Cys Ser Cys Lys65 70<210>18<211>68<212> PRT<213>Lytechinus pictus<400>18Met Pro Gly Pro Asp Val Lys Cys Phe Cys Cys Arg Asp Gly Lys Glu1 5 10 15Cys Ala Cys Gly Gly Gly Glu Cys Cys Ile Thr Gly Lys Cys Cys Lys20 25 30Glu Gly Asp Arg Thr Cys Cys Gly Lys Cys Ser Asn Ala Ala Cys Lys35 40 45Cys Ala Asp Gly Cys Lys Cys Glu Gly Ala Cys Ala Cys Thr Met Gly50 55 60Asn Cys Thr Cys65<210>19<211>43<212>PRT<213>Drosophila melanogaster
<400>19Met Val Cys Lys Gly Cys Gly Thr Asn Cys Gln Cys Ser Ala Gln Lys1 5 10 15Cys Gly Asp Asn Cys Ala Cys Asn Lys Asp Cys Gln Cys Val Cys Lys20 25 30Asn Gly Pro Lys Asp Gln Cys Cys Ser Asn Lys35 40<210>20<211>62<212>PRT<213>Caenorhabditis elegans<400>20Val Cys Lys Cys Asp Cys Lys Asn Gln Asn Cys Ser Cys Asn Thr Gly1 5 10 15Thr Lys Asp Cys Asp Cys Ser Asp Ala Lys Cys Cys Glu Gln Tyr Cys20 25 30Cys Pro Thr Ala Ser Glu Lys Lys Cys Cys Lys Ser Gly Cys Ala Gly35 40 45Gly Cys Lys Cys Ala Asn Cys Glu Cys Ala Gln Ala Ala His50 55 60<210>21<211>74<212>PRT<213>Oryza sativa<400>21Met Ser Cys Ser Cys Gly Ser Ser Cys Ser Cys Gly Ser Asn Cys Ser1 5 10 15Cys Gly Lys Lys Tyr Pro Asp Leu Glu Glu Lys Ser Ser Ser Thr Lys20 25 30Ala Thr Val Val Leu Gly Val Ala Pro Glu Lys Lys Ala Gln Gln Phe35 40 45Glu Ala Ala Ala Glu Ser Gly Glu Thr Ala His Gly Cys Ser Cys Gly50 55 60Ser Ser Cys Arg Cys Asn Pro Cys Asn Cys65 70<210>22<211>75<212>PRT<213>Triticum aestivum
<400>22Met Ser Cys Asn Cys Gly Ser Gly Cys Ser Cys Gly Ser Asp Cys Lys1 5 10 15Cys Gly Lys Met Tyr Pro Asp Leu Thr Glu Gln Gly Ser Ala Ala Ala20 25 30Gln Val Ala Ala Val Val Val Leu Gly Val Ala Pro Glu Asn Lys Ala35 40 45Gly Gln Phe Glu Val Ala Ala Gly Gln Ser Gly Glu Gly Cys Ser Cys50 55 60Gly Asp Asn Cys Lys Cys Asn Pro Cys Asn Cys65 70 75<210>23<211>62<212>PRT<213>Candida glabrata<400>23Ala Asn Asp Cys Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Cys Pro Asn Cys Ala1 5 10 15Asn Gly Gly Cys Gln Cys Gly Asp Lys Cys Glu Cys Lys Lys Gln Ser20 25 30Cys His Gly Cys Gly Glu Gln Cys Lys Cys Gly Ser His Gly Ser Ser35 40 45Cys His Gly Ser Cys Gly Cys Gly Asp Lys Cys Glu Cys Lys50 55 60
权利要求
1.一种设备，用于从底物中除去重金属，所述设备包含再生性金属结合支持物，其中包含与之相连接的聚合物膜，以及至少一种高度纯化的金属硫蛋白(MT)或其一部分，所述金属硫蛋白(MT)或其一部分来自选自哺乳动物、鱼类、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、爬行动物、线虫类、谷物和酵母构成的组的生物；其中所述再生性金属结合支持物与所述重金属结合，由此从所述底物除去所述重金属；重金属与所述再生性金属结合支持物的所述结合是可逆的，并且其中所述再生性金属结合支持物可重复使用。
2.如权利要求1所述的设备，其中，所述哺乳动物是人。
3.如权利要求1所述的设备，其中，所述哺乳动物是猴。
4.如权利要求1所述的设备，其中，所述哺乳动物是兔。
5.如权利要求1所述的设备，其中，所述鱼类是鲶鱼。
6.如权利要求1所述的设备，其中，所述软体动物是软体动物是贻贝。
7.如权利要求1所述的设备，其中，所述棘皮动物是海胆。
8.如权利要求1所述的设备，其中，所述爬行动物是青蛙。
9.如权利要求1所述的设备，其中，所述谷物是水稻。
10.如权利要求1所述的设备，其中，所述谷物是小麦。
11.如权利要求1所述的设备，其中，所述甲壳动物是丰年虾(Artemia)。
12.如权利要求1所述的设备，其中，所述MT蛋白具有选自SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQID NO.23构成的组的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的设备，其中，所述聚合物膜是尼龙。
14.如权利要求1所述的设备，其中，所述底物是液体。
15.如权利要求1所述的设备，其中，所述重金属是重金属复合物。
16.一种方法，用于从底物除去重金属，所述方法包括将其中含有重金属的所述底物与再生性金属结合支持物接触，所述支持物包含聚合物膜，所述膜连接有至少一种高度纯化的金属硫蛋白(MT)或其一部分，所述金属硫蛋白(MT)或其一部分来自选自哺乳动物、鱼类、软体动物、棘皮动物、甲壳动物、爬行动物、线虫类、谷物和酵母构成的组的生物；使所述重金属与所述再生性金属结合支持物结合，由此产生其中含有较少重金属的底物。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述聚合物膜是尼龙。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述重金属是重金属复合物。
19.如权利要求16所述的方法，其中，所述底物是液体。
20.如权利要求16所述的方法，其还包含将所述被结合的重金属从所述再生性金属结合支持物释放；以及使所述再生性金属结合支持物的金属结合能力再生。
全文摘要
本发明公开了下述设备，例如具有结合到其上的金属结合蛋白的固体支持物，用于从需要从中去除金属的底物除去这些金属。特别地，公开了具有来自丰年虾Artemia的金属硫蛋白的膜，用于从液体底物除去金属。还公开了使用金属硫蛋白从底物除去金属的相关方法。
文档编号C12N15/00GK101048221SQ200580035817
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者罗杰·A·艾斯 申请人:Mgp生物工艺有限公司